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CN101073583A - 红色诺卡氏菌细胞壁骨架在制备药物中的用途 - Google Patents

红色诺卡氏菌细胞壁骨架在制备药物中的用途 Download PDF

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CN101073583A
CN101073583A CNA2006100826271A CN200610082627A CN101073583A CN 101073583 A CN101073583 A CN 101073583A CN A2006100826271 A CNA2006100826271 A CN A2006100826271A CN 200610082627 A CN200610082627 A CN 200610082627A CN 101073583 A CN101073583 A CN 101073583A
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cell wall
nocardia rubra
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张轶
洪晓明
张国英
赵健
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Shenyang Sunbellcom Bio Pharmaceutical Co Ltd
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Shenyang Sunbellcom Bio Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

本发明涉及红色诺卡氏菌细胞壁骨架在制备治疗宫颈癌前病变的药物中的用途。

Description

红色诺卡氏菌细胞壁骨架在制备药物中的用途
技术领域
本发明涉及红色诺卡氏菌细胞壁骨架在制备药物中的用途，特别是在制备治疗宫颈癌前病变的药物中的用途。
背景技术
宫颈癌前病变是个临床上较为疑难的妇科疾病，该病变既具有一定的自限性，同时又有恶变的趋势。发展到宫颈癌需要长达10年左右的过渡期。由于宫颈癌前病变是个渐变的漫长过程，也给早期发现和早期治疗提供了充足的时间和条件。特别是宫颈癌前病变较轻的病人，更有希望治愈。
宫颈癌前病变通常称为宫颈鳞状上皮内病变(SZL)或称为宫颈上皮内瘤样病变(CIN)。也细分为非典型鳞状上皮细胞(ASCUS)和非典型腺性上皮细胞(AGUS)，以及低度宫颈鳞状上皮内病变(LSIL)和高度宫颈鳞状上皮内病变(HSIL)。通常应用较多的还有将宫颈上皮内病变分为三级，临床上常称之为CIN-I、CIN-II、CIN-III。
现代医学已查明，宫颈癌的发生主要与人乳头瘤病毒(HPV)感染有关，以及与单纯疱疹病毒感染、真菌感染相互作用更促进宫颈上皮细胞的病理改变，并逐步导致上皮细胞组织发生病变直至完全癌变。
宫颈癌前病变是指宫颈上皮细胞和细胞组织发生了异常改变，但还没有发生完全的癌变，宫颈癌有一系列的癌前病变，它的发生、发展是由量变到质变，渐变到突变的过程。宫颈癌前病变的典型形式是宫颈上皮不典型增生，所以可以从细胞组织检测中确定细胞组织病变程度。
全世界每年新发生宫颈癌为50万人，每年有20万人死于宫颈癌，我国每年新发生宫颈癌为15万人，每年约有8万人死于宫颈癌。世界卫生组织的统计资料还表明，宫颈癌在全球妇女癌症死亡率中位居第二，在一些发展中国家甚至居于首位。进入21世纪，宫颈癌正在成为影响全球妇女健康的重大疾病之一。
目前，对于宫颈癌前病变，世界上还没有确切疗效的治疗药物，在药物治疗宫颈癌前病变方面应是空白。
而世界各国对于宫颈癌前病变，通常采取对适龄妇女广泛筛查的办法，通过细胞学检测方法，并配合细胞组织学检测方法及HPV感染检测，可有效检查出是否患有宫颈癌前病变，对于患有宫颈癌前病变者，视病变程度采用宫颈表面破坏方法或宫颈病变切除的方法。这一措施，可减少宫颈癌前病变进一步向宫颈癌发展的可能性。
当前国内外在该领域的研发方向，一是进一步完善检测手段，使之更加准确和更加简便易行。二是对物理疗法和手术方法进一步改进和丰富，如激光、电切，锥切手术等的应用。该领域的科研人员治疗宫颈癌前病变的思路，主要集中在如何破坏宫颈表面和怎样切除宫颈病变上面。三是也有个别研发药物(化合物)进行治疗宫颈癌前病变试验的报道。
