CN101057131A - 用于分子的功能和结构表征的直接结合传感器与质谱集成 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对一种或多种分子进行检测、量化、识别和结构分析的方法。质谱分析(MS)不是普适的检测器，因为所有的分子不能同等地电离，这样导致量化信息的弱信号。当材料的存在已知时，可以优化MS以识别结合成分的具体质量。比色共振反射光学传感器提供一种通用的质量检测器，因为几乎所有的生物质量同等地给出比例信号。该组合方法允许选择和/或通过结合到传感器上的所有质量的量化进行检测，具有根据其各自质量和结构分析来识别特定分子的能力。

Description

用于分子的功能和结构表征的直接结合传感器与质谱集成

优先权

本申请要求于2004年6月28日申请的美国系列申请No.60/583560的权益，其在这里通过引用被整体引入。

发明背景

结构分析与检测测定组合可以提供关于分子功能和结构的互补信息。以前的工作已证实这种组合方法对例如配体垂钓(ligand Fishing)，表位作图和氨基酸测序的应用有效用，但仅在基于微流体通道表面等离子体激元共振(SPR)的系统的低通量样本限定的情况下。见Nelson等，BIA/MS of Epitope-TaggedPeptides Directly from E.coli Lysate：Multiplex Detection and Protein Identification atLow-Femtomole to Subfemtomole Levels.Analytical Chemistry 1999，71：2858-2865；Nelson等，Biosensor chip mass spectrometry：A chip-based proteomicsapproach.Electrophoresis 2000，21：1155-1163。将检测测定与结构分析组合的先前已知方法在效用上受到可以从流动细胞中回收的已结合材料的亚毫微微摩尔(femtomole)数量的极端限制，以及受到产生足够数量可检测材料所要求的众多样本注入/检测/洗脱循环的极端限制。见例如，Williams & Addona，Theintegration of SPR sensors with mass spectrometry：possible applications for proteomeanalysis.Tibtech 2000，18：45-48。

本领域需要能够使这些分析技术以与生命科学研究的产能和成本目标一致的方式进行的方法。

发明概述

本发明的一个实施方案提供一种分析或识别一种或多种分子的方法。该方法包括使包含一种或多种分子的样本与比色共振反射光学传感器接触，以使该一种或多种分子中的一种或多种被固定到比色共振反射光学传感器上。从比色共振反射光学传感器对已被固定的一种或多种分子洗脱并施加质谱分析。该固定到比色共振反射光学传感器上的一种或多种分子可以被检测。通过峰值波长值(PWV)的偏移可以直接检测该固定到比色共振反射光学传感器上的一种或多种分子。该固定到比色共振反射光学传感器上的一种或多种分子可以利用一个标记物检测。峰值波长值(PWV)信号也可以被检测。该检测可以包括使用分子质量等于、大于或小于该固定到比色共振反射光学传感器上一种或多种分子作为指示分子。对该一种或多种分子可以进行量化。可以通过比色共振反射光学传感器表面上的一种或多种结构部分(moieties)将该一种或多种分子固定到比色共振反射光学传感器上。该一种或多种结构部分可以是TiO、RaM Fc、抗生物素蛋白、生物素、抗体、抗体片段、核酸分子、蛋白质A、蛋白质A杂化物、蛋白质G、蛋白质G杂化物、蛋白质L、蛋白质L杂化物、高密度PVA、CHO或其组合。可以将该比色共振反射光学传感器偶联到用于检测的流动系统。

本发明的另一个实施方案提供一种分析或识别一种或多种分子的方法。该方法包括使包含一种或多种分子的样本与比色共振反射光学传感器接触，以使该一种或多种分子中的一种或多种被固定到比色共振反射光学传感器上；获得没有被固定到该比色共振反射光学传感器上的任何分子；以及将对该没有被固定到该比色共振反射光学传感器上的任何分子施加质谱分析。

本发明的另一个实施方案提供一种分析或识别一种或多种分子的方法。该方法包括使包含一种或多种分子的样本与基于流动的表面等离子体激元共振传感器接触，以使将该一种或多种分子中的一种或多种固定到传感器上；从传感器上洗脱已被固定的一种或多种分子；和对该一种或多种分子施加质谱分析。可以检测和/或量化该已固定到传感器上的一种或多种分子。

本发明的另一个实施方案提供一种分析或识别一种或多种分子的方法。该方法包括将包含一种或多种分子的样本与表面等离子体激元共振传感器接触，以使该一种或多种分子中的一种或多种被固定到传感器上；获得没有被固定到该传感器上的任何分子；对该没有被固定到该传感器上的任何分子施加质谱分析。可以检测和/或量化该固定到传感器上的一种或多种分子。

附图的简要说明

图1示出了利用外部MALDI-TOF板用于蛋白质的比色共振反射光学传感器/MS分析的序列步骤。该比色共振反射光学传感器微量反应板配备有固定的配体，其专门用于从被测样本中检测目标蛋白质，记录正PWV偏移。结合之后，洗脱被结合目标，与MALDI基体相混合，进而作为1μl点样施加在标准MALDI板上进行分析。

