CN100500832C - 枯草芽孢杆菌zjb-063及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了从土壤中筛选到的微生物新菌株枯草芽孢杆菌ZJB-063，及其在制备对羟基苯乙酸中的应用。本发明的有益效果主要体现在：通过筛选得到新的菌株来生物法合成对羟基苯乙酸，代替化学合成的方法。具有转化率高，环境友好，过程绿色等优点。同时该菌株可以将高毒性的腈类化合物水解成危害较小的酸类物质，生物法是迄今处理工业废水中高毒性腈化合物最经济、最有效的一种方法，所以本发明在环境治理上也具有重要的现实意义。
Description
(一)技术领域
本发明涉及从土壤中筛选到的微生物新菌株枯草芽孢杆菌ZJB-063，及其在制备对羟基苯乙酸中的应用。
(二)背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取5′-核苷酸酶的菌种。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。
对羟基苯乙酸是一种重要的有机合成中间体，用对羟基苯乙酸合成的产品用途相当广泛，其应用领域覆盖医药、农药、液晶材料等多方面。在医药领域主要用来合成心血管药物——4，7-二羟基异黄酮，该药品临床用于治疗高血压引起的颈项强痛、头痛、偏头痛、头晕、冠心病、心绞痛及早期神经感觉性耳聋等症状，疗效显著，应用普遍。还可合成消炎镇痛药物苯恶洛芬，该药品用于治疗风湿性关节炎、类风湿性关节炎以及其他发炎性疾病。而由该产品合成的抗生素药物拉氧头孢钠更是疗效显著的医药产品，它可通过阻断细菌细胞壁的合成而导致细胞的死亡。其次还用于抗高血压药物——阿替洛尔以及抗癌药物、抗糖尿病药、抗动脉硬化药、抗过敏药和消炎药、β-受体阻滞药等的合成。在农药领域主要用于合成除虫剂乙氰菊酸，此杀虫剂具有触杀和喷杀作用，对动物安全，阳光下稳定性好，近年来等到广大用户的欢迎，在高分子化合物中，对羟基苯乙酸可用作合成聚合物的光热稳定剂，在光电子领域中，对羟基苯乙酸可用来合成液晶化合物，在生物化学领域中，合成脂肪氧合酶阻滞剂需用对羟基苯乙酸。此外还可用于抗静电剂的合成。
目前所用的生产对羟基苯乙酸的方法匀为化学合成法，文献[Tetrahedron Letters，1991，32(10)：1343-1346]中报导过能产对羟基苯乙腈水合酶及对羟基苯乙腈的水解酶的菌Rhodococcus butanica ATCC 21197，该菌能催化多种腈生成对应的酰胺或酸如苯环上被羟基、甲基、氯、氰基及甲氧基等取代的苯甲腈及对位被羟基、氯及甲氧基取代的苯乙腈等。但该菌株能同时产腈水解酶和腈水合酶，所以产物中会混有较多的对羟基苯乙酰胺，增加了分离难度的同时也影响了收率。
另东京大学1990年报道的一能催化该反应的菌为Alcaligenes faecalisJM3，该菌对苯环上有取代基的苯乙腈类物质有较好的活性，但对其它脂肪类腈基本没活力[European Journal of Biochemistry，1990，194：765-772]。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供可将对羟基苯乙腈水解为对羟基苯乙酸的芽孢杆菌属新菌株及其在制备对羟基苯乙酸中的应用。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是：
枯草芽孢杆菌ZJB-063(Bacillus subtilis ZJB-063)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No.M 206038，保藏日期2006年4月14日。提议的分类命名为枯草芽孢杆菌ZJB-063。
枯草芽孢杆菌ZJB-063的由以下途径筛选得到：
