CN101045942A - 转基因番木瓜及其加工产品中转基因成分的检测 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测转基因番木瓜及其加工产品的试剂盒及其定性、定量检测方法，其定量方法包括：提取待测样品的DNA作为模板，用CAR基因特异性引物对和外源基因特异性引物对分别进行PCR扩增；将各扩增产物分别与探针杂交，并测定杂交所产生的可检测信号；分析测定数据，从而定量地检测出番木瓜或其加工产品中转基因成分含量。本发明可准确、简便地定量检测番木瓜及其加工产品中转基因成分。

Description

转基因番木瓜及其加工产品中转基因成分的检测

技术领域

本发明涉及产品检测技术，更具体地，本发明涉及定性与定量检测转基因番木瓜及其加工产品中转基因成分的检测试剂盒和检测方法。

背景技术

近年来，随着生物技术的发展，转基因作物迅速商品化，并通过贸易进入国际市场。生物技术的发展显著地提高了农产品的产量和质量，在一定程度上缓解了人口增长、自然资源匮乏、可耕作土地面积减少和不可预期的自然灾害带来的影响等。然而，转基因农作物的安全问题引起人们极大的关注。

世界上许多国家如欧盟、日本、澳大利亚、新加坡等国家，纷纷以立法或其他形式对转基因生物及其加工产品进行严格的管理，例如：要求进口转基因产品进入本国市场时，当转基因成分含量超过一定限度时应加贴标签，以供消费者选购时参考，欧盟规定转基因成分高于0.9％适应加贴标签，日本规定转基因成分高于5％时应加贴标签。

目前包括我国在内的许多国家都开展了转基因番木瓜的研究，并且市场上已经有转基因番木瓜的流通。然而，目前国内外尚没有对转基因番木瓜及其加工产品的定性和定量检测的报道。

在转基因农产品检测技术中，目前应用最为广泛的是以DNA为基础的PCR相关检测技术，目标基因的扩增需要内标基因来做对照以避免出现假阴性的结果。同时内标基因的确立也有助于确定外源基因来源的物种。目前大豆，玉米，大米的内标基因均已经被确定了，但是番木瓜的内标基因一直没有被确定出来。目前还没有一种检测转基因番木瓜及其加工产品中转基因成分含量的检测方法和检测试剂盒。

本领域迫切需要开发对转基因番木瓜及其加工产品中转基因成分进行定性与定量检测的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效、准确、简便的检测转基因番木瓜或其产品中转基因成分的试剂盒及其定性、定量检测方法。

本发明提供了一种用于检测转基因棉籽及其加工产品的试剂盒，其特征在于它含有：

(1)扩增CAR基因的特异性引物对；

(2)与CAR基因扩增产物特异性结合的探针；

(3)扩增外源基因的特异性引物对；

(4)与外源基因扩增产物特异性结合的探针；

(5)标准参照样品。

本发明所述试剂盒中扩增CAR基因的特异性引物对为：

上游引物  5’AGT GGC TCA ATA TGG TAT TCA CTA CAG A 3’

下游引物  5’AAA ATG TAG ATA TAC CTC CCT TGA GCG 3’。

本发明所述试剂盒中与CAR基因扩增产物特异性结合的探针为：

5’ATA CTT ACC CAT ATG AGG GAG TGC AAC GTT ATT G 3’。

本发明所述试剂盒中外源基因没有特别限制，可以是任何外源基因，可选自PRSVR基因、PRSVCP基因、FMV35S基因中的一种或多种。

本发明所述外源基因为PRSVR基因时，其特异性引物对为：

上游引物  5’TTG TCC CCT CTT CCG GAG TT 3’

下游引物  5’CTT CCT TGC TTA GAA CGC TTT TCA 3’，

相应的，与PRSVR基因扩增产物特异性结合的探针为：

5’CCT GGA GTG TAA TGA GGA AGC CAA GAC TTT CTT T 3’。

本发明所述外源基因为PRSVCP基因时，其特异性引物对为：

上游引物  5’TCT AAC ACT CGC GCC ACT CA 3’

