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CN101119797A - 液相色谱法 - Google Patents

液相色谱法 Download PDF

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CN101119797A
CN101119797A CNA2005800480756A CN200580048075A CN101119797A CN 101119797 A CN101119797 A CN 101119797A CN A2005800480756 A CNA2005800480756 A CN A2005800480756A CN 200580048075 A CN200580048075 A CN 200580048075A CN 101119797 A CN101119797 A CN 101119797A
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K·V·安德森
A·伯格
T·普勒斯
J·瓦西
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GE Healthcare Bio Sciences AB
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Abstract

本发明涉及一种通过连续液相色谱从粗细胞溶解产物中无磁提纯一种或多种目标细胞成分的方法，该方法包括：(a)将细胞溶解在容器中，提供粗细胞溶解产物；使由此得到的粗细胞溶解产物不经任何中间澄清便通过填有多孔颗粒色谱基质的色谱柱，以吸附目标成分，其中所述颗粒的表面存在载有金属离子的固定化次氮基三乙酸(NTA)配体；和通过洗脱回收目标成分。本发明还包括适合用于根据本发明的方法的色谱柱，该色谱柱填有粒径分布为45－165μm的多孔无磁颗粒，其中该柱的入口装置和出口装置具有孔大小为20－130μm的深层滤器元件。

Description

液相色谱法
技术领域
本发明涉及使用连续液相色谱提纯一种或多种细胞成分如蛋白和/或肽的方法。本发明还包括适用于根据本发明的方法的色谱柱，以及用于提纯一种或多种细胞成分的试剂盒。
背景技术
为研究用途以及为制备新型药物，蛋白、肽、核酸和其它生物化合物的制造中程度越来越高地使用了生物技术方法。由于色谱的多面性以及对化合物的敏感性，色谱常常是该背景下的优选提纯方法。术语色谱包括一系列密切相关的分离方法，这些方法均基于彼此不互溶的两相得以接触的原理。更具体地，将目标化合物引入流动相，其与固定相接触。然后目标化合物在其被亦称作色谱基质的色谱流动相所载通过系统时，将会经历一系列固定相和流动相之间的相互作用。相互作用利用了样品中成分的物理或化学性质的差异。
色谱法可以在不同操作模式下进行。最简单的方式是批量色谱，其中将流动相加入到含有固定相的容器中，使目标化合物和固定相之间相互作用一段时间；取出流动相；加入洗脱剂，释放出目标化合物。另一方面，在重力色谱中，将相对少量地流动相加入到含有固定相柱的顶部。通过打开柱下端地开口，重力使流动相穿过柱子，在此期间其与固定相相互作用。洗脱常常通过向顶部施以少量洗脱剂进行，再次重力使其通过柱子。由于操作方式的原因，重力色谱柱的端部不需要有分布装置，简单的漏斗便可以胜任。在流化床色谱中，其亦称作膨胀床吸收(EBA)，将液流泵入底部含有固定相的柱内，从而将固定相变为流化相，液体在顶部收取。为了改善流动性质，固定相包括相对较重的小珠，该小珠通常由聚合材料制成但包括致密的核，例如钢。EBA中所用的柱子没有填有固定相。最后，在连续液相色谱中，将基本连续的流动相的流体施以包括固定相的柱子的顶部。通过将液体泵过柱子，在吸收阶段中保持流速可控的连续相。当固定相中的目标化合物达到合适的负载时，将液流从流动相改变成洗脱剂，任选地进行一次或更多次中间洗涤，在柱的出口处从洗脱剂中回收目标馏分。洗脱剂常常包括梯度，例如盐或pH梯度。为了避免被大的污染物所污染，并在柱子当中保持有利的液体分布，入口通常装有滤器和机械液体分布器装置。最常见地，入口类似地存在有滤器和一些机械液体分布器装置。
在称为固定化金属离子吸附色谱(IMAC)的色谱提纯方法中，利用了目标化合物与存在于固定相上的金属螯合基团之间的相互作用IMAC也称作金属螯合亲和力色谱(MCAC)，其常用于提纯蛋白。IMAC背后的原理在于，许多种过渡金属离子可以经由氨基酸侧练上的给电子基团与含S基团和含N基团配合，例如，这些基团例如氨基酸组氨酸、半胱氨酸和色氨酸中所存在者。为了在色谱用途中采用该相互作用，金属离子必须固定化在不溶性承载体上。这可以通过将螯合基团连接在载体上实现。最重要的是，为能使用，所选金属对基质的亲和力必须大于对待提纯化合物的亲和力。合适的配合离子的例子有Cu(II)、Zn(II)、Ni(II)、Ca(II)、Co(II)、Mg(II)、Fe(III)，Al(III)、Ga(III)、Sc(III)等。已知多种螯合基团可以用于IMAC，例如三齿螯合剂亚氨基二乙酸(IDA)和四齿螯合剂次氮基三乙酸(NTA)。螯合基团通常称作配体，而不溶性承载体称作载体或基质。
