CN101129375A - 长春瑞滨固体脂质纳米粒与其冻干制剂及制备方法 - Google Patents
长春瑞滨固体脂质纳米粒与其冻干制剂及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种长春瑞滨固体脂质纳米粒，由长春瑞滨、脂质材料、磷脂、油酸组成，重量百分比为：长春瑞滨1％～25％、脂质材料30％～90％、磷脂5％～50％、油酸0％～20％。通过将脂质材料在水浴下熔融，将磷脂、油酸、长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到脂质材料中，减压条件下去乙醇，冷却冰冻，置pH2－5的水相中，捣碎，混悬液高压匀质，即得。本发明制剂形式为冻干制剂。本发明可提高长春瑞滨的抗癌活性，同时降低药物的刺激性和毒性以增加患者的适应性，充分发挥长春瑞滨抗肿瘤活性。制备方法设计合理，具工业实用性。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，更具体地说是涉及一种长春瑞滨固体脂质纳米粒、长春瑞滨固体脂质纳米粒冻干制剂及其他们的制备方法。
背景技术
随着医药学技术的发展与进步，人类基本上控制了以往主要威胁人类健康的传染病，而诸如肿瘤、心脑血管疾病等非传染性疾病则逐渐成为人类健康的主要敌人。根据世界卫生组织1997年度的报道，1996年全球58亿人口因癌症死亡的有630万人，约占总死亡人数的12％，其中近60％死于肺癌、胃癌、乳腺癌、结肠直肠癌、口腔癌、肝癌、宫颈癌及食管癌，是仅次于心血管疾病的第二大死因。世界卫生组织2001年报道，世界癌症发病率和死亡率比1990年上升了22％，今后20年还将上升大约50％，流行病学研究提示，我国不仅肿瘤死亡率有明显上升趋势，而且兼有发展中国家和发达国家高发性普骗性并存的特点，近年来我国每年新增肿瘤患者160-170万人，总数估计在450万人左右。因此抗肿瘤药物的开发是许多药学工作者研究的重中之重。另外，由于多数药物抗肿瘤药物不良反应严重，在治疗过程中对患者的身心造成很大的伤害，因此如何在提高药物疗效的同时降低药物的刺激性及毒性、从而提高患者生存质量逐渐成为目前抗肿瘤药物研究新的方向与重点。
长春瑞滨是一种半合成的长春碱类抗肿瘤新药，抗癌活性高，抗瘤谱广，经国外临床研究，单药或联合用药治疗非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、恶性淋巴瘤等已显示出突出的疗效。其作用机理与长春花碱和长春新碱基本相同，属于长春碱类抑制细胞分裂的抗肿瘤药物，直接作用于微管蛋白/微管的动态平衡，可抑制微管蛋白的聚合，并使分裂期微管崩解，仅在高浓度下影响轴突微管，对管蛋白的螺旋化作用低于长春新碱，通过阻断G2与M期细胞的有丝分裂导致进入间期或分裂后期的细胞死亡。静脉给药后药代动力学成三室模型，终末相平均半衰期为40小时，血浆清除率较高，约为800ml/kg/hr，组织摄入率高且持久，因胆道排除率高，故主要经粪便排泄。血浆蛋白结合水平高达50-80％。单药给药治疗，推荐剂量为每周25-30mg/m2。
近年来由于紫杉烷类抗癌药的出现，而其抗癌活性较长春瑞滨强，故长春瑞滨已逐渐沦为临床三线用药，仅用于恩环类抗生素和紫杉烷类抗肿瘤药物治疗失败后的替补治疗用药。最近国外的一份研究报告报道：长春瑞滨与曲妥单抗和用对治疗Her-2 overexpressing/amplified ABC有特效，并且人们也逐渐地发现紫杉烷的副作用巨大，患者的适应性很差。这些都促使是许多药学工作者将目光转向具有较高安全性的长春瑞滨，长春瑞滨再一次成为国际研究的热点。
最近几年来研究者逐渐意识到，单纯靠新的药用化合物的研究发现已经不可能保证治疗水平的提高。因为往往有许多的药用化合物在体外的一系列试验中得到了很好的结果，但是他们的体内研究试验却往往令人十分的失望。在这样的大背景下，人们逐渐开始探索通过一种载体将药物转运到它的作用部位，这样它们的体内作用过程已经不再只是依赖这些化合物的理化性质，而是更多地依靠载体本身的性能。只要有适合的载体，从前那些由于体内试验结果不好而被筛选掉的药用化合物也有机会成为临床用药，这大大扩大了药物筛选的范围，增加了成功的可能性。最近一些年研究比较多的药物载体有：脂质体、亚微乳、微球、纳米粒等。每一种载体都有各自的优势，但也有自己的不足之处。但现在人们普遍认为纳米粒在各个方面都表现出了令人满意的结果，特别是固体脂质纳米粒，较聚合物纳米粒毒性更低，所以说固体脂质纳米粒不仅结合了其他载体的优势，还同时避免了其他载体的缺点，是一种优良的药物传递系统。其优点主要有以下几个方面：①控制药物的释放和药物的靶向性；②增加药物的稳定性；③较高的载药量；④可以包封亲水和亲脂性的药物，适用的范围比较大；⑤几乎没有生物毒性，是一种安全的药物载体；⑥具有工业化大生产的可能性。
