CN101080638A

CN101080638A - Cop1分子及其用途

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Publication number: CN101080638A
Application number: CNA2004800446163A
Authority: CN
Inventors: 戴维·多南; 多萝西·弗伦奇; 维什瓦·迪克西特
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2004-10-14
Filing date: 2004-10-14
Publication date: 2007-11-28
Also published as: US7785815B2; AU2010219438A1; AU2004324176A1; NZ554438A; IL211255A0; EP1802978A1; CA2584197A1; EP2302388A1; ATE534905T1; IL182500A0; JP2008517266A; US20080009458A1; EP1802978B1; WO2006043938A1; AU2004324176B2; US20110045474A1; JP4678882B2; MX2007004342A

Abstract

本发明提供了在各种癌症中检测COP1过量表达的诊断、预后和治疗用途。所述方法和用途进一步包括检测p53表达。本发明还提供了用于筛选干扰COP1和p53结合的测试化合物的试剂和试剂盒。

Description

COP1分子及其用途

发明领域

本发明涉及癌症诊断和治疗领域。

发明背景

p53作为传统肿瘤抑制物起作用这一点已经得到了人们的确认。¹生物化学上，p53作为应激活化的序列特异性转录因子起作用，其激活从带有p53共有结合位点的启动子的转录。²此外，p53也作为强力的转录抑制物起作用，从而增加了另一层的基因调节。³因而，它保护细胞免于各种应激信号，例如DNA损伤、核苷酸耗尽和癌基因活化，举几个例子，通过除了抑制涉及血管生成、抗细胞凋亡和细胞周期进展的基因之外，激活涉及细胞周期延滞、细胞凋亡和DNA修复的主要基因(a cadre of genes)的转录。p53的生理学的后果主要引起生长延滞或细胞凋亡，从而防止细胞复制遗传受损的基因组。

p53是在某些、如果不是全部的癌症中被负调节或突变的强力的肿瘤抑制物蛋白^26，27。p53基因中的高频率的改变，或p53途径的失调节的元件，在人类恶性肿瘤中强调了p53完整性对于防止癌发生的重要性。根据对6月龄发展自发肿瘤的p53敲除小鼠的观测进一步证实了这一点。⁴在癌症中p53基因改变的实际频率估计为20-80％。广泛的变异可以归因于肿瘤起源的组织、检测方法和/或被分析的基因的区域。例如，在乳腺肿瘤中，基因改变的估计频率是约20％，而这个频率在小细胞肺癌中显著地提高到＞70％。^5，6卵巢肿瘤一般具有野生型p53基因²⁸。

通过蛋白酶体依赖性途径通过对E3连接酶例如Pirh2⁷和MDM2^8-10的底物识别，p53在未应激的细胞中快速地翻转，所述E3连接酶将遍在蛋白从E2酶例如UbcH5b转移到多赖氨酸残基上的底物、或底物结合的遍在蛋白上，来产生多聚遍在蛋白链。一旦K48连接的多聚遍在蛋白链长度达到4或更高，底物则被蛋白酶体的组件例如hRad23a¹¹识别，将底物靶向降解。因而，MDM2²⁵和Pirh2⁷是p53的阴性调节物。Pirh2和MDM2是p53可诱导的基因^7，12，13，从而产生负反馈环路，这可以被采用来关闭p53反应并容许细胞周期进展。

Arabidopsis thaliana COP1是含有RING指的蛋白，其起作用来抑制植物光形态发生。AtCOP1通过负调节光介导的基因表达¹⁴来控制播种发育，微阵列分析显示，AtCOP1调节了大多数，如果不是所有的光应答的基因^15，16。通过显示了代表了黑暗中的光生长植物的表型的、COP/DET/FUS蛋白的丧失功能的突变体，例示了这一点¹⁷。在机制上，这归因于AtCOP1抑制光介导发育的正调节物例如LAF1¹⁸和HY5¹⁹的能力。COP1在体外具有天然的E3连接酶活性^29，30，并可以利用LAF1作为底物。虽然COP1是植物中重要的光介导的发育开关，它在哺乳动物细胞中的作为没有得到很好地确定²⁰。

发明概述

本发明涉及在受试者中诊断癌症的方法，所述方法包括检测所述受试者癌中的COP1水平或活性。在进一步的实施方式中，所述诊断方法包括检测所述受试者的癌中的p53水平或活性。在一个实施方式中，所述检测的p53分子是野生型p53分子。在另一个实施方式中，所述p53分子是人类p53分子。在另一个实施方式中，所述p53分子使用特异性结合p53的抗体来检测。在所述诊断方法的进一步的实施方式中，所述癌症中的所述p53的核酸序列被测序。在另一个实施方式中，通过使用p53活性分析来检测所述p53分子，所述p53活性分析选自下组中至少之一：p53依赖性反式激活的抑制作用、p53诱导的细胞凋亡的抑制作用、p21mRNA水平的降低。

根据另一个实施方式，所述诊断方法包括检测所述样品中p21分子的步骤。根据另一个实施方式，所述被诊断的受试者是人类。根据又一个实施方式，所述被诊断的癌症选自下组中至少之一：乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌和移行细胞癌(transitional cell cancer)。根据又一个实施方式，所述被诊断的癌症选自由浆液腺癌、子宫内膜腺癌、明细胞腺癌和粘蛋白腺癌构成的组。

本发明涉及在受试者中监视癌症治疗的效力或评估癌症治疗的预后的方法，所述方法包括检测来自所述受试者的样品中的COP1分子，其中相对于对照所述COP1分子的过量表达方面的降低表明所述癌症治疗是有效的。

在一个实施方式中，所述方法进一步包括检测所述样品中的p53分子。在又一个实施方式中，所述检测的p53分子是野生型p53。在另一个实施方式中，通过观察p53活性来检测所述p53分子，所述p53活性选自下组中至少之一：p53依赖性反式激活的抑制作用、p53诱导的细胞凋亡的抑制作用和p21mRNA水平的降低。在一个实施方式中，所述被评估的癌症治疗是选自下组中至少之一的癌症的治疗：乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌和移行细胞癌。在一个实施方式中，所述被评估的癌症治疗是选自下组中至少之一的癌症的治疗：浆液腺癌(serous adenocarcinoma)、子宫内膜腺癌(endometrioid adenocarcinoma)、明细胞腺癌(clear cell adenocarcinoma)和粘蛋白腺癌(mucinous adenocarcinoma)。

本发明涉及在被诊断为患有癌症或存在癌症风险的受试者中治疗癌症的方法，包括：向所述受试者施用治疗有效量的抑制COP1表达的第一化合物。在一个实施方式中，所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的抑制MDM2或Pirh2表达的第二化合物。在另一个实施方式中，所述第一或第二化合物使所述癌症对癌症治疗敏感。在又一个实施方式中，所述第一或第二化合物选自下组中至少之一：反义寡核苷酸、形成三链的寡核苷酸(triple-strand forming oligonucleotide)和siRNA分子。所述方法可以进一步包括在施用所述第一和/或第二化合物之前、期间或之后施用一种或多种在癌症治疗过程期间有用的其他治疗试剂。在一个实施方式中，所述要治疗的癌症表达野生型p53。在另一个实施方式中，所述要治疗的癌症与对照相比过量表达COP1。在另一个实施方式中，所述要治疗的癌症与对照相比p53表达水平降低或p53活性降低。在又一个实施方式中，所述要治疗的癌症与对照相比p21表达水平降低。

本发明涉及筛选干扰COP1分子与p53分子结合的测试化合物的方法。在一个实施方式中，所述测试化合物可以进一步抑制COP1连接酶活性。在另一个实施方式中，所述方法进一步包括确定所述测试化合物是否调节COP1活性。在一个实施方式中，所述COP1活性选自下组中至少之一：p53的降解、p53的遍在化(ubiquitination)、p53依赖性反式激活的抑制作用、p53诱导的细胞凋亡的抑制作用和p21mRNA水平的降低。在一个实施方式中，所述COP1是人类COP1分子。在另一个实施方式中，所述p53是人类p53分子。在一个实施方式中，所述筛选方法是测量对COP1/p53结合的破坏或抑制的分析。在另一个实施方式中，所述筛选方法是报告基因分析。在进一步的实施方式中，所述筛选方法包括检测COP1活性的进一步的步骤，其中所述活性选自下组中至少之一：p53的降解、p53的遍在化、p53依赖性反式激活的抑制作用、p53诱导的细胞凋亡的抑制作用和p21mRNA水平的降低。

本发明涉及筛选抑制p53的活性的化合物的方法，包括用与COP1结合的测试化合物处理哺乳动物细胞的步骤，并检测所述处理的细胞中的p53。在一个实施方式中，所述检测步骤包括测量选自下组中至少之一：p53的降解、p53的遍在化、p53依赖性反式激活的抑制作用、p53诱导的细胞凋亡的抑制作用和p21mRNA水平的降低。在一个实施方式中，所述哺乳动物细胞已经被工程化来表达COP1。在一个实施方式中，所述哺乳动物细胞已经被工程化来表达p53。

本发明涉及抑制COP1分子表达或抑制COP1连接酶活性的化合物用于药物的制备的用途，所述药物用于在诊断为患有癌症或存在癌症风险的受试者中治疗癌症。根据一个实施方式，所述化合物是靶向COP1的RNAi。根据另一个实施方式，所述药物包括抑制MDM2或Pirh2的表达的化合物或药物的标签，所述标签提供有关与抑制COP1的化合物(COP1-inhibitingcompound)一同施用抑制MDM2或Pirh2的表达的化合物的信息。根据另一个实施方式，所述药物进一步包括抑制MDM2分子的表达或活性的化合物，和/或可以伴有施用所述MDM2抑制物的说明。根据另一个实施方式，所述药物进一步包括抑制Pirh2的表达或活性的化合物，和/或可以伴有施用所述Pirh2抑制物的说明。

本发明涉及在哺乳动物细胞中抑制p53的活性的方法，包括在细胞中过量表达COP1并检测过量表达COP1的细胞中的p53的步骤。本发明还涉及哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包含编码p53分子的重组核酸分子和编码哺乳动物COP1分子的重组核酸分子。本发明还涉及哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞被工程化以具有提高或降低p53分子表达的非编码序列(例如，启动子/增强子序列或反义序列)连同提高或降低COP1分子表达的非编码序列，或具有编码COP1分子的分子。本发明还涉及哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞被工程化以具有提高或降低COP1分子表达的非编码序列(例如，启动子/增强子序列或反义序列)连同提高或降低p53分子表达的非编码序列或编码p53分子的分子。本发明还涉及哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞被工程化以具有基因组上改变的p53的编码序列，从而p53不被表达或被表达为突变体，连同工程化所述细胞来改变COP1分子表达或活性。本发明还涉及哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞被工程化以具有基因组上改变的COP1的编码序列，从而COP1不被表达或被表达为突变体，连同工程化所述细胞来改变p53分子表达或活性。

本发明提供了哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞被工程化以具有降低的COP1活性和降低的MDM2活性，任选地所述细胞被进一步工程化以改变p53表达或活性。本发明提供了哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞被工程化以具有降低的COP1活性和降低的Pirh2活性，任选地所述细胞被进一步工程化以改变p53表达或活性。本发明提供了哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞被工程化以具有降低的COP1活性、降低的MDM2活性和降低的Pirh2活性，任选地被进一步工程化以具有改变的p53表达或活性。本发明提供了哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞被工程化以具有降低的MDM2活性、降低的Pirh2活性和提高的COP1活性。本发明提供了哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞被工程化以具有降低的COP1活性。本发明提供了哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞被工程化以具有降低的p53活性以及提高的或正常的COP1活性。在一个实施方式中，通过靶向p53或COP1分子的RNAi的方法来降低活性。

本发明还提供了包含第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子的细胞，所述第一核酸分子包含与编码COP1多肽的核酸分子可操作连接的序列特异性DNA结合结构域，所述第二核酸分子包含与编码p53多肽的核酸分子可操作连接的反式激活结构域，所述第三核酸分子包含与能由所述序列特异性DNA结合结构域识别的序列可操作连接的报告基因。本发明还提供了包含第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子的细胞，所述第一核酸分子包含与编码p53多肽的核酸分子可操作连接的序列特异性DNA结合结构域，所述第二核酸分子包含与编码COP1多肽的核酸分子可操作连接的反式激活结构域，所述第三核酸分子包含与能由所述序列特异性DNA结合结构域识别的序列可操作连接的报告基因。

本发明还提供了这样的分析，包括例如在体外遍在蛋白分析、COP1/p53结合分析、COP1连接酶分析和p53活性分析中使用重组COP1分子连同使用重组p53分子。

本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包含用于检测样品中COP1分子的试剂和包装插页(package insert)，所述包装插页含有对在包含癌细胞的样品中检测COP1分子的说明。在一个实施方式中，所述癌细胞是表达野生型p53的癌细胞。在另一个实施方式中，所述癌细胞选自下组中至少之一：乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞和移行细胞癌细胞。在另一个实施方式中，所述癌症选自下组中至少之一：浆液腺癌、子宫内膜腺癌、明细胞腺癌和粘蛋白腺癌。在一个实施方式中，所述试剂盒进一步包含用于检测样品中p53分子的试剂。

本发明提供了药物组合物，所述药物组合物包含抑制COP1的表达的化合物连同药学上可接受的载体。在一个实施方式中，所述药物组合物进一步包含抑制MDM2或Pirh2的表达的化合物。在一个实施方式中，化合物选自下组中至少之一：反义寡核苷酸、形成三链的寡核苷酸和siRNA分子。

在本发明的组合物和方法的一个实施方式中，COP1分子包含结合p53的、人类COP1或其变体的至少一部分。在本发明的组合物和方法的一个实施方式中，所述p53分子包含结合COP1的、人类p53或其变体的至少一部分。在本发明的组合物和方法的另一个实施方式中，COP1分子包含结合p53的、人类COP1或其变体的至少一部分，连同具有连接酶活性的COP1的部分。在一个实施方式中，本发明的COP1、p53、p21、MDM2和Pirh2的抑制物通过与COP1、p53、p21、MDM2和Pirh2的结合，或与编码COP1、p53、p21、MDM2和Pirh2的基因，包括这些基因的非翻译区的结合来抑制。

附图的简要说明

附图1A-E.COP1和它与p53的相互作用。A，来自基于Flag肽的洗脱的银染色SDS凝胶。p53蛋白(下部画面)的序列(SEQ ID NO：1)带有通过质谱的匹配肽，下划线的。B，在体内COP1与外源p53的相互作用。如所指出对Saos-2细胞进行转染、免疫沉淀和免疫印迹(Western印迹，WB)。C，在体内COP1与内源p53的相互作用。如所指出的用或不用COP1转染U2-OS细胞，免疫沉淀和免疫印迹。D，内源p53与内源COP1的相互作用。用抗p53或抗Myc免疫沉淀U2-OS细胞，并用抗COP1免疫印迹。E，在体外COP1与p53的相互作用。用体外翻译的HA-COP1孵育GST或GST-p53，通过抗-HA免疫印迹检测结合的COP1。下部的画面代表HA-COP1的20％总输入。