近年来，IMAC已经成功地用于提纯重组蛋白和肽，其中引入组氨酸(His)标记以促进分离和提纯。当IMAC用于提纯重组蛋白时，在大多数常用方法中，细胞在第一步中溶解成游离蛋白，之后是离心和过滤，以出去细胞碎片和其它必然堵塞滤器和/或与配体不良吸附的残余物。随后将过滤的样品与结合缓冲液合并，加入至IMAC柱。
美国专利5,047,513(Dobeli)涉及适合于提纯蛋白、尤其是那些含有相邻组氨酸残基的蛋白的金属螯合树脂。所公开的蛋白提纯通过在下式定义的金属螯合物上对蛋白进行亲和力色谱而实现：
载体基质-连接基-NH--(CH2)x--CH(COOH)--N(CH2COO-)2Ni2+
因此，金属螯合亲和力配体为次氮基三乙酸衍生物，其通过使式R--HN--(CH2)X--CH(NH2)--COOH的N-端保护的化合物与溴乙酸在碱性介质中反应，随后切除保护基，其中R表示氨基保护基，x表示2、3或4。
市售的采用Dobeli金属螯合物树脂的高通量产品可获自Qiagen，其销售用于组氨酸标记蛋白的高通量、微量提纯和使用组氨酸-标记的多用途磁电捕获(magnetocapture)试验的Ni-NTA雌性琼脂糖小珠。在磁电捕获中，使用磁铁在除去上清液使保持孔中的颗粒。因此，与重力色谱方法不同，磁电捕获中不需要沉降，而且与连续色谱方法不同，没有穿过柱子的流体。产品可以单管或96-孔微板的形式提供，据称即使在粗细胞溶解产物的情况下也能实现有效的筛选。该产品的优势在于，其提纯3μg蛋白所用的体积可以非常小-少达10μl，这对高通量微量提纯是非常方便的。颗粒平均为50μm，但范围在20-70μm。
另一种IMAC市售产品由BD Biosciences Clontech出售，即BDTALONTM CellThru树脂，其载有钴而不是镍离子。推出BD TALONTMCellThru树脂是用于在膨胀床色谱中从非澄清细胞溶解物、超声或发酵液体来提取蛋白。BD TALONTM CellThru树脂在端板釉料具有190μm孔的标准色谱柱中包括范围在300-500μm的大的琼脂糖小珠。根据产品说明，由于小珠的尺寸大，细胞碎片在小珠之间流过柱子，同时可溶性产物与BD TALONTM CellThru树脂上的固定化离子结合。如上文指出，该系统中使用的配体是基于天冬氨酸的四齿配体，其载有钴(Co2+)。众所周知的是，尽管镍和钴均为过渡金属，它们在周期表中属于不同的族，因此组氨酸标记蛋白与充镍树脂的结合通常强于其与充钴树脂的结合因此，充钴树脂可以使用不太严格的洗脱条件。但是，当需要结合能力很高时，将优选结合更强。
WO 2004/099384(Kappel)涉及固相细胞溶解方法和捕获平台，更具体地，其包括开口、内部表面和至少一部分内部表面上的溶解试剂涂层。涂层中溶解试剂的量足以在含有宿主细胞的液体悬浮液引入容器时形成能够溶解宿主细胞的溶解溶液。配体位于容器的底部和/或侧壁上，或者位于额外的载体如小珠或筛网上。据称多种提纯技术可以用于该容器，例如金属螯合色谱；免疫捕获系统；谷胱甘肽-S-转移酶(GST)捕获和生物素-抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素捕获系统。所称优势在于，所公开的系统免除了对离心细胞溶液以除去不溶物质、吸入额外的清洁剂溶解液体或酶抑制剂、或者进行后续提纯步骤的需求。WO 2004/099384的主题是提供一种方法，其在高通量应用中尤其有优势。WO 2004/099384的方法代表了批次色谱。众所周知的是，例如，关于连续色谱中相对经常出现的滤器堵塞或类似情况的风险，批次色谱对设备的要求较少，连续色谱中样品通过色谱基质。但是，连续色谱对于大规模操作通常是优选的，因为它使操作时间减少，载量增加。
最后，Wlad等人(Hanna Wlad，Andras Ballagi，Lamine Bouakaz，Zhenyu Gu和Jan-Christer Janson：″Rapid Two-StepPurification of a Recombinant Mouse Fab Fragment Expressed inEscherichia coli″in Protein Expression and Purification 22，325-329(2001))报道了对烟草花叶病毒有特异性的重组Fab片断(Fab57P)的大规模提纯方法。重组Fab片断通过以下方法提纯：使用APV Gaulin匀浆器破坏细菌两次；粗大肠杆菌匀浆不经离心直接在填有SP SepharoseTM Big小珠的柱子上进行阳离子交换色谱；通过填有结合抗原肽的Sepharose 6B的柱子的亲核吸附进行进一步提纯。