而目前在国内治疗宫颈癌前病变中，治疗较为混乱，由于恐癌心理，单纯根据宫颈细胞学涂片结果处理病人，夸大宫颈癌前病变的性质以及过度治疗病人的现象十分普遍。所以，采用有效药物治疗的方法，无疑会促进当前一边倒式的过度治疗方式的改变，使之对宫颈癌前病变采取更科学更确切更人性化的治疗方法。
能使宫颈癌前病变治疗不再痛苦，并使妇女的生理功能得到最大限度的保护，这是妇科医生及科研人员的最大追求。或者也可以说，现行的物理手段为主的治疗方法是对病变的宫颈进行破坏和切除，而新发明的红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂(Nr-cws)治疗方法是对宫颈修复和保护。现行治疗方法是对“病”治疗，Nr-cws的治疗方法是对“因”治疗，应该说新方法更科学，技术更先进，更体现人文关怀。这一新治疗药物若能推广使用，将改变欧美领导该领域技术潮流的传统局面，中国将成为引领者。
现有技术中，外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂(商品名，纳可佳)是一种免疫调节剂，红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂(Nr-cws)中含有胞壁酸、粘肽及阿拉伯半乳聚糖等，具有调节机体免疫功能，增强T细胞、巨噬细胞、NK细胞活性，并可诱导机体产生白介素、干扰素等细胞因子。目前，该外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂主要用来治疗宫颈糜烂，并发现Nr-cws还可以治疗单纯疱疹病毒(HZV)感染、带状疱疹病毒(VZV)感染、人乳头瘤病毒(HPV)感染以及真菌感染。
令人惊奇的是，本发明的发明人发现红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂可用来治疗宫颈癌前病变，解决了当前临床上对于宫颈癌前病变能够检测但缺少有效治疗药物的尴尬状况，使得宫颈癌前病变的治疗更加人性化。同时使得宫颈癌不但能早发现而且还能早治疗。对宫颈癌前病变治疗上更主动更简便，更利于将宫颈癌扼杀在萌芽状态中。
发明内容
本发明涉及红色诺卡氏菌细胞壁骨架在制备治疗宫颈癌前病变的药物中的用途。所述宫颈癌前病变为非典型鳞状上皮细胞、非典型腺性上皮细胞、宫颈鳞状上皮内病变、宫颈上皮不典型增生。其中，所述药物的药剂形式为软膏剂、乳膏剂、硬膏剂、凝胶剂、洗剂、酊剂、搽剂、油剂、糊剂、气雾剂、栓剂、泡腾片等，并且可以将所述药物直接施用在病变部位。用生理盐水将本发明药物配制成一定浓度的溶液使用。本发明药物的使用浓度为0.3ug/ml至1402ug/ml。优选为30ug/ml至240ug/ml。
使用红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂(Nr-cws)制备的药物在治疗宫颈癌前病变中有如下特点：
1、安全性好：在治疗过程中没有发现毒副作用，以及不适的感觉。
2、对应性好：局部用药治疗局部病症，避免了全身用药的身体不良反应。
3、针对性强：病症表现在上皮和黏膜处，而发明药物又在上皮和黏膜处有良好的增强免疫作用，所以更显示针对性。
4、非特异性：临床观察中，对非典型鳞状上皮细胞、非典型腺上皮细胞以及鳞状上皮内病变等宫颈癌前病变均有疗效。
5、有效性好：在观察治疗病例中，有效率达80％，治愈率达70％。
6、使用方便：治疗时，只需简单的一次性简便医疗器具即可。
7、立足早字：符合国家治疗宫颈癌的方针，从筛查宫颈癌前病变入手，不仅可以做到早发现，而且还可以实现早治疗。
8、利于推广：治疗过程中无损伤，不破坏宫颈上皮组织，安全性高，易于患者接受，便于推广。
本发明的药物的药效主要体现在其免疫调节功能上。由于正确地针对病因在关键的病变部位用药，使之免疫功能低下的病变部位免疫系统被激活，重新恢复和增强了病人的免疫功能，这是确保疗效的重要原因。
宫颈癌前病变是个可逆性的病变，通常存在一部分病人自身恢复痊愈，一部分病人维持原状，还有一部分病人继续深度病变直至发生恶变。在这里主导病变变化的关键因素是人自身免疫能力是否正常。从而也说明，人体正常的自身免疫功能有能力清除宫颈上皮病变细胞，并逐步修复受损的宫颈上皮细胞组织。这一客观事实为Nr-cws免疫治疗宫颈癌前病变提供了理论上的支持。