图2示出了来自比色共振反射光学传感器系统的数据，表示随实验时间(横坐标值)变化的抗体(hIgG&cIgG)的连接和抗原(Fab)的结合的正标准PWV偏移(纵坐标值)以及在抗原(Fab)被洗脱时的PWV偏移降低。用10mM甘氨酸缓冲剂pH 2的洗脱量是大约20μL，针对Fab洗脱的大约1.2nm PWV偏移与来自96孔微量滴定比色共振反射光学传感器板的6mm直径孔的大约28mm²表面面积的3.6ng/mm²(即捕获大约100ng的Fab并从传感器表面上洗脱)相关。Fab具有22300Da的平均分子量值。

图3A和图3B。图3A示出了用于2pmol Fab对照的MALDI-TOF光谱。图3B示出了用于从图2中的使用1μL的sinapinic acid点样MALDI表面上的比色共振反射光学传感器的单一孔中洗脱1μL材料的MALDI-TOF光谱。在22300Da的分子量下的所期望材料的主要峰值被标记，两个其它的明显的峰(11057和44967)与主要产物的峰相关。

图4示出了来自比色共振反射光学传感器的数据，表示随实验时间(横坐标值)变化的抗原A的结合(Biogen Idec所有的分子和Ab)的正标准PWV偏移(纵坐标值)以及在抗原A被洗脱时的PWV偏移降低。用10mM甘氨酸缓冲剂pH 2的洗脱量是大约12μL，对于抗原A的洗脱的大约80pm的PWV偏移与来自96孔微量滴定比色共振反射光学传感器板的6mm直径孔的大约28mm²表面面积的6.7ng的总质量(即大约0.3pmol的17900Da的分子或0.56μg/mL或28nM)相关。该检验指出比色共振反射光学传感器系统的灵敏度以检测特异性结合到传感器上的少量的材料。

图5示出了从图4所示的比色共振反射光学传感器上洗脱的6μL的材料的ESI-MS数据。仅有的明显的峰与原始的17900预期产物相关。

图6A示出了传感器的横截面图，其中显示光照射传感器的底部；然而，光可以从顶部或底部照射传感器。n_基底代表基底材料，n₁代表任选覆盖层的折射率，n₂代表光栅的折射率。图6B示出了传感器的另一个示图。

图7示出了包括一维光栅的比色共振反射光学传感器的实施方案。

图8示出了由一组同心环构成的共振反射结构。

图9示出了共振反射结构，其包括孔六角形网格(或柱六角形网格)，非常近似图8的同心环结构，不需要聚焦照射光束到网格的任一特定位置上。

发明的详细描述

在过去的30年中，生物化学分析方法和设备上的多个技术发展已使常规蛋白质特征表达方法发生很大改进，带来分析仪器的发展，能够提供更灵敏和更精确的信息。两种分析方法在蛋白质特征表达中已经找到日益增长的应用：直接结合检验和质谱分析(MS)。直接结合检验比如那些由比色共振反射光学传感器支持的检验能够监控生物分子或细胞之间的相互作用，当已固定受体和溶液中的配体之间发生所述相互作用时。该技术能够确定蛋白质的功能特征，并且能够被用来确定亲和力参数。基于MS的技术，例如基体辅助激光脱附/电离飞行时间(MALDI-TOF)和电喷雾电离(ESI)通过利用结合数据库检索的肽质量作图的从蛋白质序列核对经精确质量确定到蛋白质识别分析，被用于有机分子例如蛋白质和无机分子的结构表征。

质谱分析不是通用的检测方法，并且如果不正确调整或集中检测，则经常不能检测到存在的许多材料。通过本发明，质谱分析者将了解到材料的确存在以及存在的数量，并且由此能够开发更好方法来检测它的存在，获得通过它的质量和结构来识别材料的能力。

在本发明的一个实施方案中，可实现对质谱方法的简化。在推动质谱分析技术达到它的最高点上，目前趋势包括非常复杂样本的质量分析。本发明允许通过传感器实现对最复杂样本的解卷积同时保持质量分析。传感器允许对来自复杂介质的材料进行特定选择和量化，由此在将它引入质量分析之前“清理”样本。

质谱经常会是密集的或对于更大分子量的材料例如但不限于生物材料而言具有重叠信号，这对于来自蛋白质组分析，患者样本，动物的临床前样本，全细胞溶解产物等的复杂样本尤其是这样。通过传感器去除特定材料(例如，在MS分析中通过将样本中的特定材料固定到传感器上并且使用包含未结合特定材料的溶液)能够允许质谱变得更容易确定其它质量。在另外的方法中，质谱可以通过传感器确定材料的特定去除或选择，这可以通过没有粘附到传感器上的材料的质量分析而实现。

本发明的一个实施方案相对于前述将传感器与质量分析结合的方法具有显著的优点。本发明可以采用基于静态(表示基于非流动的系统)孔的传感器并且由此相对于其它系统提供显著的优点。基于静态的系统能够探测更短暂的相互作用。分子之间的相互作用由针对两个分子形成一对所需要花费的时间量和两个分子解离所需要花费的时间量的速率来描述。当解离速率较快时，结合的识别和分析更复杂。被允许趋于平衡的静态系统比到目前为止描述的任何基于流动的系统具有更大的机会去探测相互作用并保持它用来分析。如此本发明提供给质量分析人员更多与之工作的样本，作为优点可以采用任何样本工作。