附图2A-I.COP1负调节p53表达和反式激活活性，并在不存在MDM2或Pirh2时维持降解p53的能力。A，COP1妨碍外源p53蛋白的稳态水平。COP1或COP1ΔRING与p53一同转染入Saos-2(p53-null)细胞，通过免疫印迹评定p53的稳态水平。B，COP1妨碍内源p53蛋白的稳态水平。COP1或COP1ΔRING转染入U2-OS细胞，通过免疫印迹评定内源p53的稳态水平。C，COP1不改变p53mRNA水平。提取来自COP1或COP1ΔRING转染的U2-OS细胞的RNA，通过实时PCR并通过beta-肌动蛋白mRNA标准化来评定p53mRNA水平。D，COP1提高p53翻转(turnover)。用或不用COP1转染HEK293T细胞，通过脉冲追踪代谢标记来测定内源p53的半衰期。E，p53的COP1降解需要功能性的26S蛋白酶体。如B中的转染U2-OS细胞，只是在收集溶胞产物之前该细胞用或不用蛋白酶体抑制物ALLN处理6h。F，COP1促进体内的p53遍在化。用HA-遍在蛋白、p53和COP1或COP1ΔRING转染Saos-2细胞，并用ALLN处理。通过使用与抗-HA的免疫沉淀和使用抗-p53的免疫印迹来检测遍在化的p53。G，在体外COP1直接遍在化p53。如所指出的将细菌表达的和纯化的遍在蛋白成分与体外翻译和免疫沉淀的p53孵育。用抗-Flag检测遍在化的p53，并表示为产物＞53kDa。H，COP1阻抑p53对p21启动子的反式激活功能。用p53和COP1或COP1ΔRING与p21-Luc报告物和内部对照pCMV-b-Gal质粒转染Saos-2细胞。RLU，相对的光单位。I，COP1抑制p53依赖性细胞凋亡。如所指出的用p53和COP1转染Saos-2细胞。通过EGFP的共转染选择短暂地转染的细胞，产生的sub-G1群体通过碘化丙锭染色来对细胞死亡估计进行评定。J，COP1以MDM2非依赖性的方式促进p53降解。如所指出的用构建体转染来自p53/MDM2null小鼠的MEFs，使溶胞产物经历针对p53、肌动蛋白、MDM2和FLAG的抗体的免疫印迹。K，COP1以Pirh2非依赖性的方式促进p53降解。通过siRNA耗尽Saos-2细胞的Pirh2，随后用p53和FLAG-COP1或MDM2转染。通过免疫印迹评定对p53的稳态水平的影响。通过实时PCR确认Pirh2mRNA消除(ablation)。L，COP1抑制从bax启动子的p53依赖性转录。用掺入了报告物bax-Luc和内部对照pCMV-βGal的p53和FLAG-COP1或FLAG-COP1ΔRING转染Saos-2细胞。通过归一化荧光素酶对β-Gal的活性来评定相对反式激活活性。M，COP1抑制内源p53的反式激活活性。用pG13-Luc或NS-Luc和具有提高量的FLAG-COP1或FLAG-COP1ΔRING的pCMVβ-Gal转染U2-OS细胞。24小时转染之后，用10μM依托泊苷(etoposide)或DMSO处理细胞，处理后6小时测定荧光素酶活性。

附图3A-D.COP1的siRNA消除引起p53蛋白的积累并诱导G1延滞(arrest)。A，COP1的siRNA消除提高p53蛋白的稳态水平并提高p21和Pirh2基因的反式激活。用针对COP1的siRNA寡核苷酸转染U2-OS和H1299细胞，或用反转的COP1转染作为对照。使用标出的抗体对溶胞产物进行免疫印迹，通过实时PCR检测目标基因的mRNA。B，C，COP1的siRNA消除诱导p53依赖性的G1延滞。用COP1或反转的COP1siRNA寡核苷酸转染U2-OS(B)或H1299(C)细胞，通过FACS的碘化丙锭染色测定细胞周期分布型。D，通过两种进一步不同的siRNA寡聚物的COP1消除引起在蛋白水平的p53积累。用COP1siRNA2或COP1siRNA3和溶胞产物转染U2-OS细胞。

附图4A-E.通过siRNA的COP1、Pirh2和MDM2消除稳定和活化p53。A，COP1的消除稳定p53。用针对COP1、MDM2和/或Pirh2的siRNA寡核苷酸转染U2-OS细胞，随后脉冲追踪指定的时间段。然后收获溶胞产物，用抗p53免疫沉淀，并在phosphorimager上定量。B，p53的反式激活活性在COP1的减少时提高。用标明的siRNA寡核苷酸和p21-Luc报告物转染U2-OS细胞，通过对内部转染对照物pCMV-beta-Gal活性标准化荧光素酶来测定相对反式激活活性。C，响应于COP1的消除，p53和下游的目标p21在蛋白水平积累，并进一步受到MDM2的共消除刺激。用针对p53、p21、COP1和MDM2的抗体探试来自b的溶胞产物。D，在正常细胞中COP1负调节p53。如C中用siRNA寡核苷酸转染BJ成纤维细胞，收获溶胞产物，用针对p53、p21、肌动蛋白、MDM2和COP1的抗体进行免疫印迹。E，通过siRNA的COP1和MDM2消除使得U2-OS细胞对IR诱导的细胞死亡敏感。用标明的siRNA寡核苷酸预先处理U2-OS细胞，经受20Gy IR，通过碘化丙锭染色测定细胞死亡。

附图5A-E.COP1是p53可诱导的基因。A，在COP1启动子上p53共有位点的鉴定。下划线的序列代表p53decamer。B，来自COP1启动子的p53共有位点能够实施p53依赖性转录。将两个拷贝的p53的COP1共有位点导入pGL3-启动子荧光素酶报告物构建体的上游，并与野生型p53或突变p53R175H共转染。通过对pCMV-beta-Gal活性归一化来测定相对活性。C，COP1mRNA由p53诱导。用p53或R175H突变体转染H1299细胞，分离RNA并使用特异于COP1mRNA的探针进行实时PCR，并针对β-肌动蛋白mRNA归一化。D，COP1蛋白水平由于p53而增高。用针对p53、p21、肌动蛋白和COP1抗体免疫印迹来自C的溶胞产物。E，COP1蛋白水平响应于IR而增高。用10Gy IR照射U2-OS细胞，8h后收获。用针对p53、肌动蛋白和COP1的抗体免疫印迹溶胞产物。

附图6A-C.COP1在鼠组织中表达。A：在正常睾丸中COP1的ISH分析。左侧画面代表明视野，右侧画面代表暗视野。B：使用1st链cDNA画面的全长COP1的RT-PCR。C：全长COP1表达的Northern印迹分析。

附图7A-D.卵巢腺癌中的COP1过量表达。A：来自卵巢肿瘤的cop1mRNA的实时PCR分析。从带有匹配的正常对照的肿瘤样品制备RNA，并进行实时PCR Taqman分析。数据表示为针对匹配的正常cop1mRNA的倍数增加，并针对RPL19mRNA来归一化。B：cop1mRNA通过ISH的过量表达。在赘生的上皮细胞中cop1表达是明显的，但在相连的基质中不是；正常的卵巢组织是阴性的。C：在卵巢腺癌中COP1在蛋白水平的过量表达。与B中相同情况的卵巢腺癌证明了在赘生的上皮细胞的细胞质和核中而不是相关的基质中的COP1免疫反应性。D：卵巢肿瘤中p53基因状态和COP1过量表达与p21mRNA降低的相关性。从A中的样品提取DNA，并进行p53基因的外显子5-8的PCR，通过DNA测序来分析产物，称为野生型(wt)或突变体(mu)。p53基因状态下面的图画显示了来自过量表达COP1的A的相同样品也具有降低的p21mRNA。如A中通过实时PCR测定p21mRNA相对水平，针对RPL19mRNA归一化。数据表示为p21信使方面的倍数下降。

附图8A-G.在乳腺腺癌中COP1过量表达。通过免疫组织化学评估包括32例乳腺腺癌的组织微阵列的COP1表达。在32例乳腺腺癌病例中的25例鉴定了COP1免疫反应性。A：在赘生的上皮细胞中显示COP1免疫反应性的代表性的乳腺腺癌。B：A中显示的情况的更高放大率。C：相同的乳腺腺癌病例在赘生的上皮细胞中p53免疫反应性是阴性的，尽管散布的基质细胞是阳性的。D：C中显示的情况的更高放大率。E：在一例乳腺腺癌中的阳性p53免疫反应性。总共，3/32例是p53阳性的。F：D中显示的情况的更高放大率。G：p53突变，引起氨基酸替换C242F的G到T转换，在E和F中显示的IHC阳性实例中被证实了。原始放大率：×100(A，C和E)；×200(B，D和F)。

附图9A-B.乳腺肿瘤中的COP1和p53稳态水平。A：从正常的乳腺或肿瘤样品收获溶胞产物，并经历针对p53、COP1和肌动蛋白的抗体的免疫印迹。B：乳腺肿瘤样品中的p53基因状态。从A中的样品提取DNA，进行p53基因的内含子-外显子边界以及外显子5-8的PCR，通过DNA测序来分析产物。

发明的详细说明

本发明，部分地，证明了COP1在各种癌症中过量表达，并鉴定了肿瘤抑制物蛋白p53为COP1相互作用蛋白。功能上地，COP1经由蛋白酶体降解p53，以MDM2非依赖性方式在体内使p53直接遍在化，在体外，抑制p53反式激活潜力，并抑制p53诱导的细胞凋亡。此外，COP1的siRNA消除稳定了p53并提高了下游目标基因p21的反式激活，因而在细胞周期的G1期延滞细胞。COP1还被鉴定为参与自调整的反馈环路的p53可诱导的基因。此外，过量表达COP1的癌症显示了p21mRNA的下降。

因而，COP1的过量表达可以用来诊断各种癌症或细胞类型。在某些实施方式中，在表达野生型p53的细胞或组织中COP1的过量表达对癌症具有诊断性。

在此描述了本发明的各种可选择的实施方式和实施例。这些实施方式和实施例是说明性的，不应被看作限制本发明的范围。

异常细胞增殖

术语“细胞增殖失调”或“增殖失调”是指与一定程度的异常细胞增殖有关的失调。在一个实施方式中，所述细胞增殖失调是癌症。

“癌(cancer)”、“赘生物”、“瘤形成”、“癌(carcinoma)”、“癌的”或“肿瘤”意思是指或描述在哺乳动物中一般以不受调整的细胞生长为特征的生理状况。一般地，赘生物或癌症的细胞，例如赘生性(肿瘤)细胞，已经从正常的细胞分裂控制中解放，即，细胞的生长或增殖不受细胞环境中普通的生物化学和物理影响的调节，并展现出不受调节的生长、局部组织侵入、转移等等的特征。一般地，赘生性细胞增殖形成良性或恶性细胞的克隆。因此术语癌症或赘生物包括技术上是良性的但带有变为恶性的风险的细胞生长。“恶性肿瘤”是指任何细胞类型或组织的异常生长或增殖。当与相同类型的正常细胞或组织相比时，恶性的细胞或组织可能抑制退行发育或分化/定向的丧失，并可能展现侵入和转移能力。

此处使用的术语“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的或良性的，和所有癌前期的和癌性的细胞和组织。

大多数癌症属于三种广泛的组织学分类：癌(carcinomas)，其是主要的癌症，是上皮细胞或覆盖在器官、腺体、或其他身体结构(例如，皮肤、子宫、肺、乳腺、前列腺、胃、肠)的外部或内部表面的细胞的癌症，其倾向于转移；肉瘤(sarcomas)，其来自连接性或支持性组织(例如，骨骼、软骨、肌腱、韧带、脂肪、肌肉)；和血液肿瘤，其来自骨髓和淋巴组织。癌可以是腺癌(其一般在能分泌的器官或腺体，例如，乳腺、肺、结肠、前列腺或膀胱中发生)或可以是鳞状细胞癌(其发源于扁平上皮并一般在身体的大多数区域发展)。肉瘤可以是骨肉瘤或骨原性肉瘤(骨骼)、软骨肉瘤(软骨)、平滑肌肉瘤(平滑肌)、横纹肌肉瘤(骨骼肌)、间皮肉瘤或间皮瘤(体腔的膜性内层)、纤维肉瘤(纤维组织)、血管肉瘤或血管内皮瘤(血管)、脂肪肉瘤(脂肪组织)、胶质瘤或星形细胞瘤(脑中发现的神经原性结缔组织)、粘液肉瘤(原始的胚性结缔组织)、mesenchymous或混合的中胚层肿瘤(混合的结缔组织类型)。血液肿瘤可以是骨髓瘤，其发源于骨髓中的浆细胞；白血病，其可以是“液体肿瘤”并且是骨髓的癌症，可以是髓性的或粒细胞性的白血病(骨髓的和粒细胞的白血球)，淋巴的、淋巴细胞的或成淋巴细胞的白血病(淋巴的和淋巴细胞的血细胞)例如，急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病、慢性的髓细胞白血病，等，或真性红细胞增多症(polycythemia vera)或原红细胞增多症(erythremia)(各种血细胞产物，但红血球占优势)；或淋巴瘤，其可以是实体肿瘤并且其在淋巴系统的腺体或淋巴结中发展，其可以包括何杰金(Hodgkin)或非何杰金淋巴瘤，Burkitt’s淋巴瘤，等等。此外，也存在混合型癌症，例如腺鳞癌(adenosquamous)、混合的中胚层肿瘤、癌肉瘤(carcinosarcoma)或畸胎癌。

癌症也可以根据它们发源的器官，即“原发位点”来命名，例如，乳腺、脑、肺、肝脏、皮肤、前列腺、睾丸、膀胱、结肠和直肠、宫颈、子宫，等等。即使癌症转移到不同于原发位点的身体的另外的部位，也保留这种命名，根据本发明的癌症包括原发癌症，以及已经转移的癌症。

根据原发位点命名的癌症可以与组织学分类相关。例如，肺癌一般是小细胞肺癌或非小细胞肺癌，其可以是鳞状细胞癌、腺癌或大细胞癌；皮肤癌一般是基底细胞癌、扁平细胞癌或黑素瘤，例如恶性黑色素瘤。淋巴瘤可以在与头、颈和胸相关的淋巴结中，以及在腹部淋巴结或在腋下或腹股沟淋巴结中出现。癌症的类型和阶段的鉴定和分类可以通过使用例如国家癌症学会(http://seer.cancer.gov/publicdata/access.html)的Surveillance，Epidemiology，和End Results(SEER)程序，其是在美国关于癌症发生和存活的权威的信息来源，并且是全世界公认的。SEER程序的发生率和存活率数据可用于接近特定癌症位点和阶段的标准存活率。例如，为了确保最佳的比较组，可以从数据库中选择特定的标准，包括诊断的日期和确切的分期。通过使用例如诊断手册如Merck Manual of Diagnosis and Therapy，17^thedition，M.H.Beers and R.Barkow，eds.，John Wiley and Sons，1999中提供的信息，也可以进行癌症的鉴定。

癌症或赘生物的实例还可以包括，但不限于，本领域已知的转化的和永生的细胞、实体肿瘤、髓性增殖性疾病(myeloproliferative diseases)、胚细胞瘤、鳞状上皮细胞癌(squamous cell cancer)(例如，上皮的鳞状上皮细胞癌)、肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状细胞癌、腹膜的癌症、肝细胞癌症、胃或胃癌，包括胃肠癌症、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜的或子宫的癌、浆液腺癌、子宫内膜腺癌、明细胞腺癌、粘蛋白腺癌、Brenner肿瘤、畸胎瘤、无性细胞瘤(dysgerminoma)、恶性合胞体瘤(choriocarcinoma)、纤维瘤、粒导细胞瘤(granulosa cell tumor)、Sertoli-Leydig细胞瘤、未分化的卵巢癌、唾液腺癌、肾或肾脏癌症、前列腺癌症、阴户癌症、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、头和/或颈部的癌症、Ewing’s肉瘤、血管内皮瘤、Kaposi’s肉瘤、脂肪肉瘤、周围神经上皮瘤、滑膜肉瘤、何杰金氏病等等。

根据本发明的癌症包括任何癌症，其中癌细胞或组织过量表达COP1分子或其中COP1活性被增量调节。在某些实施方式中，根据本发明的癌症包括任何癌症，其中癌细胞或组织还表达野生型p53分子。

多肽、核酸分子和测试化合物

根据本发明的化合物包括，但不限于，COP1和p53核酸分子、多肽和/或其类似物、变体、同源物和片段。这些化合物可以用于本发明的诊断、预后、治疗、筛选方法等等的任一种。通过，例如，使用其他的保守氨基酸残基，即，具有相似的物理、生物或化学性质的残基，或使用非保守性的残基，在COP1或p53肽或肽类似物的任何位置替换、删除或插入氨基酸残基，筛选所述化合物介导与p53(如果所述化合物是COP1分子)或COP1(如果所述化合物是p53分子)结合的能力，可以制备化合物。在某些实施方式中，根据本发明的化合物可以是MDM2、Pirh2或p21分子。在某些实施方式中，本发明的化合物包括特异性结合COP1或p53，例如突变或野生型p53的抗体。这种抗体可以是例如人源化的抗体。