目前实验室研究固体脂质纳米粒的制备方法主要有：乳化溶剂蒸发/扩散法、高剪切及超声技术、高压匀质技术等许多。乳化溶剂蒸发/扩散法是将药物与脂质材料的混合物溶解于一个溶剂系统当中(这个溶剂系统一般有三种成分组成，即良溶剂、不良溶剂和架桥剂。良溶剂一般是有机溶剂，不良溶剂是指不能溶解药物和脂质材料的溶剂，架桥剂是用来增加药物与脂质材料间结合力的成分。)，乳化后在将溶剂系统当中的良溶剂蒸发除去，这样药物和脂质材料将会析出形成包裹药物的固体脂质纳米粒。这种方法的特点是所得的纳米粒粒径分布比较均匀，制备工艺简单，耗能少。但是他却有很明显的不足：所得的纳米粒粒径较大；制备过程中引入了大量的有机溶剂，不适于临床应用；工艺不适于工业化大生产；另外，对于制备水溶性药物的固体脂质纳米粒有一定的难度。高剪切及超声技术比如化溶剂蒸发/扩散法有了很大的进步，它是通过高强度的机械力而不是依靠表面张力来形成纳米球，因此制备的固体脂质纳米粒粒径较小，分布较均匀；同时还有一定的工业化生产前景。但也存在一些不足：超声过程中会使一部分药物从纳米粒中释放出来，药物的包封率会受到影响。超声还会产生较高的温度也会影响药物的稳定性。高压匀质法又分为热熔法与冷溶法。热熔法是先将药物溶解或者分散在熔融的脂质中，在脂质材料的熔点以上水浴条件，将药物与脂质材料的混合物分散在一个含有表面活性剂的水相中，制成初乳后进高压匀质机制成均匀的乳滴后，在室温下冷却，脂质材料将会包裹药物析出形成载药的固体脂质纳米粒。该方法优点是：适用于工业化大生产；制得的纳米粒粒径均匀、粒径较小等等，但是也有着很明显的不足：操作的温度较高，不适用于制备对温度比较敏感的药物；较高的温度易发生药物的降解；同时也不适用于包封亲水性的药物。
目前长春瑞滨临床上常有的剂型为注射液和冻干粉针，剂量为5-50mg/支，由于其与碱性物质接触容易产生沉淀，以及和输液器接触后容易被吸附，因此在使用时必须用生理盐水稀释，与短时间(6-10min)内输入，然后用250-500ml生理盐水冲洗静脉。同时长春瑞滨对血管有较强的刺激性，患者顺应性较差。严重影响其临床使用及临床安全性和临床疗效。
因此鉴于上述特性，为了使长春瑞滨更好的发挥临床疗效，研究和开发新型药物传递系统，以新型药物传递系统的优势提高长春瑞滨的细胞毒性，掩盖药物的刺激性，降低药物的毒性以充分发挥长春瑞滨的抗肿瘤活性，这无疑将对进一步促进和推广长春瑞滨在临床中的应用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有长春瑞滨剂型存在的缺陷，提供一种新型的长春瑞滨固体脂质纳米粒，粒径(强度径)在100-200nm之间，
本发明提供的长春瑞滨固体脂质纳米粒由长春瑞滨、脂质材料、磷脂、油酸组成，其组成重量百分比为：
长春瑞滨 1％～25％
脂质材料 30％～90％
磷脂 5％～50％
油酸 0％～20％
本发明提供的长春瑞滨固体脂质纳米粒的长春瑞滨是长春瑞滨碱或由长春瑞滨与药学上可用的酸反应得到的盐，具体可以是：酒石酸盐、马来酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、盐酸盐、硫酸盐、马来酸盐、乳酸盐、磷酸盐。
所述的脂质材料为固体脂质材料和/或液体脂质材料：固体脂质材料是单硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、山嵛酸甘油酯、硬脂酸、三癸酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯、胆固醇等；液体脂质材料是各种矿物油、植物油、动物油、脱水山梨醇脂肪酸酯(Span)、油酸、10-羟基-2-癸烯酸或其混合物。
所述的磷脂为豆磷脂、卵磷脂或其混合物。
为了更好地实现本发明，固体脂质纳米粒的组成重量百分比为：
长春瑞滨 5％～15％
脂质材料 60％～65％
磷脂 20％～30％
油酸 0％～15％
本发明的优选组成为：
长春瑞滨 5％
脂质材料为单硬脂酸甘油酯 60％
卵磷脂 30％
油酸 5％
本发明的长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液通过以下制备方法获得：(1)将脂质材料在55-100℃的水浴条件下熔融；(2)将磷脂、油酸、长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速置于液氮中冷却；(4)待完全冰冻后取出，于含有表面活性剂的水相中，水相pH 2-5，组织捣碎机下捣碎，3000-30000rpm，5-60min，制备初级混悬液；(5)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质1-15次，即制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液，整个操作均在冰浴条件下进行。