本发明的另一个实施方案提供一个系统，在该系统将比色共振反射光学传感器偶联到一流动系统上，该流动系统可以提供分子的高通量筛选。

本发明的另一个实施方案提供一种筛选小分子个体或库的方法。用于药物开发的小分子范畴由大的化合物文库组成，所述化合物中许多被认为是纯净的或者实质上是单一的组份，而这些文库的其它部分由来自在恶劣环境困境下存活的外来有机体的提取物组成。许多方法已被尝试识别人和牲畜疾病目标的高亲合力的特定粘合剂。本发明允许检测和识别以高亲合力和特异性结合所述药物目标的文库成员。

本发明的另一个实施方案提供一种筛选蛋白质个体或库的方法。在主要关注于人和病原体基因组之后，理论和药物研究前沿已花费相当多的时间和精力研究蛋白质组或大量由动物基因组规定的蛋白质的存在、活动性和相互作用。本发明提供使用这里描述的各种技术来研究动物蛋白质组的方法。

本发明的另一个实施方案提供量化分子的方法。分子可以通过比色共振反射光学传感器，通过MS，或者通过比色共振反射光学传感器和MS二者来量化。分子通过比色共振反射光学传感器量化，其通过将配体分子固定到比色共振反射光学传感器表面，然后当量化分子被显露于传感器+配体表面下时，检测量化分子的PWV偏移。如果用户已预先开发出校准曲线(PWV偏移对分子浓度)，那么分子浓度可以通过比色共振反射光学传感器被量化。如果配体被显露于包含许多分析物的复杂测试样本下，那么PWV偏移可以由分子的混合物产生。在比色共振反射光学传感器检测之后，被结合的分子可以从比色共振反射光学传感器表面上被清除并悬浮在溶液中。如果在溶液上进行MS分析，那么可以量化预先结合到传感器上的分析物。

在本发明的另一个实施方案中，确定用于一种或多种分子的结合常数。包括一系列分析物浓缩物的样本可以被显露于比色共振反射光学传感器上固定的配体下。配体+分析物组合的结合常数被确定。在传感器显露于同一浓度不同分析物组，那么可以通过传感器PWV信号的幅值相互比较分析物的亲合力。附加地或替代地，可以从传感器表面洗脱已结合材料，可以测量来自被洗脱溶液的MS信号幅值以确定结合常数。

本发明的另一个实施方案提供一种制备基体辅助激光解吸和电离/MS(MALDI/MS)基体的方法。该基体可以包括具有固定在传感器表面的一种或多种特定结合物质的比色共振反射光学传感器。任选地，该一种或多种特定结合物质可以被结合到它们各自的结合配偶体上，该一种或多种特定结合物质可以在传感器表面被排列成一阵列。

比色共振反射光学传感器

比色共振反射光学传感器即直接结合传感器已在例如于2001年8月15日申请的美国专利No.09/929957，2001年8月15日申请的美国专利系列No.930353、2004年1月20日申请的美国专利No.10/415037、2004年1月16日申请的美国专利No.10/399940、2002年1月28日申请的美国专利系列No.09/930352、2002年1月28日申请的美国专利No.10/058626、2002年7月23日申请的美国专利No.10/201878、2002年7月15日申请的美国专利No.10/196059、PCT US01/45455、PCT US03/01175、PCT US03/01298、Cunningham等的Sensors and Actuators B(81：316(2002))、Cunningham等的Sensors和Actuators B(85：219-226(2002))、Lin等的Biosensors和Bioelectronics(17：827(2002))Cunningham等的Sensors和Actuators B(87：365(2002))中详细描述过，所有这些都在这里全文引入作为参考。

比色共振反射光学传感器，本文或称传感器，可以包括次波长(subwavelength)结构表面(SWS)。SWS可以在特定波长上产生明显光学共振反射，其可以被用来高灵敏度地跟踪材料(包括例如特定结合物质或结合配偶体或两者)的相互作用。SWS充当特定结合物质的表面结合平台。

SWS是一种非常规类型的衍射光学器件，其可以模拟薄膜涂层的效果(Peng&Morris，J.Opt.Soc.Am.A，Vol.13，No.5，p.993，May 1996；Magnusson& Wang，Appl.Phys.Lett.，61，No.9，p.1022，August，1992；Peng & Morris，Optics Letters，Vol.21，No.8，p.549，April，1996)。SWS的结构包括表面浮雕光柵，例如一维，二维或三维光栅，其中与入射光的波长相比光栅的周期较小。

通过添加分子例如特定结合物质，结合配偶体或两者，或者无机分子到覆盖层的上表面或光栅表面可以调整这种结构的反射或透射颜色。所添加分子的电介质极化率导致发生最大反射或透射所处的波长的调整。

在一个实施方案中，当用白光照射时，传感器被设计成仅仅反射单一波长或窄带波长。当特定结合物质或结合配偶体或两者被连接或固定到传感器表面时，被反射的波长(颜色)发生偏移。通过链接特定结合物质到传感器表面，可以在不使用任一种荧光探针或粒子标记物或任何其它种类的标记物的情况下检测互补的结合配偶体分子。可是，如果希望，也能够使用一种或多种标记物或指示分子。例如，标记物分子可以是染料，荧光分子，生物荧光分子等。指示分子可以是分子质量等于、大于或小于固定到比色共振反射光学传感器上的一种或多种分子的生物或免疫衍生分子，例如蛋白质、肽、核酸、肽核酸、锁定(locked)核酸等。检测技术能够分辨例如大约0.1nm厚度的蛋白质结合的变化，并且可以利用侵入流体或干燥的传感器表面来执行。

