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CN100335649C - 在核酸杂交试验中减少非特异性杂交 - Google Patents

在核酸杂交试验中减少非特异性杂交 Download PDF

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CN100335649C CNB951958801A CN95195880A CN100335649C CN 100335649 C CN100335649 C CN 100335649C CN B951958801 A CNB951958801 A CN B951958801A CN 95195880 A CN95195880 A CN 95195880A CN 100335649 C CN100335649 C CN 100335649C
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Abstract

本发明提供显著减少核酸杂交试验中遇到的背景信号的方法。本方法基于消除或显著减少非特异性杂交现象，从而提供仅当感兴趣的靶多聚核苷酸存在时才产生的可检测信号。另外还提供化学合成异鸟苷或2′-脱氧-异鸟苷的新方法。本发明还可用于反义分子和适应子治疗以及药物发现。

Description

在核酸杂交试验中减少非特异性杂交
技术领域
本发明总体上涉及核酸化学和杂交试验。更具体地说，本发明涉及在核酸杂交试验中生成靶依赖性更强的信号的方法，该方法是通过使主要由非特异性杂交产生的背景噪声最小化而进行的。本发明还可应用于反义分子和适应子(aptamer)治疗和药物发现。
背景
核酸杂交试验常用于遗传研究、生物医学研究和临床诊断。在基本的核酸杂交试验中，将单链分析物(analyte)核酸与被标记的单链核酸探针杂交，检测得到的被标记双螺旋。人们开发了该基本方案的许多变型来增强准确度，促进待检测双螺旋与其他材料分离，和/或扩增待测信号。
本发明涉及一种减少在任何核酸杂交试验中遇到的背景噪声的方法。本发明公开的技术要处理的背景噪声通常源于特定试验中用到的各种多聚核苷酸组分的不合需要的相互作用，即产生的信号并不与分析物的存在和数量相对应的相互作用。本发明可与任意数量的进行多步杂交的试验形式合用，产生与多聚核苷酸分析物的存在或数量相关的可检测信号。
一种此类试验的详述见普通授让给Urdea等的美国专利4,868,105号，其公开内容在此引入作为参考。该试验用到被设计为将多聚核苷酸分析物结合到固体支持物上的二部分(two-part)捕获系统，和被设计为将可检测标记结合到待检测或定量的多聚核苷酸分析物上的二部分标记系统。二部分捕获系统用到结合在固体支持物上的捕获探针和既与捕获探针一片段杂交又与多聚核苷酸分析物一片段杂交的捕获扩展物(captureextender)分子。二部分标记系统涉及与多聚核苷酸分析物一片段杂交的标记扩展物(label extender)分子，和与标记扩展物分子杂交并且含有或结合可检测标记的标记探针。该系统的优点之一是必须进行多步杂交才能以与分析物存在相关的方式检测标记，使得必须发生两种不同的杂交反应才能完成分析物“捕获”，并且相似地，必须发生两种不同的杂交反应才能完成分析物标记。然而仍有许多方式可产生不与分析物的存在或数量相对应的可检测信号，这将在下面详述。
对本发明有用的另一试验的实施例是一种信号扩增方法，其描述见普通授让给Urdea等的美国专利5,124,246号，其公开内容在此引入作为参考。在该方法中，信号通过扩增多聚体(amplification multimer)扩增，扩增多聚体是多聚核苷酸，其被构建为含有特异性地与标记扩展物杂交的第一片段，和特异性地与标记探针杂交的相同的第二片段的多重拷贝。扩增程度理论上与第二片段的重复数成正比。多聚体可为直链或支链，支链多聚体可为叉形或梳形，梳形多聚体是优选的。
解决核酸杂交试验中背景干扰信号问题的一种途径由PCT出版物WO95/16055号给出，其中必须有至少两种捕获扩展物和/或两个或多个标记扩展物与分析物结合才能引发可检测信号。为进一步降低背景噪声，试验在有利于形成多组分复合物的条件下进行。
另一种用来增强杂交试验信号的靶依赖性的途径的描述见于欧洲专利出版物70,685号，发明人Heller等。该对比文献描述一种均一杂交试验，其中在邻近探针之间发生非辐射的能量转移；必须发生两个不同事件才能产生靶生成信号，从而提高了检测准确度。
本发明也被设计为用于提高杂交试验中多聚核苷酸分析物的检测与定量的准确度。本发明通过减少无靶时产生信号的发生率，提高这类试验的灵敏度与特异性，并且与目前所用的试验设置相比，时间和费用均不增加。
本发明的目的，即降低背景噪声，增加核酸杂交试验中分析物的检测和定量的准确度，可部分地用以“非天然”氢键模式形成碱基对的核苷变异体来实现。在此，“非天然”碱基对是在除腺苷(A)、胸苷(T)、胞苷(C)、鸟苷(G)或尿苷(U)外的其他核苷酸单位之间形成的。一种这样的非天然核苷碱基配对是在异胞嘧啶(isoC)和异鸟嘌呤(isoG)间形成的。isoC与isoG可以以标准几何构型形成碱基对(即“沃森-克里克碱基对”)，但涉及的氢键与胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)之间的氢键不同，如下所示：
Figure C9519588000081
Leach等(1992)，美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc). 114：3675-3683应用分子力学、分子动力学和自由能扰动计算研究isoC*isoG碱基对的结构和稳定性。Tor等(1993)，美国化学学会杂志 115：4461-4467描述了一种方法，其中DNA模板中的被修饰的isoC可指导isoG类似物掺入转录RNA产物。Switzer等(1993)，生化杂志 32：10489-10496研究了isoC和isoG间形成的碱基对被DNA和RNA聚合酶掺入DNA和RNA的条件。
将新碱基对引入DNA寡聚物提供了更精确地控制杂交的潜力。
发明概述
本发明提供了检测样品中核酸分析物的方法与试剂盒。一般地，这些方法是对核酸杂交试验，例如原位杂交试验、Southern、Northern和点印迹以及聚合酶链式反应试验的改进。具体地说，这些方法是液相夹心(sandwich)杂交试验的改进，其中涉及分析物结合固体支持物，标记分析物，以及检测支持物上标记的存在。优选的方法涉及扩增多聚体，它能显著地结合更多分析物—探针复合物中的标记，增加试验灵敏度和特异性。
本发明第一方面提供了一种试验方法，其中一个或多个非腺苷(A)、胸苷(T)、胞苷(C)、鸟苷(G)或尿苷(U)的核苷酸单位能形成碱基对，并且掺入到核酸杂交试验组分的非靶杂交寡聚核苷酸片段，即“普遍”(universal)片段中。使用这样的核苷酸单位会产生单一的碱基配对模式，导致普遍片段间结合特异性的增强。
本发明的相关方面提供了一种试验方法，其中至少一个第一非A、T、C、G或U的核苷酸单位能与第二非A、T、C、G或U的核苷酸单位形成碱基对，并掺入与试验组分中非靶分析物的核酸序列互补的试验组分的核酸序列中。两个这样的核苷酸单位间形成的碱基对的例子由结构(I)至(IV)给出：
Figure C9519588000091
和
Figure C9519588000101
其中R表示骨架，将其掺入多聚核苷酸中会允许碱基与互补核苷酸单位形成碱基对，R1是例如氢、甲基、α-或β-丙炔基、溴、氟、碘等，将这样的核苷酸单位引入所谓的“普遍”序列，即并不涉及与靶分析物杂交的序列，能极大地减少潜在的非特异性杂交。在优选实施方案中，第一和第二核苷酸单位可互换地由异胞苷和异鸟苷组成，如式(I)所示。
本发明的相关方面提供了一种试验方法，其中分析物和支持物结合的捕获探针之间形成的，被一个或多个不同的捕获扩展分子和/或标记扩展物和扩增物或原扩增物介导的复合物的熔解温度Tm1比标记探针和扩增物之间形成的复合物的熔解温度Tm2低得多。在这方面，该试验在起始时有利于形成所有杂交复合物的条件下进行。然后在试验过程中改变条件，使Tm1杂交复合物不稳定。
本发明另外还涉及一种进行杂交试验的方法，其中前述各种技术被综合使用，即将非A、T、G、C或U的核苷酸单位掺入试验组分的普遍片段中，并且Tm1杂交复合物的溶解温度比Tm2杂交复合物的熔解温度低得多。
另一方面，本发明涉及一种合成异鸟苷或2′-脱氧-异鸟苷的方法。
最后，本发明涉及含有进行在此描述并要求保护的试验的必需试剂的试剂盒。
附图简述
图1.图1描述现有技术的液相夹心杂交试验，粗线显示普遍序列。
图2.图2描述探针结合双链DNA的方法，粗线显示普遍序列。
图3.图3描述用含非天然核苷酸探针和竞争物阻遏非特异性杂交。
发明详述
定义与术语：
在本发明内容公开并详述之前，应当理解本发明不仅限于特定的试验方式、材料或试剂，因为这些当然可以变化。还应当理解，此处所用的术语仅为描述具体的实施方案而非进行限制。
在本说明书及后续的权利要求中，要引用许多术语，其定义如下：
此处所用的术语“多聚核苷酸”或“寡聚核苷酸”是下述化合物的通称：多聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)，多聚核糖核苷酸(含D-核糖)，嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任一其他类型的多聚核苷酸，以及其他含有非核苷酸骨架的聚合物，例如，聚酰胺(例如肽核酸(PNA))和多吗啉代(可购自抗病毒公司(Anti-Virals Inc.)，Corvallis，Oregon，商品名NeugeneTM聚合物)，以及其它合成的序列特异性核酸聚合物，条件是这些聚合物含有的核碱基的构象应能碱基配对和碱基堆积，如在DNA和RNA中一样。术语“多聚核苷酸”和“寡聚核苷酸”无长度差别，可互换使用。这些术语仅指分子的一级结构。因此这些术语的内容包括双链和单链DNA，双链和单链RNA，DNA：RNA杂交物，PNA与DNA或RNA的杂交物，以及已知类型的修饰，例如本领域已知的标记、甲基化、“加帽”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间的修饰，如不带电荷的连接(例如磷酸甲酯，磷酸三酯，氨基磷酸酯，氨基甲酸酯等)，带负电荷的连接(例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)，带正电荷的连接(例如氨基烷基氨基磷酸酯，氨基烷基磷酸三酯)，含有悬垂基元(pendant moiety)，如蛋白质(包括核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚L-赖氨酸等)，嵌合剂(例如吖啶，补骨脂素等)，螯合剂(例如金属，放射性金属，硼，氧化性金属等)，烷化剂，修饰连接(例如α异头核酸等)以及未修饰形式的多聚核苷酸或寡聚核苷酸。