本发明药物作用病变部位后，可迅速激活人体的免疫系统，调动大量的免疫细胞向病变处聚集，明显活化巨噬细胞和自然杀伤细胞杀灭和吞噬病原体和病变细胞的能力。同时还诱导产生干扰素、白介素等细胞因子，能够有效阻滞被病毒感染细胞的增殖，中止受损或有缺陷的细胞DNA合成，因而阻断了宫颈上皮细胞组织癌变的进程，防止了宫颈癌的发生。
用生理盐水将本发明药物配制成一定浓度的溶液使用。本发明药物的使用浓度为0.3ug/ml至1402ug/ml。优选为30ug/ml至240ug/ml。
为了说明本发明的药物的作用效果，申请人使用红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂分别进行了体外细胞学、动物模型和临床观察等不同阶段的基础实验。结果证明红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂治疗宫颈癌前病变的疗效是确切的。
附图说明
图1A为流式细胞仪分析时对照组Hela细胞周期情况，其中静止期(G0-G1)细胞比例为44.44％，增殖期(S+G2-M)细胞比例为56.56％。
图1B为使用红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂组Hela细胞周期情况，其中静止期(G0-G1)细胞比例为74.61％，增殖期(S+G2-M)细胞比例为25.39％。
图2为Hela细胞生长曲线。
以下将结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。
具体实施方式
实验人员将被HPV感染的宫颈癌细胞系——Hela细胞进行分组实验，在加入红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂的实验组和空白的对照组的实验中，通过综合分析MTT检测细胞的活力，绘制细胞生长曲线，结果显示：两组在不同时间点OD490光吸收值有显著性差异，实验组Hela细胞生长明显受阻，而对照组Hela细胞则异常生长，说明红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂具有阻滞Hela细胞生长的作用。
在采用流式细胞仪测定细胞处于周期各时相的比例的实验中，实验组细胞被阻滞在静止期(G0-G1)多于对照组，而实验组细胞在增殖期(S+G2-M)细胞明显少于对照组。说明红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂具有抑制宫颈癌细胞核有丝分裂的作用，可将宫颈癌细胞阻滞在G0/G1期，延缓细胞周期由G1期向S期的进程，为受损的细胞提供一次修复的机会，阻止受损细胞进入DNA合成期，防止DNA合成产生缺陷，最终防止癌症的发生。
在对实验动物进行抑制肿瘤细胞生长实验中，实验组小白鼠体内肿块生长被明显抑制，对照组小白鼠体内肿块则异常生长，两组有明显差异，说明红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂具有良好的抑制肿瘤生长作用。
关于临床病例观察，我们针对分别患有非典型鳞状上皮细胞(ASCUS)和非典型腺性上皮细胞(AGUS)，以及宫颈鳞状上皮内病变病人进行临床使用红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂治疗。经过治疗后取得初步的理想治疗效果，说明临床上红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂具有良好的治疗宫颈癌前病变的疗效。
按规范进行红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂对试验细胞的毒性试验以及对病毒感染细胞的药效实验。在这里我们选择了非洲绿猴肾细胞及人胚肺二倍体细胞为试验细胞，我们同时选择了单纯疱疹病毒和带状疱疹病毒为试验病毒。经过实验，检测出Nr-cws药液的TD0和MIC。
实验例
1.检测抗肿瘤药物-红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂对宫颈癌细胞的抑制作用
方法：
MTT(四甲基偶氮唑蓝)法检测细胞活力，绘制细胞生长曲线，并用统计学软件分析实验结果。
(1)主要材料和试剂
DMEM培养基(Gibco，USA)、胰蛋白酶(Sigma分装，USA)、MTT(Sigma分装，USA)、胎牛血清(Hyclone，USA)、二甲基亚砜(Sigma，USA)、96孔板(Corning公司)
(2)MTT的配制