其优选制备方案为：(1)将处方量的脂质材料在60℃的水浴条件下熔融；(2)将处方量的磷脂、油酸、长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速置于液氮中冷却；(4)待完全冰冻后取出，用研钵研碎后分散在适量的含有表面活性剂和/或体系稳定成分的水相中，水相pH 4；(5)组织捣碎机下捣碎，3000rpm，6000rpm，各15min，制备初级混悬液；(6)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质10次，即制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液，整个操作均在冰浴条件下进行。
在本发明的制备方法中，开发并完善了冷溶法，该方法有以下几方面的优点：(2)避免高温度下的药物降解；(3)可以避免在匀质过程中药物扩散到水相中，降低了包封率；(4)具有工业化大生产的可能性；(5)可以在一定程度上避免由于脂质材料的多种晶型的存在和转变导致的一系列不稳定性。
本发明的另一个目的是提供长春瑞滨固体脂质纳米粒冻干制剂，由长春瑞滨、脂质材料、磷脂、油酸组成，其组成重量百分比为：
长春瑞滨 1％～25％
脂质材料 30％～90％
磷脂 5％～50％
油酸 0％～20％
渗透调节剂 水相中浓度为0～20％
冻干保护剂 水相中浓度为0～20％
冻干支持剂 水相中浓度为0～20％
有不少辅料，如甘露醇、木糖醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖，可以同时作为渗透调节剂、冻干支持剂和冻干保护剂使用，所以当选用渗透调节剂时，可以只加很少量的冻干支持剂和/或冻干保护剂，甚至不加。
所述的长春瑞滨固体脂质纳米粒冻干制剂的方法，通过以下步骤实现：(1)将处方量的脂质材料在55-100℃的水浴条件下熔融；(2)将处方量的磷脂、油酸、长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速冷却；(4)于含有表面活性剂的水相中(pH 2-5)，组织捣碎机下捣碎，3000-30000rpm，5-60min，制备初级混悬液；(5)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质1-15次，制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液，整个操作均在冰浴条件下进行；(6)除菌，加入冻干保护剂，冻干支持剂，冷冻干燥，灌装。
本发明提供的长春瑞滨固体脂质纳米粒有以下几方面的特点：
1.粒径较小且分布均匀，具有被动靶向性
本发明的长春瑞滨固体脂质纳米粒粒径(强度径)在100-200nm之间，这个粒径范围完全符合注射用的标准。该粒径的粒子能通过“EPR”，即“滞留与渗漏”效应，实现肿瘤组织的被动靶向分布。
另外，较小的粒经对于靶向性有很重要的意义。研究报道显示：胃肠道中的派伊尔集结(Peyer’s patches，PP)对粒径在100nm左右的纳米粒的吸收比粒径在200nm以上的纳米粒要高出许多。本发明的长春瑞滨固体脂质纳米粒的平均粒径为147nm，比较容易被派氏集结吸收，这就为口服纳米粒的淋巴靶向吸收提供了可能性。除此以外，本发明的重酒石酸长春瑞滨固体脂质纳米粒还带正电荷，根据前人的大量实验结果证实：带负电的粒子往往易被肝脏摄取，带正电的粒子则易被肺脏摄取。所以，本发明的长春瑞滨固体脂质纳米粒对于肺癌的靶向治疗有重要的意义。
2.包封率高
由于长春瑞滨的各种酸盐形式亲水性较好，所以用其他方法制备固体脂质纳米粒时，在制备过程中药物直接与水相的接触机会较多，所以药物很容易泄露到水相中，因此包封率很难达到满意的结果。而本发明采用的方法在制备过程中是先将药物包封在固体脂质材料当中，然后依靠高压匀质机制成纳米级的粒子。在整个制备过程当中，成功地减少了药物与水相的接触的机会，从而有效地避免了药物向外水相扩散，因此有较高的包封率。本发明的重酒石酸长春瑞滨固体脂质纳米粒的包封率接近90％。国内外有很多人在研究水溶性药物的固体脂质纳米粒的制备，但从现有的文献中还没有发现这么高的包封率。
3.稳定性好
将制备好的长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液用安瓶密封后，室温避光通风条件下保存三个月后，测量重酒石酸长春瑞滨固体脂质纳米粒的粒径、电位和包封率均没有明显的变化。结果见表-1。大量的文献报道过：在固体脂质纳米粒的储存过程中，由于脂质材料的晶型的转变会导致纳米粒中包封的药物被排挤出来，包封率下降。而我们采用快速冷却的方法使固体脂质材料以无定型的形式存在，同时处方中的磷脂和油酸均有抑制晶型转变的的作用，所以本发明中的固体脂质纳米粒能够较长时间的保持对药物的包封。另外，因为制得的固体脂质纳米粒的粒径较小、分布比较均匀，且电位较高，水相中含有适当的助混悬成分，所以本发明的固体脂质纳米粒混悬液体系能够较长时间的稳定存在。
4.释放缓慢