下游引物  5’CCG TTT AAC ATT ACT TGC ATT TCG 3’，

相应的，与PRSVCP基因扩增产物特异性结合的探针为：

5’ACG AGG GAG TGA GGA ATG ATT ACG GCC T 3’。

本发明所述试剂盒中探针是用标记物标记的探针，其与扩增产物杂交时能够产生可检测信号；用于本发明的可检测信号没有限制，可以是任何核酸检测领域中常用的检测信号，可检测信号的种类取决于探针上所用的标记物，所述探针标记物可以选自生物素-亲和素、地高辛、放射性同位素、荧光标记中的一种或多种；优选地，所述探针是Taqman型荧光探针。

本发明所述试剂盒中标准参照样品是一组转基因番木瓜DNA与非转基因番木瓜DNA按梯度比例混合的混合物；优选地，各混合物中转基因番木瓜DNA的含量分别为0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、5％。

本发明试剂盒中还可以含有：

10×PCR反应缓冲液、10×25mM MgCl₂、10mM dNTP、1U/μl UNG酶、5U/μl Taq DNA聚合酶、灭菌超纯水等组分。

本发明提供了一种定性检测转基因番木瓜及其加工产品的方法，它包括以下步骤：

(1)提取番木瓜或其加工产品的DNA作为模版；

(2)用本发明所述试剂盒进行检测，将模版DNA分别加入扩增CAR基因和外源基因各自的反应体系，在PCR扩增仪上孵育，分别扩增CAR基因和外源基因；

其中扩增CAR基因和外源基因的定性PCR反应体系各组分体积配比均为：10×PCR反应缓冲液5体积份、10×25mM MgCl₂ 5体积份、10mM dNTP 5体积份、Taq DNA聚合酶0.4体积份、5μM上游引物1体积份、5μM下游引物1体积份、灭菌超纯水30.6体积份、加入的模版DNA 2体积份；

定性PCR循环参数为：

95℃预变性3min；94℃变性20s；54℃退火40s；72℃延伸40s，循环40次；

最后在72℃延伸10min；

(3)将定性PCR产物进行凝胶电泳检测；

(4)将PCR产物回收纯化、测序。

本发明还提供了一种定量检测转基因番木瓜及其加工产品的方法，它包括以下步骤：

(1)提取番木瓜或其加工产品的DNA作为模版；

(2)用本发明所述试剂盒进行检测，将模版DNA分别加入扩增CAR基因和外源基因各自的定量反应体系，在定量PCR扩增仪上孵育，分别扩增CAR基因和外源基因；

其中扩增CAR基因和外源基因的定量反应体系各组分体积配比均为：10×PCR反应缓冲液5体积份、10×25mM MgCl₂ 10体积份、10mM dATP 1体积份、1mM dGTP 1体积份、1mM dUTP 1体积份、1mM dCTP 1体积份、1U/μl UNG酶0.5体积份、5U/μl Taq DNA聚合酶0.5体积份、5μM上游引物4体积份、5μM下游引物4体积份、20μM探针1体积份、灭菌超纯水19体积份、加入的模版DNA 2体积份；

定量PCR循环参数为：

50℃ 10min；95℃ 10min；95℃ 15s；60℃ 1min，循环50次。

(3)分别将扩增产物与各自探针杂交，检测杂交所产生的可测信号，获取数据；

(4)制作标准曲线：

将标准参照物作为模板，按步骤(2)进行扩增；按步骤(3)进行测定，获取数据，制得标准曲线；

(5)将步骤(3)测定的数据与标准曲线进行比较，定量检测棉籽或其加工产品中转基因成分。

本发明中CAR基因是番木瓜蛋白酶基因，它是番木瓜的内源标记基因。在进行PCR定量检测时，需要检测该作物本身固有的内源特异标记基因，来测定样品中转基因作物和非转基因作物的模板总量，这是进行定量检测的基础。例如，用于转基因大豆检测的内源特异标记基因可选用Lectin基因；用于转基因玉米检测的内源特异标记基因可选用Zein基因或IVR基因。本发明人经过广泛而深入地研究，通过序列特异性分析，PCR检测分析和southern blot的方法，确定了CAR基因是优选的棉花的内源参照基因，在此基础上完成了本发明。