应当理解此处术语“核苷”与“核苷酸”不仅包括含有已知嘌呤和嘧啶碱基的基元，也包括含有经修饰的杂环碱基的基元。这种修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶，酰基化嘌呤或嘧啶，或其它杂环。被修饰的核苷或核苷酸也包括对糖基元的修饰，例如一个或多个羟基被卤素、芳香基团取代，或被官能团化为醚、胺等。术语“核苷酸单位”包含核苷和核苷酸。
而且对核苷酸单位的修饰包括重排、添加、取代或用其它方法改变与相应互补嘧啶或嘌呤形成氢键的嘌呤或嘧啶碱基上的官能团。得到的被修饰的核苷酸单位可以与另一这样被修饰的核苷酸单位形成碱基对，但不与A、T、C、G或U形成碱基对。在允许胸苷的N3-H和C4-氧与腺苷的N1和C6-NH2分别形成氢键，以及胞苷的C2-氧，N3和C4-NH2分别与鸟苷的C2-NH2，N1-H和C6-氧形成氢键的条件下会形成标准A-T和G-C碱基对。因而，例如鸟苷(2-氨基-6-氧-9-β-D-呋喃核糖嘌呤)可以修饰形成异鸟苷(2-氧-6-氨基-9-β-D-呋喃核糖嘌呤)。这种修饰得到的核苷碱基不再与胞苷有效地形成标准碱基对。然而，被修饰的胞苷(1-β-D-呋喃核糖-2-氧-4-氨基-嘧啶)形成异胞苷(1-β-D-呋喃核糖-2-氨基-4-氧-嘧啶)得到的被修饰的核苷酸不能有效地与鸟苷形成碱基对，但能与异鸟苷形成碱基对。异胞嘧啶购自Sigma化学公司(圣路易，密苏里州)；异胞苷可用Switzer等(1993)(引文见上，及其引述的参考文献)描述的方法制备；2′-脱氧-5-甲基-异胞苷可用Tor等(1993)(引文见上，及其引述的参考文献)描述的方法制备；异鸟嘌呤核苷酸可用Switzer等(引文见上)和Mantsch等(1993)生化杂志(Biochem.)14：5593-5601描述的方法或下面详述的方法制备。结构(II)描述的非天然碱基对，被称为κ和π，可用Piccirilli等(1990)自然(Nature)343：33-37中合成2，6-二氨基嘧啶及其互补体(1-甲基吡唑并[4，3]-嘧啶-5，7-(4H，6H)-二酮)的方法合成。其它此类能形成专一性残基对的被修饰的核苷酸单位的描述见Leach等(1992)美国化学学会杂志， 114：3675-3683和Switzer等，引文见上，或是本领域专业人员熟知的。
术语“多聚核苷酸分析物”指含有靶核苷酸序列的单链或双链核酸分子。分析物核酸可来自不同来源，例如生物流体或固体，食物，环境材料等，也可用许多方法制备用于杂交分析，例如蛋白酶K/SDS，离液序列高的(chaotropic)盐类等。术语“多聚核苷酸分析物”与术语“分析物”，“分析物核酸”和“靶”可以互换使用。
术语“靶区域”或“靶核苷酸序列”指靶分子中的探针结合区域。术语“靶序列”指有利条件下与探针形成稳定杂交物的序列。
术语“探针”指由上述定义的多聚核苷酸组成的结构，含有与靶分析物中的核酸序列互补的核酸序列。探针的多聚核苷酸区域可由DNA和/或RNA和/或合成核苷酸类似物组成。
应当理解，结合序列不需精确地互补即可形成稳定杂交物。许多情况下低于大约10％碱基错配并忽略4个或多个核苷酸的环也可形成稳定杂交物。相应地，术语“互补”指在试验条件下与其“互补体”形成稳定双螺旋的寡聚核苷酸，通常有约90％或更高的同源性。
术语“核酸多聚体”或“扩增多聚体”指直链或分支聚合物，它具有重复的相同单链寡聚核苷酸片段或不同的单链多聚核苷酸片段，每一个均含有标记探针可结合的区域，即含有与标记探针中一段核酸序列互补的核酸序列；寡聚核苷酸片段可由RNA、DNA、被修饰的核苷酸或其组合组成。至少一个片段的序列、长度和组成使其特异性结合标记探针；另外至少一个片段的序列、长度和组成使其特异性结合标记扩展物或原扩增物。典型地，这些片段含有约15至50，优选地15至30个核苷酸，其GC含量在约20％至约80％范围内。多聚体中寡聚核苷酸片段总数通常在3到1000之间，更典型地在10到100之间，最典型地约50。多聚体的寡聚核苷酸片段可以直接通过磷酸二酯键或通过间隔(interposed)连接物如核酸、氨基酸、碳水化合物或多醇桥或其它能将核酸或修饰核酸链交联的交联剂共价连接。可选地，多聚体由寡聚核苷酸片段组成，这些寡聚核苷酸片段不是共价连接的，而是以其他方式，比如通过杂交结合。此类多聚体的描述见于例如美国专利5,175,270号，发明人Nilson等。连接位点可以是片段末端(正常的3′-5′取向或随机取向)和/或链中的一个或多个内部核苷酸。直链多聚体中每个片段末端-末端连接形成线性多聚物。在一种分支多聚体中三个或多个寡聚核苷酸片段从一个原点发散开来形成分支结构。原点可以是能至少连结三个片段的另一核苷酸片段或一个多功能分子。另一类型中有一寡聚核苷酸片段骨架和一个或多个悬垂的寡聚核苷酸骨架。后一种类型的多聚体结构上是“叉型”，“梳型”或“叉型”与“梳型”的组合，其中优选的“梳型”多聚体是具有直链骨架和许多从骨架伸展出的侧链的多聚核苷酸。悬垂片段通常挂于被修饰的核苷酸或其它具有适当的官能团的其它有机基元，寡聚核苷酸可以结合或以其它方式连接于其上。多聚体可为完全直链或完全分支或是直链和分支部分的组合。典型地，多聚体上有至少两个分支位点，更优选地至少3个，更优选地5到30个，但在某些实施方案中可能更多。多聚体可包含一个或多个双链序列片段。有关多聚体合成和特定多聚体结构的进一步资料见美国专利5,124,246号，发明人Urdea等。
PCT出版物WO92/02526号描述了本发明特别优选的梳型分支多聚体，它由直链骨架和悬垂侧链组成；骨架包括为分析物核酸或与分析物结合的核酸提供特异杂交位点的片段，而悬垂侧链包括为标记探针提供特异性杂交位点的重复片段。
如上述，可用“原扩增物”分子作为标记扩展分子和扩增多聚体的桥联基元。这样，任一靶-探针复合物可以结合更多的扩增物，从而结合更多标记。原扩增物可为直链或分支型，典型地包括约30至约3000核苷酸。在优选实施方案中，原扩增物分子结合至少两种不同的标记扩展分子，从而增加试验的整体准确度(即由于要发生许多杂交事件才能形成探针-靶复合物)。
“生物样本”指从个体中分离的组织或流体样本，包括但不限于血浆、血清、脊液，精液、淋巴液、皮肤外层、呼吸道、肠道和生殖泌尿道、泪液、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、器官及体外细胞培养物样本(包括但不限于由于细胞在细胞培养基中生长而得到的成分变化的培养基、重组细胞、推定为病毒感染的细胞、以及细胞组分)。本方法优选地用于检测和/或定量如下核酸：(a)病毒核酸，例如乙肝病毒(“HBV”)核酸、丙肝病毒(“HCV”)核酸、丁肝病毒(“HDV”)核酸、人类免疫缺陷病毒(“HIV”)核酸和疱疹病毒的核酸，包括带状疱疹(鸡痘)，单纯疱疹病毒I和II，细胞肥大病毒，Epstein-Barr病毒和最近分离到的疱疹VI型病毒；(b)细菌核酸，如衣原体，结核分支杆菌等；以及(c)许多感兴趣的人类序列。
“非特异性杂交”指本来要与一段选定的多聚核苷酸杂交的一段多聚核苷酸，也与另外一段多聚核苷酸杂交，造成错误结果，即产生这样一种情况：在没有靶分析物的时候已可检测到标记。术语“杂交”并不排除Watson-Crick残基配对。
“非特异性结合”是指这样的情况，其中多聚核苷酸通过直接或间接的相互作用与固体支持物或其他试验组分结合，所述的相互作用不涉及与支持物结合的多聚核苷酸的氢键键合。
现在参考图1给出的优选实施方案，下列术语用于其中描述的杂交试验。注意图1中为清晰起见，普遍序列(universal sequeuces)用粗线标出。
“标记扩展物分子(LE)，又称“标记扩展物”，含有与分析物多聚核苷酸和扩增多聚体“AMP”互补配对的区域。若用原扩增物(图中未给出)，标记扩展物分子将与该中间物结合，而不与扩增多聚体直接结合。如果不用原扩增物也不用扩增物，标记扩展物分子将直接结合标记探针(“LP”)中的一段序列。因此，标记扩展物分子是单链多聚核苷酸，其第一核苷酸序列L-1与分析物多聚核苷酸的一段序列互补，其第二普遍区域含有与一段标记探针M-1，扩增多聚体或前扩增物互补的多聚体识别序列L-2。
“标记探针“(LP)”被设计成可以结合标记扩展物，或是如果试验中用到扩增多聚体，也结合多聚体的寡聚核苷酸重复片段。LP或者含有标记或者被设计成可以结合标记。因此，LP含有一段与多聚体的寡聚核苷酸重复单位中核酸序列M-2互补的核酸序列L-3，并且结合或被设计成可以结合能直接或间接提供检测信号的标记。
“捕获扩展物分子(CE)”，又称“捕获扩展物”，结合分析物多聚核苷酸并捕获标记，再结合到固体支持物上。因此，捕获扩展物是单链多聚核苷酸链，其第一段多聚核苷酸序列区含有与分析物的一段序列互补的核酸序列C-1，其另一非互补区有捕获标记识别序列C-2。序列C-1和L-1不同也不互补，各与分析物上物理上不同的序列互补。
“捕获探针(CP)”结合捕获扩展物与固体支持物。因此如图1所示，捕获探针具有与C-2互补的核酸序列C-3并且共价连接(或能够共价连接)固体支持物。
通常，液相杂交试验用图1所示的系统如下进行。在杂交条件下单链分析物核酸与捕获扩展物和标记扩展物共温育。得到的产物是分析物多聚核苷酸结合捕获扩展物和标记扩展物的核酸复合物。该复合物然后在杂交条件下被加到表面结合了捕获探针的固相上；不过在优选实施方案中，最初的温育是当结合支持物的捕获探针存在时进行的。得到的产物中复合物通过捕获扩展物分子和捕获探针结合到固相上。结合了复合物的固相再从未结合的材料中分开。然后可选地在杂交条件下将扩增多聚体，优选的是上述梳型多聚体加到固相—分析物—探针复合物中，让多聚体与LE杂交；如果用到原扩增物探针，固相—分析物—探针复合物与原扩增物探针二者与扩增多聚体一道，或优选地在与扩增多聚体温育之前共温育。然后通过洗涤将得到的固相复合物与任何未结合的原扩增物和/或多聚体分开。然后在能与LE杂交的条件下，或如果使用扩增多聚体，则在能与多聚体的寡聚核苷酸重复片段杂交的条件下，加入标记探针。然后洗涤得到的固相标记核酸复合物，除去未结合的标记寡聚核苷酸，然后读数。应当注意图1给出的各组分不一定按比例画，若用到扩增多聚体，则其寡聚核苷酸重复片段数要远比画出来的多，每一片段均要结合标记探针。