当抗体识别并结合抗原、但基本上不识别和结合样品中的其它分子时，抗体“特异性结合”抗原。例如，COP1抗体特异性结合COP1分子，但基本上不结合任何其它分子，例如癌细胞或组织中存在的那些。在某些实施方式中，COP1抗体可以特异性结合人类COP1分子，并且可以不特异性结合来自其他物种的COP1分子。在另一个实例中，p53抗体特异性结合p53分子，但基本上不结合任何其它分子，例如癌细胞或组织中存在的那些。在某些实施方式中，p53抗体可以特异性结合人类p53分子，并且可以不特异性结合来自其他物种的p53分子。在某些实施方式中，p53抗体可以特异性结合突变体p53分子，并且可以不特异性结合野生型p53分子。在某些实施方式中，p53抗体可以特异性结合野生型p53分子，并且可以不特异性结合突变体p53分子。特异性结合抗原的抗体具有，例如，对于抗原的亲合力，所述亲合力是所述抗体对样品中其它参考分子的亲合力的至少10、100、1000或10000倍。

在此使用的“COP1分子”是指一种分子，其基本上相同于：COP1多肽；编码COP1多肽的核酸分子；COP1核酸分子；以及其同种型、片段、类似物或变体。例如，COP1分子可以包括来自哺乳动物、具有结合p53的能力和/或COP1连接酶活性的COP1多肽的同种型、片段、类似物或变体。

COP1分子可以包括，但不限于，含有序列的多肽或核酸分子，所述序列基本上相同于登记号为AAH82804(小鼠)、NP_036061(小鼠)、NP_001001740(人类、同种型d24)、NP_071902(人类、同种型a)、XP_468011(Oryza sativa)、XP_468010(Oryza sativa)、XP_463866(Oryza sativa)、AAM34692(人类)、AAH39723(人类)、BAB45239(人类)、P_ABG08243(人类)、AAD51094(小鼠)、AAN86553(Brassica rapa subsp.Pekinensis)、CAA98718(Saccharomyces cerevisiae)、CAA04168(Arabidopsis thaliana)、XM_477896(Oryza sativa)、XM_479164(Oryza sativa)、BK000438(人类)、AF508940(人类)、AF151110(小鼠)、L24437(Arabidopsis thaliana)、P_AAY60008(人类)、P_ABJ19398(人类)、P_ABB11576(人类)、P_ABG95247(人类)、P_AAW74797(人类)、P_ABP69180(人类)、P_AAB92798(人类)、XP_064815(人类)、和/或P_AAG02591(人类)中阐述的那些，以及其同种型、片段、类似物或变体。COP1分子可以是Bianchiet al.³⁰、Wang et al.³⁹或Yi et al.²⁰中描述的分子。COP1分子可以包括包含相应于COP1的结构域的序列的分子，例如，登记号为NP_071902的残基136-177(RING结构域)；登记号为NP_071902的残基231-306(卷曲-缠绕结构域(coiled-coilded domain))；和/或登记号为NP_071902的残基410-727(WD40结构域)。在某些实施方式中，COP1多肽包括能够直接结合p53多肽和/或抑制p53活性或功能、基本上相同于在此列出的序列的分子。不限于任何特定的假说，COP1多肽可以形成同二聚体来负调节p53。因而，COP1可以包括能够同二聚化的、基本上相同于在此列出的序列的分子。在某些实施方式中，具有在此列出的序列的COP1多肽或核酸分子可以具体地从根据本发明的某些方法中排除，例如，通过检测COP1表达水平来诊断特定癌症，例如乳腺癌的方法。

“p53”是编码393个氨基酸的磷蛋白的强力肿瘤抑制蛋白^26，27。p53在许多癌症中被负调节或突变。^40-43p53的缺乏或失活可能促发癌症。存在各种p53突变。“野生型”p53是在正常的(即，非癌细胞)中发现的p53，或是不具有与癌症相关的突变的p53。可以评定样品的p53状态(例如，样品是否包括野生型或突变体p53)，实例在Vogelstein等的美国专利6,090,566中描述，或使用例如在此描述的或本领域已知的标准技术。p53分子可以包括，但不限于，含有序列的多肽，所述序列基本上相同于在例如登记号为P04637中列出的，和由所述序列编码的核酸分子。

MDM2或Pirh2分子包括连接酶^7-10，其将遍在蛋白从E2酶，例如UbcH5b转移到多赖氨酸残基上的底物，或到底物偶联的遍在蛋白上，来产生多聚遍在蛋白链，并且是p53的负调节物。^7，25MDM2或Pirh2分子包括具有序列的分子，所述序列基本上相同于登记号为AF527840(MDM2)和AF255666(Pirh2)中阐述的那些，和由所述序列编码的核酸分子。

p21或“WAF1/Cip1”最初被描述为cyclin依赖性激酶的通用抑制物。它由p53依赖性和p53非依赖性机制诱导，并已经被暗示作为细胞增殖的抑制物。P21分子包括具有序列的分子，所述序列基本上相同于登记号U03106中列出的那些，和由所述序列编码的核酸分子。

“基本上相同的”序列是氨基酸或核苷酸序列，其不同于参考序列仅一个或多个保守性替换，或在此讨论的，或一个或多个非保守性替换、删除或插入，位于不破坏所述氨基酸或核酸分子的生物学功能的序列位置。当在氨基酸或核苷酸水平使用例如Genentech开发的Align-2程序与用于比较的序列最佳地对齐时，这种序列可以是从10％到99％的任何整数、或更一般地至少10％、20％、30％、40％、50％、55％或60％，或至少65％、75％、80％、85％、90％或95％，或多达96％、97％、98％或99％相同。对于多肽，比较序列的长度可以是至少2、5、10或15个氨基酸，或至少20、25或30个氨基酸。在可选择的实施方式中，比较序列的长度可以是至少35、40或50个氨基酸，或超过60、80或100个氨基酸。对核酸分子，比较序列的长度可以是至少5、10、15、20或25个核苷酸，或至少30、40或50个核苷酸。在可选择的实施方式中，比较序列的长度可以是至少60、70、80或90个氨基酸，或超过100、200或500个核苷酸。

此处的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在对齐序列并引入缺口(如有必要)，达到最大序列同一性百分比之后，与选定序列中氨基酸残基相同的候选序列中氨基酸残基的百分比。为了确定氨基酸序列同一性百分比的对齐可以用本领域技术人员知道的各种方式来实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，例如BLAST(National Library of Medicinesoftware)、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于衡量对齐的合适的参数，包括在被比较的序列全长上实现最大对齐所需的任何算法。然而，在此处，通过使用序列比较计算机程序ALIGN-2如下所述的获得氨基酸序列同一性值％。ALIGN-2序列比较计算机程序是由Genentech，Inc.编写的，以及以用户文件在美国Copyright Office，Washington D.C.，20559提交，在那里它通过U.S.版权登记，登记号TXU510087，通过Genentech，Inc.，South San Francisco，California，公众可获得。ALIGN-2应被编译用于UNIX操作系统上，优选为数字的UNIXV4.0D。通过ALIGN-2程序设置所有序列比较参数，并且不改变。

做为选择，或另外地，两个核酸序列如果它们在高严格条件下杂交可以是“基本上相同的”。杂交反应的“严格度”通过本领域的普通技术人员容易地确定，一般是取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验性计算。一般地，为了适当退火，更长的探针需要更高的温度，而更短的探针需要更低的温度。杂交一般取决于当在低于它们的熔解温度的环境中存在互补链时变性的DNA重新退火的能力。在探针和可杂交序列之间期望的同源性越高，可以使用的相对温度越高。结果，于是更高的相对温度将倾向于产生更严格的反应条件，而较低的温度产生较低的严格度。对于杂交反应的严格度的其它细节和说明，参见，Ausubel et al.， Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience Publishers，(1995)，将其引入本文作参考。

根据一个实施方式，杂交处在高严格条件下。在此定义的“严格条件”或“高严格条件”，可以通过以下来确定：(1)采用低离子强度和高温度用于洗涤，例如在50℃0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠(2)在杂交期间采用变性剂，如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，pH6.5，和750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠在42℃；或(3)在溶液中过夜杂交，所述溶液采用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt’s溶液、超声作用后的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖在42℃，和在0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中在42℃洗涤10分钟，继之以含EDTA的0.1×SSC构成的在55℃的10分钟高严格洗涤。

“中度严格条件”可以如Sambrook et al.， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring Harbor Press，1989所描述的确定，包括使用比以上描述的那些较低严格度的洗涤溶液和杂交条件(例如，温度、离子强度和％SDS)。中度严格条件的实例是在37℃在溶液中孵育过夜，所述溶液包含：20％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精子DNA，继之以在约37-50℃在1×SSC中洗涤滤膜。熟练技术人员将知道如何根据需要调节温度、离子强度等等，来适应探针长度等的因素。

杂交可以在约20到30分子、或约2到6小时、或约10到15小时、或超过24小时或更久的时段内进行。高严格杂交也依赖于由分子生物学家通常进行的许多技术的成就，例如，高严格PCR、DNA测序、单链构象多态性分析和原位杂交。与northern和Southern杂交相比，这些技术通常用相对短的探针进行(例如，通常约16个核苷酸或更长用于PCR或测序，约40个核苷酸或更长用于原位杂交)。

本领域公知的是，可以在多肽的结构中进行某些修饰和改变而基本上不改变该肽的生物学功能，来获得生物学上等价的多肽。在本发明的一个方面，本发明的多肽也扩展到生物学上等价的肽，所述肽因不影响生物学功能的氨基酸替换而不同于本发明的多肽的序列的一部分。

如在此使用的，术语“保守的氨基酸替换”是指在肽的给定位置一个氨基酸对另一个的替换，在所述位置可以进行替换而没有相关功能的实质(substantial)丧失。在进行这种改变时，可以根据侧链取代基的相似性，例如，它们的大小、电荷、疏水性、亲水性等等进行相似氨基酸的替换，可以通过常规测试来分析这种替换对肽的功能的影响。

如在此使用的，术语“氨基酸”是指在天然发生的蛋白质中一般存在的那些L-氨基酸，D-氨基酸和当它们被修饰时的那些氨基酸。因而，本发明的氨基酸可以包括，例如：2-氨基脂肪酸；3-氨基己二酸；β-丙氨酸；β-氨基丙酸；2-氨基丁酸；4-氨基丁酸；piperidinic acid；6-氨基己酸；2-氨基庚酸；2-氨基酸异丁酸；3-氨基异丁酸；2-氨基庚二酸；2，4-二氨基丁酸；锁链素(Desmosine)；2，2’-二氨基庚二酸；2，3-二氨基丙酸；N-乙基甘氨酸；N-乙基天冬酰胺；羟基赖氨酸；别-羟基赖氨酸；3-羟脯氨酸；4-羟脯氨酸；异锁链素；别-异亮氨酸；N-甲基甘氨酸；肌氨酸；N-甲基异亮氨酸；6-N-甲基赖氨酸；N-甲基缬氨酸；正缬氨酸；正亮氨酸；和鸟氨酸。

在某些实施方式中，可以进行保守的氨基酸替换，其中氨基酸残基被具有相似亲水性值(即，在加或减2.0、或者加或减1.5，或者加或减1.0，或者加或减0.5的值之内)的另一个替换，其中以下的可以是具有约-1.6的亲水的指数的氨基酸，例如Tyr(-1.3)或Pro(1.6)被分配给氨基酸残基(如在美国专利No.4,554,101中详述的，引用本文作参考)：Arg(+3.0)；Lys(+3.0)；Asp(+3.0)；Glu(+3.0)；Ser(+0.3)；Asn(+0.2)；Gln(+0.2)；Gly(0)；Pro(-0.5)；Thr(-0.4)；Ala(-0.5)；His(-0.5)；Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)；和Trp(-3.4)。

在可选择的实施方式中，可以进行保守性氨基酸替换，其中氨基酸残基被具有相似亲水性指数的另一个替换(例如，在加或减2.0、或者加或减1.5、或者加或减1.0、或者加或减0.5的值之内)。在这种实施方式中，每个氨基酸残基可以根据它们的疏水性和电荷特征分配亲水性指数，如下：Ile(+4.5)；Val(+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；Trp(-0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；Glu(-3.5)；Gln(-3.5)；Asp(-3.5)；Asn(-3.5)；Lys(-3.9)；和Arg(-4.5)。

在可选择的实施方式中，保守性氨基酸替换可以使用公众可获得的相似性矩阵家族来进行(Altschul，S.F.1991.“Amino acid substitution matricesfrom an information theoretic perspective.”Journal of Molecular Biology，219：555-665；Dayhoff，M.O.，Schwartz，R.M.，Orcutt，B.C.1978.“A model ofevolutionary change in proteins.”In“Atlas of Protein Sequence and Structure”5(3)M.O.Dayhoff(ed.)，345-352，National Biomedical Research Foundation，Washington；States，D.J.，Gish，W.，Altschul，S.F.1991.“Improved Sensitivity ofNucleic Acid Database Search Using Application-Specific Scoring Matrices”Methods：A companion to Methods in Enzymology 3(1)：66-77；StevenHenikoff and Jorja G.Henikoff.1992“Amino acid substitution matrices fromprotein blocks.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89(biochemistry)：10915-10919；M.S.Johnson and J.P.Overington.1993.“A Structural Basis of SequenceComparisons：An evaluation of scoring methodologies.”Journal of MolecularBiology.233：716-738.Steven Henikoff and Jorja G.Henikoff.1993.“Performance Evaluation of Amino Acid Substitution Matrices.”Proteins：Structure，Function，and Genetics.17：49-61；Karlin，S.and Altschul，S.F.1990.“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence featuresby using general scoring schemes”Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87：2264-2268.)PAM矩阵基于来自进化模型的计数，而Blosum矩阵使用了来自比对内部高度保守的字块的计数。在PAM或Blosum矩阵中零以上的相似性计分可以用来进行保守性氨基酸替换。

在可选择的实施方式中，可以进行保守性氨基酸替换，其中氨基酸残基被相同种类中的另一个替换，其中氨基酸被分为非极性的、酸性的、碱性的和中性的种类，如下：非极性的：Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、Met；酸性的：Asp、Glu；碱性的：Lys、Arg、His；中性的：Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Tyr。

保守性氨基改变可以包括通过相应的D-氨基酸、通过保守的D-氨基酸、或通过天然发生的、氨基酸的非遗传编码的形式来替换L-氨基酸，以及L-氨基酸的保守性替换。天然发生的非遗传编码的氨基酸包括β-丙氨酸、3-氨基-丙酸、2，3-二氨基丙酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、N-甲基甘氨酸(肌氨酸)、羟脯氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、t-丁基丙氨酸、t-丁基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、2-萘基丙氨酸、吡啶丙氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯基丙氨酸、3-氟苯基丙氨酸、4-氟苯基丙氨酸、青霉胺、1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸、β-2-噻吩丙氨酸、甲硫氨酸亚砜、高精氨酸、N-乙酰基赖氨酸、2-氨基丁酸、2-氨基丁酸、2，4，-二氨基丁酸、p-氨苯基丙氨酸、N-甲基缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、磺基丙氨酸、ε-氨基己酸、delta-氨基戊酸或2，3-二氨基丁酸。

在可选择的实施方式中，保守性氨基酸改变包括基于亲水性或疏水性、大小或容积、或电荷的考虑的改变。氨基酸一般可以被表征为疏水性或亲水性的，主要依据氨基酸侧链的性质。根据Eisenberg等(J.Mol.Bio.179：125-142，184)的标准化的共有疏水性分值，疏水性氨基酸展现出大于零的疏水性，亲水性氨基酸展现出低于零的亲水性。遗传编码的疏水性氨基酸包括Gly、Ala、Phe、Val、Leu、Ile、Pro、Met和Trp，遗传编码的亲水性氨基酸包括Thr、His、Glu、Gln、Asp、Arg、Ser和Lys。非遗传编码的疏水性氨基酸包括t-丁基丙氨酸，而非遗传编码的亲水性氨基酸包括瓜氨酸和高半胱氨酸。