许多文献报道的固体脂质纳米粒药物的释放过程中突释现象很明显，这主要是因为通过乳化溶剂扩散法等方法制得的固体脂质纳米粒，药物主要是富集在纳米粒的表面，而不是均匀的分散在纳米粒当中，所以药物的释放过程中突释现象很明显。这样的释放行为是不理想的，因为有可能药物在没有被转运到作用部位时就已经释放完了，达不到预期的靶向作用。除此以外还可能产生副作用，拿长春瑞滨举例，如果突释明显，静脉注射后药物很快的释放出来，这样释放出来的药物就会刺激血管，引发静脉炎。这样就达不到我们预期的减小药物副作用的目的了。本发明中药物是均匀分布在固体脂质纳米粒当中的，药物的释放是依靠脂质材料的溶蚀，因此释放曲线光滑、平稳。参见图4，本发明的长春瑞滨固体脂质纳米粒前2小时的释放量不足10％，几乎没有明显的突释现象，从而可以避免上述的问题，达到预期的发明目的。
5.抗癌活性高
本发明的主要目的之一就是提高长春瑞滨的抗癌活性。大量的文献报道：固体脂质纳米粒能够增加细胞对药物的摄取。细胞对纳米粒的吸收机制主要是通过胞吞，通过细胞对纳米粒的摄取，增加了进入癌细胞中的药物量，所以对细胞的杀伤力增强了。我们拿市售的长春瑞滨水针注射液和自制的长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液的体外抗癌活性作了对比，结果表明长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液对癌细胞的抑制率比长春瑞滨水针注射液的癌细胞抑制率高很多，12小时时的抑制率长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液为长春瑞滨水针注射液的2倍多。这可以充分说明将长春瑞滨包封到固体脂质纳米粒中后，增强了细胞对药物的摄取，提高了细胞毒性。而空白纳米粒对照实验表明：空白的固体脂质纳米粒对癌细胞几乎无毒性。这说明抗癌活性均由药物产生，同时说明了固体脂质纳米粒是一种安全、有效的药物载体。
6.降低了药物的副作用
本发明提供的这种长春瑞滨固体脂质纳米粒，其中长春瑞滨能较好的均匀的分布在固体脂质当中，通过药物传递系统的作用更易于转运至癌细胞中，增加了癌细胞内的药物浓度从而提高了抗癌活性；同时由于药物被包裹与固体脂质纳米粒中，有效地避免了药物与血管的直接接触，降低了长春瑞滨对血管的刺激性。血管刺激性试验结果可以充分说明这一点。
本发明把药物长春瑞滨做成固体脂质纳米粒后，由于药物被包封在脂质材料中，可以避免与血管内壁或体液的直接接触，从而降低了药物在注射部位所产生的刺激性及由此发生的全身毒性，急性毒性试验结果表明：与市售的长春瑞滨水针注射剂相比长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液毒性大大降低；另外，由于新型载体——固体脂质纳米粒的作用，极大地增强了癌细胞对药物的摄取，明显提高了癌细胞毒性，细胞毒性试验结果表明：与市售的长春瑞滨水针注射液相比长春瑞滨固体脂质纳米粒具有更强的毒性。同时空白对照实验结果表明：空白固体脂质纳米粒几乎无细胞毒性，是一种安全的、高效的载体。将长春瑞滨制备成固体脂质纳米粒冻干制剂后，其物理和化学稳定性将进一步得到提高，便于储存与运输。本发明提供的长春瑞滨固体脂质纳米粒冻干制剂，可提高长春瑞滨的抗癌活性，同时降低药物的刺激性和毒性以增加患者的适应性，充分发挥长春瑞滨抗肿瘤活性；制备方法设计合理，具工业实用性。
附图说明：
图1为长春瑞滨固体脂质纳米粒原子力显微镜照片。
图2为长春瑞滨固体脂质纳米粒粒径分布图。
图3为长春瑞滨固体脂质纳米粒Zeta电位。
图4为长春瑞滨固体脂质纳米粒体外累计释药曲线。
图5为长春瑞滨固体脂质纳米粒体外细胞毒性试验结果。
图6为MCF-7细胞形态(500μg/ml空白纳米粒孵育24h)。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
本发明提供的长春瑞滨固体脂质纳米粒由长春瑞滨、脂质材料、磷脂、油酸组成：长春瑞滨 14mg
单硬脂酸甘油酯 200mg
卵磷脂 90mg
油酸 14mg
制备方法：(1)将处方量的脂质材料单硬脂酸甘油酯在60℃的水浴条件下熔融；(2)将处方量的磷脂、油酸、长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速置于液氮中冷却；(4)待完全冰冻后取出，用研钵研碎后分散在适量的含1％F68的水相中，水相pH 4；(5)组织捣碎机下捣碎，3000rpm，6000rpm，各15min，制备初级混悬液；(6)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质10次，即制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液。整个操作均在冰浴条件下进行。
结果：制备的固体脂质纳米粒原子力显微镜照片参见图1，粒度分布参见图2，体积平均粒径为98nm，电位结果参见图3，平均电位为：+34mv。药物包封率为87.3％.