本方法主要侧重通过将捕获探针、捕获扩展物分子与标记探针、标记扩展物分子和扩增物的相互作用最小化，减少不正确的基元结合上与支持物结合的捕获探针的可能性，从而消除背景噪声源。
互补寡聚核苷酸序列间杂交是由于其中的嘌呤和嘧啶核苷酸能形成稳定的碱基对。5种天然存在的核苷酸：腺苷(A)、鸟苷(G)、胸苷(T)、胞苷(C)和尿苷(U)形成嘌呤-嘧啶碱基对G-C和A-T(U)。G-C碱基对结合能比A-T碱基对的大，因为前者有3个氢键而后者仅有两个氢键，如下图所示：
Figure C9519588000161
和
Figure C9519588000162
因此，在常规的液相核酸夹心试验中，寡聚核苷酸分子被设计成含有与其它试验组分或靶分析物的核酸序列互补的核酸序列并因此可以与后者杂交，如上详述。本发明的方法将非天然的核苷酸单位引入试验组分的普遍寡聚核苷酸片段，形成专一性碱基对，从而减少非特异性杂交。本发明的方法进而将与靶分析物存在和/或数量相联系的可检测标记试验组分从其它非特异性结合而产生试验背景噪声的试验组分分开，从而降低试验组分的非特异性结合产生的信号。
在本发明的第一个实施方案中，提供一个杂交试验，其中能形成特定碱基对的非A、T、C、G和U的核苷酸单位被掺入非靶分析物特异性的试验组分杂交寡聚核苷酸片段，于是更难与靶特异性探针序列或外源非靶核酸序列形成稳定杂交物。因此例如如图1所示，这些核苷酸单位可被掺入互补的核酸序列C-2/C-3，L-2/M-1和L-3/M-2中。用天然存在的核苷酸(即A、T、C、G或U)来构建与靶分析物核酸片段互补的试验组分杂交寡聚核苷酸片段。可以用核苷酸单位对应物替换约15％至约100％天然存在的核苷酸来构建含有核苷酸单位的寡聚核苷酸片段。优选地，寡聚核苷酸的每三个或四个碱基中有一个被能够形成特定碱基对的核苷酸单位替换。本领域专业人员可明显看出，随着核苷酸单位替换的百分比增加，非特异性杂交相应减少。然而，完全替换还需至少两种新的碱基对才能有足够的序列多样性阻止普遍序列间的非特异性杂交。
在本发明的另一实施方案中，提供一种杂交试验，其中C-2/C-3杂交物或L-2/M-1杂交物的熔解温度Tm1比L-3/M-2杂交物的熔解温度Tm2低很多，这样可以解决产生不依赖靶的信号的问题。本方法基于杂交复合物的设计和构建，其中熔解温度Tm1比熔解温度Tm2低至少5℃，优选地低至少10℃，更优选地低至少20℃。
在起初有利于Tm1和Tm2杂交复合物形成的严谨性条件下进行该试验，从而利用了稳定性的差别。在试验的后续步骤中改变严谨性，使靶分析物从捕获探针上物理分离或结合扩增物的标记探针从靶上物理分离。可通过调整热力学参数控制严谨性。这些参数在本领域广为人知，包括甲酰胺浓度、盐浓度、离液序列高的盐浓度、pH(氢离子浓度)、有机溶剂含量和温度。优选地用pH和盐浓度控制严谨性：试验的一个步骤在某一pH或盐浓度下进行，使捕获探针/捕获扩展物之间形成的杂交复合物不稳定或者使标记扩展物/扩增物(或原扩增物)之间形成的杂交物不稳定。优选地在添加底物这一步控制严谨性。因此，在优选实施方案中，在利于所有试验成分形成稳定杂交复合物的条件下进行杂交试验，随后加入标记底物并在标记探针不从标记扩展物或扩增物释放的前提下改变严谨性，使诸如捕获探针/捕获扩展物，或标记扩展物/扩增物(原扩增物)等杂交复合物不稳定。
本发明另一实施方案提供一种方法，通过将杂交试验设计成形成Tm1杂交复合物的互补核苷酸序列比形成Tm2杂交复合物的互补核苷酸序列短，从而影响本发明上述实施方案。本领域专业人员应当理解，互补核苷酸序列变短，形成的序列多样性就会变小。不过可通过在互补序列中加入非天然碱基对，例如isoC-isoG碱基对，维持这种多样性。
本领域专业人员可以看出，Tm1和Tm2温差越大，本技术去除背景噪声的“效率”越高，因此本领域专业人员会认识到温度差别小于10℃，甚至小于5℃，也可降低背景噪声，尽管降低程度要小。
本发明公开的方法，即在杂交寡聚核苷酸序列中引入非天然核苷酸单位以增加与靶分析物杂交的特异性，有许多用途。
在基本或扩增的液相核酸夹心试验中可将许多捕获探针固定到固体表面上。最常用的是将表面与来自例如鲑精或小牛胸腺的DNA温育来控制可供非特异结合的表面积。不过这种DNA的存在有可能增加试验成分与固体支持物的非特异性杂交，因而增加背景噪声。将这些天然DNA替换成含有非天然碱基的合成DNA将会使非特异性杂交和非特异性结合降至最小。
优选地，用本领域已知的方法用3′加尾短寡聚核苷酸与核苷酸混合物制备这些多聚核苷酸。可选地，可将含有非天然核苷酸的短的几乎是随机序列的寡聚核苷酸连到一起形成多聚核苷酸。分支DNA可方便地用于这个目的。例如可制备整段序列-TNVN-F-TNVN-J-TNVN-，其中F是isoC而J是isoG，并化学连接形成多聚物。该方法比酶的3′加尾方法优越的是消除了同多聚物/同寡聚物序列。
构建含有非天然核苷酸单位的杂交寡聚核苷酸的另一应用是设计反义化合物。反义化合物，例如描述于Ching等(1989)，美国国家科学院院刊， 86：10006-10010；Broder等(1990)，国际医学年刊(Ann.Int.Med.)， 113：604-618；Loreau等(1990)FEBS通讯(FEBSLetters) 274：53-56，以及PCT出版物WO91/11535号，WO91/09865号，WO91/04753号，WO90/13641号，WO91/13080号和WO91/06629号中的反义化合物是与产生特定蛋白质的mRNA结合并使之失去作用，或是阻止其产生的寡聚核苷酸。常规的反义分子通常能与许多种寡聚核苷酸反应。然而由于其长度(通常是多到30个核苷酸单位的寡聚核苷酸序列)，这种反义分子会有与非靶种类非特异性杂交的问题。一种解决方法是利用多个探针与靶之间短的杂交区域；用探针之间短的“二聚化结构域”来增大整个复合物的强度，描述见Distefano等(1992)美国化学学会杂志， 114：1006-1009。二聚化结构域被设计成带着含有非天然核苷酸单位的互补序列的尾部，故而能高效并特异地结合靶分析物，而不增加与非靶分析物的非特异性杂交。该构思以双链DNA描述于图2中。
如图2所示，可用链平移法分开双链DNA。有超螺旋张力的富AT启动子序列具有S1核酸酶的敏感性因而已部分成为单链，是这种反义基因(antigene)应用特别优选的位点。可以用短的寡聚核苷酸使特异性最大化；将它们连在一起形成寡聚核苷酸网络可提高其结合能。
在该构建体中，短的普遍序列当靶不存在时不会形成稳定的碱基对，并且含有isoC和isoG来限制探针与人类序列的非特异性杂交。当探针1、2和3结合靶后，普遍序列会足够近，其有效浓度会大大增加。然后普遍序列会配对，进一步增大结合强度。RNA靶也可与该方法结合起来用。
SELEX方法，其描述见于授予Gold等的美国专利5,270,163号，Tuerk等(1990)，科学(Science) 249：505-510，Szostak等(1990)自然(Nature) 346：818-822和Joyce(1989)基因(Gene) 82：83-87，可用来选择根据形状而识别并结合所需靶分子的RNA或DNA序列。术语“适应子”(或“核酸抗体”)指的是这样的单链或双链DNA或单链RNA分子。见例如PCT出版物WO92/14843号，WO91/19813号和WO92/05285号，其公开内容在此引入作为参考。“靶分子”与“靶分析物”不同，前者包括适应子要结合的聚合物如蛋白质，多糖，寡聚核苷酸或其它大分子，以及小分子如药物，代谢物，毒素等。
在SELEX方法中构建一段寡聚核苷酸，其中有一段n聚体，优选的是形成寡聚核苷酸“随机物库”的核苷酸随机序列，其两侧是两个聚合酶链式反应(PCR)引物。该构建体然后在利于寡聚核苷酸结合靶分子的条件下接触靶分子。这些结合靶分子的寡聚核苷酸是：(a)用常规方法如过滤、离心、色谱等从不与靶分子结合的寡聚核苷酸中分开的；(b)从靶分子中解离的；以及(c)用常规PCR技术扩增的，以形成寡聚核苷酸的配体富集库。进一步进行几轮结合、分离、解离和扩增直到得到具有所需的结合亲和力、特异性或二者兼有的适应子。可用化学方法或体外转录制备鉴定的最终适应子序列。制备这些适应子时，将选定的碱基对用非天然残基对替换，减少适应子与人类核酸的杂交。
本发明至少可以以两种方式用于SELEX。第一随机物DNA序列库的序列中可包括isodG和isodC。用6个或更多核苷酸而不是常规的四个核苷酸A、T、G和C合成DNA链能增加识别蛋白质或其它重要生物大分子的可能的随机结构的数目。这又增加了鉴定到以更高亲和力和/或特异性结合靶分子的序列的机会。
在SELEX中，选择出来的保守寡聚核苷酸序列可能与细胞内序列发生不希望发生的杂交。在选择过程中用非天然碱基可以降低这种非特异性杂交。不被人类RNA和DNA聚合酶识别但能被某些噬菌体或细菌聚合酶识别的核苷酸在本应用中尤其有用。
本发明在SELEX方法中的第二个应用是制备非特异性杂交最少化的最终适应子结构，例如，用SELEX方法从RNA或DNA库中选择表现预想的结合亲合力、特异性或其它分子识别特征的适应子。这些靶分子识别特征由适应子二级结构决定，而适应子二级结构部分地通过形成分子内寡聚核苷酸杂交复合物维持。一旦阐明适应子的二级结构，本领域普通专业人员将会明了某些分子内杂交复合物中碱基对的特异性十分优选地用于维持适应子的二级结构及由此而来的靶分子识别和结合特征，即某些碱基对优选地是G-C或A-T。这些分子内杂交复合物中的其它碱基对，例如在基环碱基配对部分的碱基对可以在不改变适应子的二级结构的情况下被任一对互补核苷酸替换，在此被称为N-N1碱基对。
只需用isoG-isoC或isoC-isoG替换选定的N-N1碱基对和最终适应子结构的G-C和C-G碱基对即可减少与非靶寡聚核苷酸序列的非特异性杂交。由于isoC-isoG碱基对与C-G碱基对能量相同，分子的基本形状与发夹强度将会十分相似。若是将得到的序列更倾向于具有A-U或U-A，而不是C-G，最好用与A-U能量相等的碱基对来替换碱基对。这些替换通过限制适应子与细胞RNA和DNA序列发生不需要的杂交的可能性而使适应子对靶分子特异性更强。
在基本的方法中，用isoC-isoG或isoG-isoC碱基对替换选定的碱基对。在最终结构中，isoG-isoC碱基对包括核苷酸和脱氧核苷酸。可化学制备嵌合适应子(包括核苷酸和脱氧核苷酸)。可选地，可通过体外转录含有isoC和isoG的DNA模板用核糖-isoGTP和核糖-isoCTP(带有适当的2′保护)来制备适应子。
本发明其它应用包括原位杂交，以减少杂交试验和聚合酶链式反应(PCR)试验中的非特异性结合。