然而，尽管有上述方法，本领域仍然需要有另外的方法用于蛋白和/或肽的提纯，上述方法可以处理更大量的样品，并且结合能力得到提高。
发明内容
本发明的第一个方面是提供一种新的从粗细胞溶解产物中分离细胞成分如蛋白和/或肽的方法。该方法最常用于得到经提纯的所需组分，但它也可用于从所需液体中除去一种或多种细胞成分。
本发明的另一个方面是一种用于分离细胞成分，例如，从粗细胞溶解产物中捕获蛋白和/或肽，的液相色谱法，该方法提供的纯度高于现有技术的方法。这可以通过所附权利中所定义的方法实现，其提供了得到改善的对细胞成分的分离。
本发明的一个特定方面是提供这样一种方法，其适合于大规模操作，例如制备提纯。这可以通过所附权利要求中定义的方法实现，其提供的结合能力得到提高。
本发明的第二个方面是提供一种适合于从粗细胞溶解产物中提纯细胞成分如蛋白和/或多肽的填充色谱柱。
本发明的特定方面是提供上述的色谱柱，其能在不产生过高背压的情况下从粗细胞溶解产物中提纯细胞成分如蛋白和/或肽。
从从下文的描述和权利要求中，将产生本发明的其它方面和优势。
附图说明
图1说明了通过在1ml的柱管体积中进行分布洗脱来提纯蛋白，如实施例1中所述。
图2A说明了通过在5ml柱管体积中进行分布洗脱来提纯蛋白，如实施例2中所述。
图2B说明了如实施例1和2中所述进行的SDS-PAGE分析。洗脱库中的主要谱带是GFP-His单体和GFP-His二聚体。
图3A显示了通过梯度洗脱提纯蛋白，如实施例3中所解释。从色谱中看出，目标蛋白在50-65ml处洗脱。
图3B显示了所进行的SDS-PAGE分析，如实施例3中所解释。洗脱库中的主要谱带是GFP-His单体和GFP-His二聚体。
具体实施方式
定义
术语“粗”是指未经澄清。
术语“树脂”在本文中是指固定相，与诸如“基质”或“色谱基质”的其它常用术语可互换地使用。
本文所用术语“吸附”是目标成分与填有金属离子地配体的连接(结合)。
术语“无磁提纯”是指在方法的任何阶段中均不利用磁相互作用将颗粒保留在色谱柱上，而且处理液体如流动相和洗脱剂在不受任何实质磁影响的条件下通过柱子。术语“无磁颗粒”是指通常由聚合材料制成的颗粒，其上不添加磁性组分。
术语“肽”用于包括任何肽，例如单肽、二肽、寡肽和多肽。
发明详述
在第一个方面，本发明涉及通过连续液相色谱从粗细胞溶解产物中无磁提纯一种或多种目标细胞成分的方法，该方法包括
(a)将细胞溶解在容器中，提供粗细胞溶解产物；
(b)使由此得到的粗细胞溶解产物通过填有多孔颗粒色谱基质的色谱柱，以吸附目标成分，其中颗粒表面存在载有选自Ni2+离子、Cu2+离子和Zn2+离子的一种或多种金属离子的固定化次氮基三乙酸(NTA)配体；和，任选地，
(c)通过使基质与释放吸附组分的洗脱缓冲液接触，回收目标成分。
在有利的实施方式中，使粗细胞溶解产物不经任何中间澄清便通过色谱柱。含有细胞的液体如发酵肉汤的化学和机械溶解使本领域公知的。化学溶解可以用任何溶解试剂进行，例如洗涤剂、溶解酶或离液剂。在有利的实施方式中，(a)中所用的溶解试剂是酶。在具体实施方式中，化学溶解通过在适当条件下加入适当良的溶解酶来实现。机械溶解也是本领域公知的，通常使用的方法包括超声、弗氏细胞压碎器、匀浆、研磨和冻融溶解。正如本领域技术人员将会认识到，机械溶解的时间应当设置成足够长，以避免下游处理中堵塞滤器，但也要足够短，以避免目标蛋白和/或肽的变形。在一个实施方式中，(a)包括化学溶解和溶解两者。化学溶解之后通过任何公知方法如超声进行机械溶解。在本方法的最佳实施方式中，(a)包括加入溶解酶，然后进行超声。
在本方法中，然后直接将粗细胞溶解产物不经中间澄清便装入色谱柱。因此，本发明的有时在于，可以不经通常使用的离心、过滤和/或沉降将粗细胞溶解产物应用于色谱柱。本发明表明，当使用未澄清的溶解产物时，可以得到等效的蛋白库(protein pool)体积、收率和纯度。除就整体成本而言处理时间减少的优异效果之外，免除常规使用的离心过滤步骤还包括例如目标蛋白降解减少的益处。即使现有技术中已经使用IMAC来提纯粗蛋白溶解产物，本发明首次表明连续IMAC法可以直接应用于粗细胞溶解产物，而不采用任何促进分离的磁分离原理，并且不产生影响提纯的大的背压。这是相当出乎意料的，因为人们本来预计细胞碎片和类似物质会堵塞滤器和/或损坏色谱基质的性能。
如公知，加入样品之前色谱基质通常用合适的结合缓冲液平衡。在该情况下，样品是粗蛋白溶解产物，其优选与结合缓冲液混合，以得到合适地吸附(结合)条件。因而，在一个实施方式中，在(a)中，溶解产物与结合缓冲液混合，以提供pH合适的流动相。说明性的结合缓冲液含有尿素和胍。所用体积取决于处理的规模，但在任何情况下均在100-200ml的范围之内。在一个实施方式中，本发明以分析规模进行，流动相体积则至多50ml，例如1-50ml，如1ml或5ml。