实施例2
本发明提供的长春瑞滨固体脂质纳米粒由长春瑞滨、脂质材料、磷脂、油酸组成：长春瑞滨 42mg
单硬脂酸甘油酯 200mg
卵磷脂 90mg
油酸 14mg
制备方法：(1)将处方量的脂质材料单硬脂酸甘油酯在60℃的水浴条件下熔融；(2)将处方量的磷脂、油酸、长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速置于液氮中冷却；(4)待完全冰冻后取出，用研钵研碎后分散在适量的含有1％F68的水相中，水相pH 3.7；(5)组织捣碎机下捣碎，3000rpm，6000rpm，各15min，制备初级混悬液；(6)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质10次，即制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液。整个操作均在冰浴条件下进行。
结果：制备的固体脂质纳米粒体积平均粒径为154nm，平均电位为：+28mv。药物包封率为81.6％。
实施例3
本发明提供的长春瑞滨固体脂质纳米粒由长春瑞滨、脂质材料、磷脂、油酸组成：长春瑞滨 100mg
单硬脂酸甘油酯 150mg
卵磷脂 140mg
油酸 10mg
制备方法：(1)将处方量的脂质材料单硬脂酸甘油酯在60。℃的水浴条件下熔融；(2)将处方量的磷脂、油酸、长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速置于液氮中冷却；(4)待完全冰冻后取出，用研钵研碎后分散在适量的含有1％F68的水相中，水相pH 4；(5)组织捣碎机下捣碎，3000rpm，6000rpm，各15min，制备初级混悬液；(6)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质10次，即制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液。整个操作均在冰浴条件下进行。
结果：制备的固体脂质纳米粒体积平均粒径为448nm，平均电位为：+32mv。药物包封率为61.5％。
实施例4
本发明提供的长春瑞滨固体脂质纳米粒由长春瑞滨、脂质材料、磷脂、油酸组成：长春瑞滨 3.2mg
单硬脂酸甘油酯 200mg
卵磷脂 90mg
油酸 14mg
制备方法：(1)将处方量的脂质材料单硬脂酸甘油酯在60℃的水浴条件下熔融；(2)将处方量的磷脂、油酸、长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速置于液氮中冷却；(4)待完全冰冻后取出，用研钵研碎后分散在适量的含有1％F68的水相中，水相pH 4；(5)组织捣碎机下捣碎，3000rpm，6000rpm，各15min，制备初级混悬液；(6)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质10次，即制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液。整个操作均在冰浴条件下进行。
结果：制备的固体脂质纳米粒体积平均粒径为154nm，平均电位为：+29mv。药物包封率为89.1％。
实施例5
本发明提供的长春瑞滨固体脂质纳米粒由长春瑞滨、脂质材料、磷脂、油酸组成：长春瑞滨 14mg
单硬脂酸甘油酯 200mg
卵磷脂 90mg
制备方法：(1)将处方量的脂质材料单硬脂酸甘油酯在60℃的水浴条件下熔融；(2)将处方量的磷脂、长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速置于液氮中冷却；(4)待完全冰冻后取出，用研钵研碎后分散在适量的含有1％F68的水相中，水相pH 4；(5)组织捣碎机下捣碎，3000rpm，6000rpm，各15min，制备初级混悬液；(6)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质10次，即制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液。整个操作均在冰浴条件下进行。
结果：制备的固体脂质纳米粒体积平均粒径为271nm，平均电位为：+36mv。药物包封率为65.4％。
实施例6
本发明提供的长春瑞滨固体脂质纳米粒由长春瑞滨、脂质材料、磷脂、油酸组成：长春瑞滨 12mg
单硬脂酸甘油酯 200mg
豆磷脂 30mg
油酸 12mg
制备方法：(1)将处方量的脂质材料单硬脂酸甘油酯在60℃的水浴条件下熔融；(2)将处方量的磷脂、油酸、长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速置于液氮中冷却；(4)待完全冰冻后取出，用研钵研碎后分散在适量的含有1％F68的水相中，水相pH 4；(5)组织捣碎机下捣碎，3000rpm，6000rpm，各15min，制备初级混悬液；(6)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质10次，即制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液。整个操作均在冰浴条件下进行。
结果：制备的固体脂质纳米粒体积平均粒径为75nm，平均电位为：+22mv。药物包封率为84.5％。
实施例7
本发明提供的长春瑞滨固体脂质纳米粒由长春瑞滨、脂质材料、磷脂、油酸组成：长春瑞滨 36mg
单硬脂酸甘油酯 200mg
豆磷脂 90mg
油酸 12mg
制备方法：(1)将处方量的脂质材料单硬脂酸甘油酯在60℃的水浴条件下熔融；(2)将处方量的磷脂、油酸、长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速置于液氮中冷却；(4)待完全冰冻后取出，用研钵研碎后分散在适量的含有1％F68的水相中，水相pH 4；(5)组织捣碎机下捣碎，3000rpm，6000rpm，各15min，制备初级混悬液；(6)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质10次，即制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液。整个操作均在冰浴条件下进行。
结果：制备的固体脂质纳米粒体积平均粒径为64nm，平均电位为：+27mv。药物包封率为85.1％。
实施例8
本发明提供的长春瑞滨固体脂质纳米粒由长春瑞滨、脂质材料、磷脂、油酸组成：长春瑞滨 42mg
单硬脂酸甘油酯 200mg
卵磷脂 90mg