疏水性或亲水性的氨基酸可以根据它们的侧链的特征进一步细分。例如，芳香族氨基酸是具有含至少一个芳香环或杂芳香环的侧链的疏水性氨基酸，其可以含有一个或多个取代基，例如-OH、-SH、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-NO、-NH₂、-NHR、-NRR、-C(O)R、-C(O)OH、-C(O)OR、-C(O)NH₂、-C(O)NHR、-C(O)NRR等等，其中R独立地是(C₁-C₆)烷基、取代的(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)烯基、取代的(C₁-C₆)烯基、(C₁-C₆)炔基、取代的(C₁-C₆)炔基、(C₅-C₂₀)芳基、取代的(C₅-C₂₀)芳基、(C₆-C₂₆)烷芳基、取代的(C₆-C₂₆)烷芳基、5-20个原子的(5-20membered)杂芳基、取代的5-20个原子的杂芳基、6-26个原子的烷基杂芳基(alkheteroaryl)或取代的6-26个原子的烷基杂芳基。遗传编码的芳香族氨基酸包括Phe、Tyr和Trp，而非遗传编码的芳香族氨基酸包括苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸、beta-2-噻吩丙氨酸、1，2，3，4-四氢-异喹啉-3-羧酸、4-氯苯基丙氨酸、2-氟苯基丙氨酸、3-氟苯基丙氨酸和4-氟苯基丙氨酸。

无极性氨基酸是具有在生理pH不带电的侧链的疏水性氨基酸，其具有键，在所述键中被两个原子共有的一对电子一般由两个原子的每一个相等地保持(即，侧链不是极性的)。遗传编码的非极性氨基酸包括Gly、Leu、Val、Ile、Ala和Met，而非遗传编码的非极性氨基酸包括环己基丙氨酸。非极性氨基酸可以被进一步细分到包括脂肪族氨基酸，其是具有脂肪族烃侧链的疏水性氨基酸。遗传编码的脂肪族氨基酸包括Ala、Leu、Val和Ile，而非遗传编码的脂肪族氨基酸包括正亮氨酸。

极性氨基酸是具有生理pH下不带电的侧链的亲水性氨基酸，但其具有一个键，其中由两个原子共用的电子对被原子之一更紧密地保持。遗传编码的极性氨基酸包括Ser、Thr、Asn和Gln，而非遗传编码的极性氨基酸包括瓜氨酸、N-乙酰基赖氨酸和甲硫氨酸亚砜。

酸性氨基酸是侧链pKa值低于7的亲水性氨基酸。酸性氨基酸一般由于氢离子的损失在生理学pH具有带负电的侧链。遗传编码的酸性氨基酸包括Asp和Glu。碱性氨基酸是侧链pKa值高于7的亲水性氨基酸。碱性氨基酸一般由于与水合氢离子的缔合在生理pH具有带正电的侧链。遗传编码的碱性氨基酸包括Arg、Lys和His，而非遗传编码的碱性氨基酸包括非环状氨基酸鸟氨酸、2，3，-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸和高精氨酸。

本领域技术人员理解的是，上述分类法不是绝对的，氨基酸可以被分类到超过一个种类中。此外，可以根据已知的行为和或特征性化学、物理或生物学性质，根据特定分析，或与早先鉴定的氨基酸比较，来对氨基酸分类。氨基酸也可以包括具有氨基酸样侧链的双功能部分。

保守性改变也可以包括通过例如氨基酸的功能性侧基的反应的化学上衍生部分对非衍生残基的替换。因而，这些替换可以包括一些化合物，所述化合物的游离氨基以及被衍生为盐酸胺、p-甲苯磺酰基基团、苄氧羰基基团、t-丁氧羧基基团、氯乙酰基基团或醛基基团。类似地，游离羧基可以被衍生来形成盐、甲基和乙基酯或其它类型的酯或酰肼，侧链可以被衍生来形成对于游离羟基来说为O-酰基或O-烷基衍生物，或对于组氨酸的咪唑氮来说为N-im-苯基组氨酸。肽类似物还包括化学上改变的氨基酸，例如，通过甲基化、通过烷基胺例如乙胺、乙醇胺或乙二胺的C-末端氨基酸的酰胺化、或氨基酸侧链的酰化或甲基化(例如，赖氨酸的ε氨基的酰化)。肽类似物还可以包括用取代的酰胺(例如，式-C(O)-NR的化合物，其中R是(C₁-C₆)烷基、(C₁-C₆)烯基、(C₁-C₆)炔基、取代的(C₁-C₆)烷基、取代的(C₁-C₆)烯基或取代的(C₁-C₆)炔基)或酰胺键的电子等排物(isostere)(例如，-CH₂NH-、-CH₂S、-CH₂CH₂-、-CH＝CH-、(顺式和反式)、-C(O)CH₂-、-CH(OH)CH₂-或-CH₂SO-)替换肽中的酰胺键。

例如，通过聚合或接合(conjunction)，化合物可以共价连接来形成同聚物或异聚物。可以使用间隔区(spacer)和接头，其一般由小的中性分子，例如在生理条件下不带电的氨基酸组成。可以以许多方式实现连接。例如，可以在肽末端添加半胱氨酸残基，通过受控的氧化可以共价地结合多个肽。

做为选择，可以使用异双功能试剂，例如形成二硫化物/酰胺的试剂，或形成硫醚/酰胺的试剂。化合物也可以连接到另一个化合物，所述另一个化合物可以，例如，靶向癌细胞或抑制癌症细胞的生长或增殖。例如，通过具有环状的部分，也可以限制化合物。

肽或肽类似物可以通过标准的化学技术，例如，通过使用溶液或固相合成方法的自动化合成来合成。自动化的肽合成仪是商业上可获得的，并使用了本领域公知的技术。也可以使用标准方法，例如在Sambrook，et al.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2^nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)或Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，1994)中描述的那些，使用重组DNA技术来制备肽和肽类似物。

在某些实施方式中，本发明的化合物包括基本上相同于COP1、MDM2、p21或p53核酸分子或其片段，或与COP1、MDM2、p21、或p53核酸分子或其片段互补的核酸分子。例如，这种核酸分子可以用作本发明的分析和方法中的探针或引物。“探针”或“引物”是定义的序列的单链DNA或RNA分子，其可以与含有互补序列的第二DNA或RNA分子(目标)碱基配对。产生的杂交分子的稳定性取决于发生碱基配对的程度，并受到一些参数，例如探针和目标分子之间的互补性的程度和杂交条件的严格性的程度的影响。杂交严格度的程度受到一些参数，例如温度、盐浓度和有机分子例如甲酰胺的浓度的影响，通过本领域技术人员公知的方法来测定。特异于在此描述的核酸序列的探针或引物，或其部分，可以在长度上不同，从至少8个核苷酸到超过500个供货商的任何整数，包括中间的任何数字，取决于所为的目的、所处的条件、所使用的探针或引物。例如，探针或引物可以是长度8、10、15、20或25个核苷酸，或可以是长度至少30、40、50或60个核苷酸，或可以是长度超过100、200、500或1000个核苷酸。特异于在此描述的核酸分子的探针或引物可以与在此描述的核酸序列具有大于20-30％的序列同一性、或至少55-75％的序列同一性、或至少75-85％的序列同一性、或至少85-99％的序列同一性、或100％的序列同一性。

探针或引物可以来自基因组DNA或RNA，例如，通过扩增，或来自克隆的DNA片段，并可以含有代表来自单个个体的单个基因的全部或一部分的基因组DNA或cDNA序列。探针可以具有独特的序列(例如，与COP1或p53核酸分子的100％同一性)和/或具有已知的序列。可以化学合成探针或引物。

通过本领域技术人员已知的方法，探针或引物可以放射性地或非放射性地被可检测地标记。探针或引物可以用于涉及核酸杂交的方法，例如，核酸测序、通过聚合酶链式反应的核酸扩增、单链构象多态性(SSCP)分析、限制性片断多态性(RFLP)分析、Southern杂交、northern杂交、原位杂交、电泳迁移移动分析(EMSA)和本领域技术人员已知的其他方法。

核酸分子也可以是反义分子、siRNA分子或三螺旋(triple helix)分子，其可以用于例如降低细胞中目标分子的表达。在此使用的“翻译”涉及核酸是指与核酸分子，例如，基因，如COP1、mdm2、p21或p53基因的编码链互补的核酸序列。在某些实施方式中，反义核酸分子是当都在细胞中表达时能够降低由互补基因编码的多肽的水平的核酸。在某些实施方式中，与在仅表达基因、不表达互补的反义核酸分子的细胞中的多肽水平相比，多肽水平被降低从至少10％到至少25％的任意值，或从至少25％到至少50％的任意值、或从至少50到至少75％的任意值、或从至少75％到100％的任意值、或从至少2倍到至少10倍的任意值、或100倍。

“siRNA”分子或“RNAi”分子是指形成双链RNA的核酸，该双链的RNA当siRNA在基因或目标基因的相同细胞中表达时具有降低或抑制基因或目标基因的表达的能力。“siRNA”因而是指由互补链形成的双链RNA。杂交以形成双链分子的siRNA的互补部分一般具有基本上的或完全的同一性。在一个实施方式中，siRNA是指具有与目标基因基本上的或完全的同一性并形成双链siRNA的核酸。siRNA的序列可以相应于全长目标基因，或其子序列。一般地，siRNA长度至少约15-50个核苷酸(例如，双链siRNA的每个互补序列长度是15-50个核苷酸，双链siRNA长度是约15-50个碱基对，更优选约20-30个碱基核苷酸、优选长度约20-25或约24-29个核苷酸，例如，长度20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。还参见PCT/US03/07237，完全引入本文作参考。当siRNA或RNAi在表达目标核酸的细胞中表达时，如果它降低所述核酸的表达至少约10％，那么可以说siRNA分子或RNAi分子“特异于”目标核酸。

可以理解的是，在此讨论的治疗试剂，包括核酸分子，可以被修饰或合成，来改善它们的生物利用率、药物动力学和药效性质。例如，治疗性核酸分子可以使用本领域已知的技术合成从而伴有一个或多个硫代磷酸酯键。

在某些实施方式中，测试化合物包括小的有机分子。“小的有机分子”是指天然发生或合成的有机分子，其具有超过约50道尔顿并低于约2500道尔顿、优选低于约2000道尔顿，优选在约100到约1000道尔顿之间、更优选在约200到约500道尔顿之间的分子量。小的有机分子可以是遍在蛋白连接酶抑制物，例如Ro106-9920和其类似物。⁴⁴

在本发明的某些实施方式中，测试化合物包括能够干扰COP1/p53相互作用或结合的抗体。测试化合物也可以包括肽、核酸分子或小分子，其能够干扰COP1/p53相互作用或结合和/或抑制COP1活性(例如，COP1酶活性)。

候选或测试化合物可以根据本领域已知的方法从天然产物的大库或合成的(或半合成的)提取物或化学物质库来鉴定。药物发现和开发领域的设计人员将理解，测试提取物或化合物的准确的来源对于本发明的方法不是关键的。因而，使用在此描述的示范性的方法可以筛选实际上许多的化学提取物或化合物。这种提取物或化合物的实例包括，但不限于，基于植物、真菌、原核生物或动物的提取物、发酵肉汤、和合成的化合物，以及已有化合物的修饰。对于任何数量的化合物，包括但不限于，基于糖类、脂质、肽和核酸的化合物的随机产生或直接合成(例如，半合成或全合成)，许多方法也是可获得的。合成的化合物库是商业上可获得的。做为选择，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的库是从许多来源的商业途径可获得的，包括Biotics(Sussex，UK)、Xenova(Slough，UK)、Harbor Branch Oceanographic Institute(Ft.Pierce，FL，USA)和PharmaMar，MA，USA.。此外，如果希望，根据本领域已知的方法，例如，通过标准的提取和分馏方法，产生天然或合成产生的库。此外，如果希望，使用标准的化学、物理或生物化学方法容易地修饰任何库或化合物。

例如，当发现粗提物抑制COP1/p53相互作用时，进一步分馏阳性引导性提取物(positive lead extract)是必需的，以分离对观察的效果直接相关的化学组分。因而，提取、分馏和纯化过程的目标是具有COP1/p53结合抑制活性的粗提物中化学实体的仔细表征和鉴定。在此描述的用于化合物的混合物中活性检测的相同分析可以被用于纯化活性成分和测试其衍生物。分馏和纯化这种异质提取物的方法是本领域已知的。如果希望，被证明是对治疗有用的试剂的化合物根据本领域已知的方法进行化学修饰。鉴定为具有治疗、预防、诊断或其它价值的化合物可以使用，例如，任何癌症动物模型来随后进行分析。

诊断、治疗、预防和/或筛选的用途、分析方法和试剂

根据本发明的化合物、组合物(例如，药物组合物)和方法可以在受试者中用于诊断癌症或用于治疗或预防癌症，或用于筛选对治疗或预防癌症有用的测试化合物。

在此使用的，受试者可以是人类、非人灵长类、大鼠、小鼠、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫、蝇、蠕虫，等等。受试者可以是临床患者、临床试验志愿者、实验动物，等等。受试者可以被怀疑患有癌症或存在患上癌症的风险，被诊断患有癌症，或是确认没有患癌症的对照受试者。在一个优选的实施方式中，所述受试者是人类。

癌症的诊断方法和癌症诊断的临床描绘是本领域普通技术人员已知的。如在此讨论的，通过测量COP1表达水平可以诊断或检测各种癌症，其中COP1的过量表达表明了癌症诊断结论。“过量表达”是指相对于对照，例如，相对于由非癌细胞正常产生的表达水平，特定分子，例如COP1的mRNA或多肽表达增加。展现COP1分子的过量表达的癌症也可以展现p53分子(例如，p53多肽)的降低的表达，或p21分子(例如，p21mRNA)的降低的表达。“表达水平的降低”是指相对于对照，例如，相对于由非癌细胞正常产生的表达水平，特定分子，例如p53或p21的mRNA或多肽表达的降低。当与对照相比时，这种提高或降低可以是10％和90％之间的任何值，或30％和60％之间的任何值，或超过100％，或可以是2倍到10倍之间的任何值，包括2倍和10倍，或更高，例如100倍。过量表达或提高、或者降低或减少的精确数量不是关键的，只要过量表达或降低是统计学上显著的。

根据本发明的试剂包括在此描述的化合物。在某些实施方式中，本发明涵盖包括在此描述的化合物的细胞，例如哺乳动物细胞。例如，通过例如重组技术，哺乳动物细胞可以被工程化，用以包括重组p53、重组Pirh2、重组MDM2和/或重组COP1分子，或用以降低或敲除内源蛋白表达，或通过改变编码这些蛋白的基因来突变那些蛋白。这些分子的表达水平或活性可以通过例如使用特异性针对这些分子的siRNA分子来降低。例如，这些哺乳动物细胞例如可以用于筛选干扰p53/COP1结合或抑制p53或COP1活性的测试化合物。

例如，为了筛选用于治疗癌症或细胞增殖性失调的测试化合物，对照细胞可以表达降低的或零水平的p53，和表达正常或增高的水平的COP1。测试细胞可以表达正常或增高水平的COP1和p53两者。可以用测试化合物孵育这种细胞，分析细胞周期、p21表达、p53诱导的细胞凋亡、p53依赖性反式激活、COP1连接酶活性等等方面的变化。可以使用基于构建体的报告物例如p21-荧光素酶，使用内部荧光素酶报告物作为背景以及实时RT-RCR技术。这种哺乳动物细胞可以在现有细胞系中进行工程化，例如p53野生型细胞系(U2-OS细胞)、或p53-null细胞系(H1299)，其可以被工程化来过量表达COP1分子。