如上所述，本方法优势在于，可以得到出人意料地高的蛋白结合容量。因而，在一个实施方式中，蛋白容量为至少20mg蛋白/ml色谱基质，例如，至少30mg蛋白/ml色谱基质，优选至少40mg/ml色谱基质。但本领域技术人员应理解的是，结合容量取决于所结合成分的性质，例如蛋白和/或肽的性质，因此上述数字仅仅作为通常的例子。
如公知，结合容量高是大规模操作的必要条件，以提供经济的处理。因而，根据本发明得到的格外高的结合容量使该方法适合于制备提纯。因此，在一个实施方式中，本方法使制备方法。因而，在另外可选的实施方式中，方法以大规模进行，即，进行制备处理，流动相的体积则通常在数升直至成千上万升的范围内，例如约20-20 000升，如约10 000升。
如上述，颗粒表面上存在的金属螯合亲和力配体包括四齿的亚氮基乙酸(NTA)。在一个实施方式中，NTA配体载有Ni2+离子。NTA配体是本领域公知的，例如，参见US4,877,830(Dbeli)。在一个实施方式中，金属螯合NTA配体已经经由硫醚连接固定在多孔颗粒上，例如，参见US 6,623,655(Kappel)。本发明还包括其中颗粒表面存在例如三齿、其它四齿或五齿的其它金属螯合基团的实施方式。这些其它配体可以使用任何公知的化学方法固定化在颗粒上，例如通过醚、胺或酰胺。金属螯合基团可以载有任何公知的螯合金属，例如上文背景技术中所列举者。
在一个实施方式中，多孔颗粒的粒径在45-400μm的范围之内，更具体地为70-200μm，例如90-150μm。但是，取决于颗粒基质的制备方式，其粒径分布可以变化，因此，通常采用的方式是通过范围定义，其中可找到特定部分的颗粒直径。因此，在本发明的一个实施方式中，多孔颗粒的孔分布为45-165μm，其是指至少80％、优选至少95％的颗粒在该范围之内。在另外可选的实施方式中，至少80％、优选至少95％的颗粒在10-45μm的范围之内。在另一个可选的实施方式中，至少80％、优选至少95％的颗粒在165-400μm的范围之内。本领域技术人员将认识到，本发明的色谱基质粒径的选择决定于所用的设备，特别是色谱柱的滤器。但是，本方法也可以另外可选地使用较小的颗粒进行，其取决于所用的柱子。在该意义上，应当理解到本文所用的术语“颗粒表面”是指颗粒的外表面以及其孔表面。多孔颗粒可以由任何有机或无机聚合物制成。
因此，在一个实施方式中，聚合物颗粒由天然有机聚合物制成，例如碳水化合物，优选交联碳水化合物材料，例如琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、konjac、交叉菜胶、gellan、藻酸盐等。本发明中使用的颗粒可以很容易地根据标准方法制备，例如通过反向悬液凝胶化(S Hjerten：Biochim Biophys Acta 79(2)，393-398(1964))。另外可选地，颗粒可以是市售产品，例如SepharoseTM FF(Amersham Biosciences AB，Uppsala，Sweden)。
在另一个实施方式中，聚合物颗粒可以由合成的有机聚合物制成，优选交联的合成聚合物，例如苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯、乙烯基酰胺等。这些颗粒可以很容易地根据标准方法合成，例如，参见“Styrene basedpolymer supports  developed by suspension polymerization(悬浮聚合产生的苯乙烯基聚合物载体)”(R Arshady：Chimica eL′Industria 70(9)，70-75(1988))。另外可选地，该方法中可以使用市售产品，例如SourceTM(Amersham Biosciences AB，Uppsala，Sweden)。
在另一实施方式中，颗粒由无机颗粒制成，例如二氧化硅或陶瓷，例如羟基磷灰石。
在有利的实施方式中，色谱柱以单次使用的形式提供。在该意义上，术语“单次使用”理解成使用一次或使用次数非常有限，有时称之为“一次性”柱子。因此，在具体的实施方式中，填充色谱柱以无菌或基本无菌的形式提供。这种无菌色谱柱有利地应用于医疗或诊断工业。通过将无菌或除菌样品应用于根据本发明的无菌柱，可以避免后续的无菌过滤，这对于某些较大的蛋白是特别有利的，例如，其难以进行无菌过滤。因此，本方法的一个实施方式是提纯目标细胞成分地方法，其包括在使粗细胞溶解产物通过之前对填充柱进行灭菌。另外可选地，将色谱基质和柱子分别灭菌，在无菌条件下将基质装柱。
IMAC的洗脱通常根据本领域的标准方案进行，其通常涉及加入包括咪唑、还优选尿素和胍的洗脱缓冲液。另外可选地，通过降低pH进行洗脱。洗脱缓冲液可以作为连续或分布的pH梯度加入。这种梯度洗脱至少可以用于指定处理的洗脱条件优化，一旦确立该条件后，可以在(c)中加入pH最优的洗脱缓冲液。