检测系统组成如下：例如垂直入射经过例如光纤光探针时照射传感器的点的光源，和收集同样垂直入射经过例如第二光纤光探针的反射光的分光计。因为在激励/检测系统与传感器表面之间不产生物理接触，所以不需要特殊的耦合棱镜，并且传感器可以易于适应任何通用的化验平台包括例如微量滴定板和微阵列玻片。单个的分光计读数可以在几毫秒内执行，因此可以快速测量同时产生在传感器表面上的大量分子相互作用并实时监控反应动力。

这种技术在同时测量大量生物分子相互作用的应用中上是有用的，特别是当分子标记物改变或抑制所研究分子的功能时。具有蛋白质目标的药物化合物文库的高通量筛选，和用于蛋白质组的蛋白质-蛋白质相互作用的微阵列筛选是应用的实例，其需要由本发明的组合物和方法提供的灵敏度和通量。

图6A和6B是比色共振反射光学传感器的实例图。在图6中，n_基底表示基底材料，n₂表示光学光栅的折射率，n₁表示任选的覆盖层，n_bio表示一种或多种特定结合物质的折射率，t₁表示一维、二维或三维光栅结构上的任选覆盖层的厚度，t₂表示光栅的厚度，t_bio表示一种或多种特定结合物质的层厚度。在一个实施方案中，n2＞n1(见图6A)。对层厚度(即覆盖层，一种或多种特定结合物质，或光学光栅)进行选择以使顶部表面上的附加分子获得共振波长灵敏度。对光栅周期进行选择以在所希望的波长上获得共振。

传感器包括由高折射率材料构成的光学光栅、支持光栅的基底和一种或多种固定在与基底相对的光栅表面上的特定结合物质。任选地，覆盖层覆盖光栅表面。依据本发明制造的光学光栅被涂覆有或包括高折射率的介电薄膜，其可以由包括例如硫化锌、二氧化钛、氧化钽和氮化硅的材料构成。本发明的传感器也可以包括光学光栅，其由例如塑料或环氧树脂构成，涂有高折射率材料。

线性光栅(即一维光栅)具有共振特性，其中照明光偏振极性被定向垂直于光栅周期。具有任选覆盖层的线性光栅结构的一个实施方案的示意图如图7所示。比色共振反射光学传感器还可以包括例如二维光栅。具有光学特征的光栅横截剖面可以包括任何周期重复函数，例如“方波”。光学光栅还可以包括从直线、正方形、圆形、椭圆形、三角形、梯形、正弦波、卵形、长方形和六边形组成的组中选择的形状的重复形式。线性光栅具有与二维光栅相同的间距(即高和低折射率区域之间的距离)、周期、层厚度和材料特性。但是，为了以一种方式共振耦合到光学结构中以导致最陡峭的共振峰，光必须沿垂直于光栅线的方向偏振。因此，偏振轴垂直于线性光栅方向的偏振滤波器必须被插入到照明源和传感器表面之间。

光学光栅也可以包括例如“阶梯状”型面，其中单一的、固定高度的高折射率区域被嵌入在较低的折射率覆盖层内。

还可能的是，制作一种共振传感器，其中高折射率材料不是阶梯状的，而是随横向位置变化。例如，二维光栅的高折射率材料n₂在高度上正弦变化。为了在特定波长上产生共振反射，正弦的周期与等效阶梯状结构的周期相等。作为传感器，正弦变化结构的共振作用和它的功能已利用GSOLVER(GratingSolver Development Company，Allen，Texas，USA)计算机模型得到核实。

本发明的传感器还可以在与基底相对的光学光栅表面上包括覆盖层。在存在覆盖层的情况下，将一种或多种特定结合物质固定在与光栅相对的覆盖层的表面上。优选地，覆盖层包括具有比包括光栅的材料小的折射率的材料。覆盖层可以由例如玻璃(包括旋压玻璃(spin-on glass，SOG))、环氧树脂或塑料构成。满足传感器折射率要求的各种聚合物可以被用于覆盖层。SOG可以被使用，这是由于它的良好折射率、易于操作和易于利用玻璃表面活化技术用特定的结合物质激活。当传感器表面的平面度不是特定系统配置的关键时，SiN/玻璃的光栅结构可以直接被用作检测表面，其活化可以采用与玻璃表面上相同的方式完成。

在光学光栅上没有覆盖层的情况下共振反射也可以被获得。例如，传感器可以包括涂有高折射率材料的结构化薄膜层的基底。在不使用planarizing覆盖层的情况下，环境介质(例如空气或水)充满光栅。因此，特定结合基底，在光学光栅的所有显露于特定结合物质的表面上而不仅仅是上表面上，被固定到传感器上。