根据本发明的分析可以在体内、体外或回体(ex vivo)使用从标准来源获得的样品并通过标准过程进行。“样品”可以是任何分离自受试者的器官、组织、细胞或细胞提取物，例如分离自患有癌症的哺乳动物的样品。例如，样品可以包括，但不限于，细胞或组织(例如，来自活组织检查或尸检)，其来自从患者(人类或动物)、测试受试者或实验动物获得的骨骼、脑、乳腺、结肠、肌肉、神经、卵巢、前列腺、视网膜、皮肤、骨骼肌、肠、睾丸、心脏、肝脏、肾脏、胃、胰腺、子宫、肾上腺、扁桃体、脾、软组织、外周血、全血、红血球浓缩物、血小板浓缩物、白细胞浓缩物、血细胞蛋白、血浆、富血小板血浆、血浆浓缩物、来自血浆的任何分馏物的沉淀、来自血浆的任何分馏物的上清液、血浆蛋白质馏分、纯化的或部分纯化的血液蛋白或其它成分、血清、精液、哺乳动物初乳、奶、尿、大便、唾液、脑脊液、心包液、腹膜液、胎盘提取物、羊水、冷沉淀物(cryoprecipitate)、冷上清液、细胞溶胞产物、哺乳动物细胞培养物或培养基、发酵产物、腹水、血细胞中存在的蛋白、实体肿瘤或其它样本，或其任何提取物。在某些实施方式中，期望的是从样品中得到的与非癌细胞分离的癌细胞。

样品还可以包括，但不限于，由正常的或转化的细胞(例如，经由重组DNA或单克隆抗体技术)的细胞培养物中产生的产物。样品还可以包括，但不限于，分离自非哺乳动物受试者，例如昆虫或蠕虫的任何器官、组织、细胞或细胞提取物。“样品”也可以是在实验条件下产生的、不是从受试者直接分离的细胞或细胞系。样品也可以是无细胞的、人工衍生的或合成的。样品可以来自已知是癌的、怀疑是癌的、据信不是癌的(例如，正常的或对照的)的细胞或组织。

“对照物”包括用于确定基线表达或活性而获得的样品。因而，可以通过许多方法从非癌细胞或组织，例如从围绕受试者的肿瘤或癌的细胞；从没患癌症的受试者；从不怀疑存在癌症风险的受试者；或从来自这些受试者的细胞或细胞系获得对照样品。对照物还包括早先已建立的标准物。因此，根据本发明的实施的任何测试或分析可以与所述建立的标准物相比，可以不必每次获得用于比较的对照样品。在体外遍在化分析中，对照物可以是具有降低的遍在化p53分子能力的COP1分子(例如，在它的连接酶结构域中有缺陷的分子例如COP1RΔRing)。

例如，COP1或p53分子可以在癌细胞、组织或细胞溶胞产物(cell lysate)中提供，或可以使用重组技术构建。可以使用微阵列，例如组织微阵列。可以从细胞或细胞系的商业来源，例如，ATCC，Manassas，VA，USA获得重组蛋白、细胞和/或细胞系。

可以从例如The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，USA，获得癌症的适合的动物模型。在某些实施方式中，可以使用在COP1或p53表达或活性中有缺陷的动物模型。

COP1或p53核酸分子或多肽表达或活性，或COP1/p53结合可以使用各种技术来分析，包括免疫组织化学(IHC)、原位杂交(ISH)、Northern印迹、聚合酶链式反应(例如，实时定量PCR或RT-PCR)、基于抗体的分析，例如免疫沉淀、免疫荧光、Western印迹，核酸测序等等。例如，对来自样品的PCR产物的如测序、单链构象多态性(SSCP)分析或限制性片断长度多态性(RFLP)分析的方法可以用于检测COP1或p53基因中的突变；免疫沉淀、RIA、ELISA或Western印迹可以用于测量COP1或p53多肽的水平或结合；COP1或p53基因或mRNA的表达可以使用反义寡核苷酸、siRNA或形成三链寡核苷酸下调来抑制转录或翻译；northern印迹可用于测量COP1或p53mRNA水平，或者PCR可以用于测量COP1或p53核酸分子的水平。这种分析包括任何或所有形式的COP1或p53的检测，包括前体、片段(例如，由内蛋白水解性降解产生的)、翻译后修饰的形式，等等。本发明的方法涵盖对COP1相关生物学活性的分析，例如p53降解、p53的遍在化、p53反式激活的抑制作用、p53诱导的细胞凋亡的抑制作用、p21mRNA的降低，等等。

在某些实施方式中，受试者中的细胞可以在体内暴露于抗体(例如，COP1抗体或p53抗体或两者)，所述抗体任选地被可检测地标记，例如放射性同位素，通过，例如放射性的外部扫描或活组织的分析可以评估所述抗体与细胞的结合。

可以使用可检测地标记的分子，即，用于标记和鉴定分子，例如寡核苷酸探针或引物、基因或其片段、肽、或cDNA分子的存在的任何手段，来进行分析。可检测地标记分子的方法是本领域公知的，包括，但不限于，放射性标记(例如，用同位素例如³²P或³⁵S)和非放射性的标记，例如酶的标记(例如，使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶)、化学发光的标记，荧光标记(例如，使用荧光素)、生物发光标记、或对附着于探针的配体的抗体检测。还包括在这个定义内的是通过间接手段可检测地标记的分子，例如，与第一部分(例如生物素)结合、随后与可被观察和分析的第二部分(例如，荧光素标记的链霉抗生物素蛋白)结合的分子。标记还包括毛地黄毒苷、荧光素酶和水母发光蛋白。

“检测”是用来包括确定物质的存在或不存在，或定量物质的数量。因而该术语是指使用本发明的材料、组合物和方法用于定性的和定量的测定。一般地，用于检测的特定技术对于实践本发明不是关键的。例如，根据本发明的“鉴定”包括使用本领域已知的或以下描述的方法检测：COP1、mdm2、p21或p53的基因、基因组或核酸分子或者COP1、mdm2、p21或p53多肽的存在或缺乏；COP1、mdm2、p21或p53基因中的突变；COP1、mdm2、p21或p53核酸分子，例如，mRNA或多肽的表达水平的变化；COP1多肽(例如，COP1连接酶活性、p53翻转(turnover)、p53依赖性反式激活活性的抑制)或p53多肽(例如，p53结合、p53依赖性反式激活、COP1结合、p21的反式激活，等等)的生物学功能/活性的变化。在某些实施方式中，“检测”可以包括检测野生型p53。在某些实施方式中，“检测”可以包括检测突变型p53。检测可以包括定量当与对照物相比时在10％和90％之间的任何值、或30％和60％之间的任何值、或超过100％的变化(提高或降低)。检测可以包括定量2倍到10倍之间的任何值，包括2倍和10倍，或更高，例如100倍的改变。

药物组合物&兽医用组合物、剂量和施用

本发明的化合物可以单独地或与其它化合物(例如，核酸分子、小分子、肽或肽类似物)组合地，在存在脂质体、佐剂或任何药学上可接受的载体的情况下，以适合于向哺乳动物，例如，人类、小鼠等施用的形式来提供。如果希望，用根据本发明的化合物处理可以和更多传统的和现有的癌症治疗组合，例如化学疗法例如烷化剂、抗代谢物、抗生素、抗微管化合物，例如，Avastin、CPT11、oxaliplatin、放射疗法，例如电离辐射，等等。在某些实施方式中，根据本发明的的治疗化合物包括针对COP1、p53、p21、MDM2或Pirh2分子的siRNA分子。根据本发明的的化合物可以长期地(chronically)或间歇地(intermittently)提供。“长期施用”是指化合物连续地施用延长的时间段，代替使用急性的短期剂量，以便维持最初的治疗效果(活性)。“间歇的”施用是用没有具体化合物的治疗的时段点缀其间的治疗。

可以采用常规的药物实践来提供适合的制剂或组合物，来将所述化合物施用给患有癌症或癌症前期症状的受试者。可以采用任何适当的施用途径，例如，胃肠外的、静脉内的、皮下的、肌肉内的、颅内的、眶内的、眼的、心室内的、囊内的、脊柱内的、鞘内的、脑池内的、腹膜内的、鼻内的、气雾、表面的或口服施用。治疗制剂可以是液体溶液或悬浮液形式，对于口服施用，制剂可以是片剂或胶囊的形式；对于鼻内的制剂，为粉末、滴鼻剂或气雾剂的形式。

在例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”(19^th edition)，ed.A.Gennaro，1995，Mack Publishing Company，Easton，Pa中，可以找到用于制备制剂的本领域公知的方法。用于肠胃外施用的制剂可以，例如，含有赋形剂、无菌水或盐水、聚二醇例如聚乙二醇、植物来源的油、或氢化的萘。生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧化丙烯共聚物可以用来控制化合物的释放。其它潜在地有用的胃肠外递送系统包括乙烯-醋酸乙烯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的输注系统和脂质体。用于吸入的制剂可以含有赋形剂，例如，乳糖，或可以是含有例如聚氧乙烯-9-十二烷基醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或可以是用于以滴鼻剂形式或作为胶体施用的油溶液。对于治疗或预防或防止性组合物，取决于癌症，以足够防止、抑制或减缓癌症生长或发展的量向个体施用化合物。化合物的效力的测量包括可观察的和/或可测量的以下一种或多种的降低或消失：癌细胞数目的降低或癌细胞消失，肿瘤大小的降低；癌细胞向周围器官浸润得到抑制(即，防止、抑制、减缓或停止)；肿瘤转移得到抑制(即，防止、抑制、减缓或停止)；肿瘤生长在一定程度上得到抑制；和/或与具体癌症相关的一种或多种症状一定程度上得到减轻，和发病率和死亡率降低。

根据本发明的“有效量”的化合物包括治疗有效量或预防有效量。“治疗有效量”是指在剂量上和在必需的时段内，实现期望的治疗结果有效的量，所述治疗结果例如可观察的和/或可测量的以下一种或多种的降低或消失：癌细胞数目的减少或癌细胞消失，肿瘤大小的降低；癌细胞向周围器官浸润得到抑制(即，防止、抑制、减缓或停止)；肿瘤转移得到抑制(即，防止、抑制、减缓或停止)；肿瘤生长在一定程度上得到抑制；和/或与具体癌症相关的一种或多种症状在一定程度上得到减轻，和发病率和死亡率降低。化合物的治疗有效量可以根据一些因素例如疾病状态、年龄、性别和个体的体重，和化合物在个体中引发期望的反应的能力而变化。可以调节给药方案来提供最佳的治疗反应。治疗有效量也是一种量，其中治疗有益的效果胜过化合物的任何毒性或不利影响。“预防有效量”是指在剂量上和必需的时段内，实现期望的预防结果有效的量，例如可观察的和/或可测量的一种或多种以下的降低或消失：癌细胞数目的减少或癌细胞消失，肿瘤大小的降低；癌细胞向周围器官浸润得到抑制(即，防止、抑制、减缓或停止)；肿瘤转移得到抑制(即，防止、抑制、减缓或停止)；肿瘤生长在一定程度上得到抑制；和/或与具体癌症相关的一种或多种症状在一定程度上得到减轻，和发病率和死亡率降低。一般地，在疾病之前或较早阶段，在受试者中使用预防剂量，从而预防有效量可以低于治疗有效量。化合物的治疗或预防有效量的优选的范围可以是从0.1nM-0.1M、0.1nM-0.05M、0.05nM-15μM或0.01nM-10μM之间的任何整数。

注意到，给药值可以随要减轻的状况的严重度而变化。对于任何具体受试者，根据个体需要和施用或监督组合物的施用的人的专业判断，可以调节具体的给药方案。以上阐述的剂量范围仅是示范性的，不限制可由执业医生选择的剂量范围。组合物中活性化合物的量可以根据一些因素例如疾病状态、年龄、性别和个体的体重而变化。可以调节给药方案来提供最佳的治疗反应。例如，可以使用单个丸剂(a single bolus)，可以随着时间使用几个分开的剂量(sevral divided doses)，或剂量可以视治疗情况的需求成比例降低或提高。以剂量单位形式(dosage unit form)配置胃肠外的组合物可能是有益的，便于施用和剂量均匀化(uniformity)。

对于疫苗制剂来说，可以提供本发明的化合物的免疫原性有效量，单独地或与其它化合物组合，与免疫佐剂，例如，Freund’s不完全佐剂、二甲基双十八烷基铵氢氧化物或氢氧化铝施用。化合物也可以与载体分子例如牛血清白蛋白或钥孔血蓝蛋白偶联来增强免疫原性。

一般地，应当使用本发明的化合物而不引起实质上的毒性。本发明的化合物的毒性可以使用标准技术测定，例如，通过在细胞培养物或实验动物中测试，并确定治疗指数，即，LD50(对群体的50％致死的剂量)和LD100(对群体的100％致死的剂量)之间的比例。然而在某些情况下，例如在严重的疾病状况中，施用实质上过量的组合物可能是必需的。

实施例1：材料和方法

表达载体、重组蛋白和抗体

早先已经描述了Flag-COP1³³。通过将COP1 PCR亚克隆到pcDNA3.1+(Invitrogen)中产生HA-COP1，通过将COP1亚克隆到pGEX6P1(Pharmacia)中产生GST-COP1。早先已经描述了pcDNA3.1+53、pG13-Luc、p21-Luc、bax-Luc、NS-Luc和pCMV-MDM2^21，22，35。

从来自HEK293T细胞的cDNA扩增全长COP1。通过PCR将HA-COP1亚克隆到pcDNA3.1+(Invitrogen)中，通过PCR和亚克隆到pGEX6P1(Pharmacia)中产生GST-COP1。通过将含有来自COP1启动子的p53共有位点的两个拷贝、或含有共有位点的突变体的寡核苷酸连接到pGL3-启动子(Promega)中，产生COP1-Luc和COP1mut-Luc。

所有GST重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)密码子+(Stratagene)中表达，用1mg/ml溶菌酶超声降解，在PBS中用蛋白酶抑制物混合物(Roche)用1％TritonX-100溶解，随后使用Glutathione Sepharose4B分批方法纯化，用还原的谷胱甘肽洗脱或用PreScission蛋白酶(Pharmacia)裂解。重组蛋白的体外转录/翻译使用带T7/T3的TnT试剂盒(Promega)或Rapid翻译系统(RTS)(Roche)进行。

根据厂家的推荐使用抗-p53(DO-1；Calbiochem)、抗-p53(1801；BDPharmingen)、抗-p53(FL-393；Santa Cruz Biotechnology)、抗-p21(Ab-1；Calbiochem)、抗-MDM2(2A10；Calbiochem)、抗-Flag(M2；Sigma)、抗-Myc(9E10；Roche)、抗-His-HRP(Roche)、抗-肌动蛋白(ICN)、抗-GST(B-14；Santa Cruz Biotechnology)和抗-HA(Roche)。抗-COP1是针对人类COP1的氨基酸71-270产生的单克隆抗体。

细胞、转染、报告物和细胞凋亡分析

U2-OS、Saos-2、HEK293T和BJ细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)并在McCoy’s 5A(Invitrogen)或DMEM(Sigma)培养基中维持。p53^-/-/MDM2^-/-MEFs在具有10％FBS和1x L-Glutamine的DMEM中生长。H1299细胞在RPMI中生长。

根据厂家的推荐使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Oligofectamine(Invitrogen)或Geneporter 2(Gene Therapy Systems)进行所有转染。为了评价COP1对p53的稳态水平的影响，用渐增量的FLAG-COP1或FLAG-COP1ΔRING和250或500ng pcDNA3.1+p53转染Saos-2细胞，或者用或不用渐增量(0.5、1和2μg)的pCMV-FLAG-COP1或pCMV-FLAG-COP1ΔRING转染U2-OS细胞，按说明在收获细胞之前用50μMALLN处理6小时。

对于报告物分析，用150或250ng pcDNA3.1+p53或pcDNA3.1+p53R175H、100ng p21-Luc、bax-Luc、COP1-Luc、COP1mut-Luc或NS-Luc，和10ng pCMVβ-Gal，有或没有渐增量(0.5、1和2μg)的pCMV-FLAG-COP1或pCMV-FLAG-COP1ΔRING短暂地转染Saos-2或H1299细胞。根据厂家的说明书进行荧光素酶分析，并针对β-半乳糖苷酶活性(Promega)归一化。

对于p53依赖性细胞死亡分析，用1μg增强的绿色荧光蛋白(EGFP)和5μg pcDNA3.1+、pcDNA3.1+p53、pCMV-FLAG-COP1或pcDNA3.1+p53和pCMV-FLAG-COP1短暂地转染Saos-2细胞48小时。收获细胞，用碘化丙锭染色，用于通过荧光激活的细胞分选(FACS)进行分析。挑选转染的细胞，根据DNA含量确定随后的细胞周期分布型。