所用富集培养基，其配方如下：葡萄糖5g/L，K2HPO4 0.8g/L，KH2PO43.3g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，NaCl 1g/L，FeSO4·7H2O 2mg/L，CaCl215mg/L，对羟基苯乙腈1g/L，自来水配置，自然pH。121℃灭菌15min，备用。
用于筛选微生物的土样来自各种可分离到微生物的样品，如果园、农田、污水处理站等。
称取5g土样于50mL水中，用玻璃珠振荡打碎，取悬浊液5mL于装有45mL富集培养基的三角瓶中，置于摇床28℃、150r/min培养4-5天。然后取1mL富集后的培养物于40mL新鲜的富集培养基中再进行一轮富集培养。培养4-5天后进行稀释涂平板。先将培养液进行梯度稀释，选取稀释度为10-7、10-8、10-9、10-10等四个梯度进行涂布，每一梯度做两个对照，每次吸取涂布的菌悬液量为0.1mL。涂布完毕后置于生化培养箱中28℃培养，培养时间主要以长出合适大小的单菌落为参考，一般为3-4天。待长出合适大小的单菌落后，根据形态上的差异随机挑取单菌落接种于试管斜面并分别编号，置生化培养箱中28℃培养至长满整个斜面，时间一般为3-4天。
从已长好的试管斜面上挑取一环菌体至装有30mL发酵产酶培养基的250mL三角瓶中，摇瓶培养均在28℃，摇床转速150r/min。培养48h后又加入5mL的2g/L的对羟基苯乙腈水溶液进行诱导培养24h。培养完成后在9000r/min下离心10分钟收集菌体，并用生理盐水洗涤一次，离心弃上清后备用。
用10mLpH为7.0的0.2mol/L的磷酸钠盐缓冲液洗下菌体并倒至50mL的磨口三角瓶中，再加入2g/L的对羟基苯乙腈水溶液10mL，置于水浴摇床上30℃反应，24h后取样，离心取上清液进行微滤，然后用薄板色谱法(TLC)检测是否有对羟基苯乙酸生成。有对羟基苯乙酸生成的菌株即为所要筛选的菌株。
所筛选得到具有很强水解对羟基苯乙腈能力产生对羟基苯乙酸的枯草杆菌ZJB-063细胞形态为杆状，长0.6～0.8μm、宽2.0～3.0μm，活动能力差，无鞭毛、有芽孢，革兰氏染色阳性；所述的枯草芽孢杆菌ZJB-063生化实验过氧化氢酶阳性，好氧，V.P.反应阳性，M.R.实验阴性，油脂水解阳性，明胶液化阳性，氧化酶实验阴性，石蕊牛奶反应阳性，生长最高温度40℃，脲酶测定阳性。以上是对枯草杆菌ZJB-063的部分菌株形态与生理生化特征，详细描述见表1：
表1：枯草杆菌ZJB-063菌株形态与生理生化特征
注：表中+表示阳性，-表示阴性。
菌株的16s rDNA序列分析：
以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物p16S-8：5′-aga gttt gat cct ggctca g-3′和p16S-1541：5′-aag gag gtg atc cag ccg ca-3′扩增菌株的16S rDNA基因，将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，经PCR扩增成功获得了一长约为1.5kb的片段，经测序确认该片段实际长度为1489bp，其序列如下：
GGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAA。
将该序列(已提交GenBank，GenBank登记号为No.DQ474759)与GenBank中相关数据进行相似性分析发现，与枯草芽孢杆菌的同源性最高(homology，100％/ 1489bps，based on 16S rDNA)。同已知的细菌16S rDNA序列进行比对，利用Phylips(version 3.572)软件构建进化树(见图1)，确定菌株ZJB-063的进化地位，生理生化鉴定结合分子鉴定，可确认该菌株为枯草芽孢杆菌，拟命名为Bacillus subtilis ZJB-063。