制备方法：(1)将处方量的脂质材料单硬脂酸甘油酯在60℃的水浴条件下熔融；(2)将处方量的磷脂、油酸、长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速置于液氮中冷却；(4)待完全冰冻后取出，用研钵研碎后分散在适量的含有1％F68的水相中，水相pH4；(5)组织捣碎机下捣碎，3000rpm，6000rpm，各15min，制备初级混悬液；(6)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质10次，即制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液。整个操作均在冰浴条件下进行。
结果：制备的固体脂质纳米粒体积平均粒径为148nm，平均电位为：+33mv。药物包封率为72.6％。
实施例9
本发明提供的长春瑞滨固体脂质纳米粒由长春瑞滨、脂质材料、磷脂、油酸组成：长春瑞滨 14mg
单硬脂酸甘油酯 200mg
卵磷脂 90mg
油酸 80mg
制备方法：(1)将处方量的脂质材料单硬脂酸甘油酯在60℃的水浴条件下熔融；(2)将处方量的磷脂、油酸、长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速置于液氮中冷却；(4)待完全冰冻后取出，用研钵研碎后分散在适量的含1％F68的水相中，水相pH 4；(5)组织捣碎机下捣碎，3000rpm，6000rpm，各15min，制备初级混悬液；(6)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质10次，即制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液。整个操作均在冰浴条件下进行。
结果：制备的固体脂质纳米粒体积平均粒径为121nm，平均电位为：+19mv。药物包封率为88.2％。
实施例9
本发明提供的长春瑞滨固体脂质纳米粒由长春瑞滨、脂质材料、磷脂、油酸组成：长春瑞滨 14mg
单硬脂酸甘油酯 180mg
卵磷脂 200mg
油酸 14mg
制备：(1)将处方量的脂质材料单硬脂酸甘油酯在60℃的水浴条件下熔融；(2)将处方量的磷脂、油酸、长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速置于液氮中冷却；(4)待完全冰冻后取出，用研钵研碎后分散在适量的含0.5％卵磷脂和1％F68的水相中，水相pH 4；(5)组织捣碎机下捣碎，3000rpm，6000rpm，各15min，制备初级混悬液；(6)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质10次，即制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液。整个操作均在冰浴条件下进行。
结果：制备的固体脂质纳米粒体积平均粒径为75nm，平均电位为：+17mv。药物包封率为82.2％。
实施例10
本发明提供的长春瑞滨固体脂质纳米粒由长春瑞滨、脂质材料、磷脂、油酸组成：重酒石酸长春瑞滨 14mg
单硬脂酸甘油酯 200mg
卵磷脂 14mg
油酸 14mg
制备：(1)将处方量的脂质材料单硬脂酸甘油酯在60℃的水浴条件下熔融；(2)将处方量的磷脂、油酸、重酒石酸长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速置于液氮中冷却；(4)待完全冰冻后取出，用研钵研碎后分散在适量的含20％蔗糖和1％F68的水相中，水相pH 4；(5)组织捣碎机下捣碎，3000rpm，6000rpm，各15min，制备初级混悬液；(6)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质10次，即制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液。整个操作均在冰浴条件下进行。
结果：制备的固体脂质纳米粒体积平均粒径为513nm，平均电位为：+14mv。药物包封率为53.7％。
实施例11
本发明提供的长春瑞滨固体脂质纳米粒由长春瑞滨、脂质材料、磷脂、油酸组成：长春瑞滨 14mg
胆固醇 200mg
卵磷脂 90mg
油酸 14mg
制备：(1)将处方量的脂质材料胆固醇在60℃的水浴条件下溶解在一定量的有机溶剂(如乙醇、丙酮等)中；(2)将处方量的磷脂、油酸、长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速置于液氮中冷却；(4)待完全冰冻后取出，用研钵研碎后分散在适量的含1％F68的水相中，水相pH 4；(5)组织捣碎机下捣碎，3000rpm，6000rpm，各15min，制备初级混悬液；(6)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质10次，即制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液。整个操作均在冰浴条件下进行。
结果：制备的固体脂质纳米粒体积平均粒径为336nm，平均电位为：+23mv。药物包封率为73.8％。
实施例12
本发明提供的长春瑞滨固体脂质纳米粒由长春瑞滨、脂质材料、磷脂、油酸组成：重酒石酸长春瑞滨 14mg
硬脂酸 900mg
卵磷脂 90mg
油酸 14mg
制备：(1)将处方量的脂质材料硬脂酸在60℃的水浴条件下熔融；(2)将处方量的磷脂、油酸、重酒石酸长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速置于液氮中冷却；(4)待完全冰冻后取出，用研钵研碎后分散在适量的含0.2％胆酸钠和1％F68的水相中，水相pH 4；(5)组织捣碎机下捣碎，3000rpm，6000rpm，各15min，制备初级混悬液；(6)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质10次，即制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液。整个操作均在冰浴条件下进行。
结果：制备的固体脂质纳米粒体积平均粒径为266nm，平均电位为：+36mv。药物包封率为77.4％。
实施例13
本发明提供的长春瑞滨固体脂质纳米粒由长春瑞滨、脂质材料、磷脂、油酸组成：重酒石酸长春瑞滨 14mg
脂质材料：单硬脂酸甘油酯 160mg，鲸蜡油 40mg
卵磷脂 90mg
油酸 14mg