通过Genentech或Dharmacon合成具有30个dTdT悬伸的COP1siRNA1(AACUGACCAAGAUAACCUUGA)(SEQ ID NO：2)，COP1siRNA1反向的(AAAGUUCCAAUAGAACCAGUC)(SEQ ID NO：3)，COP1siRNA2(AAGACUUGGAGCAGUGUUACU)(SEQ ID NO：4)，COP1siRNA3(AAGAGGUGUUGGAGUGUUGAC)(SEQ ID NO：5)，Pirh2siRNA1(AACTGTGGAATTTGTAGG)(SEQ ID NO：6)，Pirh2B反向的(AAGGAUGUUUAAGGUGUCAA)(SEQ ID NO：7)，Pirh2siRNA2(AAUGUAACUUAUGCCUAGCUA)(SEQ ID NO：8)，Pirh2siRNA2反向的(AAAUCGAUCCGUAUUCAAUGU)(SEQ ID NO：9)和MDM2(AAGGAAUUUAGACAACCUGAA)(SEQ ID NO：10)siRNA寡核苷酸。实验中的对照siRNA是指反向的siRNA寡核苷酸的混合物。用siRNA寡核苷酸以24-36h的间隔转化U2-OS、h1299、Saos-2和BJ细胞三次，并根据需要扩增以防止接触抑制。

免疫沉淀和GST pull down分析

在免疫沉淀(IP)裂解缓冲液(1％Triton X-100，150mM NaCl，50mMTris，pH 7.4，和蛋白酶抑制物混合物)或放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液(0.1％SDS，1％NP-40，150mM NaCl，0.5％脱氧胆酸盐，50mM Tris，pH 7.4，和蛋白酶抑制物混合物)中裂解细胞，用目标抗体和蛋白A/GPLUS珠子(Pierce)预先澄清和免疫沉淀。COP1相互作用蛋白的鉴定如早先描述的进行³³，除了制备稳定地表达Flag-COP1的U2-OS细胞。

在PBST(具有0.1％Tween 20的PBS)中用与体外翻译的HA-COP1组合的5μg GST或GST-p53，在冰上孵育1小时进行GST pull down分析。然后向混合物添加谷胱甘肽琼脂糖4B珠子，孵育1小时，随后用PBST洗涤5次。使GST-结合的蛋白进行SDS-PAGE和使用抗-HA和抗-GST对其进行免疫印迹。按需要用高盐裂解缓冲液洗涤IPs。如早先描述的进行脉冲追踪试验⁷，除了用pCMV-Flag6a或pCMV-Flag-COP1转化HEK293T细胞24h，和用所指明的siRNA寡核苷酸转染U2-OS细胞。

原位杂交、实时PCR和Northern印迹

如早先描述的²³，使用COP1-1特异性688bp³³P标记的反义核探针，对石蜡包埋的组织和组织微阵列(TMA)切片进行同位素原位杂交。这种探针覆盖了COP-1从核苷酸364开始编码序列的大部分5′一半。从相同的模板转录的并包括在每个杂交实验中的有义对照探针没有显示在任何组织中的背景之上的信号。如早先描述²⁴的构建代表正常组织和卵巢肿瘤的TMA。卵巢肿瘤TMA由正常卵巢、输卵管、子宫的样品以及78个表面上皮细胞瘤组成。使用Qiagen RNAeasy试剂盒从细胞或组织提取总RNA，设计探针用于COP1、p21、RPL19和β-肌动蛋白mRNA的实时PCR。使用ABI 7700序列检测器根据厂家的推荐进行所有反应。

在65℃在Church缓冲液(35.5g/L Na₂HPO₄，0.17％(v/v)H₃PO₄，1％(w/v)牛血清白蛋白，1mM EDTA，7％(w/v)SDS)中小鼠Multiple TissueNorthern Blots(Clontech)与全长、³²P标记的鼠COP1cDNA杂交过夜。在40mM磷酸钠缓冲液pH 7.2/1％(w/v)SDS中在65℃洗涤滤膜，在-70℃对底片曝光。

体外和体内遍在化分析

对于体外遍在化反应，用抗-p53(DO-1和1801)免疫沉淀体外翻译的p53，用PBST洗涤5次，在蛋白A/G珠子上进行反应。在室温用20μM ZnCl₂预先孵育30分钟的10μg His-Ubiquitin(Boston Biochem)或FLAG-遍在蛋白(Sigma)、20ng Ubc5Hb(A.G.Scientific)、20ng兔E1(Sigma)和500ng GST-COP1(E3)，与30μl的总体积的含有50mM Tris pH7.5，2mMATP，5mM MgCl₂和2mM DTT的缓冲液孵育。在30℃孵育2小时之后，然后在具有1％SDS的PBST中使反应沸腾5分钟，然后降低到0.2％的SDS使用抗-p53(DO-1和FL-393)进行重新免疫沉淀。最后，在95℃在SDS样品缓冲液中用2-巯基乙醇孵育样品，进行SDS-PAGE，继之以使用抗-His-HRP(Roche)或抗-FLAG-HRP(M2)的免疫印迹来检测p53的遍在化的种类。

对于体内分析，用100ng HA-Ub、500ng pcDNA3.1+p53、2μgpCMV-FLAG6a、pCMV-FLAG-COP1或pCMV-FLAG-COP1ΔRING转化H1299s或p53^-/-/MDM2^-/-MEF，在收获之前用50μM ALLN处理2小时，用抗-HA进行免疫沉淀和用抗-p53(DO-1)进行Western印迹。

COP1相互作用蛋白的鉴定

通过用pcDNA3.1+共转染并根据G418(Invitrogen)抗性进行选择，产生表达pCMV-FLAG-COP1或pCMV-FLAG6a的U2-OS稳定细胞系。扩增FLAG或FLAG-COP1表达克隆并用50μM ALLN处理2小时，然后用低渗的裂解缓冲液(10mM KCl、1.5mM MgCl₂、10mM HEPES pH7.9，1mM DTT、蛋白酶抑制物混合物)收获，继之进行匀浆。然后将通过离心澄清的溶胞产物进行与抗-FLAG M2珠子(Sigma)的孵育。在过夜孵育之后，用洗涤缓冲液1(20mM HEPES pH7.9，420mM NaCl，1.5mM MgCl₂，0.2mM EDTA，25％甘油和蛋白酶抑制物混合物)洗涤珠子1次，用洗涤缓冲液2(0.1％NP-40，20mM Tris pH7.5，300mM NaCl和蛋白酶抑制物混合物)洗涤5次。用300μg/ml FLAG肽(Sigma)洗脱结合的蛋白，随后通过SDS和银染色分析。切下感兴趣的条带，用胰蛋白酶原位消化，通过毛细管液相色谱-离子阱串联的质谱法(ion trap tandem mass spectrometry)对产生的肽测序。

p53基因测序、实时PCR和western印迹

分离肿瘤样品并通过强力涡旋在裂解缓冲液(1％SDS、20mM TrispH7.5，2mM EDTA，400mM NaCl)中进行重悬浮，补充500μg/ml蛋白酶K(Sigma)，在55℃孵育过夜直到样品完全消化。然后将样品以1∶1比例和苯酚-氯仿-isoayml alcohol(25∶24∶1)重悬浮，以14,000rpm离心10分钟之前在室温孵育30分钟。然后在等体积的异丙醇中重悬浮上部的水层，进一步离心15分钟。产生的团粒在70％乙醇中洗涤，在无核酸酶的H₂O中重悬浮。对于石蜡包埋的组织微阵列样品，通过在65℃在30μlPicoPure K提取缓冲液(Arcturus，Mountainview，CA)中孵育微切割的肿瘤组织48小时来提取DNA。在95℃将消化物热钝化10分钟，直接添加到PCR反应中(ExpandHigh Fidelity PCR系统，Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN)。分离的基因组DNA进行用以下引物进行PCR，所述引物针对p53基因的外显子5-8并包括M13特异性序列：

外显子5R(CAGGAAACAGCTATGACCAGCCCTGTCGTCTGTCCA)(SEQ ID NO：11)

外显子5F(TGTAAAACGACGGCCAGTTTCAACTCTGTCTCCTTC)(SEQ ID NO：12)

外显子6R(CAGGAAACAGCTATGACCTTAACCCCTCCTCCCAGAGA)(SEQ ID NO：13)

外显子6F(TGTAAAACGACGGCCAGTGCCTCTGATTCCTCACTGAT)(SEQ ID NO：14)

外显子7R(CAGGAAACAGCTATGACCTGTGCAGGGTGGCAAGTGGC)(SEQ ID NO：15)

外显子7F(TGTAAAACGACGGCCAGTAGGCGCACTGGCCTCATCTT)(SEQ ID NO：16)

外显子8R(CAGGAAACAGCTATGACCAGGCATAACTGCACCCTTGG)(SEQ ID NO：17)

外显子8F(TGTAAAACGACGGCCAGTCCTTACTGCCTCTTGCTTCTC).(SEQ ID NO：18)

用M13F和M13R测序引物，使用荧光染料-终止子化学方法(AppliedBiosystems，Foster City CA)对PCR产物测序。

使用如下的针对COP1、p21、Pirh2、β-肌动蛋白和RPL19的特异性探针，从分离自正常和肿瘤样品的总RNA进行实时PCR。使用ABI 7700序列检测器根据厂家的推荐进行所有反应。

RT-PCR引物序列：(所有引物扩增每个基因的3′UTR的片段)

ss.Pirh2-1290F-TCCTCTAAATGTGAATTTTGATGTAA(SEQ ID NO：19)

ss.Pirh2-1463R-TCCCAACTACTTTTATGGAATACCT(SEQ ID NO：20)

ss.Pirh2-1359T-TTTTCCAAAGTTTTCTATGTTTGGCTCAATTAGG(SEQ ID NO：21)

p21WAF1-1866F-GTGCTTAGTGTACTTGGAGTATTGG(SEQ ID NO：22)

p21WAF1-1939R-AGTCCAGGCCAGTATGTTACAG(SEQ ID NO：23)

p21WAF1-1893T-TCTGACCCCAAACACCTTCCAGC(SEQ ID NO：24)

b-actin-1312F-AAAACTGGAACGGTGAAGGT(SEQ ID NO：25)

b-actin-1380R-CGGCCACATTGTGAACTT(SEQ ID NO：26)

b-actin-1356T-ATGCTCGCTCCAACCGACTGC(SEQ ID NO：27)

hCOP-2362F-CCTTTGGGACATTGGGAAT(SEQ ID NO：28)

hCOP-2436R-CCACCAAGAGCAGCAATGT(SEQ ID NO：29)

hCOP-2382T-CCCAGCCAACTCTCCACCATCAA(SEQ ID NO：30)

RPL19序列：

DNA103410-432F AGCGGATTCTCATGGAACA(SEQ ID NO：31)

DNA103410-502R CTGGTCAGCCAGGAGCTT(SEQ ID NO：32)

DNA103410-453T TCCACAAGCTGAAGGCAGACAAGG(SEQ ID NO：33)

在TLB(0.5％NP40、20mM Tris pH7.5、5mM EDTA、蛋白酶抑制物混合物(Roche))中收获组织，继之以匀浆。在进行SDS-PAGE和western印迹分析之前通过在20,000×g离心60分钟来澄清溶胞产物。用针对COP1、p53(DO-1和1801，Santa Cruz Biotechnology)和肌动蛋白(ICN)的抗体对膜进行探查。

COP1和p53的免疫组织化学

收集组织，在10％中性缓冲液的福尔马林中固定，并包埋入石蜡。将玻璃载片上的5μ切片脱蜡并在蒸馏水中水化。对于p53染色，在99℃在Dako Target Retrieval(Dako，S1700)溶液中将载玻片孵育20分钟，然后在TBST中漂清载玻片。使用KPL封闭缓冲液(KPL，37-00-84)和Vector抗生物素蛋白/生物素试剂盒(Vector，SP2001)使内源的过氧化物酶、抗生物素蛋白和生物素淬灭，随后是TBST漂清。在3％BSA/PBS的10％正常马血清中孵育载玻片30分钟。然后在室温在5μg/ml抗-p53抗体(NovusBiologicals，NB200-104)中孵育载玻片60分钟。在TBST中洗涤之后，在室温用2.5μg/ml生物素化的马抗小鼠第二抗体(Vector，BA2001)孵育载玻片30分钟。用TBST洗涤之后，在室温用Vectastain ABC Elite试剂(Vector，PK6100)孵育载玻片30分钟。然后用TBST漂清载玻片，用Pierce MetalEnhanced DAB孵育四分钟，在水中漂洗。然后载玻片用Mayer’s苏木素复染，脱水，封固并盖上玻片，用于明视野观察。对于COP1染色，在99℃在Dako Target Retrieval High pH溶液(Dako，S3308)中孵育载玻片20分钟，然后载玻片在TBST中漂洗。使用KPL封闭试剂和Vector抗生物素蛋白/生物素试剂盒淬灭内源的过氧化物酶、抗生物素蛋白和生物素，随后TBST漂清。在3％BSA/PBS的10％正常马血清中孵育载玻片30分钟。然后在室温在1μg/ml抗-COP1(克隆1D5)抗体中孵育载玻片60分钟。在TBST中洗涤之后，在室温用2.5μg/ml生物素化的马抗小鼠第二抗体孵育载玻片30分钟。在TBST洗涤之后，在室温用Vectastain ABC Elite试剂孵育载玻片30分钟。然后在biotinyl tyramide试剂(Perkin Elmer，NEL700)中孵育载玻片3分钟，随后TBST洗涤，然后用Vectastain ABC Elite试剂孵育30分钟。在TBST洗涤之后，用Pierce Metal Enhanced DAB孵育载玻片四分钟，在水中漂清，用Mayer’s苏木素复染，脱水，封固并盖上玻片。

实施例2：p53是COP1的底物

为了获得COP1如何调节细胞过程的了解，使来自稳定表达FLAG标记的COP1或空载体的U2-OS细胞的溶胞产物经历与抗-FLAG的免疫沉淀，通过FLAG肽洗脱结合的蛋白，通过SDS-PAGE分析，通过质谱法测序特定的条带(附图1A)。大约53kDa处的条带的质谱分析显示了来自肿瘤抑制物蛋白p53的5个匹配肽。为了确认这种相互作用是真实的，无p53的Soas-2细胞用p53和Myc-COP1转染，用抗-p53(DO-1)免疫沉淀，用抗-Myc免疫印迹(附图1B)。COP1仅在存在转染的p53的情况下被免疫沉淀，从而表明COP1可以与p53相互作用。还用转染的COP1和内源的p53观察到这种相互作用(附图1C)。此外，在U2-OS细胞中在p53和COP1之间在内源蛋白水平存在相互作用(附图1D)。体外翻译的血凝素(HA)-COP1能够在体外与谷胱甘肽S-转移酶(GST)-p53相互作用(附图1E)。

通过用稳定量的p53和增加量的FLAG-COP1或缺少RING指结构域的COP1突变体FLAG-COP1ΔRING转染，来评定COP1影响p53蛋白的稳态水平潜力。COP1的转染引起外源p53蛋白的稳态水平的降低，其随RING指结构域的删除被取消(附图2A)。为了评定COP1是否影响内源p53的稳态水平，用FLAG-COP1或FLAG-COP1ΔRING转染U2-OS细胞(附图2B)。与在外源p53的情况下一样，COP1能够降低内源p53的稳态水平，其取决于COP1的RING指结构域。

为了获得对p53蛋白水平中这种降低机制的进一步的了解，对p53基因进行实时PCR来确定COP1是否抑制p53基因转录(附图2C)。在U2-OS细胞中Flag-COP1或Flag-COP1ΔRING的转染没有引起p53信使RNA水平的显著的变化。然而，使用脉冲追踪分析，在人类胚肾HEK293T细胞中COP1的转染显示了相对于空的载体对照p53半衰期的明显降低，表明COP1主动地提高p53的翻转(turnover)。假定p53的半衰期由于COP1过量表达显著地缩短，并且这与p53mRNA影响或对MDM2蛋白水平的任何直接影响无关，那么这种效果可能是翻译后的。