所述的枯草芽孢杆菌ZJB-063可用来水解对羟基苯乙腈制备对羟基苯乙酸。
对羟基苯乙腈：英文名为p-hydroxybenzylcyanide，分子式为C8H7NO，分子量133.15，主体为一苯环，其重要的基团有：一个氰基(-CN)和一个羟基(-OH)。黄色晶体熔点67-71℃，沸点756mmHg下330℃，有刺激性及毒性。
对羟基苯乙酸：英文名为p-hydroxyphenylaceticacid，分子式为C8H8O3，主体为一苯环，其重要的基团有：对个羧基(-COOH)和一个羟基(-OH)。是一种白色或浅黄色的针状结晶体，熔点为149-151℃，易升华，易溶于乙醚、乙醇、醋酸，部分溶于水，易溶于50-60℃热水中。
由对羟基苯乙腈水解生成对羟基苯乙酸的反应式如下：
所述的应用是将枯草芽孢杆菌ZJB-063菌种接种到适用于芽孢杆菌的培养基中进行发酵培养获得产生腈水解酶的微生物细胞，然后对发酵液进行离心或过滤，得到菌体，将菌体细胞或处理过的菌体细胞添加到含有对羟基苯乙腈溶液中进行水解反应，最后对转化液进行分离，即得所述的对羟基苯乙酸。所述处理过的菌体细胞是指经处理后得到的粗酶、固定化细胞、固定化酶。
用于本发明枯草芽孢杆菌ZJB-063菌种的培养基是一些含有可以被上述菌株利用营养物质，培养基中合理配入上述微生物能利用的碳源、氮源、无机盐等。作为碳源的有：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、糊精、淀粉、甘油、甘露醇、山梨醇、油脂类(豆油、猪油等)；作为氮源的有：肉汁、酵母膏、干酵母、大豆粉、玉米浆、蛋白胨、尿素、氨盐(硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、醋酸胺等)，肽类(二肽、三肽等)；无机盐类有：Na、K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn、Co、Ni等金属盐类和磷酸盐、醋酸盐等有机酸盐类；另可加有：氨基酸类(如谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸等)、微生素(VB1、VB2、VB12、VC、VE、烟酸等)、核酸类(如嘌呤、嘧啶及其衍生物等)。用无机酸或有机酸、碱类调节培养基的pH值。
优选的，所述的应用是将枯草杆菌ZJB-063菌株的种子液接种入发酵培养基中进行发酵培养，所述的种子培养的培养基组成为：葡萄糖：1.0％，酵母膏：0.3％，NaCl：0.1％，K2HPO4：0.02％，KH2PO4·3H2O：0.02％，MgSO4：0.02％，用去离子水配制，pH自然；取种子培养基，分装培养三角瓶中，灭菌；接入斜面菌种枯草杆菌ZJB-063，培养菌体，摇床转速150r/min，在28℃摇床培养48h作为种子液；所述发酵培养基组成为：葡萄糖0.5～2.0％，酵母粉0.1～2.0g％，尿素0.0～1.0g％，谷氨酸钠0.0～0.1％，K2HPO4 0.01～0.2％、KH2PO4 0.01～0.1％，(NH4)2SO4 0.0～1.0％，MgSO40.01～0.1％、FeCl2 0～0.01％，余量为去离子水；种子液接种量为2～5％体积比，培养条件为：pH6～8、温度20～40℃下培养1～3天。优选的培养条件式在pH6.5～7.5，温度28～32℃条件下培养48～60h。所述培养基组成以质量/体积百分比计算，某物质浓度为1％表示100mL溶液中含有1g该物质。可采用培养方式有：静置培养、摇动培养、或通风搅拌培养等，大量生产菌体时宜采用深层通风搅拌培养。