特定结合基底和结合配偶体

如果存在，通过例如物理吸附或通过化学结合，一种或多种特定结合物质被固定到光栅或覆盖层上。一个特定的结合物质可以是例如有机或无机分子、核酸、肽、蛋白质溶液、肽溶液、单或双链DNA溶液、RNA溶液、RNA-DNA杂化物溶液、包含来自组合化学文库的化合物的溶液、提纯的小分子测试化合物例如那些被用在制药工业以发展药物先导物的化合物或者小分子测试化合物的混合物、来自各种源例如细菌、病毒、人或其它用于蛋白质组分析的动物源的蛋白质混合物个体或库、人造的、合成的或动物衍生周质(periplasmic)提取物、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(scFv)、F(ab)片段、F(ab′)₂片段、Fv片段、提纯的免疫体(immunobody)(例如，scFv，sFab，F(ab)，全抗体)或免疫体混合物、小有机分子、细胞、病毒、细菌、聚合物、TiO、RaM抗生物素蛋白、生物素、蛋白质A、蛋白质A杂化物、蛋白质G、蛋白质G杂化物、蛋白质L、蛋白质L杂化物、高密度PVA、CHO、或生物样本。生物样本可以是例如血、血浆、血清、胃肠分泌物、组织或肿瘤匀浆、滑液、排泄物(feces)、唾液、痰、囊肿(cyst)液、羊水、脑脊髓液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、泪液、或前列腺液。聚合物可以选自每个分子具有多个活性部位的长链分子组，所述分子由水凝胶、右旋糖苷、聚氨基酸及其衍生物组成，包括聚赖氨酸(包含聚-1-赖氨酸和聚-d-赖氨酸)、聚-苯基丙氨酸-赖氨酸和聚-葡萄糖-赖氨酸。

优选地，一种或多种特定结合物质在传感器排列成一个或多个不同位置(location)的阵列。特定结合物质阵列包括本发明传感器表面上的一种或多种特定结合物质，这样表面包含许多不同位置，每一个具有不同的特定结合物质或具有不同数量的特定结合物质。例如，一个阵列可以包括1、10、100、1000、10000或100000个不同位置。这样一种传感器表面被称为一个阵列，这是因为一种或多种特定结合物质被典型地以规则的网格形状摆放在x-y坐标中。但是，一个阵列可以包括以任一种规则或不规则的模式摆放的一种或多种特定结合物质。例如，不同位置可以限定一种或多种特定结合物质的点阵列，一个阵列点的直径可以为大约50至大约500微米，一个阵列点的直径也可以为大约150至大约200微米。一种或多种特定结合物质可以被结合到它们特定结合配偶体上。

本发明传感器上的阵列可以通过将一种或多种特定结合物质的微滴放置在例如光栅或覆盖层表面上的x-y网格位置上产生。当传感器被显露于包括一种或多种结合配偶体的测试样本时，结合配偶体将优先被吸引到微阵列上的不同位置，微阵列包括具有对结合配偶体高亲合力的特定结合物质。不同位置中的一些将结合配偶体收集到它们的表面上，而其它位置将不收集。

特定结合物质特异性结合到被添加到本发明传感器表面的结合配偶体上。特定结合物质特异性结合到它的结合配偶体上，而基本上不结合到被添加到传感器表面的其它结合配偶体上。例如，当特定结合物质是抗体并且它的结合配偶体是特定抗原，那么抗体特异性结合到特定的抗原上，而基本上不结合到其它抗原上。结合配偶体可以是例如无机分子、有机分子、核酸、肽、蛋白质溶液、肽溶液、单或双链DNA溶液、RNA溶液、RNA-DNA杂化物溶液、包含来自组合化学文库的化合物的溶液、提纯的小分子测试化合物例如那些被用在制药工业以发展药物先导物的化合物或者小分子测试化合物的混合物，来自各种源例如细菌、病毒、人、或其它用于蛋白质组分析的动物源的蛋白质混合物个体或库、人造的、合成的或动物衍生的周质提取物、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(scFv)、F(ab)片段、F(ab′)₂片段、Fv片段、提纯的免疫体(例如，scFv、sFab、F(ab)，全抗体)或免疫体混合物、小有机分子、细胞、病毒、细菌、聚合物、TiO、RaM抗生物素蛋白、生物素、蛋白质A、蛋白质A杂化物、蛋白质G、蛋白质G杂化物、蛋白质L、蛋白质L杂化物、高密度PVA、CHO或生物样本。一个生物样本可以是例如血、血浆、血清、胃肠分泌物、组织或肿瘤匀浆、滑液、排泄物(feces)、唾液、痰、囊肿液、羊水、脑脊髓液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、泪液、或前列腺液。

本发明阵列的一个实例是核酸阵列，其中阵列内的每个不同位置包含不同的核酸分子。在这个实施方案中，核酸微阵列内的点检测与测试样本中的相反核酸链的互补化学结合。

尽管微量滴定板是用于生物化学测定的最普遍形式，但微阵列日益被看作使一次性可以被测量的生物化学相互作用的数目最大化而同时使贵重试剂量最小化的手段。通过用微阵列点样器(spotter)将特定结合物质施加到本发明的传感器上，可以获得10000个特定结合物质/in²的特定结合物质密度。通过将照明光束聚焦来检查单一微阵列位置，传感器可以被用作微阵列读出系统。传感器表面可以是例如微量滴定板的内部表面。