粗溶解产物来源的细胞可以是任何原核或真核细胞，例如细菌、酵母等。目标化合物可以是任何细胞成分，例如多肽、蛋白、蛋白片断、DNA、RNA、其它核苷酸序列、碳水化合物、脂、甾醇或激酶。在本方法的一个实施方式汇总，至少一种目标成分是蛋白，在最佳实施方式汇总，蛋白用1个、2个或更多个优选相邻的组氨酸残基标记。因此，细胞优选为表达组氨酸标记的蛋白或肽的重组细胞。组氨酸标记蛋白的制备是本领域人员公知的，如上文背景技术部分所讨论。在任何情况下目标蛋白的大小可以是10000-200000 Da。在本发明一个有利的实施方式中，至少一种目标化合物是肽，优选组氨酸标记肽。
本发明的另一个方面是一种提纯目标细胞成分的方法，其包括：
(a)使用上述方法提纯目标成分；
(b)冲洗色谱基质；
(c)使用上述方法提纯目标成分；其中(b)-(c)重复至多10次。这种冲洗通常通过使缓冲液例如500mM咪唑通过填充柱进行，以除去残余物和松散结合的成分。
在一个实施方式中，本发明的该方面是一种提纯目标细胞成分的方法，其包括：
(a)使用上述方法提纯目标成分；
(b)溶出(stripping)色谱基质的金属离子；
(c)对色谱基质进行原地清洗(cip)；
(d)将色谱基质重新载有金属离子；和
(e)使用上述方法提纯目标成分；其中(b)-(e)重复至多30次。
柱子的溶出可以，例如，用pH 7.4的包括磷酸钠、NaCl和EDTA的溶出缓冲液进行。
(c)的cip可以根据任何公知原理进行，其通常取决于色谱基质的性质。说明性例子有，多糖基质用1M NaOH原地清洗，使用时间为1-2小时。Cip将会除去，例如，沉淀的蛋白、疏水结合的蛋白和脂蛋白。cip还可以包括反向流动。如本领域所公知，应当取决于特定系统何时表现出背压增加来决定cip循环的次数。说明性的方法可以包括，例如，至多300个cip步骤。
对于镍螯合基质，例如，重载通过将蒸馏水中的NiSO4装入柱子进行。
在本发明有利的实施方式中，尤其是对于大规模处理，(b)的溶出之前是冲洗，冲洗之后继续提纯至少一次。冲洗可以通过任何合适的缓冲液，例如上述的缓冲液。各次cip之间的冲洗-提纯循环次数将根据具体情况而变化，但本领域技术人员可以很容易地确定合适的次数，作为说明性的例子，为5-10次。
本发明的另一个方面是由如下柱管(column tube)构成的液相色谱柱，上述柱管具有基本上相对的两端处的液流入口装置和液流出口装置，其中柱管填有色谱基质，其中柱具有位置相邻于所述入口和出口装置的分布器装置，其特征在于，该色谱基质包括大小分布为45-165μm的多孔无磁颗粒；并且颗粒表面存在固定化的配体；并且相邻于出口分布器装置处是孔径分布为20-130μm的深层滤器(deep filter)元件。
颗粒可以是任何上述的材料，并且粒径在所定义的范围之内。而且，颗粒可以包括任何种类的配体，例如，离子交换配体、疏水相互作用色谱(HIC)配体、反向色谱(RPC)配体、亲和配体，或固定化的金属亲和配体(IMAC)，或多模式配体，例如，双模阳离子交换体或双模阴离子交换体。
因此，在一个实施方式中，本发明的柱子包括具有免疫球蛋白结合配体如蛋白A的多孔颗粒。市售的这种基质的说明性例子有MabSelectTM系列，例如MabSelectTM Xtra和MabSelectTM Sure(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)，这些颗粒是高度耐流动(flow resistant)的。因此，在具体的实施方式中，颗粒如US6,602,990(Berg)中所述制备，在此将该专利并入本文作为参考。另一种市售基质为CaptoTM系列，例如CaptoQ(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)。该实施方式在大规模运行时尤其有利。
另一种根据本发明的柱子中存在的合适色谱基质的说明性例子为金属螯合基质，例如IDA或NTA。市售NTA基质的例子为NiSepharoseTM FF(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)或HisSelectTM(Sigma-Aldrich)。
因此，本发明该方面的具体实施方式是由如下柱管(column tube)构成的液相色谱柱，上述柱管具有基本上相对的两端处的液流入口装置和液流出口装置，其中柱管填有色谱基质，其中柱具有位置相邻于所述入口和出口装置的分布器装置，其特征在于，该色谱基质包括大小分布为45-165μm的多孔无磁颗粒；并且颗粒表面存在固定化的亚氮基乙酸(NTA)配体；并且相邻于出口分布器装置处是孔径分布为20-130μm的深层滤器元件。
NTA配体可以载有任何金属离子，例如上文背景技术部分中所列举者，优选载有一种或多种选自Ni2+离子、Cu2+离子和Zn2+离子的金属离子。在有利的实施方式中，NTA配体已经载有Ni2+离子。在有利的实施方式中，NTA配体已经通过硫醚连接固定化在多孔颗粒上。配体的固定化在上文中从本发明第一个方面的角度进行了讨论。