以PBS配制成5mg/ml贮存液，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光可以保存一周。
(3)红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂的制备
Nr-cws由沈阳胜宝康生物制药有限公司提供，将收集的Nr-cws配置成一定浓度的混悬液后，在0.07MPa下灭菌15min，并置于4℃保存。步骤：
细胞生长曲线与细胞活力测定：
1)HeLa细胞培养：以胰蛋白酶消化收集对数生长期HeLa细胞，用DMEM培养液配制细胞悬液，调整细胞浓度为5×104/ml，接种于96孔细胞培养板内，0.1ml/孔，对照组和实验组各5孔，其中实验组加入红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂(商品名：纳可佳，沈阳胜宝康生物制药有限公司生产)之终浓度值至30μl/ml，置于含5％CO2培养箱内(37℃)培养24-120h，每隔2日更换培养液，于培养的24h、48h、72h、96h、120h用MTT法检测两组细胞生长差异。
2)细胞生长检测：按文献报道的MTT法，分别于每个待检测点(24h、48h、72h、96h、120h)加入MTT溶液(5mg/ml贮存液)20μl/孔，置CO2培养箱内培养4h，然后去上清，每孔加入DMSO 150μl/孔，培养箱内孵育20min，待MTT完全溶解后，用ELISA测定仪590nm波长测定没孔的光吸收值。
3)HeLa细胞生长曲线绘制：取各时间点光吸收值相近数据平均值和标准差，以时间为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
4)统计学处理：采用SPSS12.0统计软件对各组数据进行配对t检验。
结果：
表1为不同时间点HeLa细胞OD490光吸收值，表2为采用SPSS10.0统计软件对各组数据进行配对t检验分析结果，p＜0.05表明两组数据具有明显差异。结合Hela细胞生长曲线图2可以看出实验组(加药组)与对照组明显不同，红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂明显抑制HeLa细胞生长，实验组肿瘤细胞生长明显减缓。
                                    表1.HeLa细胞OD490光吸收值
  组别时间   24h   48h   72h   96h   120h
  对照组   0.46±0.03   0.75±0.01   0.98±0.05   1.45±0.07   2.17±0.01
  实验组   0.38±0.02   0.53±0.01   0.66±0.02   1.07±0.1   2.10±0.06
                                               表2.配对T检验
配对比较 t 自由度   显著性(双尾概率)
均值 标准差 均数标准误   95％置信区间比较
  下限   上限
  配对   对照组-实验组   .21600   .13939   .06234   .04292   .38908   3.465   4   .026
流式细胞仪测定
1)细胞培养：含10％血清的DMEM培养HeLa细胞至对数生长期，0.25％的胰酶消化后，以5000个细胞每孔接种于24孔细胞培养板内，0.1ml/孔，对照组和实验组各3孔，待细胞贴壁后，用PBS洗涤两次，再以无血清培养培养12h使细胞同步化，更换10％血清的DMEM培养基继续培养，其中实验组加入Nr-cws至终浓度值30μg/ml，置于含5％CO2培养箱内(37℃)培养，每隔2日更换培养液，于加药一周后用流式细胞仪检测两组细胞DNA合成差异。
2)细胞制备：以0.25％的胰酶消化收集细胞，用PBS洗两遍，离心，去掉上清液，留0.5ml细胞悬液，用震荡器使之分散，用注射器将细胞迅速注入4℃70％冷乙醇中，4℃保存，至少18h。离心收集细胞，加入RNA酶(终浓度为50μg/ml)，内含0.1％ Triton X-100，37℃水浴30min后，放入冰浴中，停止RNA酶的作用，PBS洗两次，加入碘化丙啶(PI)，终浓度为50μg/ml，保存在冰浴中暗处至少30min，上机前用孔径40μm的尼龙网过滤。