原位杂交的灵敏度不足以检测到单个靶分析物分子。原位PCR(见例如Bagasra等，(1993)，免疫方法杂志(J.ImmunologicalMethods) 158：131-145)满足这一灵敏度要求，不过其定量不如PCR精确。另一可选方案是用多个标记扩展物探针结合靶分析物。标记扩展物与原扩增物或扩增物结合。原扩增物一旦被应用，可将标记扩展物和扩增物桥联起来。扩增物将会结合标记探针，探针可优选地用发光(luminescence)探测(若灵敏度足够高则用荧光探测)。如前述，普遍序列L-2/M-1和M-2/L-3由含有最优的15-30％isoC和isoG的短寡聚核苷酸组成，以减少与人类序列的不需要的杂交。可用第四种碱基对进一步减少这些序列中的天然碱基。
如前面提到的，用非天然碱基对可以减少非特异性结合与非特异性杂交。随机多聚物或含有6-8个不同核苷酸的近乎随机的嵌段同聚物可用来减少扩增物和标记探针与对多聚核苷酸有高度亲和力的细胞组分的非特异性结合。因此可以减少非特异性结合，而不会象通常那样，通过引入小牛或鲑鱼天然序列而增加了非特异性杂交。
本领域专业人员应明了，同样的策略可应用于印迹试验，例如点印迹、Southern印迹、Northern印迹等，来降低非特异性杂交以及探针与固体支持物的非特异性结合。
本发明还可用于PCR和其它指数扩增技术。例如在嵌套(nested)PCR中，靶分析物先扩增再稀释几千倍后，通常用一个引物的5′突出部分进行捕获(capture)，用另一引物的5′突出部分进行标记。插入一段不被聚合酶阅读的间隔序列，从而使突出部分保持单链状态(见例如Newton等人(1993)，核酸研究21：1155-1162)。这些5′突出部分的一般序列可以制备成含有修饰的碱基对以降低在非靶序列上引发扩增的频率。实际上，5′突出部分第一个残基是isodC或isodG可用于代替现在常用的间隔序列，聚合酶没有isodGTP或isodCTP去转录相应isodC或isodG，故而不能阅读isodC或isodG。由于聚合酶在引物中检测到有isodG时会以较低的频率将T加入聚合物中，故5′突出部分的第一个碱基优选用isoC。
实验部分
除非另加说明，本发明实践采用本领域专业人员已知的合成有机化学、生物化学、分子生物学等常规技术。这些技术在文献中有详述。见例如Sambrook，Fritsch & Maniatis《分子克隆实验指南》，第二版(1989)；《寡聚核苷酸合成》(M.J.Gait编，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames & S.J.Higgins编，1984)以及《酶学方法》系列(学术出版公司)。
凡是以“引文见上”或“引文见下”提到的专利，专利申请和出版物，均在此引入作为参考。
应当理解，尽管本发明是以优选的特定实施方案来描述，上述描述及下列实施例仅用来说明而非限制本发明的范围。本发明范围内的其它
方面、改进和修改方案对本发明相关领域人员应是显而易见的。
发明人在下列实施例中已尽力保证所用数据(例如数量，温度等)的准确性，但有可能存在某些实验错误和偏差。温度单位是摄氏度，并且除有其它说明，压力为大气压或接近大气压。
异鸟苷或2′-脱氧-异鸟苷的合成
仅有很少的异鸟苷或2′-脱氧-异鸟苷的合成方法见于报道。例如，2′-脱氧-异鸟苷可以如下合成：1)通过碱性条件下直接光解从2′-脱氧腺苷通过2′-脱氧腺苷-(N1-氧化物)合成(Switzer等(1993)引文见上)；2)通过碱性条件直接光解从2-氯-2′-脱氧腺苷合成(Seela等(1992)瑞士化学学报(Helv.Chim.Acta) 75：2298-2306)；以及3)通过化学途径，将6-氨基-1-(2′-脱氧-β-D-红戊呋喃糖基(erythropentofuranosyl))-1H-咪唑-4-腈[AICA2′-脱氧核苷]，与异氰酸苯甲酯反应，然后用氨处理影响嘧呤环退火(annealation)来合成(Kazimierczuk等(1991)瑞士化学学报 74：1742-1748)。
不过，由于2′-脱氧腺苷-(N1-氧化物)向2′-脱氧-异鸟苷的光解转化不易扩大规模，一种从容易得到的2′-脱氧核糖核苷起始材料合成2′-脱氧异鸟苷的化学途径被设计出来。
若干种将2′-脱氧鸟苷通过特别的“可转变”2′-脱氧鸟苷衍生物，例如O6-苯基-2′-脱氧鸟苷，转化成2，6-二氨基嘌呤核苷和N6-烷基-2，6-二氨基嘌呤核苷的方法已见于报道(MacMillan等(1991)，四面体(Tetrahedron)， 47：2603-2616；Gao等(1992)，有机化学杂志(J.Org.Chem.) 57：6954-6959；Xu等(1992)，四面体， 48：1729-1740)。进一步，Fathi等(1990)四面体通报(Tetrahedron letters) 31：319-322描述用一种方法将2′-脱氧鸟苷用无水三氟乙酸/吡啶处理，然后由苯酚原位置换，可方便地合成O6-苯基-2′-脱氧鸟苷。可选地，Reese等(1984)J.Chem.Soc.Perkin Trans.I，1263-1271描述了将O6-苯基基元引入2′-脱氧鸟苷的方法，其中中间产物O6-(4-甲苯磺酰)-2′-脱氧鸟苷用三甲基胺再苯酚处理，置换掉O6(4-甲苯磺酰)，得到O6-苯基-2′-脱氧鸟苷。用S-氧化可从2-(甲硫基)-6-氨基-吡唑嘧啶核糖核苷，得到2-(甲基磺酰)-6-氨基-吡唑嘧啶核糖核苷，再用NaOH置换，即得异鸟苷类似物(Cottam等(1983)核酸研究， 11：871-882)。
用亚硝酸烷基酯转化鸟苷和2′-脱氧鸟苷中的2-氨基基团也见于报道。这包括用自由基反应将2-氨基转化成2-卤素(Nair等(1982)，合成(Synthesis)670-672)和2-(甲硫基)-6-氯-嘌呤核糖核苷(Trivedi(1991)，《核酸化学》(Nucleic Acid Chemistry)，Townsend等编，Wiley-Inter-科学出版社，第4部分，269-273)。用纯的亚硝戊酯氧化O6-(对硝基苯乙基)-3′，5′-O-二-叔丁基-二甲基硅烷-2′-脱氧鸟苷，得到O6-(对硝基苯乙基)-3′，5′-O-二-TBDMS-2′-脱氧黄苷，也见于报道(Steinbrecher等(1993)Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 32：404-406)。
一种合成2′-脱氧-异鸟苷的方法见于Seela等(1994)，瑞士化学学报 77：622-30。第一步，2′-脱氧鸟苷被转化成2-氨基-2′-脱氧腺苷。第二步，将2-氨基-2′-脱氧腺苷用亚硝酸钠对2-氨基重氮化脱氧，得到2′-脱氧-异鸟苷。
本发明公开并要求保护具有下面结构式的化合物的合成方法，
Figure C9519588000241
其中R1选自氢、羟基、巯基、卤素、氨基、烷基、烯丙基和-OR2，R2是烷基、烯丙基、甲硅烷基或磷酸，该方法包括：
a)用适于保护3′和5′羟基的试剂与具有下述分子式的化合物反应：
Figure C9519588000242
b)将步骤a)产物与一种适于将O6-氧基基元转化成易受亲核置换的官能团的试剂反应，产生官能团化的O6部分。
c)将步骤b)产物的2-氨基氧化。
d)将步骤c)产物与亲核试剂反应，置换官能团化的O6基元；和
e)将步骤(d)产物与适于将保护的3′和5′羟基去保护的试剂反应。
通过用适当的试剂，例如TBDMS、苯甲酰氯、脱水乙酸等保护糖基元的羟基可分别将鸟苷或2′-脱氧鸟苷转化成异鸟苷或2′-脱氧异鸟苷。如前述，糖基元的一个或多个羟基可用卤素、芳香基团取代，或者形成官能团如醚，胺等。分离产物并修饰O6，使之能被适当的亲核试剂置换。这样的可置换基团有，例如CH3-S-C6H4-O6-，C6H5-SO2-O6-，C6H5-O6-，4-硝基-C6H4-O6-，2，4，6-三硝基-C6H2-O6-等。然后用亚硝酸烷基酯或本领域已知的其它合适试剂(见Nair等(1982)，引文见上；Trevidi(1991)引文见上；或Steinbrecher等，(1993)，引文见上)将2-氨基转化成氧官能团。产物与适当的亲核试剂如NH4OH，或其它含有末端-NH2、-SH、-COOH的氨基烷基、氨基芳基、氨基杂烷基、氨基杂芳基等反应，置换掉修饰的O6离去基团。用例如碱或氟化物处理可将保护的羟基去保护。
在下面的讨论中，O6-(4-甲基苯硫基)被用作置换基团的例子。但是该基团仅用于描述特定实施方案，而非限制性的。
用烷基胺作亲核试剂可方便地合成N6-烷基化异鸟苷衍生物。例如，己二胺可用来置换O6-(4-甲基苯硫基)形成N6-(6-氨基己基)-异鸟苷。保护氨基己基(例如变成三氟乙酰氨基衍生物，然后转化成氨基亚磷酸酯(phosphoramidite)试剂，得到官能团化的异鸟苷类似物，可加入到寡聚核苷酸的任一位置供进一步合成后衍生化。因此，有可能特异性标记选定的异鸟苷/异胞苷残碱基对的异鸟苷基元。也可以简单地用适当的端基化亲核基团，例如-COOH、-SH、-NH2等替换O6-(4-甲基苯硫基)基团合成一系列带有任何所需官能团的异鸟苷N6-衍生物。
进而O2-(4-甲基苯硫基)-2′-脱氧黄苷的完全保护的氨基亚磷酸形式(O2-(4-甲基苯硫基)-5′-O-DMT-3′O-(BCE-二异丙基氨基亚磷酸)-2′-脱氧黄苷)加入寡聚核苷酸后可用作可转换的衍生物。用烷基二胺或其它官能团化烷基胺将O2-(4-甲基苯硫基)从O2-(4-甲基苯硫基)-2′-脱氧黄苷合成后替换，得到含有N6-(氨基烷基)-2′-脱氧-异鸟苷的寡聚核苷酸。官能团化的异鸟苷可作为特异性引入标记或其它标志分子的位点。
合成方法概述 如方案1所述，从2′-脱氧鸟苷用如下5步合成2′脱氧异鸟苷：
1)将2′-脱氧鸟苷转化成3′，5′-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)2-2′-脱氧鸟苷(Ogilvie等(1973)加拿大化学杂志(Can.J.Chem.) 51：3799-3807)，重结晶纯化；
2)转化成O6-(4-甲苯磺酰)-3′，5′-O-TBDMS2-2′-脱氧鸟苷；
3)用Reese的方法用适当的苯酚，例如4-(甲基硫代)苯酚或phentachlorophenyl在O6替换掉4-甲苯磺酰，得到O6-(4-(甲基硫代)苯基)-3′，5-O-TBDMS2-2′-脱氧鸟苷(Reese等(1984)，引文见上)；