按照上述方法培养获得产生腈水解酶的微生物细胞，然后通过离心的方法分离出细胞。再将细胞或以处理过的细胞(粗酶、固定化细胞、固定化酶等)悬浮在水、或缓冲液、也可以是生理盐水中，然后加入底物对羟基苯乙腈进行水解反应。所述水解反应的反应条件为：反应温度5～40℃，反应pH5～10，反应2～48h。最适反应温度30～34℃、pH8.6～9.0，底物的转化率可达100％，酸的产率大于95％。加入底物对羟基苯乙腈的方式有多种，可以一次性加入，也可以逐渐地，以可控制的方式连续加入腈化合物，底物浓度最大达到25g/L。腈化合物在细胞或处理过的细胞的催化作用下转化为对羟基苯乙酸，反应液中大约含有0.1％～1.5％(重量比)的干细胞和大约0.05％～2％(重量比)的腈化合物。
所述对羟基苯乙腈溶液中还添加有体积浓度0.1～90％的助溶剂，以增加底物的溶解度，所述助溶剂选自下列之一：①甲醇、②二甲基亚砜、③乙醇、④乙二醇、⑤丙酮。
本发明中作为生物催化剂的微生物细胞或处理过的细胞(粗酶、固定化细胞、固定化酶等)可以重复利用。
所述转化液分离方法为：回收反应液中的菌体细胞，将转化液经弱碱性阴离子交换树脂吸附，再用1～1.5mol/L盐酸洗脱，往洗脱液中加入乙酸乙酯去除杂质，收集水相加热浓缩后冷却结晶，过滤、冲洗、干燥，即得所述的对羟基苯乙酸。
在产物浓度较高的情况下可不过离子交换柱，直接向离心去除细胞后的转化液中加入少量乙酸乙酯去除杂质后即可加热浓缩。然后经冷却结晶，过滤干燥，最终对羟基苯乙酸的产率可达90％以上，产品纯度在98％以上。
具体的，所述对羟基苯乙酸制备方法如下：
(1)种子培养：种子培养基组成：葡萄糖1.0％，酵母膏0.3％，NaCl0.1％，K2HPO4 0.02％，KH2PO4·3H2O 0.02％，MgSO40.02％，用去离子水配制，pH自然；将种子培养基分装、灭菌，接入斜面枯草芽孢杆菌ZJB-063菌种，摇床转速150r/min，28℃摇床培养48h作为种子液，备用；
(2)发酵培养：发酵培养基组成：葡萄糖1.8％，酵母膏0.5％，K2HPO40.05％，KH2PO4·3H2O 0.05％，MgSO4 0.1％，味精0.076％，尿素0.75％，用去离子水配制，pH自然；将发酵培养基分装、灭菌，以体积比2％接种量接入种子液，摇床转速150r/min，28℃下培养60h；
(3)催化水解：发酵液离心收集菌体，用生理盐水配制菌悬液，与质量浓度0.1％的对羟基苯乙腈水溶液混合，pH7.0、30℃水浴中转化3h；
(4)产物分离：转化液离心去除菌体细胞，转化液用弱碱性阴离子交换树脂D301-FC(购自浙江千秋环保水处理有限公司)吸附，用水淋洗，然后用1mol/L盐酸洗脱，向洗脱液中加入乙酸乙酯去除其它杂质，收集水相并加热浓缩冷却结晶，过滤，少量水冲洗后置于烘箱中干燥，即得所述的对羟基苯乙酸。
用薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)等的分析方法可以对发酵液中的对羟基苯乙酸及对羟基苯乙腈进行分析。用薄层层析(TLC)的分析方法如下：薄板为普通硅胶板，所用流动相为95％的乙醇水溶液，室温下经过30-40分钟层析，在碘缸中显色，对羟基苯乙酸Rf＝0.558，对羟基苯乙腈Rf＝0.854。高效液相色谱检测方法为：所用色谱柱填料为HypersilODS2(5μm)，尺寸为4.6mm×250mm(大连依利特公司生产)。分离对羟基苯乙腈及对羟基苯乙酸等物质的流动相组成为V(甲醇)∶V(水)∶V(四氢呋喃)∶V(乙酸)＝35∶65∶8∶1。对羟基苯乙酸及对羟基苯乙腈的出峰时间分别为4.7min和5.2min。
本发明的有益效果主要体现在：通过筛选得到一株新的菌株来生物法合成对羟基苯乙酸，代替化学合成的方法。具有转化率高，环境友好，过程绿色等优点。同时该菌株可以将高毒性的腈类化合物水解成危害较小的酸类物质，生物法是迄今处理工业废水中高毒性腈化合物最经济、最有效的一种方法，所以本发明在环境治理上也具有重要的现实意义。
(四)说明书附图
图1为Bacillus subtilis ZJB-063与相关菌株的进化树。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