3)结果：比较对照组和实验组细胞DNA合成差异，实验组处于静止期细胞比例明显多于对照组。而在增殖期细胞实验组明显少于对照组。说明红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂具有抑制宫颈肿瘤细胞作用。(数据见下表)
                    Hela细胞增殖各期比例分析
Figure A20061008262700101
2.红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂对小鼠肿瘤细胞的生长的抑制
细胞接种密度为106/只，一周以后(8-9天)呈现肉眼可见肿块。按临床剂量开始在肿瘤部位注射药物(浓度为30ug/ml)，2次/周，四周后处死小鼠，量取瘤组织长、宽及瘤体重量，结果见上表。实验表明实验组肿瘤生长明显减缓。实验组平均瘤重为0.62g，明显小于对照组2.54g，有统计学差异。
3.红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂对临床病人进行局部治疗的效果。
红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂对十例宫颈病变患者的治疗效果见(表3)。十例病人的药使用浓度分别为30ug/ml、60ug/ml、120ug/ml和240ug/ml。其中，28岁-35岁6人，35岁以上3人，26岁1人，其中3例发现伴有HPV感染。经过不同疗程，不同用药量Nr-cws治疗，有7人完全治愈，1人病症减轻，2人炎症减轻，关于这三例未痊愈病人，经分析主要是病情较重且有并发症，用药疗程不够所致。但其中3例HPV感染者转阴。以宫颈癌前病变为主要观察对象，其痊愈率为70％，有效率为80％。因此，红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂对非典型鳞状上皮细胞病变和非典型腺性上皮细胞病变及宫颈不典型增生均有较好的治疗作用。通过Nr-cws的治疗，使得宫颈病变上皮细胞被清除，受损的宫颈上皮组织被修复，同时还使HPV感染转阴。
表3：
                                        治疗宫颈癌前病变病例观察表
  序号   姓名代号   年龄   宫颈病变名称   用药途径   疗程   治疗后检测
  01   MAFA*   36   非典型鳞状上皮细胞   外敷、推注   2   痊愈
  02   JIHO*   50   非典型鳞状上皮细胞   外敷、推注、表皮注射   2   痊愈
  03   WAXU   30   非典型腺性上皮细胞   外敷、推注   2   痊愈
  04   LICE   28   非典型鳞状上皮细胞   外敷、推注   2   痊愈
  05   XYLI*   26   低度宫颈鳞状上皮内病变   外敷、推注、表皮注射   2   痊愈
  06   GANA   28   非典型鳞状上皮增生   外敷、推注   3   痊愈
  07   ZHYE   35   不典型增生、重度糜烂   外敷、推注   1   炎症减轻
  08   LIXI   38   非典型鳞状上皮增生、宫颈炎   外敷、推注   2   炎症减轻
  09   LIJI   34   低度宫颈鳞状上皮内病变   外敷、推注   2   痊愈
  10   CEMH   29   宫颈上皮不典型增生   外敷、推注   1   不典型上皮细胞
注：*该患者同时HPV感染
4.红色诺卡氏菌细胞壁骨架制剂对病毒感染细胞的药效试验。
1)Nr-cws对细胞的毒性作用：
由沈阳胜宝康生物制药有限公司提供的Nr-cws溶液，在VERO细胞和2BS细胞培养内观察其对细胞的毒性。
(1)Nr-cws溶液对2BS细胞的毒性试验结果(以下试验为三次试验结果的均值)
验证药物：Nr-cws溶液CPE法：最大无毒浓度(TD0)为625ug/ml，半数中毒浓度(TD50)为1667ug/ml。MTT法最大无毒浓度(TD0)为625ug/ml，半数中毒浓度(TD50)为1417ug/ml。
(2)Nr-cws溶液对VERO细胞的毒性试验结果(以下试验为三次试验结果的均值)
验证药物：Nr-cws溶液CPE法：最大无毒浓度(TD0)为1042ug/ml，半数中毒浓度(TD50)为2220ug/ml。MTT法最大无毒浓度(TD0)为958ug/ml，半数中毒浓度(TD50)为2376ug/ml。
2)Nr-cws对感染细胞的抑制作用：
(1)Nr-cws溶液对HSV-I型病毒的抑制作用(以下试验为三次试验结果的均值)