进一步，可以将微阵列和微量滴定板的实施方案相结合，这样一种或多种特定结合物质被排列为在传感器表面上的一个或多个不同位置的阵列，所述表面位于微量滴定板的一个或多个孔内并包含微量滴定板的一个或多个表面，优选底表面。特定结合物质的阵列包括微量滴定板孔内的传感器表面上的一种或多种特定结合物质，这样表面包含一个或多个不同位置，每个位置具有不同的特定结合物质或具有不同量的特定结合物质。例如，一个阵列可以包括1、10、100、1000、10000、或100000个不同位置，这样，微量滴定板实施方案的每个孔可以在其内具有一个或多个不同位置的阵列，与微量滴定板实施方案中的其它孔分隔，这允许在本发明的一个微量滴定板上处理多个不同的样本，每个隔开孔处理一个或多个样本。任一孔内的一个阵列或多个阵列可以与同一微量滴定板的任意其它微量滴定孔中存在的一个阵列或多个阵列相同或不同。

可以利用本领域公知的方法，将一种或多种特定结合物质固定到传感器。此外，可以利用本领域公知的方法，从传感器表面洗脱特定结合物质或结合配偶体两者。

质谱

利用任一种质谱仪和任一种质谱分析方法，通过质谱分析，可以分析测试样本。此外，在本发明的方法中可以使用与其它设备例如气相色谱仪、液相色谱仪、超临界流体色谱仪和毛细管电泳设备连接的质谱仪。在本发明的方法中可以使用傅立叶转换离子回旋共振(FT-ICR)分光计和飞行时间(TOF)质谱、电喷雾电离质谱(ESI-MS)、象限仪和四极设备。如果希望，所选的离子监控(SIM)可以被用于量化分析。质谱/质谱(MS/MS)、同位素质谱和元素质谱分析技术也可以被用于本发明的方法中。

本发明的方法

比色共振反射光学传感器阵列与质谱分析技术结合，例如MALDI-TOF或ESI-MS，可以被用于提供有机和无机分子例如来自血清的蛋白质的功能和结构表征。此外，本发明的方法可以通过表位标记被用在受体去孤儿化(deorphaning)分析和蛋白质识别中。

利用基于微量反应板的比色共振反射光学传感器格式和无标记物阵列的非破坏性属性，比色共振反射光学传感器/MS系统是多维分析方法，其在简单的、高通量的、高灵敏的平台中提供例如蛋白质功能和结构的互补信息，例如蛋白质翻译后变化。在比色共振反射光学传感器/MS分析期间，在例如384个测试样本中针对分析物的被固定配体的结合亲合力实时被同时监控。可以洗脱被选择性保留或选择性不保留在比色共振反射光学传感器微量反应板孔上的分析物(针对选择性保留的分子)，并随后通过质谱分析例如MALDI-TOF或ESI-MS被分析，其可以确定亲合保留的分析物的特性并检测多个亲合回收的分析物。通过这种方式使用，传感器担当量化特异性结合到目标的事件的灵敏装置，并且担当微量纯化载体以供进一步分析。

在对生物传感器选择保留的分子进行分析时只有直接结合到传感器表面上的质量才被探测；与传感器表面发生化学相互作用的死细胞和其它沉淀材料不产生显著信号。

由于比色共振反射光学传感器读取装置的简单性和低成本，比色共振反射光学传感器/MS集成是节约成本的方法，为MS系统使用者带来新功能和从竞争平台区分MS系统。

有许多受体具有各种预测的生物功能，但没有已知的配体；这种受体通常被称为孤儿。“配体垂钓”或“去孤儿化”是用以针对众多化合物或细胞/组织提取物筛选这些受体以便为所述受体识别出可能的配体的方法。见Williams，Biotechnology match making：screening orphan ligands and receptors.Current opinionin Biotechnology 2000，11：42-46。

类似的技术也可以被应用到不具有已知结合配偶体的新的蛋白质。对于配体垂钓的最方便的方法常规地是那些基于直接结合的方法，因为阵列的这些类型不取决于配体激活受体或酶的能力。利用比色共振反射光学传感器/MS系统，孤儿配体被固定到比色共振反射光学传感器微量反应板中所有孔的底表面上。每个单个孔被显露于包含针对所述孤儿的可能的配体的单独测试样本。包含针对所述孤儿的高亲合力结合物的任一孔将在比色共振反射光学传感器读取器中记录为峰值波长值(PWV)正偏移，记录一次“命中”。只有满足命中阈值的孔被洗脱以通过MS用于被结合蛋白质的识别。

比色共振反射光学传感器/MS可以与基因标记技术一起被使用以用于蛋白质识别。见例如，Nelson等，Analytical Chemistry 1999，71：2858-2865。首先，标记被融合进名义上未知的基因中，用于跟踪蛋白质通量表达和选择性地将蛋白质与表达系统(例如E.coli)隔离的目的。使用比色共振反射光学传感器微量反应板的底表面上的高选择性的标记-特异性的固定配体，传感器被用来亲合隔离，检测和量化被标记的从表达系统回收的多肽。比色共振反射光学传感器分析之后，被标记的多肽的质量被正确通过例如MALDI TOF分析确定，其反过来经过数据库检索被用于蛋白质结构表征例如序列核对。