为了测试这种假说，用FLAG-COP1或FLAG-COP1ΔRING转染U2-OS细胞，并用DMSO或蛋白酶体抑制物ALLN处理(附图2E)。ALLN的添加显著地提高了p53蛋白的水平，这早先已由Flag-COP1的转染降低，表明COP1指导了p53的蛋白酶体介导的降解。

为了确定p53经由蛋白酶体的COP1介导的降解是否是p53遍在化的结果，用p53、FLAG-COP1或FLAG-COP1ΔRING和HA-遍在蛋白转染H1299或Saos-2细胞(附图2F)。用抗-HA免疫沉淀和用抗-p53免疫印迹揭示了p53的遍在化的种类仅与FLAG-COP1的共转染存在。这些数据表明COP1靶向p53，通过遍在化经由蛋白酶体降解。

为了确定COP1是否通过MDM2或Pirh2起作用来调节p53降解，在p53^-/-/MDM2^-/-小鼠胚成纤维细胞(MEFs)中或在通过siRNA耗尽Pirh2的Saos-2细胞中进行p53和COP1或COP1ΔRING的短暂转染，并评定它们影响p53稳态水平的能力(附图2J，K)。基本上，COP1能够解释在含MDM2和Pirh2的细胞中实现的p53的负调节。这些结果表明COP1在调节p53时可以独立于MDM2起作用。

由于COP1在体内调节p53的遍在化(附图2F)，我们希望确定在体外p53是否是COP1的直接底物。在大肠杆菌中表达GST和GST-COP1，并纯化，随后用于使用体外翻译的p53进行遍在化分析(附图2G)。只有存在所有的反应成分和p53时COP1才能直接遍在化p53。因此，这些数据表明COP1充当了p53的E3连接酶。

实施例3：

为了确定COP1过量表达对p53依赖性反式激活的影响，用p53和COP1或COP1ΔRING，和p21-荧光素酶(Luc)或bax-Luc转染Saos-2细胞(附图2H，L)。添加COP1显著地降低p53从p21和bax启动子反式激活的能力。此外，内源p53的反式激活能力，以及由DNA损伤诱导的能力，通过COP1的过量表达以相同的方式被消除(附图2M)。为了进一步评定COP1负调节p53的能力，我们确定了COP1是否能在Saos-2细胞中抑制p53诱导的细胞死亡(附图21)。p53的转染显著地提高SubG1群体中的细胞群体，尽管如此，这被COP1的共转染显著地抑制，表明COP1抑制p53诱导的细胞死亡。单独的COP1转染对细胞周期分布没有深刻的影响。

为了揭示COP1在更多生理情况下的作用，使内源COP1经历通过siRNA的消除(ablation)，评定对内源p53稳态水平的任何影响(附图3A)。通过实时PCR和免疫印迹来评定COP1的敲除。在U2-OS细胞中通过siRNA缺失(delete)COP1引起p53蛋白的显著积累。这些结果是可以用两种进一步的独立的siRNA寡核苷酸(附图3D)重现，表明COP1在未应激的细胞中负调节p53。根据这种p53蛋白水平的显著积累，我们接下来确定了p53是否可以诱导它的下游目标基因，p21和Pirh2。使用实时PCR，我们观察了响应于COP1消除的p21和Pirh2mRNA的显著提高，表明了p53依赖性转录的提高。此外，通过导入COP1siRNA，总p21蛋白水平显著地提高。相比之下，COP1siRNA寡核苷酸向p53-null细胞系H1299中的转染对p21蛋白或对p21和Pirh2mRNA水平没有影响。此外，在U2-OS细胞中COP1的缺失引起G1/S比例的显著的提高(1.82到3.71)，但在H1299细胞中未能具有任何影响(附图3C)表明G1延滞以p53依赖性方式发生。

为了确认在未应激的细胞中COP1介导p53翻转，在缺失COP1的U2-OS细胞中进行脉冲追踪分析(附图4A)。相对于对照物，COP1蛋白的消除提高了p53的半衰期2倍。还通过siRNA消除了Pirh2和MDM2，用于脉冲追踪分析和与COP1比较。相比对照物，Pirh2的缺失提高了p53的半衰期1.5倍，而MDM2消除提高了p53的半衰期2倍。将COP1置于MDM2和Pirh2的环境中，通过siRNA的COP1和Pirh2的共消除引起p53半衰期的进一步提高，超过对照3.5倍。令人惊讶地，COP1和MDM2一同消除引起了对p53半衰期的协同作用，使其延长8倍。通过同时的Pirh2消除没有进一步延长所述半衰期，表明p53的半衰期在这个特定系统中已经达到了最大值。进行报告物分析来测量p53的反式激活功能(附图4B)。与p53的半衰期方面的提高相符，在COP1、Pirh2或MDM2的消除时，存在p21启动子的反式激活的中度提高，伴随来源于MDM2的消除的最高刺激。在蛋白水平也证实了这些观察结果(附图4C)。响应于COP1和MDM2的共消除，还存在着来自p21启动子的显著刺激和蛋白水平方面的提高(附图4A，B)。值得注意的是，响应于所有E3连接酶的消除，p53或p21蛋白水平(附图4C)，或启动子活性(附图4B)没有进一步增强，表明增生细胞可能具有p21和/或p53的有限阈值。此外，COP1、Pirh2或MDM2的消除引起正常BJ成纤维细胞中p53和p21稳态水平的提高，表明每种连接酶在正常细胞中在负调节p53方面具有作用(附图4D)。

根据COP1和MDM2的消除引起p53反应的观察结果，我们测试了COP1和/或MDM2的缺失是否在U2-OS细胞中恢复正常的DNA-损伤反应，因为已知它们对电离辐射(IR)诱导的细胞死亡是高度抗性的³¹。用针对COP1和/或MDM2的siRNA寡核苷酸转染U2-OS细胞，随后用20Gy IR处理，通过碘化丙锭染色评估细胞死亡(附图4E)。用对照siRNA预先处理的U2-OS细胞在用IR处理后对细胞死亡是高度抗性的；然而，用COP1或MDM2siRNA预先处理的细胞产生了对IR诱导的细胞死亡敏感的细胞亚群。更显著地，通过siRNA的COP1和MDM2的同时消除引起了对IR的细胞死亡的协同致敏。

COP1是参与负反馈环路的p53可诱导的基因

假定MDM2和Pirh2形成自动调节的反馈环路，我们研究了COP1也是这种调节机制的部分的可能性。扫描COP1基因的启动子区域揭示了，相对转录起始位点(+1)从-2094到-2073的p53共有结合位点³²的存在(附图5A)。将这个共有位点(COP1-Luc)或这个共有位点版本的突变体(COP1mut-Luc)的两个拷贝插入到含有最小启动子的荧光素酶报告基因的上游，并转染到具有pcDNA3.1+，p53或DNA结合突变体p53R175H的H1299细胞中(附图5B)。p53的转染提高了COP1-Luc的荧光素酶活性，但COP1mut-Luc报告物构建体没有，而p53R175H突变体未能对COP1-Luc或COP1mut-Luc具有任何深刻的影响。此外，同实时PCR评定的，p53的转染实质上提高了H1299细胞内的COP1mRNA水平(附图5C)。还通过用抗-COP1的western印迹检测了总COP1蛋白方面的提高(附图5D)。此外，用IR处理的U2-OS细胞，其活化了p53依赖性转录并稳定了p53，引起了相对未处理细胞的COP1蛋白水平的提高(附图5E)。作为对照，还通过免疫印迹评定了p21和p53蛋白水平来证实IR损害引发了p53反应。结合起来，这些数据表明，COP1是参与负反馈环路的p53可诱导的基因。

COP1在癌细胞中过量表达

通过实时PCR和原位杂交(ISH)技术在哺乳动物细胞/组织中检查COP1表达。我们通过ISH(附图6A)、RT-PCR(附图6B)和Northern印迹(附图6C)在正常的鼠组织中进行了表达分析。ISH分析表明，cop1在正常的鼠骨骼肌、肠和睾丸中表达。在睾丸中，在赖氏细胞(Leydig cells)中显著的表达是明显的，在生殖细胞中也存在中度的信号(附图6A)。Northern印迹画面证实了cop1在睾丸以及心脏、肝脏和肾脏中表达(附图6C)。cDNA画面RT-PCR也表明，cop1在脑、胃、小肠、胰腺、肾上腺、子宫和前列腺中表达。RT-PCR和Northern印迹画面对于全长cop1mRNA表达的组织分布是良好符合的。除了鼠组织之外，我们通过ISH评估了人类组织并在正常人扁桃体、脾、睾丸、胰腺和结肠中鉴定了cop1表达。这与之前的发现是一致的，之前的发现通过Northern印迹显示了在正常人睾丸、胸腺、结肠、心脏、前列腺、脾、肠和肝脏中显著的cop1表达。³⁶

为了确定COP1基因表达在癌症中是否改变，从各种正常组织和肿瘤样品收获了总RNA，通过实时PCR和针对RPL19mRNA来标准化测定了相对cop1表达。存在着cop1mRNA相对正常对照的2-8倍显著提高(附图7A)。因而，我们在由67个卵巢腺癌病例的0.6mm核心组成的卵巢组织微阵列(TMA)上使用ISH的cop1特异性探针一式三份进行了大量的研究。浆液腺癌的30％(8/27)病例显示了仅在恶性细胞内的阳性信号，而在基质区室中(附图7B)或正常卵巢组织中没有观察到信号。此外，子宫内膜腺癌(Endometrioid adenocarcinoma)的16％(3/19)病例和明细胞腺癌(clear celladenocarcinoma)的27％(3/11)病例显示了编码COP1的mRNA的阳性信号(表1)。

表1：组织微阵列上卵巢腺癌病例的概述。通过ISH和IHC展现了COP1表达。

	ISH(#阳性/总病例)	IHC(#阳性/总病例)

核心诊断(Core Diagnosis)
核心诊断(Core Diagnosis)
浆液腺癌				8/27	11/27
浆液腺癌	子宫内膜腺癌	3/19	12/19	8/27	11/27
明细胞腺癌	子宫内膜腺癌	3/19	12/19	3/11	4/11
明细胞腺癌	粘蛋白腺癌	0/10	5/10	3/11	4/11
卵巢腺癌的总病例	粘蛋白腺癌	0/10	5/10	14/67	32/67

为了证实在蛋白水平上COP1在这些肿瘤中过量表达，对如上所述的相同卵巢TMA以及附图7A中用于RT-PCR的卵巢样品进行使用针对COP1的特异性抗体的IHC分析。TMA的结果在表1中概述，显示了47％(11/27)的浆液腺癌、63％(12/19)的子宫内膜腺癌、36％(4/11)的明细胞腺癌和50％(5/10)的粘蛋白腺癌显示了在恶性细胞的核和细胞质区室内的强的COP1免疫反应性；然而，在基质内没有检测到信号(附图7C)。此外，正常组织对于与COP1抗体的任何反应性是阴性的。总起来说，这些数据表明了COP1mRNA和蛋白质在恶性细胞中特异性地过量表达。存在着ISH和IHC数据的良好拟合(表1)；相对于ISH数据，根据IHC子宫内膜和粘蛋白腺癌显示了更高百分比的COP1阳性样品，提示了COP1的转录后调节。

接下来我们希望确定过量表达COP1的任何肿瘤样品是否带有p53依赖性反应中的缺陷。为了解决这个问题，我们使用针对p53目标基因和cyclin-依赖性激酶抑制物p21/WAF1的特异性探针对过量表达COP1卵巢肿瘤进行了实时PCR(附图7A)，通过与正常对照样品比较，评定了mRNA中的倍数变化。相对于匹配的正常对照，过量表达COP1的大多数样品显示p21mRNA显著降低(附图7D)。这些结果与COP1负调节p53活化p21转录的能力相一致。

假定在卵巢癌症中p53可能是突变的，那么确定这些样品中的p53基因状态是重要的，因为p53的特定突变体丧失了它们从p21启动子反式激活的天生能力。例如，如果在COP1过量表达的样品中p53被突变，则观察到的p21mRNA的减量调节可能独立于p53。因此，我们对经常鉴定出p53突变的外显子5-8以及内含子-外显子边界进行了测序，发现这些样品的7/8是野生型的，1/8具有R249S突变，其位于p53DNA结合区中并显示使正常的乳腺上皮细胞永生。³⁷此外，R249S突变卵巢样品(编号8)具有正常水平的p21mRNA，与通过COP1的野生型p53依赖性转录的抑制相符。

使用COP1特异性抗体，在具有1mm核心上排列的32例乳腺腺癌的TMA上进行了IHC。引人注目地，81％(25/32)的病例显示了在恶性细胞中专有的、而在基质或正常的上皮细胞内没有的与COP1抗体的强免疫反应性(附图8A和8B)。使用不受蛋白质磷酸化影响的1801p53-特异性抗体的IHC分析³⁸揭示了仅3/32例具有阳性信号(附图8E和8F)。相比之下，COP1阳性的大多数病例是p53阴性的(附图83C和8D)。假定除非被DNA破坏剂或基因突变稳定化，通过IHC难以在组织中检测p53，对来自乳腺TMA的p53基因进行测序来确定这些特定的样品实际上是突变的p53(附图8G)。在三个病例的每一个中鉴定的突变引起如下的氨基酸替换：C242F、P278S和R175H。

为了更为定量地比较乳腺癌样品中p53和COP1的蛋白水平，我们进行了肿瘤溶胞产物的Western印迹分析(附图9A、B)。用抗COP1的免疫印迹揭示了正常乳腺组织(样品N)中非常弱的信号，但在67％(10/15)的病例中检测到COP1的显著提高，证实了使用乳腺TMA的早先的观测(附图8A和8B)，COP1在乳腺腺癌中实际上过量表达。与正常的乳腺组织相比时，在53％(8/15)的病例中p53水平降低，但在20％(3/15)的病例中显著地提高。

为了进一步阐明COP1过量表达对p53的重要性，必需确定这些样品中的p53基因状态。因此，外显子5-8被测序并分析了在内含子-外显子边界处的突变以及外显子的突变。27％(4/16)的病例带有外显子8内的突变(附图9B)：样品T6和T12含有R290H突变，而样品T7和T10带有R273H突变。当在乳腺肿瘤中过量表达COP1时，所述乳腺肿瘤表现出75％(6/8)的病例野生型p53水平被显著降低，p53的稳态蛋白水平被显著地降低，COP1被过量表达。仅25％(2/8)的病例显示p53水平的降低。当观察到COP1过量表达并且p53水平没有伴随的降低时，p53基因状态是突变的，从而表明COP1具有负调节野生型p53的能力。

结果表明，至少45％的卵巢腺癌和80％的乳腺腺癌具有强的COP1过量表达，在含有野生型p53和过量表达COP1的某些样品中、但不在含有突变p53和过量表达的COP1的样品中，可以看到p53功能或稳态蛋白水平中的缺陷(附图7A-D和9A-B)。在含有野生型p53的癌症中主要地而不是专有地检测到COP1的过量表达，表明COP1的主要作用之一是抑制p53依赖性肿瘤抑制。

在各种癌症中COP1和p53水平的检查产生以下结果：对于结肠腺癌，12/38病例是p53阳性的，12个p53阳性病例中的5个也是COP1阳性的，8例是COP1阳性p53阴性；对于乳腺腺癌，3/32例是p53阳性，根据IHC，3例p53阳性病例的2例也是COP1阳性的，23/32例是COP1样品p53阴性；对于移行细胞癌(transitional cell carcinoma)(肾脏、前列腺、膀胱)，3/3例是p53和COP1阳性的；对于肺部腺癌，1/3是p53和COP1阳性的；对于淋巴瘤，1/3是p53和COP1阳性的；对于卵巢腺癌，32/67是COP1阳性的，亚型COP1阳性如下：浆液腺癌11/27；子宫内膜腺癌12/19；明细胞腺癌4/11；粘蛋白腺癌5/10。