在一个实施方式中，多孔颗粒的平均粒径为45-400μm，更具体地，为70-200μm，例如90-150μm。在具体实施方式中，多孔颗粒的平均粒径大约为90μm。但取决于颗粒基质的制备方式，其大小分布可以变化，因而，通常采用的方式是通过范围定义，其中可找到特定部分的颗粒直径。因此，在本发明的一个实施方式中，多孔颗粒的孔分布为45-165μm，其是指至少80％、优选至少95％的颗粒在该范围之内。
本发明色谱柱的深层滤器元件有市售，例如，可获自Basell。分布器装置也可购得，本领域技术人员可以很容易地提供构成根据本发明的柱子的部件。柱管可以由任何适当的公知材料制成，例如玻璃或塑料材料。
在一个实施方式中，本发明的柱子具有分析规模的柱管体积，如上文中所详述。
在本发明柱子的一个实施方式中，柱管体积适合于蛋白和/或肽的制备提纯，如上文中所详述。
本发明还涉及包括至少两个上述色谱柱的多孔板。多孔板的格式是本领域公知的，技术人员很容易根据本发明及该领域常识的教导制备这样的板。
多孔板的有利实施方式是蛋白和/或肽提纯的自动系统，其包括至少一块根据本发明的板。本发明特别适合于自动化，因为它是一种连续方法，包括的处理步骤比现有技术要少。技术人员可以很容易地对本方法进行自动化并/或根据本发明及该领域常识的教导将其改造成多孔格式。
本发明还包括根据本发明的柱子在上述方法中的应用。因此，该方面的细节可以参见上文的详述部分。但是，本发明的应用的有利的离子是用于制备基于蛋白的药物或诊断剂，特别是用于迅速发展的个体化(personalised)药物领域。本发明在个体化医药中的另一用途是使用该方法诊断患者。在该实施方式中，该方法定量地用于鉴别，例如通过将其直接从自粗细胞溶解产物中与本文所公开的色谱基质结合来诊断目标细胞成分的存在。
最后，本发明还包括一种试剂盒，其在单独的小室内包括根据本发明的柱子；一种或多种选自Ni2+离子、Cu2+离子和Zn2+离子的金属离子；和至少一种缓冲液。在一个试剂盒实施方式中，一种缓冲液是包括尿素或胍的结合缓冲液。根据本发明的柱子、色谱基质和其它细节可以如上文所讨论。因此，在一个实施方式中，试剂盒包括一次性色谱柱。
试剂盒还可以包括额外的用于柱子的装置，例如金属接口、管连接件、和盖螺母。在另一个实施方式中，一种缓冲液为包括咪唑的洗脱缓冲液。在有利的实施方式中，试剂盒包括书面的说明书，优选地对从粗细胞溶解产物中提取蛋白和/或肽进行说明。
附图详述
图1说明通过如实施例1所述进行的分布洗脱来提纯蛋白。结合缓冲液中和样品中的咪唑浓度为45mM，以得到纯的目标蛋白，即，减少污染的大肠杆菌蛋白的结合。目标蛋白在大约130ml下洗脱(线性吸收范围以上，＜2000mAU)。蓝色的线(上方)表示280nm处的吸收，而棕色的线(下方)表示加样过程中的压力。
图2A说明通过如实施例2所述进行的分布洗脱来提纯蛋白。结合缓冲液中和样品中的咪唑浓度为45mM，以得到纯的目标蛋白，即，减少污染的大肠杆菌蛋白的结合。目标蛋白在大约130ml下洗脱(线性吸收范围以上，＜2000mAU)。蓝色的线(上方)表示280nm处的吸收，而棕色的线(下方)表示加样过程中的压力。
图2B说明了如实施例1和2中所述进行的SDS-PAGE分析。在所示的凝胶中，条带1：LMW；条带2：起始物质；条带3：流过柱子，实施例1；条带4：流过，实施例2；条带5：冲洗，实施例1；条带6：冲洗，实施例2；条带7：洗脱库(eluted pool)，实施例1；条带8：洗脱库，实施例2。洗脱库中的主要条带为GFP-His单体和GFP-His二聚体。
图3A说明通过如实施例3所述进行的梯度洗脱来提纯蛋白。从色谱图中可以看出，目标蛋白在50-65ml下洗脱。洗脱由490nm处的吸收(对目标蛋白的特异性更强)指示。之前的封含有污染的大肠杆菌蛋白。蓝色的线表示280nm处的吸收；红色线表示490nm处的吸收，棕色线表示加样过程中的压力。
图3B说明了如实施例3中所述进行的SDS-PAGE分析。在所示的凝胶中，条带1：LMW；条带2：起始物质；条带3：流过；条带4：洗脱库。洗脱库中的主要条带为GFP-His单体和GFP-His二聚体。
实验部分
以下实施例的提供仅用于进行说明，不应视为对所附权利要求定义的本发明进行限定。在此将以下和本发明说明书别处的所有参考文献并入作为参考。
材料和方法
色谱管由PP Moplen HP 400R(Basell)制成；设置有常规装置，获自PIAB(56110890和56110889)；Frohe AB(56324771，72，73，74)；Silva Plastic Center AB(56104640和56102939)；和MicroPlastAB(56320264)。实施例1和3：高度25.2mm，直径7.2mm。实施例2：高度25.2mm，直径16.2mm。深层滤器元件为Vyon F，材料HDPE，孔径25-127μm(PIAB)。