种子培养基配方(重量/体积百分比，以下同)：葡萄糖：1.0％，酵母膏：0.3％，NaCl：0.1％，K2HPO4：0.02％，KH2PO4·3H2O：0.02％，MgSO4：0.02％，用去离子水配制，pH自然。
发酵培养基配方：葡萄糖：1.8％，酵母膏：0.5％，K2HPO4：0.05％，KH2PO4·3H2O：0.05％，MgSO4：0.1％，味精：0.076％，尿素：0.75％，用去离子水配制，pH自然。
取100mL上述种子培养基，平均分装在2个250mL三角瓶中，灭菌。接入斜面菌种枯草芽孢杆菌ZJB-063，培养菌体，摇床转速150r/min，在28℃摇床培养48h作为种子液，备用。
取1L上述发酵培养基，平均分装入10个500mL摇瓶中，灭菌。接入种子液，接种量为2％(v/v)，进行培养，培养温度为28℃，培养时间为60h，摇床转速150r/min。
培养完成后，将发酵液在9000r/min下离心收集菌体，并将菌体悬浮于200mL生理盐水中制得菌悬液，将菌悬液与用缓冲液(NaH2PO4-Na2HPO4，0.2mol/L)配制的对羟基苯乙腈水溶液等体积混合后，置于30℃的水浴摇床上反应，底物浓度为1g/L，pH为7.0转化3h后，离心去除转化液中的细胞，用高效液相色谱检测。得对羟基苯乙腈的转化率为100％。将转化液离心去除细胞，并过滤，将该转化液经弱碱性阴离子交换树脂D301-FC(购自浙江千秋环保水处理有限公司)吸附，用水淋洗，然后用1mol/L盐酸洗脱，洗脱体积为150mL。向洗脱液中加入20mL的乙酸乙酯，振荡以去除洗脱液中的其它杂质。收集水相并加热浓缩后置于冰箱中冷却即会有对羟基苯乙酸晶体析出。最后滤纸过滤，少量水冲洗后置于烘箱中干燥，即可得产品对羟基苯乙酸，最终产率在91.3％。
实施例2：
发酵产酶培养基配方葡萄糖：2.0％，酵母粉：0.7％(NH4)2SO4：0.5％，KCl：1.0％，K2HPO4·12H2O：0.05％，NaH2PO4·2H2O：0.05％，MgSO4：0.01％，用自来水配制，用HCl调节pH为6.5。
取1000mL培养基，平均分装在10个500mL三角瓶中，灭菌。接入斜面菌种枯草芽孢杆菌ZJB-063，培养菌体50h，然后进行离心分离收集得到菌体，将这些菌体加入到500mL对羟基苯乙腈水溶液中，最终底物浓度为3g/L，利用菌体水解对羟基苯乙腈；反应条件：温度33℃，初始pH为6.8，转化时间为4h，摇床转速100r/min。经高效液相色谱检测，得对羟基苯乙腈的转化率为100％。将转化液离心去除细胞，并过滤，并将该转化液经弱碱性阴离子交换树脂D301-FC吸附，用水淋洗，然后用1mol/L盐酸洗脱，洗脱体积为200mL。向洗脱液中加入20mL的乙酸乙酯，振荡以去除洗脱液中的其它杂质。收集水相并加热浓缩后置于冰箱中冷却即会有对羟基苯乙酸晶体析出。最后滤纸过滤，少量水冲洗后置于烘箱中干燥，即可得产品对羟基苯乙酸，最终产率在93.1％。
实施例3：
液体种子培养基同实施例1。
发酵产酶培养基：葡萄糖：0.5％，酵母粉：2％，尿素：0.4g％，谷氨酸钠：0.1％，K2HPO4：0.01％，KH2PO4：0.01％，(NH4)2SO4：1.0％，MgSO4：0.01％、pH自然。
取100mL液体种子培养基，平均分装在2个250mL三角瓶中，灭菌。接入斜面菌种枯草芽孢杆菌ZJB-063，培养菌体，摇床转速150r/min，在28℃摇床培养36h作为种子液，备用。
取2L上述发酵培养基，平均分装入20个500mL摇瓶中，灭菌。接入种子液，接种量为4％(v/v)，进行培养，培养温度为28℃，培养时间为60h，摇床转速150r/min。