4)中性条件下用亚硝酸叔丁酯将2-的氨基氧化成氧官能团(oxyfunction)，产生O6-(4-(甲基硫代)苯基)-3′，5′-O-TBDMS2-2′-脱氧黄苷)(Steinbrecher等，(1993)，引文见上)；和
5)温度升高后用氢氧化铵置换掉O2-(4-(甲基硫代)苯基)，得到3′，5′-O-TBDMS2-2′-脱氧-异鸟苷。
用相似的反应方案可以影响从鸟苷合成异鸟苷。
                方案1
                   方案1(续)
Figure C9519588000281
                    方案1(续)
Figure C9519588000291
得到的材料在各方面(TLC，HPLC，UV和NMR)均与用报道的光解途径制备的真实样本(Switzer等，(1993)，引文见上)相同。
制备异胞苷或2′-脱氧-异胞苷衍生物
在寡聚核苷酸合成过程中使糖苷键对稀酸稳定可以制备异胞苷或2′-脱氧-异胞苷的衍生物。2′-脱氧腺苷的N2-脒衍生物已见于报道，例如McBride等(1988)，美国化学学会杂志， 108：2040-2048，Froehler等(1983)，核酸研究， 11：8031-8036和Pudlo等(1994)，生物医学有机化学通报 4：1025-1028。用下述方法合成N2-(N，N-二(X)亚胺甲基氨基)-2′-脱氧-异胞苷。此处例举X为正丁基。不过X可以是C2-C10烷基、芳基、杂烷基、杂芳基等。
用二-正丁胺对N，N-甲基甲酰胺二甲基乙缩醛合成N-二-正丁基甲酰胺二甲基乙缩醛，见McBride等(1986)，引文见上，Froehler等(1983)引文见上，和Pudlo等(1994)，引文见上。10mmol 2′-脱氧-5-甲基-异胞苷悬浮于100ml甲醇中。加入10mmol N，N-二-叔丁基甲酰胺二甲基乙缩醛。室温下搅拌2小时后得到澄清溶液。60H硅石上薄层色谱分析，用10％二氯甲烷中的甲醇展开显示起始材料完全消耗。加水(10ml)破坏过剩试剂，真空除去溶剂，得到3.8g粗制N2-(N，N-二丁基甲酰脒)-2′-脱氧-异胞苷。该衍生物可直接转化成5′-O-DMT-N2-(N，N-二丁基甲酰脒)-2′-脱氧-异胞苷，用于加入寡聚核苷酸。
可制备其它异胞苷衍生物以提供官能团化的取代基，通过这些取代基可以将可检测标记引入寡聚核苷酸的特定位置。例如，5-烷基化的2′-脱氧尿苷衍生物已见报道，例如5-[N-(6-三氟乙基氨基己基)-3-(E)丙烯酰氨基]-2′-脱氧尿苷，见Ruth(1991)《碱基上连接标志基团的寡聚脱氧核苷酸》，Eckstein编《寡聚核苷酸及类似物》，IRL出版社，255-282页。发现这种5位衍生物不会阻碍碱基对杂交模式。Ruth描述的化学过程可用于合成5-[N-(6-三氟乙基氨基己基)-3-(E)丙烯酰氨基]-2′-脱氧-异胞苷，由此提供官能团化的异胞苷，它可以在选定的异鸟苷*异胞苷碱基对被可检测标记。
这些和其它异胞苷和2′-脱氧-异胞苷的5位衍生物更增加了碱基对形成的稳定性。这些衍生物包括：5-β-丙炔基(见Froehler等(1993)，四面体通报 34：1003-1006)，5-β-丙烯基或其它5-烷基异胞苷或2′-脱氧-异胞苷衍生物。
用于完成本发明的核酸杂交试验的试剂盒的包装组合中包括：至少一种杂交寡聚核苷酸探针，一段能与分析物形成杂交复合物的片段，一种检测杂交复合物的装置，其中至少一种杂交寡聚核苷酸探针含有在A-T和G-C碱基对形成条件下不会有效地与腺苷(A)、胸苷(T)、胞苷(C)、鸟苷(G)或尿苷(U)碱基配对的第一种核苷酸单位。试剂典型地分别装在试剂盒的不同容器中。试剂盒还可包括用于分析物变性的变性试剂、杂交缓冲液、洗涤溶液、酶底物、阴性对照和阳性对照以及完成试验的书面说明。
本发明的多聚核苷酸可用固相直接寡聚核苷酸合成法、酶连接方法以及普通授让美国专利申请系列号07/813,588描述的液相化学合成法组合起来装配。
所有的寡聚核苷酸化学合成均可在自动DNA合成仪(珀金、爱乐默/应用生物系统分部380B型)上进行。采用β-氰乙基型的氨基亚磷酸酯法，包括5′-磷酸化，用PHOSTELTM试剂(DMT-O-CH2CH2-(SO2)-CH2CH2-O-P(N(iPr)2)(-O-CH2CH2CN)，其中DMT是二甲氧基三苯甲基，iPr是异丙基)。除有其它说明，采用生产商的标准方案。
                    实施例1
        靶特异性扩展物序列与一般试验组分
         非特异性杂交产生的试验背景噪声
为了确定靶特异性扩展物序列与一般试验组分杂交怎样造成试验背景噪声，用表1、2、3给出的捕获扩展物与标记扩展物库进行扩增DNA杂交试验以对M13噬菌体进行定量。
  SEQIDNO：                         表1捕获扩展物库A
  1   ATTGCGAATAATAATTTTTTCACGTTGAAAATCTTCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
  2   GAATTTCTTAAACAGCTTGATACCGATAGTTGTTCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
  3   ATTGTATCGGTTTATCAGCTTGCTTTCGAGGTTTCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
  4   CCGCTTTTGCGGGATCGTCACCTTCTC TTGGAAAGAAAGTGAT
  5   GCTGAGGCTTGCAGGGAGTTAAAGG TTCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
  6   ATGAGGAAGTTTCCATTAAACGGGT TTCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
  7   TCGCCTGATAAATTGTGTCGAAATCC TTCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
  SEQIDNO：                        表2捕获扩展物库B
  8   TCCAAAAAAAAAGGCTCCAAAAGGAGCCTTTATTCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
  9   CGCCGACAATGACAACAACCATCGCTTCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
  SEQIDNO：                         表3标记扩展物库
  10   ATGAGGAAGTTTCCATTAAACGGGTTTAGGCATAGGACCCGTGTCT
  11   GAGGCTTTGAGGACTAAAGACTTTTTC TTAGGCATAGGACCCGTGTCT
  12   CCCAGCGATTATACCAAGCGCG TTAGGCATAGGACCCGTGTCT
  13   AAGAATACACTAAAACACTCATCTTTGACCTTAGGCATAGGACCCGTGTCT
  14   CTTTGAAAGAGGACAGATGAACGGTG TTAGGCATAGGACCCGTGTCT
  15   GGAACGAGGCGCAGACGGTCA TTAGGCATAGGACCCGTGTCT
  16   ACGAGGGTAGCAACGGCTACA TTAGGCATAGGACCCGTGTCT
  17   GCGACCTGCTCCATGTTACTTAGCCTTAGGCATAGGACCCGTGTCT
  18   CTCAGCAGCGAAAGACAGCATCGGATTAGGCATAGGACCCGTGTCT
  19   ATCATAAGGGAACCGAACTGACCAATTAGGCATAGGACCCGTGTCT
  20   CCACGCATAACCGATATATTCGGTCTTAGGCATAGGACCCGTGTCT
  21   TACAGACCAGGCGCATAGGCTGGCTTAGGCATAGGACCCGTGTCT
  22   AAACAAAGTACAACGGAGATTTGTATCATTAGGCATAGGACCCGTGTCT
  23   CACCAACCTAAAACGAAAGAGGCGATTAGGCATAGGACCCGTGTCT
  24   AAAATACGTAATGCCACTACGAAGGTTAGGCATAGGACCCGTGTCT
为描述起见，每个探针的靶结合区3′非靶结合区中间有一空格分开。
试验基本按PCT出版物WO95/16055所述进行。简而言之，在含有与捕获扩展物的非靶结合区互补的捕获探针的微量滴定板小孔中63℃杂交过夜后，将微量滴定板在室温下冷却10分钟，用含有0.1×SSC(15mM NaCl，1.5mM柠檬酸钠；pH7.0)，0.1％十二烷基硫酸钠的缓冲液洗两次。在小孔内加入与标记扩展物3′非靶结合区互补的15×3(15个“臂”，每个有3个碱性磷酸酶探针结合位点)分支DNA扩展物(100fm)，53℃温育30分钟，然后将滴定板冷却，如上洗涤。在小孔中加入碱性磷酸酶探针(200fm)，53℃再温育15分钟，滴定板再冷却，如上洗涤。用0.1×SSC缓冲液再洗3次。20分钟后在二氧六环磷酸盐底物溶液Lumiphos 530(Lumigen)用Chiron光度计检测信号。结果由表4给出。
                            表4非专一性结合试验背景噪声
捕获扩展物库   信号(+M13噬菌体)   噪声(-M13噬菌体)
  只有Pool A   293，306，337，359   1.1，0.9，1.1，2.0
  Pool A+Pool B   390，393，379，376   103，130，436，172
加入捕获扩展物库B不增加净信号，但增加噪声约一百倍。用计算机分析所涉及的序列显示库B的捕获扩展物#8与分支DNA扩增物(含有一个寡聚(dA)-寡聚(dT)9聚体)的T20-LLA2序列有很高同源性，而库B的捕获扩展物#9与分支DNA扩增物的BLA3c序列有很高同源性。