本文所用，术语“CAR特异性引物”指能特异性地扩增硬脂酸脱氢酶基因或其片段的引物。

本文所用，术语“外源基因特异性引物”指能特异性地扩增出转入植物的外源基因或其片段的引物。应理解，外源基因特异性引物随外源基因的不同而变化，相应的与外源基因扩增产物特异性结合的探针也随外源基因的不同而变化；例如，当外源基因是PRSVR基因时，选用的外源基因特异性引物就是PRSVR基因特异性引物，即能特异性地扩增PRSVR基因或其片段的引物；相应的与外源基因扩增产物特异性结合的探针也就是PRSVR基因或其片段的探针。本发明所述试剂盒中外源基因没有特别限制，可以是任何外源基因，可以是一种或多种PRSVR基因、PRSVCP基因、FMV35S基因等。

本发明所述试剂盒中标准参照样品是一组转基因番木瓜DNA与非转基因番木瓜DNA按梯度比例混合的混合物；它们分别含有一定比例的转基因番木瓜DNA和非转基因番木瓜的DNA；优选地，标准参照物是将分离的转基因番木瓜DNA和非转基因番木瓜的DNA均稀释到30ng/ul，按体积比例将两种DNA混合，配成转基因番木瓜DNA含量分别占5％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％的DNA溶液，作为定量检测的DNA参照样品。参照样品中转基因番木瓜DNA随外源基因的改变相应地改变。

可用于本发明的DNA提取技术没有特别限制，可以是本领域常用的各种提取技术。一种优选的方法是磁珠提取法，例如用Promega公司生产的磁珠法DNA提取试剂盒提取番木瓜中的DNA。

本发明定量检测的原理：通过检测番木瓜内源参照基因CAR基因测定样品中棉花DNA的总模板量，通过检测外源基因，测定样品中转基因DNA的模板量，然后以转基因DNA的模板量除以番木瓜总DNA的模板量，从而计算出样品中转基因番木瓜含量的百分比。外源基因和内源基因CAR基因的检测分别同时在两个反应管内进行，反应体系和反应条件均相同。通过标准参照物绘制出ΔCt值(Ct外源基因-Ct CAR基因)与转基因成分含量百分比的标准曲线。通过与标准曲线的比对，就可定量确定同一或相同条件下测定的未知番木瓜及其加工产品中转基因成分。

本发明反应体系中模板量的测定是通过PCR扩增，与特异性探针结合，并根据结合所发出的可检测信号进行检测。可用于本发明的可检测信号没有限制，可以是任何核酸检测领域中常用的检测信号。可检测信号的种类取决于探针上所用的标记物，其中可以是生物素-亲和素、地高辛、放射性同位素、荧光标记等。优选的探针是Taqman型探针。

结果表明，本发明试剂盒及其检测方法可以满足转基因番木瓜的定量检测需求，有利于对转基因番木瓜及其加工产品进行标识。此外，采用本发明的统一的参照样品有利于消除不同的实验室间的测试差异。

应用本发明试剂盒可以使检测研究机构准确快速地对抽检样品进行标识，有效地贯彻落实我国关于转基因产品的法律法规，有效地保护了消费者的知情权，同时建立起我国自己的转基因番木瓜及其加工产品检测技术体系，准确鉴定和防止国外未经标签和安全性评价的转基因番木瓜及其加工产品进入我国，对我国生态环境和人民健康造成不利影响；同时也为我国加入WTO后利用技术性贸易壁垒的合法性保护本国农产品市场及出口提供强有力的技术支持。