9000r/min下离心收集菌体，用蒸馏水洗涤两次，用玻璃珠打碎菌团后平均分装到10个500mL的三角瓶中，每个三角瓶中加入200mL缓冲液(甘氨酸-氢氧化钠，0.05mol/L)，pH为9.2，向每瓶中加入10mL乙醇，底物对羟基苯乙腈的浓度为10g/L，置于30℃，100r/min的摇床上转化。转化12h后，经高效液相色谱检测得底物转化率已达100％。将所得到的转化液离心去除细胞，将上清液收集得到1900mL转化液，向该上清液中加入200mL乙酸乙酯，用以去除乙醇及其它杂质。将水相收集后在旋转蒸发仪浓缩，并经冷却结晶，过滤干燥后得到产物对羟基苯乙酸。最终对羟基苯乙酸的产率为90.5％。
实施例4：
液体种子培养基同实施例1。
发酵产酶培养基：葡萄：1.35％，酵母粉：0.65％，(NH4)2SO4：0.55％，K2HPO4：0.066％，KH2PO4：0.05％，MgSO4：0.05％，pH自然。
取100mL液体种子培养基，平均分装在2个250mL三角瓶中，灭菌。接入斜面菌种枯草芽孢杆菌ZJB-063，培养菌体，摇床转速150r/min，在28℃摇床培养45h作为种子液，备用。
取2L上述发酵培养基，平均分装入20个500mL摇瓶中，灭菌。接入种子液，接种量为3％(v/v)，进行培养，培养温度为28℃，培养时间为72h，摇床转速150r/min。
9000r/min下离心收集菌体，用蒸馏水洗涤两次，用玻璃珠打碎菌团后平均分装到10个500mL的三角瓶中，每个三角瓶中加入200mL缓冲液(甘氨酸-氢氧化钠，0.05mol/L)，pH为8.6，底物对羟基苯乙腈的浓度为1g/L，置于30℃，100r/min的摇床上转化。转化开始后每隔2-3h向每瓶中加入0.2g底物，所加的底物使缓冲体系中的底物浓度提高1g/L，经转化48h后，底物的累积浓度已到约25g/L，共加入底物50g。经高效液相色谱检测得底物转化率已达100％。将所得到的转化液离心去除细胞，将上清液收集，在旋转蒸发仪上将产物浓缩，冷却结晶，过滤后少量水洗涤，将剩余的对羟基苯乙酸滤液收集后可再进行分离，干燥后得到产物对羟基苯乙酸，产率为93.2％。
实施例5：
液体种子培养基同实施例1。
发酵培养基配方葡萄糖：2.0％，尿素：0.8％，酵母膏：0.1％，NaCl：0.5％，K2HPO4·12H2O：1.0％，KH2PO4·2H2O：0.5％，MgSO4：0.02％，用自来水配制，用NaOH溶液调节pH为7.5。
取1000mL培养基，平均分装在10个500mL三角瓶中，灭菌，按4％(v/v)的接种量接入液体种子枯草芽孢杆菌ZJB-063。培养50h后离心收集菌体，将菌体悬浮地于200mLpH为8.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，用超声波将菌体破碎，再进行离心去除细胞及细胞碎片后得粗酶液180mL，加入pH为8.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液120mL后共得300mL。向该粗酶液中加入对羟基苯乙腈，最终底物浓度为3g/L。反应条件：温度32℃，初始pH为8.0，转化时间为10h左右，反应在静置下进行。取上述转化液2mL，进行离心后取上清液，经高效液相色谱检测，得对羟基苯乙腈的转化率为100％。将转化液离心取上清液，向上清液中加入20mL乙酸乙酯，将水相在旋转蒸发仪上将产浓缩，冷却结晶，过滤后少量水洗涤，将剩余的对羟基苯乙酸滤液收集后可再进行分离，干燥后得到产物对羟基苯乙酸，产率为91.8％。
实施例6：
液体种子培养基同实施例1。
发酵培养基配方葡萄糖：1.5％，尿素：0.1％，酵母膏：1％，NaCl：0.1％，K2HPO4·12H2O：1.0％，KH2PO4·2H2O：0.5％，MgSO4：0.05％，用自来水配制，用NaOH溶液调节pH为7.5。