色谱柱使用标准填充法填有Ni SepharoseTM HP(AmershamBiosci-ences，Sweden)。
实施例1：使用分布洗脱提纯绿色荧光蛋白
该实验中的柱体积为1ml。样品体积为100ml，样品载量为20mg。样品是未经澄清的大肠杆菌BL-21溶解产物中的组氨酸标记绿色荧光蛋白GFP-(His)6。
GFP-(His)6的理论分子量Mr为28197，pI6.1。克隆获自Dr.David Drew，Stockholm University。
根据标准方法在添加葡萄糖的包括100μg/ml羧苄青霉素和25μg/ml氯霉素的培养基中进行发酵(大肠杆菌BL21[DE3]细胞)，在4小时内以IPTG 0.8mM诱导至OD600约为25。将细胞均化，部分提纯，得到GFP-His推测浓度约12mg/ml的制剂。
将部分提纯的GFP-(His)6刺入(加入)由5ml结合缓冲液/克细胞糊剂组成的来自非转化大肠杆菌BL 21的提取物中。样品中的最终GFP-(His)6浓度为0.2mg/ml。
通过加入0.2mg/ml溶解酶、20μg/ml DNAse和1mM MgCl2(最终浓度)来进行酶溶解。加入蛋白酶抑制剂PefablocTM SC，使最终浓度为1mM。在室温下搅拌30分钟进行溶解。最后对样品进行匀浆，将pH调节至pH7.4。
流动相包括结合缓冲液：45mM咪唑、0.5M氯化钠、20mM磷酸钠，pH 7.4。
洗脱用以下洗脱缓冲液进行：500mM咪唑、0.5M氯化钠、20mM磷酸钠，pH 7.4。
色谱系统：KTATM Explorer 10(Amersham Biosciences，Sweden)
流速：1ml/min。
色谱方法：
平衡：5倍柱体积(CV)的结合缓冲液
加样：100ml样品
冲洗未结合的蛋白：20CV结合缓冲液
洗脱：10CV洗脱缓冲液
产生的色谱图显示于图1。
使用非还原SDS-PAGE分析来自色谱的峰，并根据ExcelGel SDS(#80-1310-00)的说明书进行。使用梯度凝胶8-18％。将样品与2x样品缓冲液(未还原)1∶1混合，在95℃下加热5分钟。将20μl样品混合物应用于凝胶上的纸片。电源限幅设置：600V，50mA，30W。凝胶用Coomassie染色。
产生的凝胶显示于图2B，还有对根据实施例1得到的色谱峰的分析。
实施例2：使用分布洗脱提纯绿色荧光蛋白
该实验中的柱体积为5ml。样品体积为500ml，样品载量为100mg。样品是未经澄清的大肠杆菌BL-21溶解产物中的组氨酸标记绿色荧光蛋白GFP-(His)6。
GFP-(His)6的理论分子量Mr为28197，pI6.1。克隆获自Dr.David Drew，Stockholm University。
根据标准方法在添加葡萄糖的包括100μg/ml羧苄青霉素和25μg/ml氯霉素的培养基中进行发酵(大肠杆菌BL21[DE3]细胞)，在4小时内以IPTG 0.8mM诱导至OD600约为25。将细胞均化，部分提纯，得到GFP-His推测浓度约12mg/ml的制剂。
将部分提纯的GFP-(His)6刺入(加入)由5ml结合缓冲液/克细胞糊剂组成的来自非转化大肠杆菌BL 21的提取物中。样品中的最终GFP-(His)6浓度为0.2mg/ml。
通过加入0.2mg/ml溶解酶、20μg/ml DNAse和1mM MgCl2(最终浓度)来进行酶溶解。加入蛋白酶抑制剂PefablocTM SC，使最终浓度为1mM。在室温下搅拌30分钟进行溶解。最后对样品进行匀浆，将pH调节至pH7.4。
流动相包括结合缓冲液：45mM咪唑、0.5M氯化钠、20mM磷酸钠，pH7.4。
洗脱用以下洗脱缓冲液进行：500mM咪唑、0.5M氯化钠、20mM磷酸钠，pH7.4。
色谱系统：KTATM Explorer 10(Amer sham Biosciences，Sweden)
流速：5ml/min。
色谱方法：
平衡：5倍柱体积(CV)的结合缓冲液
加样：100ml样品
冲洗未结合的蛋白：20CV结合缓冲液
洗脱：10CV洗脱缓冲液
产生的色谱图显示于图2A。
使用非还原SDS-PAGE分析来自色谱的峰，并根据ExcelGel SDS(#80-1310-00)的说明书进行。使用的梯度凝胶8-18％。将样品与2x样品缓冲液(未还原)1∶1混合，在95℃下加热5分钟。将20μl样品混合物应用于凝胶上的纸片。电源限幅设置：600V，50mA，30W。凝胶用Coomassie染色。
产生的凝胶显示于图2B，还有对根据实施例1得到的色谱峰的分析。
实施例3：梯度洗脱
该实验中的柱体积为1ml。样品体积为36ml，样品载量为36mg。样品是未经澄清的大肠杆菌BL-21溶解产物中的组氨酸标记绿色荧光蛋白(GFP-(His)6)。