制备：(1)将处方量的脂质材料单硬脂酸甘油酯和鲸蜡油在90℃的水浴条件下熔融；(2)将处方量的磷脂、油酸、重酒石酸长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速置于液氮中冷却；(4)待完全冰冻后取出，用研钵研碎后分散在适量的含1％F68的水相中，水相pH 4；(5)组织捣碎机下捣碎，3000rpm，6000rpm，各15min，制备初级混悬液；(6)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质10次，即制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液。整个操作均在冰浴条件下进行。
结果：制备的固体脂质纳米粒体积平均粒径为92nm，平均电位为：+29mv。药物包封率为85.2％。
实施例14
本发明提供的长春瑞滨固体脂质纳米粒由长春瑞滨、脂质材料、磷脂、油酸组成：重酒石酸长春瑞滨 14mg
脂质材料：硬脂酸 160mg，鲸蜡油 40mg
豆磷脂 90mg
油酸 14mg
制备：(1)将处方量的脂质材料硬脂酸和鲸蜡油在60℃的水浴条件下熔融；(2)将处方量的磷脂、油酸、重酒石酸长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速置于液氮中冷却；(4)待完全冰冻后取出，用研钵研碎后分散在适量的含1％F68的水相中，水相pH 4；(5)组织捣碎机下捣碎，3000rpm，6000rpm，各15min，制备初级混悬液；(6)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质10次，即制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液。整个操作均在冰浴条件下进行。
结果：制备的固体脂质纳米粒体积平均粒径为207nm，平均电位为：+25mv。药物包封率为81.3％。
实施例15 体外释放试验
取1ml刚制备的VD-SLN dispersion置于透析袋中(分子量7000)，将该透析袋放入装有10ml释放介质PBS(pH7.4)的棕色瓶中，置于37℃摇床中，按设计好的时间点取样(1，2，4，8，12，24，36，48h)，每次取样均换液10ml。用HPLC测量长春瑞滨的浓度，计算药物累计释放量。不同组成的长春瑞滨固体脂质纳米粒的体外药物释放曲线参见图4，各种组成见表1：
| 组成 | 成分(mg) | |||
| 单硬脂酸甘油酯 | 磷脂 | 油酸 | 药物 | |
| ABCDEF | 200200200200200200 | 909090303030 | 1414-1212- | 144214123612 |
图4中：(△)游离药物；()组成A；()组成B；(○)组成C；(◇)组成D；(◆)组成E；(□)组成F.其中组成A采用两种方法制备：冷溶均质法()和溶剂扩散法(●).图中没点为3个数的平均值。
药物包封率测定
采用超滤离心法测定药物包封率。取药物纳米粒混悬液适量，至于超滤离心管内(内有10000D分子量的膜)，5000s/min离心5min，HPLC测定滤出液中药物量，按如下公式计算包封率：
W＝(m总-m游离)/m总×100％
其中m总为加入纳米粒混悬液药物总量，m游离为游离药物量。
实施例16体外抗癌活性评价(MTT试验)
(1)接种MCF-7细胞：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液配成单个细胞悬液，每孔1ml接种于24孔板中；
(2)培养MCF-7细胞：将培养板移入CO2孵箱中，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养12h；
(3)加药：按照实验设计的时间点加药，即48、36、24、12、8、4h；
(4)呈色：当时间达到预定的时间后，向每个孔加入5mg/ml的MTT溶液，60ul。继续孵育12h，中止培养，小心吸弃孔内的培养上清液。每孔加入DMSO 1ml，溶解紫色结晶物；
(5)比色：选择570nm波长，在酶标仪上测定个孔的吸光度，记录结果，计算出抑制率。
长春瑞滨固体脂质纳米粒体外抗癌活性评价结果参见图5，其中(
)游离药物10μg/ml ，()载药纳米粒10μg/ml，(
)游离药物20μg/ml，()载药纳米粒20μg/ml，(▲)空白纳米粒250μg/ml，(■)空白纳米粒500μg/ml。
MCF-7细胞形态(500μg/ml空白纳米粒孵育24h)参见图6。
实施例17长春瑞滨固体脂质纳米粒刺激性试验
1.血管刺激性试验
将长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液与市售的长春瑞滨水针注射液按临床用药量(30mg/次)进行体表面积换算出实验兔用计量(1.4mg/kg)。试验前按2ml/kg的给药量用无菌生理盐水注射液新鲜配制。选用体重2.5-3.0kg的健康新西兰白兔6只，雌雄兼有。注射部位用碘酊和乙醇消毒后，其中三只白兔于右耳耳缘静脉注射长春瑞滨水针注射液，左耳注射相同剂量的无菌生理盐水注射液作为对照；另三只白兔于右耳耳缘静脉注射长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液，左耳注射相同剂量的无菌生理盐水注射液作为对照，注射速度为2.8ml/min(相当于人临床注射速度)。每日一次，连续三天，末次给药24小时后，由耳缘静脉注入空气处死白兔，肉眼观察注射部位的反映情况，并解剖兔耳血管及周围组织做石蜡切片(注射部位下向心端1cm及5cm处)，HE染色，光镜检查。肉眼观察注射部位反映情况的结果参见表2。
表2血管刺激性试验肉眼观察
表2显示，长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液和长春瑞滨水针注射液对血管的刺激性结果表明：长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液的血管刺激性弱于长春瑞滨水针注射液；同时病理切片报告也表明：长春瑞滨水针注射液组对新西兰白兔的耳血管有比较明显的血管刺激性，而长春瑞滨固体脂质纳米粒组对新西兰白兔耳血管未见明显的刺激性。
2.肌肉刺激性试验
长春瑞注射液的剂量换算、药物配制、新西兰白兔的选择同上(共4支，每种剂型两只)。剪去白兔两侧股四头肌部位的兔毛，用碘酊和乙醇消毒后，分别在右侧股四头肌注射长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液和长春瑞滨水针注射液1ml，左侧股四头肌注射等量的无菌生理盐水注射液作为对照，注射48小时后，由耳缘静脉注入空气处死白兔，解剖取出股四头肌，纵向切开，观察注射部位肌肉组织的反映情况，确定反应级数。