附图说明

图1：PRSVR基因引物和探针对参照样品(5％、2％、1％、0.5％、、转基因番木瓜DNA样品)进行定量PCR测试的线性图。

图2：PRSVR基因引物和探针对转基因番木瓜的定量检测标准曲线。

图3：CAR基因引物和探针参照样品(5％、2％、1％、0.5％转基因番木瓜DNA样品)进行定量PCR测试的线性图。

图4：CAR基因引物和探针对转基因番木瓜的定量检测标准曲线。

图5：PRSVCP基因引物和探针对参照样品(5％、2％、1％、0.5％转基因番木瓜DNA样品)进行定量PCR测试的线性图。

图6：PRSVCP基因引物和探针对对转基因番木瓜的定量检测标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1.材料和仪器

1.1植物材料

转PRSVR基因抗病毒番木瓜标样由中国农业科学院提供，为抗病毒的转基因番木瓜，果实和叶子纯度为100％。阴性非转基因番木瓜由中国农业科学院提供。

1.2试剂

1.2.1 DNA提取的有关试剂

1)电泳专用琼脂糖。

2)TAE(50×)：242g Tris-碱，57.1ml冰醋酸，100ml 0.5mol/lEDTA(pH 8.0)，溶于水中，定容至1L。

3)液氮。

4)70％乙醇。

5)TE(pH 8.0)：量取10ml 1mol/L Tris.HCl(pH 8.0)和2ml0.5mol/L EDTA(pH 8.0)。加水定容至1000ml。分装后高压灭菌备用。

6)溴化乙锭：10mg/ml。

7)100-2000bp ladder DNA Marker：科昊达生物公司产品。

8)6×Loading Buffer：Promega公司产品。

9)总DNA回收试剂盒：上海生工生物技术公司产品。

10)Promega磁珠法DNA提取试剂盒。

1.2.2 PCR反应的有关试剂

1)10×Buffer(PCR反应缓冲液)(5μl)：500mmol/l KCl，100mmol/l Tris.HCl pH 8.3室温，15mmol/l MgCl₂：Promega公司产品。

2)10×Mg²⁺(25mM)：Promega公司产品；

3)10×dNTP(2mM)：Promega公司产品；

4)引物：上海生工生物工程公司合成，先配成100μM-20℃储存，稀释为终浓度5μM供使用；

5)探针：上海生工生物工程公司合成，稀释成20μM供使用；

6)Taq DNA聚合酶，5unit/μl：Promega公司产品；

7)UNG酶(1U/μl)(Applied Biosystems公司产品公司产品)

8)超纯水(dd H2O)：Easy Pure纯水仪制得。

9)TaqManTM PCR Core Regent Kit试剂盒Cat NO货号.：N808-0228(给出中译名)美国Applied Biosystems生产。