取2000mL培养基，平均分装在10个500mL三角瓶中，灭菌，按2％(v/v)的接种量接入液体种子枯草芽孢杆菌ZJB-063。培养48h后离心收集菌体，将菌体悬浮地于400mLpH为9.2的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液中，用超声波将菌体破碎，再进行离心去除细胞及细胞碎片后得粗酶液380mL，加入pH为9.2的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液220mL后共得600mL。向该粗酶液中加入对羟基苯乙腈，并加入40mL乙醇为促溶剂，最终底物浓度为12g/L。反应条件：温度35℃，初始pH为9.2，转化时间为18h左右，反应在静置下进行。取上述转化液2mL，进行离心后取上清液，经高效液相色谱检测，得对羟基苯乙腈的转化率为98％。将转化液离心(12000r/min，5min)取上清液，向上清液中加入80mL乙酸乙酯，将水相在旋转蒸发仪上将产浓缩，冷却结晶，过滤后少量水洗涤，将剩余的对羟基苯乙酸滤液收集后可再进行分离，干燥后得到产物对羟基苯乙酸，产率为89.6％。
实施例7：
液体种子培养基同实施例1。
发酵培养基配方：葡萄糖：1.5％，酵母膏：0.2％，牛肉膏：0.5％，NaCl：0.1％，K2HPO4·12H2O：0.05％，KH2PO4·2H2O：0.1％，MgSO4：0.01％，FeCl20.001％，用去离子水配制，用HCl溶液调节pH为6.0。
取1000mL培养基，平均分装在10个500mL三角瓶中，灭菌，按5％(v/v)的接种量接入液体种子枯草芽孢杆菌ZJB-063。培养72h后离心收集菌体，将菌体悬浮于250mL pH为7.5的HCl-Tris缓冲液(0.05mol/L)中，用超声波将菌体破碎，再进行离心去除细胞及细胞碎片后得粗酶液380mL，加入pH为7.5的HCl-Tris缓冲液(0.05mol/L)250mL后共得500mL。向该粗酶液中加入对羟基苯乙腈，并加入50mL二甲基亚砜(DMSO)为促溶剂，最终底物浓度为14g/L。反应条件：温度30℃，初始pH为7.5，在水浴摇床上进行转化(50r/min)，时间为16h左右。取上述转化液2mL，进行离心后取上清液，经高效液相色谱检测，得对羟基苯乙腈的转化率为98％。将转化液离心(12000r/min，5min)取上清液，向上清液中加入100mL乙酸乙酯，将水相在旋转蒸发仪上将产物浓缩，冷却结晶，过滤后少量水洗涤，将剩余的对羟基苯乙酸滤液收集后可再进行分离，干燥后得到产物对羟基苯乙酸，产率为90.8％。
SEQUENCE LISTING
<110>浙江工业大学
<120>枯草芽孢杆菌ZJB-063及其应用
<130>
<160>3
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1489
<212>DNA
<213>Bacillus subtilis
<400>1
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>Unknown
<220>
<223>人工序列
<400>2
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>Unknown
<220>
<223>人工序列
<400>3
Claims (8)
1.枯草芽孢杆菌ZJB-063(Bacillus subtilis ZJB-063)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No.M206038，保藏日期2006年4月14日。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌ZJB-063在制备对羟基苯乙酸中的应用。