本发明要解决的是依赖杂交的试验背景噪声问题。构建核苷酸序列，它由不与“天然”核酸碱基形成稳定碱基对的核苷酸间断，于是阻抑了这些序列与天然序列杂交。在理想条件下，普遍序列的每三个或四个碱基中有一个是修饰核苷酸，不与A、C、G或T(U)配对。用与C*G碱基对能量相等的碱基对，还可减小普遍序列的长度。统计证据显示这样还可降低普遍序列之间，普遍序列与样本中非靶序列以及普遍序列与扩展物中靶特异性序列发生不需要的杂交的频率。若依靠多齿结合形成稳定杂交物，可进一步减小普遍序列的长度(见WO95/16055)。用至少6种，优选地8种核苷设计所有普遍序列：捕获探针、捕获扩展物尾、标记扩展物尾、扩增物、标记探针和原扩增物(若用到的话)。
                     实施例2
            isoC-isoG碱基对的特异性和强度
为了确定isoC-isoG碱基对的特异性和强度，对下列寡聚核苷酸作热熔分析：
1)5′(L)CA CCA CTT TCT CC(T)3′[SEQ ID NO：25]；
2)5′(L)CA CFA CTT TCT CC(T)3′[SEQ ID NO：26]；
3)3′(T)GT GGT GAA AGA GG 5′[SEQ ID NO：27]；
4)3′(T)GT GJT GAA AGA GG 5′[SEQ ID NO：28]；和
5)5′CA CTA CTT TCT CC(T)3′[SEQ ID NO：29]
这些寡聚核苷酸的核心杂交物含有13个核苷酸。不参与碱基配对的核苷酸用括号标出。L＝伯胺，F＝isoC，J＝isoG。用Cary3E光度计在3×SSC(0.45M  NaCl，0.045M柠檬酸钠)pH7.9中进行热熔分析。共温育的两种寡聚核苷酸均约为1.5μM。根据dA260/dT对温度的曲线上最大值计算Tm。由表4给出的结果显示isoC*isoG碱基对与天然的C*G碱基对能量相同。
                         表4iosC*isoG碱基配对专一性的Tm分析
匹配/错配，成对寡聚核苷酸 Tm1 Tm2   平均Tm
  C*G  匹配，1*3   60   60   60
  isoC*isoG  匹配，2*4   60   61   60
  isoC*G  错配，2*3   52   52   52
  isoG*C  错配，1*4   52   52   52
  G*T    错配，3*5   50   49   49
  isoG*T    错配，4*5   53   53   53
相应地，含有约等摩尔C、G、isoC、isoG、A和T的普遍序列比仅含有约等比的A、T、C、G的序列要短。这就限制了它与多少含A、T(U)、C和G的LE和CE靶结合序列和样本中天然非靶序列交叉反应的潜力。
这些数据也显示了isoC*isoG碱基对的特异性。isoC*G和isoG*C为错配。标准地，不稳定性用摄氏度衡量与错配百分比接近，因此由Tm变化约7.5℃可估计13个核苷酸出现一个错配(7.5％错配率)。C*G或isoC*isoG配对与错配相比，观察到的8℃变化与A、T、C和G密码平均错配的变化相似。
isoG至少以两个互变异构体形式(酮式和烯醇式)存在。水溶剂中利于酮式，有机溶剂中利于烯醇式(Sepiol等(1976)自然研究杂志，31：361-370)。isoG烯醇式互变异构体原则上可与dT形成两个氢键，与A*T碱基对相似。如果杂交缓冲液中存在较高水平的烯醇式互变异构体，isoC*isoG碱基对的特异性会受限制。不过，观察到的isoG*T错配的Tm是53℃，与其它错配基本相同。
这些数据支持下述结论：在3×SSC pH7.9中烯醇式互变异构体浓度很低或是即使它存在，它仍然形成Tm比isoC-isoG杂交物的低7-8℃的杂交物。G*T错配对照Tm约49℃，这比预计的平均G*T错配Tm低些，但与isoG-T错配很接近。
本领域专业人员应理解，再有一个碱基配对组合(即8个碱基，4对)，无论其与C*G是否能量相同，均可进一步增加普遍序列中碱基配对特异性。这种情况下几乎可以从普遍序列中去除A、T、C和G。不过有少量这些碱基能增加可能的普遍序列文库的多样性，从而可以设计出相互之间相互作用尽可能少的普遍序列。
例如，用4碱基密码只能设计出两对连一个三聚体杂交都没有的十五聚体普遍序列。即加入第三对15聚体序列，必须形成一些3核苷酸杂交物。用6碱基密码可设计出8对连一个三聚体杂交都没有的十五聚体普遍序列。用8碱基密码能设计出19对这样的十五聚体。
                          实施例3
                 pH对isoC*isoG碱基配对的影响
为了检验pH对isoC*isoG碱基配对的影响，对实施例2给出的寡聚核苷酸作Tm分析。在0.5M盐和约1.5μM寡聚核苷酸下确定pH对含有互补isoC*isoG碱基对(分别为序列2和4)和互补C*G碱基对(分别为序列1和3)的寡聚核苷酸Tm的影响(n＝2或3)，结果由表5给出。
                                   表5isoC*isoG碱基配对的pH敏感性的Tm分析
杂交物，成对的寡聚核苷酸 pH Tm1 Tm2 Tm3   平均Tm
  isoG*isoC，2*4   7.9   62   60   60   61
  isoG*isoC，2*4   5.1   60   59   62   60
  isoG*isoC，2*4   9.5   53   51   52   52
  G*C，1*3   9.5   52   52   52
通常寡聚核苷酸杂交物在pH5和pH10时稳定。低于pH5，C和A质子化，高于pH10，G和T会失去亚氨基质子。因此小于pH5和高于pH10时，核酸杂交物稳定性降低。表2的数据显示isoC*isoG碱基对有正常的酸稳定性。不过pH增加1.6单位，isoC*isoG杂交物或G*C杂交物Tm均表现反常的-9℃变化。这可能是由于它们长度太短。
理论上可以根据美国专利5,270,163号，发明人Gold等，Tuerk等(1990)科学， 249：505-510，Szostak等(1990)自然 346：818-822和Joyce(1989)基因 82：83-87描述的SELEX方法选择对pH更敏感的杂交物，其中许多DNA或RNA随机物在中性pH结合，在微酸性或微碱性pH下从靶序列解离从而进行选择。扩增后，选择过程可连续重复。最后一次重复过后，将具有所需pH敏感性的寡聚物克隆并测序。可以合成这些序列，将性质最优的序列用直接竞争试验选出。
本扩增DNA试验方案中利用在弱碱中不稳定性减少试验背景噪声。最后一步中典型的底物缓冲液pH为9.5到10.5。用具有适当的碱基不稳定性的捕获探针，靶可以从表面上分离，在另一小孔中检测到。背景被留下来。用WO95/16055公开的方法将捕获扩展物与支持物的结合最小化可减少由于捕获扩展物释放与捕获探针非特异性结合的分子造成的背景噪声。
由于并不需要释放与非特异性结合扩增物杂交的碱性磷酸酶探针，优选地，选出的捕获探针-捕获扩展物杂交物比扩增物和标记探针以及扩增物和标记扩展物杂交物的碱基不稳定性更强(即给定pH下Tm更高)。可选地，图1的L-2/M-2杂交物是碱基不稳定杂交物。另一例中，M-2/L-3杂交物应当更稳定；否则与非特异性结合扩增物杂交的标记探针会释放出来。
如上述可以想像将释放出来的靶转移到一新的小孔中读数。不过优选地在产生它的小孔中释放出来的溶液中阅读。这可避免再加一步移液操作并消除与之相联的误差。有几种方法可避免小孔转移，如下述。
为进一步增强试验特异性，靶的特异性释放可与屏蔽表面的背景连着做。这样就不必转移到另一支持物上。例如，固相支持物表面包被上标记探针抑制物和/或各种发光抑制物，吸收物，或猝灭物。当前用的表面包被是多聚(苯丙氨酸-赖氨酸)。苯丙氨酸是碱性磷酸酶，一种特别优选的酶标记的抑制物。在聚肽包被中可包括其它碱性磷酸酶抑制物如色氨酸和半胱氨酸。发光抑制物包括量子产率低的化合物，即与脱磷酸化dioxefane碰撞激发后倾向于放热而非发光的化合物。
至少有两种其它方法可方便地使释放溶液的检测更容易，而避免将释放出来的靶转移到另一小孔中。通过使显色试剂不能接触固相或屏蔽掉固相支持物上发生的信号产生，靶相关的信号可以在溶液中读数。在反应容器中加入比水重的不混溶油可使固相与后续的显色步骤隔离。该油可覆盖容器底部，使感兴趣的溶液浮于上层。为了简化用目视或反射测量方法进行的比色检测，在油中可加入不透明物质提供一个显色的中性背景。
对于化学发光检测，油中可加入光学不透明物质。如果用白色固体如二氧化钛，浮着的水相发出的光将会向上反射出容器。利于检测溶于油的暗色固体或染料分子也可用于屏蔽静止相。即使油溶液不能将固相与显色试剂完全隔离，悬浮的固体或溶解的染料也会阻止光透射过表面。
也可将静止相用染料染色，阻止该表面附近反应发光。这对于不透明小孔中用有颜色的小珠作固相尤其方便。
                         实施例4
           中性与碱性pH下盐对isoC*isoG碱基对的影响
为检验盐浓度对isoC*isoG碱基对的影响，对实施例2给出的寡聚核苷酸作Tm分析。在pH7.9或9.5和约1.5μM寡聚核苷酸下确定盐浓度对含互补isoC*isoG碱基对(分别为序列2和4)和互补C*G碱基对(分别为序列1和3)的寡聚核苷酸Tm的影响(n＝2或3)，结果由表6给出。
标准地，盐浓度变化一个对数单位，多聚核苷酸的Tm变化约16-17℃。pH7.9时对isoC*isoG杂交物计算得的盐浓度每变一个对数单位Tm变10-11℃，与13聚体预计的相同。然而pH9.5时盐浓度每变一个对数单位，isoC*isoG杂交物仅变3℃，C*G杂交物仅变5℃，这个变化出奇地低。
这可以用于特异性靶释放。通常低盐浓度用于特异性靶释放。不过一部分背景也明显增多。
                                     表6作为盐浓度函数的isoC*isoG的稳定性
杂交物，成对寡聚核苷酸   盐(M) pH   平均Tm(℃) dTmdlog[Na+]
isoC*isoG，2*4   0.5   7.9   61
isoC*isoG，2*4   0.17   7.9   56   10-11
isoC*isoG，2*4   0.5   9.5   52
isoC*isoG，2*4   0.17   9.5   50   3
C*G，1*3   0.5   9.5   52
C*G，1*3   0.1   9.5   48.5   5
由于在弱碱pH下isoC*isoG碱基对的熔解与盐浓度无关，在升高pH的同时降低盐浓度不会得到额外的好处。因此可使用高盐(也有利于碱性磷酸酶)用于释放，并使背景释放最小。
如实施例3所述，SELEX方法可用于寻找在任意选定pH下熔解与盐浓度无关的DNA或RNA序列。