1.3仪器设备

1)PCR扩增仪：美国MJ RESEARCH Minicycler PTC-150型；

2)定量PCR扩增仪：美国生物技术公司ABI Prism SequenceDetector 7000型；

3)电泳仪：美国Continental Lab Products75.2314型；

4)凝胶成像系统：美国BIO-RAD Gel DOC-2000型；

5)离心机：德国Eppendorf 5415D型；

6)微量加样器：德国Eppendorf产品有2.5、10、20、100、200、1000μl等规格；

7)天平：德国Sartorius；

8)高压灭菌锅：日本Tomy SS-325型。

9)DNA冷冻浓缩仪：美国CentriVap Console Labconco产品。

2.试验方法

2.1番木瓜总DNA的提取

使用CTAB法提取DNA，具体操作程序如下。

称取100mg样品，转移到1.5ml离心管；加入700μl CTAB提取缓冲液；65℃温浴30分钟，期间不时颠倒混匀；13000g，离心10分钟；转移上清至1.5ml离心管；加入2/3体积异丙醇，颠倒混匀10-15次，室温30分钟；12000g，离心10分钟；取沉淀用350μl TE溶解；用等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)抽提两遍；两倍无水乙醇沉淀2小时；12000g，离心10分钟；用70％的乙醇洗涤沉淀；用冷冻浓缩仪抽干液体；加入100μl双蒸水，震荡混匀，65℃温浴10min。将离心管在离心管架上保留1min，小心将液体转移至另一新管中；取1μl做PCR。

2.2 PCR测试

2.2.1引物设计

本试验所用的引物序列及扩增片断长度见表1

表1：本试验所用的引物、探针序列及扩增片断长度

基因名称	序列	扩增长度(bp)
			CAR	上游引物5’AGT GGC TCA ATA TGG TAT TCA CTA CAG A 3’下游引物5’AAA ATG TAG ATA TAC CTC CCT TGA GCG 3’探针5’ATA CTT ACC CAT ATG AGG GAG TGC AAC GTT ATT G3’	91
PRSVR	上游引物5’TTG TCC CCT CTT CCG GAG TT 3’下游引物5’CTT CCT TGC TTA GAA CGC TTT TCA 3’探针5’CCT GGA GTG TAA TGA GGA AGC CAA GAC TTT CTTT 3’	100
			PRSVCP	上游引物5’TCT AAC ACT CGC GCC ACT CA 3’下游引物5’CCG TTT AAC ATT ACT TGC ATT TCG 3’探针5’ACG AGG GAG TGA GGA ATG ATT ACG GCC T 3’	100

2.2.2 PCR反应体系

定量PCR测试的反应体系见表2；

定性PCR测试的反应体系见表3。

表2定量PCR测试的反应体系

试剂名称	50μl反应体系	25μl反应体系
			10×Buffer	5.0	2.5
10×Mg2+(25mM)	10.0	5.0
			dATP(10mM)	1.0	0.5
dGTP(mM)	1.0	0.5
			dUTP(mM)	1.0	0.5
dCTP(mM)	1.0	0.5
			UNG酶(1U/μl)	0.5	0.25
Taq DNA聚合酶(5U/μl)	0.5	0.25
			上游引物(5μM)	4.0	2.0
下游引物(5μM)	4.0	2.0
			探针(20μM)	1.0	0.5
灭菌超纯水	19.0	9.5
			模板	2.0	1.0(约30ng DNA)

表3定性PCR测试的反应体系

试剂名称	50μl反应体系	25μl反应体系
			10×Buffer	5.0	2.5
10×dNTP	5.0	2.5
			10×Mg2+(25mM)	5.0	2.5

Taq DNA聚合酶(5U/μl)	0.4	0.2
			上游引物(5μM)	1.0	0.5
下游引物(5μM)	1.0	0.5
			灭菌超纯水	30.6	15.3
模板	2.0	1.0(约30ng DNA)

2.2.3 PCR反应循环参数

定量PCR反应循环参数：50℃10min；95℃10min；95℃15s；60℃1min，循环50次。

定性PCR反应循环参数：

95℃预变性33min；94℃变性20s；54℃退火40s；72℃延伸40s，循环40次；

最后在72℃延伸10min；

2.3定性PCR产物的凝胶电泳检测

1)配制琼脂糖凝胶

将50×TAE稀释成1×TAE溶液，用1×TAE配制琼脂糖(浓度为2％)，凝胶用微波炉蒸煮融化，待降温至60℃，加入溴化乙锭至终浓度为5‰，倒入电泳槽凝胶板中凝固；