GFP-(His)6的理论分子量Mr为28197，pI6.1。克隆获自Dr.David Drew，Stockholm University。根据标准方法在添加葡萄糖的包括100μg/ml羧苄青霉素和25μg/ml氯霉素的培养基中进行发酵(大肠杆菌BL21[DE3]细胞)，在4小时内以IPTG 0.8mM诱导至OD600约为25。将细胞均化，部分提纯，得到GFP-His推测浓度约12mg/ml的制剂。将部分提纯的GFP-(His)6刺入(加入)由5ml结合缓冲液/克细胞糊剂组成的来自非转化大肠杆菌BL21的提取物中。样品中的最终GFP-(His)6浓度为1.0mg/ml。
通过加入0.2mg/ml溶解酶、20μg/ml DNAse和1mM MgCl2(最终浓度)来进行酶溶解。加入蛋白酶抑制剂PefablocTM SC，使最终浓度为1mM。在室温下搅拌30分钟进行溶解。最后对样品进行匀浆，将pH调节至pH7.4。
流动相包括结合缓冲液：5mM咪唑、0.5M氯化钠、20mM磷酸钠，pH7.4。
洗脱用以下洗脱缓冲液进行：500mM咪唑、0.5M氯化钠、20mM磷酸钠，pH7.4。
色谱系统：KT ATM Explorer 100(Amersham Biosciences，Sweden)
流速：1ml/min。
色谱方法：
平衡：5倍柱体积(CV)的结合缓冲液
加样：36ml样品
冲洗未结合的蛋白：10CV结合缓冲液
梯度洗脱：20CV 1-50％洗脱缓冲液(5-250mM咪唑)
产生的色谱图显示于图3A和B。
使用非还原SDS-PAGE分析上述得到的色谱的峰。根据ExcelGelSDS(#80-1310-00)的说明书进行SDS-PAGE分析。使用的梯度凝胶8-18％。将样品与2x样品缓冲液(未还原)1∶1混合，在95℃下加热5分钟。将20μl样品混合物应用于凝胶上的纸片。电源限幅设置：600V，50mA，30W。凝胶用Coomassie染色。

Claims (15)

1.一种通过连续液相色谱从粗细胞溶解产物中无磁提纯一种或多种目标细胞成分的方法，所述方法包括
(a)将细胞溶解在容器中，提供粗细胞溶解产物；
(b)使由此得到的粗细胞溶解产物通过填有多孔颗粒色谱基质的色谱柱，以吸附所述的目标成分，其中所述颗粒的表面存在载有选自Ni2+离子、Cu2+离子和Zn2+离子的一种或多种金属离子的固定化次氮基三乙酸(NTA)配体；和，任选地，
(c)通过使所述基质与释放吸附组分的洗脱缓冲液接触，回收所述的目标成分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中(a)的溶解包括化学溶解。
3.根据权利要求1所述的方法，其中(a)的溶解包括机械溶解。
4.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中(a)的溶解包括化学溶解和之后的机械溶解。
5.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的目标成分是蛋白和/或肽。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的蛋白/肽用至少一个组氨酸残基标记。
7.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述色谱基质的结合容量为至少约30mg蛋白/ml基质，优选至少约40mg蛋白/ml色谱基质。
8.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其使用制备规模的体积和流速进行。
9.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其使用分析规模的体积和流速进行。
10.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的NTA配体已经通过硫醚连接固定化在所述的多孔颗粒上。
11.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述的NTA配体载有Ni2+离子。
12.根据前述权利要求中任意一项所述的方法，其中所述颗粒的大小分布为45-165μm。
13.一种提纯目标细胞成分的方法，其包括：
(a)使用根据前述权利要求中任意一项所述的方法提纯目标成分；
(b)冲洗所述色谱基质；
(c)使用根据前述权利要求中任意一项所述的方法提纯目标成分；
其中(b)-(c)重复至多10次。
14.一种提纯目标细胞成分的方法，其包括：
(a)使用根据权利要求1-12中任意一项所述的方法提纯目标成分；
(b)溶出所述色谱基质上的Ni2+离子；
(c)对所述色谱基质进行原地清洗(cip)；
(d)将所述色谱基质重新载有Ni2+离子；和
(e)使用根据权利要求1-12中任意一项所述的方法提纯目标成分；
其中(b)-(e)重复至多30次。
15.根据权利要求14所述的方法，其中(b)的溶出之前是冲洗，所述冲洗之后继续提纯至少一次。
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