                        实施例5
                碱基对错配对杂交的影响
前述实施例显示有isoG的寡聚核苷酸特异性地与含有isoC的互补物碱基配对。该含isoG的寡聚核苷酸若与另一个有单个isoG*T或isoG*C错配的寡聚物杂交，稳定性降低7-8℃。典型地，Tm每变化10℃结合会降低10倍。
两个碱基错配对13聚体杂交物结合的影响用表7给出的探针来测试。
                         表7
  SEQIDNO： 序列1
  30   5′GATGTGGTTGTCGTACTTTTTTTGACACTCCACCAT
  31   5′GATGTGGTTGTCGTACTTTTTTTGACAFTCCJCCAT
  32   ALK.PHOS.-CTACACCAACAGCATGAA 5′
  33   3′TCACTAAGTACCACCTCACAG
  34   5′AGTGATTCATGGTGGAGTGTCTCTCTTGGAAAGAAAGTGAT
  35   3′GAGAACCTTTCTTTCACTX
1F＝isoC，J＝isoG，ALK.PHOS.＝碱性磷酸酶，X＝一段含有一个结合固相支持物的胺的间隔序列。
根据报道(Urdea等(1988)核酸研究 16：4937-4955)制备标记的探针32，即碱性磷酸酶寡聚核苷酸结合物。标记的探针32与对照探针30杂交，产生碱性磷酸酶探针30*32。标记的探针32与修饰探针31杂交，产生isoC，isoG-碱性磷酸酶探针31*32。
根据报道(PCT出版物，WO93/13224号，其公开内容引入此处作为参考)将探针35，即捕获探针，结合到微量滴板小孔上，产生杂交的固相支持物。捕获扩展物探针34与探针35杂交。该捕获扩展物与碱性磷酸酶探针30*32互补，与碱性磷酸酶探针31*32部分互补。探针33是“竞争多聚体”，可以与捕获扩展物结合，阻止任一碱性磷酸酶探针结合。
在约1.0M NaCl中53℃进行下述温育30分钟：
(1)250fmol探针34在含有1pmol固定化探针35的小孔中；
(2)250fmol探针34+5pmol探针33在含有1pmol固定化探针35的小孔中；
(3)5pmol探针33在含有1pmol固定化探针35的小孔中；
(4)仅有缓冲液。
如实施例1所述用0.1×SSC，0.1％SDS洗两次后，上述每一温育小孔在同一条件下分别用下述再温育15分钟：
(1)25fmol探针30+500attomol探针32；
(2)25fmol探针31+500attomol探针32；
(3)500attomol探针32；
(4)仅有缓冲液。
将滴定板如上洗两次，再用相同缓冲液加10mM MgCl2，1mMZnCl2，0.1％Brij-35洗三次。用Lumiphos Plus(Lumigen)温育25分钟后，用Chiron光度计对滴定板读数。
可形成的杂交物如图3所示，其中Z，此处举例为isoC和isoG，是非天然核苷酸。竞争多聚体探针33可与捕获扩展物形成21个碱基对，理论上可阻止两种碱性磷酸酶探针结合。修饰的探针*标记的探针(31*32)可与捕获扩展物杂交，形成11个碱基对和2个错配(例如G*isoC，isoG*T)。对照探针*标记的探针(30*32)可与捕获扩展物形成13个碱基对。
如表8所示，捕获扩展物(34)与对照探针*标记探针(30*32)形成结合紧密的杂交物(样本1＝399相对光度单位(RLU))。样本2中，捕获扩展物与摩尔数20倍过量的竞争多聚物预温育，将背景噪声降低约10倍(30RLU)。修饰探针*标记探针(31*32)与捕获扩展物杂交比与对照探针*标记探针(30*32)杂交少40倍(样本3＝9RLU)。两个错配造成杂交有40倍变化。这与2个错配预计的变化相符，每一个使Tm降7-8℃(参照7×8＝56倍)。用竞争多聚物和错配碱性磷酸酶探针(样本4＝0.4RLU)，降低背景噪声约1000倍。样本5是对照，基本无背景噪声(0.1RLU)。这与预计相符，因为标记探针32与捕获扩展物没有可检测到的同源性。
                                表8碱基对错配对杂交的影响
  样本号NO： 初次杂交 二次杂交   平均RLU1(n＝6)   ％CV2
  1   34+35   30+32   399   7
  2   33+34+35   30+32   30   9
  3   34+35   31+32   9   6
  4   33+34+35   31+32   0.4   4
  5   34+35   32   0.1   11
1RLU＝相对光度单位
2％CV＝标准差/平均值×100
在杂交试验中，对所有捕获扩展物都用竞争多聚物是不实际的，因为典型地每个试验有5-10个捕获扩展物。另外，该实施例显示用竞争多聚物预温育并不比用15％碱基(用isoC，isoG)替换简单，例如普遍序列中每13个碱基中有2个碱基替换。用30％碱基替换(10个中有3个)预计将会使完全碱基配对的互补体的非特异性杂交减少约1000倍(30％错配约等于Tm变化30℃；Tm每变10℃结合约减少10倍)。
                     实施例6
             2′-脱氧-异鸟苷的化学合成
用下述方法从2′-脱氧鸟苷合成2′-脱氧-异鸟苷。
第1步一水合2′-脱氧鸟苷(50mmol)和咪唑(200mmol)用500ml二甲基甲酰胺(DMF)共蒸发干燥，残余物溶于500ml DMF。该溶液中加入叔丁基二甲基甲硅烷基氯(150mmol)，将反应混合物室温搅拌18小时。加入甲醇(30mL)，25分钟后真空蒸发去除溶剂，残余物溶于1L CH2Cl2，用1L 5％NaHCO3和1L 80％饱和NaCl溶液洗涤，有机相用Na2SO4干燥、过滤后蒸发至干，得到粗产品(30g)，直接溶于2L热乙醇。缓慢冷却至20℃，再在4℃贮存20小时，得到纯3′，5′-TBDMS2-2′-脱氧鸟苷(65％产率)。
第2步0℃下将3′，5′-TBDMS2-2′-脱氧鸟苷(12mmol)悬浮于含有三乙胺(150mmol)，N，N-二甲基氨基吡啶(100mg)和4-甲苯磺酰氯(40mmol)的125ml CH2Cl2中。反应混合物室温下搅拌20小时。此时所有固体均溶解，得到微黄溶液。用50ml 5％NaHCO3搅拌1小时猝灭反应。反应混合物用300ml CH2Cl2稀释，用300ml 5％NaHCO3和300ml 80％饱和NaCl溶液洗涤，有机相用Na2SO4干燥，过滤后蒸发至干，得到粗产品(8.9g)。用1％至4％甲醇/CH2Cl2梯度作硅胶快速色谱，得7.95g纯O6-(4-甲苯磺酰)-3′，5′-O-TBDMS2-2′-脱氧鸟苷(11mmol)。
第3步12g O6-(4-甲苯磺酰)-3′，5′-O-TBDMS2-2′-脱氧鸟苷(17mmol)悬浮于300ml CH3CN中。然后加入甲基吡咯烷(17ml)，悬浮液搅拌1小时，得到澄清溶液。TLC分析显示所有起始物质均转化成基线物质(base line material)。加入11g 4-(甲基硫代)苯酚(85mmol)，搅拌溶液60小时。蒸发后加入600mL乙酸乙酯。该溶液用3×400mL的0.3M NaOH和400ml 80％饱和NaCl萃取，有机相用Na2SO4干燥，过滤后蒸发至干，得到11.55g粗产品。用4％至5％甲醇/CH2Cl2梯度作硅胶快速色谱，得8.16g O6-(4-(甲基硫代)苯基)-3′，5′-O-TBDMS2-2′-脱氧鸟苷(11mmol)。
第4步4g O6-(4-(甲基硫代)苯基)-3′，5′-O-TBDMS2-2′-脱氧鸟苷(6.5mmol)0℃溶于65mL CH2Cl2，滴加6.5ml亚硝酸叔丁酯。溶液逐渐升至室温，混合物中产生气体(N2)。40分钟后，TLC分析显示起始材料完全消耗，出现一个新的迁移较慢的点。与2×100mL甲苯真空共蒸发除去过量亚硝酸叔丁酯。用4％至5％甲醇/CH2Cl2梯度作硅胶快速色谱对残渣粗产品纯化，得到2.75g O6-(4-(甲基硫代)苯基)-3′，5′-O-TBDMS2-2′-脱氧黄苷(4.45mmol)。
第5步所有纯化得的2.75g O6-(4-(甲基硫代)苯基)-3′，5′-O-TBDMS2-2′-脱氧黄苷(4.45mmol)溶于50mL甲醇。加入浓缩的氨水(50mL)，然后混合物在密封高压气弹中100℃加热4小时。冷却后用乙醇真空共蒸发除去溶剂，得到1.8g粗产品(3.6mmol)。用热乙醇重结晶得到纯3′，5′-O-TBDMS2-2′-脱氧-异鸟苷样品。该物质在各方面(UV，TLC，NMR和MS)都与报导的光解途径制得的样品(Switzer等(1993)，引文见上)相同。
                      实施例7
           控制扩增物和碱性磷酸酶探针与捕获
               扩展物的非特异性杂交
A.构建isoC、isoG bDNA amp和isoC、isoG ap探针
根据前述PCT出版物WO92/02526号报道的方法构建15位点的梳型扩增多聚体(amp)。用报道的12核苷酸衔接物和T4DNA连接酶将臂连到梳上。根据美国专利5,124,246报道从含有一个氨基功能团的寡聚核苷酸构建碱性磷酸酶(ap)探针。所用序列是：
序列(5′--＞3′)   序列ID
AGT FAJ CGC FGT AFC AAJTJC..........   AMP重复序列(臂)
ATC ACG AAC TCA TCA CGA ACT C   AMP引导序列(梳)
GFA FTT GJT ACJ GCG FTJ ACT......L   AP探针序列
F＝isoC，J＝isoG，L＝长链胺
B.制备捕获扩展物(CE)序列
用标准氨基亚磷酸酯法制备TNF-α，白介素-2(IL-2)，IL-4，IL-6和γ干扰素(IFNγ)的捕获扩展物。测试的捕获扩展物序列是：
                          TNFαCE库
TCCAGCTGGAAGACCCCTCCCAGATAGATGGGCZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7140.tnf.21
CGATTGATCTCAGCGCTGAGTCGGTCACCCTTCZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7141.tnf.22
TGCCCAGACTCGGCAAAGTCGAGATAGTCGGGCZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7142.tnf.23