2)点样

取20μl PCR扩增产物，加2μl上样缓冲液点样进行电泳，并加入DNA分子标记同时电泳，以判断PCR产物片断的大小。

3)电泳条件

电压根据电泳槽的长度而定3-5V/cm，电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定。

4)结果

电泳检测结果用凝胶分析成像系统或紫外检测仪记录。

2.4 PCR产物的测序

PCR产物用上海生工生物技术公司PCR产物胶回收试剂盒回收纯化，PCR产物送上海生工生物技术公司测序。

实施例1、转PRSVR基因抗病毒番木瓜标准参照样品的制备

本发明将纯的转PRSVR基因抗病毒番木瓜和非转基因番木瓜分别用CTAB法提取DNA，并均稀释到50ng/ul，按体积比例将两种DNA混合，配成转基因抗病毒番木瓜DNA含量分别占5％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％的DNA溶液，作为定量检测的参照样品。

实施例2、检测转PRSVR基因抗病毒番木瓜及其加工产品的试剂盒

试剂盒含有：

(1)扩增CAR基因的特异性引物对：

上游引物5’AGT GGC TCA ATA TGG TAT TCA CTA CAG A 3’

下游引物5’AAA ATG TAG ATA TAC CTC CCT TGA GCG 3’。

100uM各100μl；

(2)与CAR基因扩增产物特异性结合的探针：

5’ATA CTT ACC CAT ATG AGG GAG TGC AAC GTT ATT G 3’

(3)扩增PRSVR基因的其特异性引物对：

上游引物5’TTG TCC CCT CTT CCG GAG TT 3’

下游引物5’CTT CCT TGC TTA GAA CGC TTT TCA 3’，

100uM各100μl；

(4)与PRSVR基因扩增产物特异性结合的探针：

5’CCT GGA GTG TAA TGA GGA AGC CAA GAC TTT CTT T 3’.

(5)扩增PRSVCP基因的其特异性引物对：

上游引物5’TCT AAC ACT CGC GCC ACT CA 3’

下游引物5’CCG TTT AAC ATT ACT TGC ATT TCG 3’，

100uM各100μl；

(6)与PRSVCP基因扩增产物特异性结合的探针：

5’ACG AGG GAG TGA GGA ATG ATT ACG GCC T 3’.

(7)标准参照样品：

由实施例1制备的转PRSVCP基因抗病毒番木瓜标准参照样品，DNA浓度为30ng/μl，各200μl。

其中(2)、(4)、(6)的探针是Taqman型荧光探针，5’端均采用荧光激发染料FAM标记，3’端均采用荧光淬灭染料TAMRA标记。

试剂盒中还可以含有：

10×PCR反应缓冲液、10×25mM MgCl₂、10mM dNTP、1U/μl UNG酶、5U/μl Taq DNA聚合酶、灭菌超纯水等组分。

实施例3、用实施例2的试剂盒进行定性检测

步骤如下：

(1)用Promega公司生产的磁珠法DNA提取试剂盒提取待测棉籽中的DNA作为模版；

(2)实施例2试剂盒进行检测，将模版DNA分别加入扩增CAR基因、PRSVCP基因和PRSVR基因各自的反应体系，在PCR扩增仪上孵育，分别扩增CAR基因、PRSVCP基因和PRSVR基因；

扩增CAR基因、PRSVCP基因和PRSVR基因的定性PCR反应体系(25μl反应体系)，其中组分均为：10×PCR反应缓冲液2.5μl、10×25mM MgCl₂ 2.5μl、10mM dNTP 2.5μl、Taq DNA聚合酶0.2μl、5μM上游引物0.5μl、5μM下游引物0.5μl、灭菌超纯水15.3μl、加入的模版DNA 1μl(约30ng DNA)；。

定性PCR循环参数为：

95℃预变性33min；94℃变性20s；54℃退火40s；72℃延伸40s，循环40次；

最后在72℃延伸10min；

(3)将定性PCR产物进行凝胶电泳检测；结果用凝胶分析成像系统或紫外检测仪记录；结果PCR产物片断CAR基因扩增长度为91bp；PRSVCP基因和PRSVR基因扩增长度为100bp；符合定量PCR检测的引物设计要求。