0级：无变化；
1级：轻度充血，其范围在0.5cm×1.0cm以下；
2级：中度充血，其范围在0.5cm×1.0cm以上；
3级：重度充血，伴有肌肉变性；
4级：出现坏死，由褐色变性；
5级：出现广泛性坏死。
两种长春瑞滨注射液肌肉刺激性试验结果参见表3。
表3肌肉刺激试验结果
3.溶血性试验
自新西兰白兔的颈动脉取血20ml，至于烧瓶内，用玻璃棒轻轻搅动，数分钟后，除去纤维蛋白，取出学业，加等量生理盐水注射液，离心(1500rpm/min，10min)，除去上清液；沉淀的红细胞再加生理盐水注射液清洗，离心。如此反复直至上清液透明，按红细胞的容量用生理盐水配成2％的混悬液。
取干净的试管7支，分别编号，一次加下表内各液，第6管不加供试液作为空白对照管，第7管用蒸馏水代替生理盐水，摇匀，至于37℃水浴中，分别于0.5、1、2、3h观察是否有溶血现象发生。结果见表4、表5。
表4长春瑞滨水针注射液溶血性试验结果
| 编号 | 水针注射液(ml) | 生理盐水(ml) | 2％细胞悬液(ml) | 0.5h | 1h | 2h | 3h |
| 12345 | 0.10.20.30.40.5 | 2.42.32.22.12.0 | 2.52.52.52.52.5 | ----- | ----- | ----- | ----- |
| 67 | 02.5(蒸馏水) | 2.50 | 2.52.5 | -+ | -+ | -+ | -+ |
-，未见溶血；+，溶血。
表5长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬注射液溶血试验结果
| 编号 | 纳米粒混悬液(ml) | 生理盐水(ml) | 2％细胞悬液(ml) | 0.5h | lh | 2h | 3h |
| 1234567 | 0.10.20.30.40.502.5(蒸馏水) | 2.42.32.22.12.02.50 | 2.52.52.52.52.52.52.5 | ------+ | ------+ | ------+ | ------+ |
-，未见溶血；+，溶血。
Claims (7)
1.一种长春瑞滨固体脂质纳米粒，包括脂质材料、磷脂、油酸，其特征是：其中药物为长春瑞滨，其组成重量百分比为：
长春瑞滨 1％～25％
脂质材料 30％～90％
磷脂 5％～50％
油酸 0％～20％
粒径在100-200nm之间，
所述的长春瑞滨是长春瑞滨碱或由长春瑞滨与药学上可用的酸反应得到的盐，选用的酸是：酒石酸盐、马来酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、盐酸盐、硫酸盐、马来酸盐、乳酸盐或磷酸盐；
所述的脂质材料为固体脂质材料和/或液体脂质材料：固体脂质材料是单硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、山嵛酸甘油酯、硬脂酸、三癸酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、三棕榈酸甘油酯或胆固醇；液体脂质材料是各种矿物油、植物油、动物油、脱水山梨醇脂肪酸酯、油酸、10-羟基-2-癸烯酸或其混合物；
所述的磷脂为豆磷脂、卵磷脂或其混合物。
2.根据权利要求1所述的长春瑞滨固体脂质纳米粒，其特征是：其组成的重量百分比为：
长春瑞滨 5％～15％
脂质材料 60％～65％
磷脂 20％～30％
油酸 0％～15％。
3.根据权利要求1所述的长春瑞滨固体脂质纳米粒，其特征是：其组成的重量百分比为：
长春瑞滨5％
脂质材料为单硬脂酸甘油酯60％
卵磷脂30％
油酸5％。
4.根据权利要求1-3任一所述的长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液的制备方法，其特征通过以下步骤实现：(1)将脂质材料在55-100℃的水浴条件下熔融；(2)将磷脂、油酸、长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速置于液氮中冷却；(4)待完全冰冻后取出，于含有表面活性剂的水相中，水相pH2-5，组织捣碎机下捣碎，3000-30000rpm，5-60min，制备初级混悬液；(5)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质1-15次，即制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液，整个操作均在冰浴条件下进行。
5.根据权利要求1-3任一所述的长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液的制备方法，其特征通过以下步骤实现：(1)将处方量的脂质材料在60℃的水浴条件下熔融；(2)将处方量的磷脂、油酸、长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速置于液氮中冷却；(4)待完全冰冻后取出，用研钵研碎后分散在适量的含有表面活性剂和/或体系稳定成分的水相中，水相pH4；(5)组织捣碎机下捣碎，3000rpm，6000rpm，各15min，制备初级混悬液；(6)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质10次，即制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液，整个操作均在冰浴条件下进行。
6.根据权利要求1-3任一所述的长春瑞滨固体脂质纳米粒，其特征是：制剂形式为冻干制剂，制剂组成的重量百分比为：
长春瑞滨 1％～25％
脂质材料 30％～90％
磷脂 5％～50％
油酸 0％～20％
渗透调节剂 水相中浓度为0～20％
冻干保护剂 水相中浓度为0～20％
冻干支持剂 水相中浓度为0～20％。
7.根据权利要求6所述的长春瑞滨固体脂质纳米粒冻干制剂的制备方法，其特征是通过以下步骤实现：(1)将处方量的脂质材料在55-100℃的水浴条件下熔融；(2)将处方量的磷脂、油酸、长春瑞滨用乙醇溶解，然后滴加到熔融的脂质材料中；(3)在真空减压条件下完全除去乙醇后，迅速冷却；(4)于含有表面活性剂的水相中(pH2-5)，组织捣碎机下捣碎，3000-30000rpm，5-60min，制备初级混悬液；(5)将制好的初级混悬液转移至高压匀质机中，高压匀质1-15次，制成长春瑞滨固体脂质纳米粒混悬液，整个操作均在冰浴条件下进行；(6)除菌，加入冻干保护剂，冻干支持剂，冷冻干燥，灌装。
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