①一次给药组：
验证药物：Nr-cws溶液CPE法：药物半数有效浓度(IC50)为0.145ug/ml，最小有效浓度(MIC)为0.313ug/ml，治疗指数(TI)为1997。MTT法：药物半数有效浓度(IC50)为0.124ug/ml，最小有效浓度(MIC)为0.30ug/ml，治疗指数(TI)为2111。
②三次给药组：
验证药物：Nr-cws溶液CPE法：药物半数有效浓度(IC50)为0.116ug/ml，最小有效浓度(MIC)为0.3ug/ml，治疗指数(TI)为1997。MTT法：药物半数有效浓度(IC50)为0.11ug/ml，最小有效浓度(MIC)为0.313ug/ml，治疗指数(TI)为1997。
(2)Nr-cws溶液对VZV病毒的抑制试验结果(以下试验为三次试验结果的均值)
①一次给药组：
验证药物：Nr-cws溶液CPE法：药物半数有效浓度(IC50)为0.583ug/ml，最小有效浓度(MIC)为1.25ug/ml，治疗指数(TI)为500。MTT法：药物半数有效浓度(IC50)为0.456ug/ml，最小有效浓度(MIC)为0.846ug/ml，治疗指数(TI)为779。
②三次给药组：
验证药物：Nr-cws溶液CPE法：药物半数有效浓度(IC50)为0.308ug/ml，最小有效浓度(MIC)为1.25ug/ml，治疗指数(TI)为500。MTT法：药物半数有效浓度(IC50)为0.25ug/ml，最小有效浓度(MIC)为0.342ug/ml，治疗指数(TI)为1827。
综合实验结果：
①Nr-cws对试验细胞TD0为：VERO 1042±360ug/ml，2BS 625±0ug/ml。
Nr-cws对感染细胞抑制作用MIC为：一次给药组0.3±0ug/ml，三次给药组0.313±0ug/ml。结果见表4。
②
                 表4：Nr-cws溶液对VERO和2BS细胞的毒性测定结果
药物 试验方法             VERO             2BS
  TD0ug/ml   TD50ug/ml   TD0ug/ml   TD50ug/ml
Nr-cws溶液   细胞形态变化   1042±360   2220±242 625±0 1667±0
MTT法 958±0   2376±213 625±0   1417±144.3
表5 Nr-cws溶液抗单纯疱疹病毒I型和水痘-带状疱疹病毒药效试验
  病毒   药物   方   一次给药组   三次给药组
  法   IC50   MIC   TI   IC50   MIC   TI
HSV-I Nr-cws溶液   CPE法   0.145±0.01   0.313±0 1997   0.116±0.01   0.313±0 1997
  MTT法   0.124±0.04   0.30±0 2111   0.11±0.01   0.313±0 1997
注：IC50和MIC单位为ug/ml，此表为三次试验结果的平均值。

Claims (8)

1.红色诺卡氏菌细胞壁骨架在制备治疗宫颈癌前病变药物的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的抗人乳头瘤病毒药物包括药物有效剂量的红色诺卡氏菌细胞壁骨架和药学上可接受的载体。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的载体包括赋形剂。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述的赋形剂是右旋糖酐。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述药物为局部用药物。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述的局部用药物包括软膏剂、乳膏剂、硬膏剂、凝胶剂、洗剂、酊剂、搽剂、油剂、糊剂、气雾剂、栓剂、泡腾片等。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述的局部用药物为洗剂或者搽剂。
8.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述药物是每1毫升或者每毫克药物中含有0.3-1402微克所述的红色诺卡氏菌细胞壁骨架产物。
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