(4)PCR产物用上海生工生物技术公司PCR产物胶回收试剂盒回收纯化，PCR产物送上海生工生物技术公司测序。

实施例4、用实施例2的试剂盒进行定量检测

步骤如下：

(1)用Promega公司生产的磁珠法DNA提取试剂盒提取待测棉籽中的DNA作为模版；

(2)用实施例2试剂盒进行检测，将模版DNA分别加入扩增CAR基因、PRSVCP基因和PRSVR基因各自的定量反应体系，在定量PCR扩增仪上孵育，分别扩增CAR基因、PRSVCP基因和PRSVR基因；

扩增CAR基因、PRSVCP基因和PRSVR基因的定量反应体系(50μl反应体系)，其中组分均为：10×PCR反应缓冲液5μl、10×25mMMgCl₂ 10μl、10mM dATP 1μl、1mM dGTP 1μl、1mM dUTP 1μl、1mM dCTP 1μl、1U/μl UNG酶0.5μl、5U/μl Taq DNA聚合酶0.5μl、5μM上游引物4μl、5μM下游引物4μl、20μM探针1μl、灭菌超纯水19μl、加入的模版DNA 2μl(约30ng DNA)；

定量PCR循环参数为：

50℃10min；95℃10min；95℃15s；60℃1min，循环50次。

(3)分别将扩增产物与各自探针杂交，检测杂交所产生的荧光信号，获取数据，结果(见附图1和3)；

此类结果也可以用表格数据来体现，但是表格体现不出对这些数据的处理分析结果。附图1和3既可以体现数据结果并且其本身又体现了这组数据的好坏和重复性等问题。

(4)制作标准曲线：

将标准参照物作为模板，按步骤(2)进行扩增；按步骤(3)进行测定，获取数据，制得标准曲线(见附图2和4)；

用PRSVCP基因和PRSVR基因的引物和探针对参照样品进行定量PCR测试的图谱如图2和5所示；

用CAR基因的引物和探针对参照样品进行定量PCR测试的图谱如图1和2所示；

通过对上述PRSVR基因、PRSVCP基因和SAD1基因的引物和探针进行定量PCR反应所得的ΔCt值经过统计学分析，可以得出得到转基因番木瓜定量监测的标准曲线(见图2，4和6)和线性方程Y＝-3.2311X+24.325；R²＝0.9991；Y＝-2.5435X+19.482；R²＝0.9953。

(5)将步骤(3)测定的数据与标准曲线进行比较，定量检测棉籽或其加工产品中转基因成分。

样品号	A	B	C	D
					转基因成分含量	11.85	17.23	4.72	58.23

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1、一种用于检测转基因番木瓜及其加工产品的试剂盒，其特征在于它含有：

(1)扩增CAR基因的特异性引物对；

(2)与CAR基因扩增产物特异性结合的探针；

(3)扩增外源基因的特异性引物对；

(4)与外源基因扩增产物特异性结合的探针；

(5)标准参照样品。

2、根据权利要求1所述的试剂盒

其中扩增CAR基因的特异性引物对为：

上游引物5’AGT GGC TCA ATA TGG TAT TCA CTA CAG A 3’

下游引物5’AAAATG TAGATATAC CTC CCT TGA GCG 3’；

其中与CAR基因扩增产物特异性结合的探针为：

5’ATA CTT ACC CAT ATG AGG GAG TGC AAC GTT ATT G 3’。

3、根据权利要求1所述的试剂盒，其中外源基因选自PRSVR基因、PRSVCP基因、FMV35S基因中的一种或多种。

4、根据权利要求1或3所述的试剂盒

其中外源基因为PRSVR基因时，其特异性引物对为：

上游引物5’TTG TCC CCT CTT CCG GAG TT 3’

下游引物5’CTT CCT TGC TTA GAA CGC TTT TCA 3’，

相应的，与PRSVR基因扩增产物特异性结合的探针为：

5’CCT GGA GTG TAA TGA GGAAGC CAA GAC TTT CTT T 3’.