比色共振反射光学传感器测定系统可以容易地与基于MS的分析系统合作以同时提供例如蛋白质亲合力和蛋白质识别信息。考虑到比色共振反射光学传感器系统的内在灵敏度、通量和成本优势，这在以前是没有过的，目标去孤儿化和表位作图是利用这种独特性能的其它应用。初步的检验已被执行以确定目标Fab片段的离线比色共振反射光学传感器+MALDI-TOF分析的基本方法(见实施例)。由于比色共振反射光学传感器读取装置的简单性和低成本，比色共振反射光学传感器/MS集成是节约成本的方法，为MS系统使用者带来新的功能，并从竞争平台中区分MS系统。

本发明的另一个实施方案提供一种分析或识别一种或多种分子的方法，包括：将包括一种或多种分子的样本与基于流动的表面等离子体激元共振传感器接触，以使该一种或多种分子中的一种或多种被固定于传感器，被固定的分子可以从传感器上洗脱或者未固定的分子可以被收集。这些分子然后接受质谱分析。固定到传感器上的一种或多种分子可以被检测，该一种或多种分子可以被量化。

任何地方提及的所有专利、专利申请和其它科学或技术文件在这里被整体引入作为参考。这里描述的方法和合成物作为目前优选实施方案的代表，是示例性的并且不意味着对本发明范围的限制。其中的变化和其它应用对本领域的技术人员来说是显而易见的，并且被包围在本发明的宗旨里面。在这里示意性描述的本发明可以适当地在这里没有具体公开的任一要素或多个要素、一个限制或多个限制不存在的情况下实践。因此，例如，在这里的每个例子中，术语“包括”、“基本上由......组成”和“由......组成”中任一个可以由其它两个术语中的任一个所代替。已采用的术语和表达被用作描述的术语但不是限制，并且不意味着这种术语和表达的使用把所示和所描述的特征的任一等价物或其部分排除之外，但可以意识到在本发明所要求保护的范围内可以有各种修改。因此应该理解地是，尽管本发明已通过实施方案具体公开并且这里公开的可选特征、修改和概念变化被认为是落入本发明由说明书和附加权利要求限定的范围内。

另外，尽管本发明的特征或方面以马库什组或其它替代物分组方式描述，但本领域的技术人员可以意识到：本发明也可以马库什组或其它组的任一单一成员或成员亚组的方式描述。

实施例

实施例1

Tandem BIND/MALDI-MS检验

执行用以显示被结合到比色共振反射光学传感器表面的材料能够通过质谱被有效地洗脱和分析的检验。使捕获抗体被吸收到比色共振反射光学传感器表面。在比色共振反射光学传感器上应用样本的期间允许相应的抗原被结合到抗体上。被特异性结合到抗体上的任何材料随后被从表面上洗脱，然后将一小份洗脱材料进行质谱分析。被洗脱的材料与适量的MALDI基体混合并被添加到MALDI板，被用来(TOF)MS分析。

图1示出了用来将比色共振反射光学传感器技术与MALDI型质谱检验结合的规程。该过程包括在比色共振反射光学传感器板上吸附抗体(0.1mg/ml)并添加抗人IgG。该对照是鸡IgY。IgG结合到被添加的人Fab(MW平均值＝22300Da)上，并且比色共振反射光学传感器信号被检测。利用甘氨酸(10mM，pH＝2.0)洗脱抗体，从比色共振反射光学传感器板取出所述溶液，ZipTip吸液管尖端被用来使取出以便于MS分析的溶液脱盐。1ul的脱盐材料被添加到MALDI板并与1ul sinapinic acid混合，在Biogen Idec’s ABI/Voyager系统上获得MALDI-MS数据。

实施例2

基体辅助激光解吸电离(MALDI)质谱(MS)

比色共振反射光学传感器TiO传感器被预先用PBS漂洗三次并在室温中放置30分钟，读取几分钟的基线读数并且将10ul的1mg/ml的人IgG或鸡IgY被稀释入已在孔中的90ul PBS，以形成最终100ug/mL的抗体浓度。将蛋白质放入孔中并被允许结合到TiO表面，持续90分钟。未结合的蛋白质溶液被从孔中取出并且该孔每次用200ul的PBS漂洗三次。

读取几分钟的另一基线读数，然后将1ul的1mg/ml的抗人IgG(Fab)放入孔中，这些孔被涂覆有hIgG(红)或cIgY(黄)并被允许培养60分钟。所有的未结合蛋白质溶液被从孔上取出，该孔用PBS漂洗三次。监控几分钟结合信号的稳定性。由hIgG结合的任何保留的Fab在每个孔中用30ul的10mM甘氨酸pH 2缓冲剂洗脱。在传感器仪器上该洗脱过程被监控并且任何被洗脱的蛋白质被收集以用于质谱分析。

利用BIND检测抗人IgG(Fab)2和人IgG的特异性相互作用。针对鸡IgY(黄)上抗人IgG(Fab)2，存在不可检测的信号。参见图2。12uL中有大约0.8nmΔPWV的蛋白质(＝3ng×0.8nm×28或67ng的蛋白质)被从hIgG涂布的传感器表面洗脱以用于质谱分析。