因此，COP1在许多癌症中过量表达，包括乳腺癌、卵巢癌症等等，这伴随着野生型p53稳态蛋白水平或p53依赖性转录方面的下降。我们还在卵巢、血清、子宫内膜腺癌和粘蛋白腺癌的一些病例中通过IHC检测了COP1，通过ISH在mRNA水平没有观察到可检测信号，表明COP1蛋白的稳态水平方面的提高也可以在翻译后水平发生而不是提高转录。

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其它实施方式

虽然在此公开了本发明的各种实施方式，根据本领域技术人员的公知常识可以在本发明的范围内进行许多修改和修饰。这种修饰包括替换本发明的任何方面的已知的等价物从而以基本上相同的方式达到相同结果。在此使用的登记号，是指来自多个数据库的登记号，对于核苷酸序列包括GenBank、欧洲分子生物学实验室(EMBL)、日本的DNA数据库(DDBJ)、或基因组序列数据库(GSDB)，对于多肽序列包括蛋白质信息资源(PIR)、SWISSPROT、蛋白质研究基金(PRF)和蛋白质数据库(PDB)(来自确定了结构的序列)以及来自GenBank、EMBL、DDBJ或RefSeq中核苷酸序列的注明的编码区的翻译物。数值范围包括定义该范围的端点的数值。在本说明书中，词语“包含(comprising)”是开放式术语，基本上等同于术语“包括，但不限于”，词语“包含(comprises)”具有与此相应的含义。在此对参考文献的引用不应解释成为承认这些参考文献是本发明的先有技术。所有出版物引入本文作参考，如同每个单独出版物被具体和分别地全文引入本文作参考。本发明包括基本上如以上描述和参考实施例和附图的所有实施方式和其改变形式。

Claims

1.一种在受试者中诊断癌症的方法，所述方法包括：

检测来自所述受试者的癌症的样品中的COP1分子，其中所述COP1分子相对于对照的过量表达是癌症的指示。

2.权利要求1的方法，进一步包括检测所述样品中的p53分子，其中p53表达水平的降低或p53活性的抑制是癌症的指示。

3.权利要求2的方法，其中所述p53分子是野生型的。

4.权利要求2或3的方法，其中所述p53分子是人类p53分子。

5.权利要求2到4的任一项的方法，其中所述p53分子是p53多肽。

6.权利要求5的方法，其中使用特异性结合所述p53多肽的抗体来检测所述p53多肽。

7.权利要求5的方法，其中使用免疫组织化学来检测所述p53多肽。

8.权利要求2到7的任一项的方法，其中所述p53活性选自下组中的至少之一：p53依赖性反式激活的抑制作用、p53诱导的细胞凋亡的抑制作用和p21 mRNA水平的降低。

9.权利要求1到8的任一项的方法，其中所述COP1分子是人类COP1。

10.权利要求1到9的任一项的方法，其中所述COP1分子是COP1多肽。

11.权利要求10的方法，其中使用特异性结合所述COP1多肽的抗体来检测所述COP1多肽。

12.权利要求10或11的方法，其中使用免疫组织化学来检测所述COP1多肽。

13.权利要求1到10的任一项的方法，其中所述COP1分子是COP1mRNA。

14.权利要求13的方法，其中使用原位杂交来检测所述COP1 mRNA。

15.权利要求1到14的任一项的方法，进一步包括检测所述样品中的p21分子，其中p21表达水平的降低是癌症的指示。

16.权利要求1到15的任一项的方法，其中所述受试者是人类。

17.权利要求1到16的任一项的方法，其中所述癌症是表达野生型p53的癌症。

18.权利要求1到17的任一项的方法，其中所述癌症选自下组中的至少之一：乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌和移行细胞癌。

19.权利要求18的方法，其中所述卵巢癌选自下组中的至少之一：浆液腺癌、子宫内膜腺癌、明细胞腺癌和粘蛋白腺癌。

20.一种在受试者中监视癌症治疗的效力的方法，所述方法包括：

提供来自所述受试者的样品；和

检测所述样品中的COP1分子，其中相对于对照所述COP1分子的过量表达方面的降低表明癌症治疗是有效的。

21.一种评定患有癌症的受试者的预后的方法，所述方法包括：

提供来自所述受试者的样品；和

检测所述样品中的COP1分子，其中所述COP1分子相对于对照的过量表达方面的降低表明改善的预后。

22.权利要求20或21的方法，进一步包括检测所述样品中的p53分子，其中p53表达水平的提高或p53活性的提高是有效的癌症治疗或改善的预后的指示。

23.权利要求22的方法，其中所述p53分子是野生型的。

24.权利要求22或23的方法，其中所述p53分子是人类p53分子。

25.权利要求22到24的任一项的方法，其中所述p53分子是p53多肽。

26.权利要求25的方法，其中使用特异性结合所述p53多肽的抗体来检测所述p53多肽。

27.权利要求25的方法，其中使用免疫组织化学来检测所述p53多肽。

28.权利要求22到27的任一项的方法，其中所述p53活性选自下组中的至少之一：p53依赖性反式激活的抑制作用、p53诱导的细胞凋亡的抑制作用和p21 mRNA水平的降低。

29.权利要求20到28的任一项的方法，其中所述COP1分子是人类COP1。

30.权利要求20到29的任一项的方法，其中所述COP1分子是COP1多肽。

31.权利要求30的方法，其中使用特异性结合所述COP1多肽的抗体来检测所述COP1多肽。

32.权利要求30或31的方法，其中使用免疫组织化学来检测所述COP1多肽。

33.权利要求20到29的任一项的方法，其中所述COP1分子是COP1mRNA。

34.权利要求33的方法，其中使用原位杂交来检测所述COP1 mRNA。

35.权利要求20到34的任一项的方法，进一步包括检测所述样品中的p21分子，其中p21表达水平的降低是癌症的指示。

36.权利要求20到35的任一项的方法，其中所述受试者是人类。

37.权利要求20到36的任一项的方法，其中所述癌症是表达野生型p53的癌症。

38.权利要求20到37的任一项的方法，其中所述癌症选自下组中的至少之一：乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌和移行细胞癌。

39.权利要求38的方法，其中所述卵巢癌选自下组中的至少之一：浆液腺癌、子宫内膜腺癌、明细胞腺癌和粘蛋白腺癌。

40.一种在诊断为患有癌症或存在癌症风险的受试者中治疗癌症的方法，包括：

向所述受试者施用治疗有效量的抑制COP1的表达的第一化合物。

41.权利要求40的方法，进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的抑制MDM2或Pirh2表达的第二化合物。

42.权利要求40或41的方法，其中所述第一或第二化合物选自下组中的至少之一：反义寡核苷酸、形成三链的寡核苷酸和siRNA分子。

43.权利要求42的方法，其中所述第一或第二化合物使所述癌症对癌症治疗敏感。

44.权利要求43的方法，进一步包括施用所述癌症治疗。

45.权利要求44的方法，其中所述第一或第二化合物在所述癌症治疗之前施用。

46.权利要求44的方法，其中所述第一或第二化合物在所述癌症治疗期间施用。

47.权利要求43到46的任一项的方法，其中所述癌症治疗包括放射治疗或化学治疗。

48.权利要求40到47的任一项的方法，其中所述癌症是表达野生型p53的癌症。

49.权利要求40到48的任一项的方法，其中与对照相比在所述癌症中COP1过量表达。

50.权利要求40到49的任一项的方法，其中与对照相比在所述癌症中p53表达水平降低。

51.权利要求40到50的任一项的方法，其中与对照相比在所述癌症中p21表达水平降低。

52.权利要求40到51的任一项的方法，其中所述受试者是人类。

53.一种筛选干扰COP1分子与p53分子的结合的测试化合物的方法，所述方法包括：

a)在容器中提供第一多肽、第二多肽和测试化合物，所述测试化合物是要检测它干扰所述第一和第二多肽的结合的能力的化合物；和

b)测定与所述第二多肽结合的所述第一多肽的量、从所述第二多肽上被替换下来的所述第一多肽的量或被阻止与所述第二多肽结合的所述第一多肽的量；

其中所述第一多肽是COP1多肽和所述第二多肽是p53多肽，或者其中所述第一多肽是p53多肽和所述第二多肽是COP1多肽；和其中降低与所述第二多肽结合的所述第一多肽的量的化合物、或替换结合到所述第二多肽上的所述第一多肽的化合物、或阻止所述第一多肽与所述第二多肽结合的化合物，被鉴定为干扰COP1分子与p53分子结合的化合物。

54.权利要求53的方法，进一步包括确定所述测试化合物是否调节COP1活性。

55.权利要求54的方法，其中所述COP1活性选自下组中的至少之一：p53的降解、p53的遍在化、p53依赖性反式激活的抑制作用、p53诱导的细胞凋亡的抑制作用和p21 mRNA水平的降低。

56.权利要求53到55的任一项的方法，其中所述COP1分子是人类COP1。

57.权利要求53到56的任一项的方法，其中所述p53是人类p53。

58.一种筛选干扰COP1分子与p53分子的结合的测试化合物的方法，所述方法包括：

a)提供第一核酸分子、第二核酸分子、第三核酸分子和测试化合物，所述第一核酸分子包含与编码第一多肽的核酸分子可操作连接的序列特异性DNA结合结构域，所述第二核酸分子包含与编码第二多肽的核酸分子可操作连接的反式激活结构域，所述第三核酸分子包含与能由所述序列特异性DNA结合结构域识别的序列可操作连接的报告基因，所述测试化合物是要检测它在细胞中干扰所述第一和第二多肽结合的能力的化合物，其中所述第一多肽是COP1多肽和所述第二多肽是p53多肽，或者所述第一多肽是p53多肽和所述第二多肽是COP1多肽；和

b)测定所述报告基因的表达水平，其中降低所述报告基因的表达的化合物是干扰COP1分子与p53分子的结合的化合物。

59.权利要求58的方法，进一步包括确定所述测试化合物是否调节COP1活性。

60.权利要求59的方法，其中所述COP1活性选自下组中的至少之一：p53的降解、p53的遍在化、p53依赖性反式激活的抑制作用、p53诱导的细胞凋亡的抑制作用和p21 mRNA水平的降低。

61.权利要求58到60的任一项的方法，其中所述COP1是人类COP1。

62.权利要求58到61的任一项的方法，其中所述p53是人类p53。

63.一种筛选抑制p53的活性的测试化合物的方法，包括用与COP1结合的测试化合物处理哺乳动物细胞、并检测所述处理的细胞中的p53的步骤。

64.权利要求63的方法，其中所述检测步骤包括测量选自下组中的至少之一：p53的降解、p53的遍在化、p53依赖性反式激活的抑制作用、p53诱导的细胞凋亡的抑制作用和p21 mRNA水平的降低。

65.权利要求63或64的方法，其中所述哺乳动物细胞已经被工程化来表达COP1。

66.权利要求63到65的任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞已经被工程化来表达p53。

67.权利要求63到66的任一项的方法，其中所述COP1是人类COP1。

68.权利要求63到67的任一项的方法，其中所述p53是人类p53。

69.抑制COP1分子表达或抑制COP1连接酶活性的化合物用于药物的制备的用途，所述药物用于在诊断为患有癌症或存在癌症风险的受试者中治疗癌症。

70.权利要求69的用途，其中所述癌症相对于对照具有COP1分子的过量表达。

71.权利要求69或70的用途，其中所述癌症相对于对照具有在癌症中p53活性的降低。

72.权利要求69到71的任一项的用途，其中所述癌症相对于对照具有在癌症中p53水平的降低。

73.权利要求69到72的任一项的用途，其中所述癌症具有相对于对照物在癌症中p21水平的降低。

74.权利要求69到73的任一项的用途，其中在所述癌症中表达野生型p53。

75.权利要求69到74的任一项的用途，其中所述化合物是靶向COP1的RNAi。

76.权利要求69到74的任一项的用途，还包括使用抑制MDM2或Pirh2的表达的化合物。

77.权利要求69到76的任一项的方法，其中所述COP1是人类COP1。

78.权利要求69到77的任一项的方法，其中所述p53是人类p53。

79.权利要求69到78的任一项的方法，其中所述MDM2是人类MDM2。

80.权利要求69到79的任一项的方法，其中所述Pirh2是人类Pirh2。

81.一种在哺乳动物细胞中抑制p53的活性的方法，包括在细胞中过量表达COP1并检测在过量表达COP1的所述细胞中所述p53的步骤。

82.权利要求81的方法，其中所述检测步骤包括测量选自下组中的至少之一：p53的降解、p53的遍在化、p53依赖性反式激活的抑制作用、p53诱导的细胞凋亡的抑制作用和p21 mRNA水平的降低。

83.权利要求81或82的方法，其中所述哺乳动物细胞已经被工程化来表达p53。

84.权利要求81到83的任一项的方法，其中所述p53是野生型p53。

85.权利要求81到84的任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞已经被工程化来具有MDM2活性的降低的表达。

86.权利要求81到85的任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞已经被工程化来具有Pirh2活性的降低的表达。

87.权利要求81到86的任一项的方法，其中所述COP1是人类COP1。

88.权利要求81到87的任一项的方法，其中所述p53是人类p53。

89.权利要求81到88的任一项的方法，其中所述MDM2是人类MDM2。

90.权利要求81到89的任一项的方法，其中所述Pirh2是人类Pirh2。

91.一种哺乳动物细胞，包含编码p53分子的重组核酸分子和编码哺乳动物COP1分子的重组核酸分子。

92.一种哺乳动物细胞，其已经被工程化以具有降低的COP1活性和降低的MDM2活性。

93.一种哺乳动物细胞，其已经被工程化以具有降低的COP1活性和降低的Pirh2活性。

94.一种哺乳动物细胞，其已经被工程化以具有降低的COP1活性、降低的MDM2活性和降低的Pirn2活性。

95.上述的哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞已经被进一步工程化来表达p53。

96.一种哺乳动物细胞，其已经被工程化以具有降低的MDM2活性、降低的Pirh2活性和提高的COP1活性。

97.一种哺乳动物细胞，其已经被工程化以具有降低的p53活性以及提高或正常的COP1活性。

98.任何上述的哺乳动物细胞，其中所述活性通过RNAi的方法来降低。

99.任何上述的哺乳动物细胞，其中通过向所述细胞中导入编码COP1分子的DNA分子来提高COP1活性。

100.一种细胞，其包含第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子，所述第一核酸分子包含与编码COP1多肽的核酸分子可操作连接的序列特异性DNA结合结构域，所述第二核酸分子包含与编码p53多肽的核酸分子可操作连接的反式激活结构域，所述第三核酸分子包含与能由所述序列特异性DNA结合结构域识别的序列可操作连接的报告基因。

101.一种细胞，其包含第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子，所述第一核酸分子包含与编码p53多肽的核酸分子可操作连接的序列特异性DNA结合结构域，所述第二核酸分子包含与编码COP1多肽的核酸分子可操作连接的反式激活结构域，所述第三核酸分子包含与能由所述序列特异性DNA结合结构域识别的序列可操作连接的报告基因。

102.权利要求100或101的哺乳动物细胞，其中所述报告基因是荧光素酶。

103.任何上述哺乳动物细胞用于筛选干扰COP1分子与p53分子的结合的测试化合物的用途。

104.一种试剂盒，包含用于检测样品中COP1分子的试剂和包装插页，所述包装插页含有对在包含癌细胞的样品中检测COP1分子的说明。

105.权利要求104的试剂盒，其中所述癌细胞是表达野生型53的癌细胞。

106.权利要求104或105的试剂盒，其中所述癌症选自下组中的至少之一：乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌和移行细胞癌。

107.权利要求104到106的任一项的试剂盒，其中所述卵巢癌选自下组中的至少之一：浆液腺癌、子宫内膜腺癌、明细胞腺癌和粘蛋白腺癌。

108.权利要求104到107的任一项的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于检测样品中p53分子的试剂。

109.一种试剂盒，包含用于检测样品中COP1分子的试剂和用于检测样品中p53分子的试剂。

110.一种药物组合物，包含抑制COP1的表达的化合物连同药学上可接受的载体。

111.权利要求110的药物组合物，进一步包含抑制MDM2或Pirh2的表达的化合物连同药学上可接受的载体。

112.权利要求110或111的药物组合物，其中所述化合物选自下组中的至少之一：反义寡核苷酸、形成三链寡核苷酸和siRNA分子。