其中外源基因为PRSVCP基因时，其特异性引物对为：

上游引物5’TCT AAC ACT CGC GCC ACT CA 3’

下游引物5’CCG TTT AAC ATT ACT TGC ATT TCG 3’，

相应的，与PRSVCP基因扩增产物特异性结合的探针为：

5’ACG AGG GAG TGA GGA ATG ATT ACG GCC T 3’.

5、根据权利要求1所述的试剂盒，其中探针是用标记物标记的探针，其中探针标记物选自生物素-亲和素、地高辛、放射性同位素、荧光标记中的一种或多种。

6、根据权利要求5所述的试剂盒，其中探针是Taqman型荧光探针。

7、根据权利要求1所述的试剂盒，其中标准参照样品是一组转基因番木瓜DNA与非转基因番木瓜DNA按梯度比例混合的混合物。

8、根据权利要求7所述的试剂盒，其中标准参照样品是一组转基因番木瓜DNA与非转基因番木瓜DNA的混合物，各混合物中转基因番木瓜DNA的含量分别为0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、5％。

9、一种定性检测转基因番木瓜及其加工产品的方法，它包括以下步骤：

(1)提取番木瓜或其加工产品的DNA作为模版；

(2)用任一权利要求1-8所述的之任一试剂盒进行检测，将模版DNA分别加入扩增CAR基因和外源基因各自的反应体系，在PCR扩增仪上孵育，分别扩增CAR基因和外源基因；

其中扩增CAR基因和外源基因的定性PCR反应体系各组分体积配比均为：10×PCR反应缓冲液5体积份、10×25mM MgCl₂ 5体积份、10mM dNTP 5体积份、Taq DNA聚合酶0.4体积份、5μM上游引物1体积份、5μM下游引物1体积份、灭菌超纯水30.6体积份、加入的模版DNA 2体积份；

定性PCR循环参数为：

95℃预变性34min；94℃变性20s；549℃退火430s；72℃延伸430s，循环40次；

最后在72℃延伸10min；

(3)将定性PCR产物进行凝胶电泳检测；

(4)将PCR产物回收纯化、测序。

10、一种定量检测转基因番木瓜及其加工产品的方法，它包括以下步骤：

(1)提取番木瓜或其加工产品的DNA作为模版；

(2)用任一权利要求1-8所述的之任一试剂盒进行检测，将模版DNA分别加入扩增CAR基因和外源基因各自的定量反应体系，在定量PCR扩增仪上孵育，分别扩增CAR基因和外源基因；

其中扩增CAR基因和外源基因的定量反应体系各组分体积配比均为：10×PCR反应缓冲液5体积份、10×25mM MgCl₂ 10体积份、10mM dATP 1体积份、1mM dGTP 1体积份、1mM dUTP 1体积份、1mM dCTP 1体积份、1U/μl UNG酶0.5体积份、5U/μl Taq DNA聚合酶0.5体积份、5μM上游引物4体积份、5μM下游引物4体积份、20μM探针1体积份、灭菌超纯水19体积份、加入的模版DNA 2体积份；

定量PCR循环参数为：

50℃ 10min；95℃ 10min；95℃ 15s；60℃ 1min，循环50次；

(3)分别将扩增产物与各自探针杂交，检测杂交所产生的可测信号，获取数据；

(4)制作标准曲线：

将标准参照物作为模板，按步骤(2)进行扩增；按步骤(3)进行测定，获取数据，制得标准曲线；

(5)将步骤(3)测定的数据与标准曲线进行比较，定量检测番木瓜或其加工产品中转基因成分。

Images