实施例3

Tandem BIND/MALDI-MS检验-MS数据

图3A示出了来自在显露于传感器表面下之前施加给MS的包含Fab的对照溶液的数据。主要峰值在22300，另外两个峰值是与母体分子质量相关的特征峰值。

图3B示出了来自从传感器表面洗脱的溶液的MALDI-MS数据。该质谱与图3A所示的对照谱相同。

实施例4

Tandem比色共振反射光学传感器/电喷雾电离(ESI)-MS检验

将抗体吸附到CHO比色共振反射光学传感器板(低密度乙醛板)上(0.1mg/mL)。该抗体是专有的人抗Ag A抗体，将抗原A(20000Da)添加(～20mg/mL)到抗体涂布的传感器上并且检测BIND^TM信号。未结合的Ag A溶液被从传感器上取出并且孔被用PBS冲洗三次。任何在传感器上被捕获的抗原A被用12uL甘氨酸(10mM，pH＝2.0)从一个直径为6mm的孔洗脱。包含被洗脱蛋白质的溶液被从比色共振反射光学传感器板上取出。在Biogen MS系统上获取ESI-MS数据。

抗原蛋白质被取出，如由传感器分析确定的差别信号所证明。MS数据示出了从传感器上洗脱的特定抗原蛋白质材料的明确捕获和质量测定。抗原A在42分钟的时间点(横坐标值)结合到被固定到CHO比色共振反射光学传感器上的抗体A上。未结合的抗原A洗脱质量/孔(抗原)＝＞6.7ng或0.3pmol。被洗脱抗原浓度＝＞0.56ug/mL或28nM。

图4示出了来自ESI-MS检验的原始质谱，检验中注入6uL的从单个6mm传感器孔洗脱的材料。图5示出了来自ESI-MS检验的质谱，检验中注入6uL的从单个6mm传感器孔洗脱的材料。母体峰位于感兴趣分子的期望质量上，18052mw处的峰值是与主要峰的糖基化相关的特征峰值。图5证明了传感器“清理”样本的能力，因此提供一更简单的质量分析检验。为了在临床前检验中捕获人单克隆Ab，传感器最初涂有蛋白质A。mAb加入到传感器表面之后，100％的人血清被添加到传感器上。上述的数据曲线，随着100％的人血清被添加到传感器表面之后，自归零的基准点起始。在图5中的8分钟处，1uL或5uL于血清中的抗原被添加到包含mAb的不同孔中。另一个包含非特异性人IgG的对照孔被添加5uL的包含抗原的血清。数据清楚地示出，在8.5分钟处，1和5uL的mAb表面显示不同的浓度，同时非特异性hIgG没有显示明显的变化。清洗传感器之后，保留的Ag被洗脱并准备好用于质量分析，不含来自从100％人血清中的其它混杂材料。通过传感器响应，我们能够看出我们将15ng(0.18nm×3ng/mm2/nm×28mm2)的Ag传送给质量分析物。

实施例证明了比色共振反射光学传感器能够提供给质谱分析的材料量的两个极端点。此外，在比色共振反射光学传感器系统上已利用50％的血清样本收集了相似的ESI-MS结果。

Claims (15)

1、一种分析或识别一种或多种分子的方法，包括：

(a)使包含一种或多种分子的样本与比色共振反射光学传感器接触，以将该一种或多种分子中的一种或多种固定到该比色共振反射光学传感器上；

(b)从该比色共振反射光学传感器上洗脱该已固定的一种或多种分子；和

(c)对该一种或多种分子施加质谱分析，

其中对一种或多种分子进行分析或识别。

2、权利要求1的方法，其中检测已被固定到该比色共振反射光学传感器上的该一种或多种分子。

3、权利要求1的方法，其中对该一种或多种分子量化。

4、权利要求1的方法，其中确定该一种或多种分子的结合常数。

5、权利要求2的方法，其中确定该一种或多种分子的结合常数。

6、权利要求2的方法，其中通过峰值波长值(PWV)的偏移直接检测已固定到该比色共振反射光学传感器上的该一种或多种分子。

7、权利要求2的方法，其中使用标记物检测已固定到该比色共振反射光学传感器上的该一种或多种分子。

8、权利要求7的方法，其中还检测峰值波长值(PWV)信号。

9、权利要求2的方法，其中检测已固定到该比色共振反射光学传感器上的该一种或多种分子包括使用分子质量等于、大于或小于已固定到该比色共振反射光学传感器上的一种或多种分子的指示分子。

10、权利要求1的方法，其中通过该比色共振反射光学传感器表面上的一种或多种结构部分将该一种或多种分子固定到该比色共振反射光学传感器上。

11、权利要求10的方法，其中该一种或多种结构部分包括TiO、RaM Fc、抗生物素蛋白、生物素、抗体、抗体片段、核酸分子、蛋白质A、蛋白质A杂化物、蛋白质G、蛋白质G杂化物、蛋白质L、蛋白质L杂化物、高密度PVA、CHO或它们的组合。

12、权利要求2的方法，其中将比色共振反射光学传感器偶联到用于检测的流动系统上。

13、一种分析或识别一种或多种分子的方法，包括：

(a)使包含一种或多种分子的样本与比色共振反射光学传感器接触，以将所述一种或多种分子中的一种或多种固定到该比色共振反射光学传感器上；

(b)获得没有被固定到该比色共振反射光学传感器上的任意分子；和

(c)对没有被固定到该比色共振反射光学传感器上的任意分子进行质谱分析，

其中对一种或多种分子进行分析或识别。

14、权利要求13的方法，其中对该一种或多种分子量化。

15、权利要求13的方法，其中确定该一种或多种分子的结合常数。

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