3.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌ZJB-063在制备对羟基苯乙酸中的应用，其特征在于：所述的应用是将枯草芽孢杆菌ZJB-063菌种接种到适用于芽孢杆菌的培养基中进行发酵培养，然后对发酵液进行离心或过滤，得到菌体，将菌体细胞或处理过的菌体细胞添加到含有对羟基苯乙腈溶液中进行水解反应，最后对转化液进行分离，即得所述的对羟基苯乙酸。
4.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌ZJB-063在制备对羟基苯乙酸中的应用，其特征在于：所述的应用是将枯草杆菌ZJB-063菌种的种子液接种入发醇培养基中进行发酵培养，所述的种子培养的培养基组成为：葡萄糖：1.0％，酵母膏：0.3％，NaCl：0.1％，K2HPO4：0.02％，KH2PO4·3H2O：0.02％，MgSO4：0.02％，用去离子水配制，pH自然；取种子培养基，分装培养容器中，灭菌；接入斜面菌种枯草杆菌ZJB-063，培养菌体，摇床转速150r/min，在28℃摇床培养48h作为种子液；所述发酵培养基组成为：葡萄糖0.5～2.0％，酵母粉0.1～2.0g％，尿素0.0～1.0g％，谷氨酸钠0.0～0.1％，K2HPO40.01～0.2％、KH2PO40.01～0.1％，(NH4)2SO40.1～1.0％，MgSO40.01～0.1％、FeCl20.001～0.01％，余量为去离子水；种子液接种量为2～5％体积比，培养条件为：pH6～8、温度20～40℃下培养1～3天。
5.如权利要求3所述的枯草杆菌ZJB-063在制备对羟基苯乙酸中的应用，其特征在于所述水解反应的反应条件为：反应温度5～40℃，反应pH5～10，反应2～4h。
6.如权利要求3所述的枯草杆菌ZJB-063在制备对羟基苯乙酸中的应用，其特征在于所述对羟基苯乙腈溶液中还添加有体积浓度0.1～90％的助溶剂，所述助溶剂选自下列之一：①甲醇、②二甲基亚砜、③乙醇、④乙二醇、⑤丙酮。
7.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌ZJB-063在制备对羟基苯乙酸中的应用，其特征在于所述转化液分离方法为：回收反应液中的菌体细胞，然后将转化液经弱碱性阴离子吸附，再用1～1.5mol/L盐酸洗脱，往洗脱液中加入乙酸乙酯去除杂质，收集水相加热浓缩后冷却结晶，过滤、冲洗、干燥，即得所述的对羟基苯乙酸。
8.如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌ZJB-063在制备对羟基苯乙酸中的应用，其特征在于所述对羟基苯乙酸制备方法如下：
(1)种子培养：种子培养基组成：葡萄糖1.0％，酵母膏0.3％，NaCl 0.1％，K2HPO4 0.02％，KH2PO4·3H2O 0.02％，MgSO40.02％，用去离子水配制，pH自然；将种子培养基分装、灭菌，接入斜面枯草芽孢杆菌ZJB-063菌种，摇床转速150r/min，28℃摇床培养48h作为种子液，备用；
(2)发酵培养：发酵培养基组成：葡萄糖1.8％，酵母膏0.5％，，K2HPO4 0.05％，KH2PO4·3H2O 0.05％，MgSO40.1％，味精0.076％，尿素0.75％，用去离子水配制，pH自然；将发酵培养基分装、灭菌，以体积比2％接种量接入种子液，摇床转速150r/min，28℃下培养60h；
(3)催化水解：发酵液离心收集菌体，用去离子水配制菌悬液，与质量浓度0.1％的对羟基苯乙腈水溶液混合，pH7.0、30℃水浴中转化3h；
(4)产物分离：转化液离心去除菌体细胞，转化液经弱碱性阴离子交换树脂D301-FC吸附，用水淋洗，然后用1mol/L盐酸洗脱，向洗脱液中加入乙酸乙酯去除其它杂质，收集水相并加热浓缩冷却结晶，过滤，少量水冲洗后置于烘箱中干燥，即得所述的对羟基苯乙酸。
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