CCTCCTCACAGGGCAATGATCCCAAAGTAGACCZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7143.tnf.24
CAGGGGAGGCGTTTGGGAAGGTTGGATGTTCGTZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7144.tnf.25
TGTCTGAAGGAGGGGGTAATAAAGGGATTGGGGZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7145.tnf.26
CAATTCTCTTTTTGAGCCAGAAGAGGTTGAGGGZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7146.tnf.27
AAGTTCTAAGCTTGGGTTCCGACCCTAAGCCCCZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7147.tnf.28
                           IL-6CE库
CTGGACAGCTCTGGCTTGTTCCTCACTACTCTCZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7270.il6.15
CTGCAGGAACTGGATCAGGACTTTTGTACTCATZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7271.il6.16
GGTGGTTATTGCATCTAGATTCTTTGCCTTTTTZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7272.il6.17
CGTCAGCAGGCTGGCATTTGTGGTTGGGTCAGGZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7273.il6.18
GTCCTGCAGCCACTGGTTCTGTGCCTGCAGCTTZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7274.il6.19
CTTAAAGCTGCGCAGAATGAGATGAGTTGTCATZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7275.il6.20
CCGAAGAGCCCTCAGGCTGGACTGCAGGAACTCZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 7276.il6.21
                           IFNγCE库
CATCGTTTCCGAGAGAATTAAGCCAAAGAAGTTZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8013.infg.1
GAGCTGAAAAGCCAAGATATAACTTGTATATTTZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8014.infg.2
GCAGTAACAGCCAAGAGAACCCAAAACGATGCAZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8015.infg.3
AAGGTTTTCTGCTTCTTTTACATATGGGTCCTGZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8016.infg.4
TACATCTGAATGACCTGCATTAAAATATTTCTTZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8017.infg.5
CAAAATGCCTAAGAAAAGAGTTCCATTATCCGCZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8018.infg.6
                           IL-2CE库
GAGTTGAGGTTACTGTGAGTAGTGATTAAAGAGZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8428.il-2.1
AAGACAGGAGTTGCATCCTGTACATTGTGGCAGZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8429.il-2.2
TGTTTGTGACAAGTGCAAGACTTAGTGCAATGCZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8430.il-2.3
GTGTTTTCTTTGTAGAACTTGAAGTAGGTGCACZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8431.il-2.4
GTAAATCCAGMAGTAAATGCTCCAGTTGTAGCTZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8432.il-2.5
                            IL-4CE库
ACACTTTGAATATTTCTCTCTCATGATCGTCTTZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8720.il-4.15
TCAAAAACTCATAAATTAAAATATTCAGCTCGAZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8721.il-4.16
TATAAATATATAAATACTTAAAAAATAAAGCTAZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8722.il-4.17
TAGATTCTATATATACTTTATTTTATGATGAGTZCTCTTGGAAAGAAAGTGAT 8723.il-4.18
Note：Z＝三甘醇间隔序列。
C.测量CE和amp以及CE和ap之间非特异性
杂交(NSH)的方法
100fmol各种捕获扩展物探针或各种捕获扩展物探针共100fmol在微孔中53℃温育1小时。用A清洗液(0.1×SSC，0.1％SDS)洗两次后，如WO95/16055描述用扩增物稀释剂+/-非isoC，isoG amp或用上述实施例7A描述用扩增物稀释剂+/-isoC，isoG amp将小孔温育30分钟。用A清洗液再洗两次后，用含有WO95/16055描述的非isoC，isoG ap探针或上述实施例7A描述的isoC，isoG ap探针的amp稀释剂(15×SSC，50％蛋白酶K消化的马血清)将小孔温育15分钟。
用到下述定义：AP NSB＝CE不存在时ap探针的背景。Amp NSB＝CE不存在时amp和ap探针的背景，减去ap NSB。AP NSH＝无amp的CE样本的RLU，减去AP NSB。AMP NSB＝CE样本的RLU-APNSH-AMP NSB-AP NSB。
D.结论
用每小孔100fm的量对五种CE探针检测背景非特异性杂交。结果由下表给出。
  寡聚探针#   AMP NSH   iC AMP NSH   AP NSH   iC AP NSH
  7,273   11.2   (0.2)   6.1   (0.2)
  7,274   1.2   (0.1)   0.1   (0.2)
  7,144   13.1   0.1   0.1   (0.2)
  8,015   37.4   0.1   (0.0)   (0.2)
  8,018   0.2   (0.1)   0.1   (0.1)
  AMP NSB：   iC AMP NSB：   AP NSB：   iC AP NSB：
  无DNA   1.1   0.6   0.7   0.5
括号内数值比零RLU小。AMP＝非isoC，isoG amp，
iC AMP＝isoC，isoG amp，AP＝非isoC，isoG ap，iC AP＝isoC，isoG ap。
对所有amp和ap探针，当CE探针不存在时非特异性结合背景(AP-NSB和AMP-NSB)均可忽略不计(＜＝1RLU)。三种扩展物与现在的amp探针有很强杂交反应性(＞10RLU)，但这不见于isoC，isoGamp。一种探针与现在的AP探针有6RLU的杂交反应性，这也不见于isoC，isoG AP探针。所有情况下，isoC，isoG探针的NSH可忽略。小于1.0的RLU值相对于NSB可忽略不计。
用相同分子对5种CE探针库检测其非特异性杂交背景。结果如下。
  寡聚CE库(CE数)   AMP NSH   iC AMP NSH   AP NSH  iC AP NSH
  IL-2(5)   2.3   0.2   1.2  0.0
  IL-4(4)   (0.2)   0.2   0.0  0.0
  IL-6(7)   16.0   0.2   4.7  0.0
  TNF(8)   14.6   0.0   0.0  0.3
  IFNg(6)   34.9   (0.1)   0.2  0.1
  AMP NSB：   iC AMP NSB：   AP NSB：  iC AP NSB：
  无DNA   1.7   1.1   0.4  0.5
缩写见前面表注。
同样，所有amp和ap探针的NSB相对NSH均可忽略不计。5个库中的4个amp NSH相当大，从2.3到34.9RLU，没有1个CE库其isoC，isoG amp的NSH足够大(均＜1)。库中的两个对ap探针有大的NSH，没有一个库与isoC，isoG ap探针有足够大的相互作用。本实验中共对30个CE序列选择其杂交反应性。
本领域专业人员具备了将新型碱基对引入杂交试验方案中的能力之后，即可明了用isoC，isoG引导序列替换amp引导序列将可以使此处用的isoC，isoG amp的NSH值变低。
E.isoC，isoG amp和ap的完整的IL-2和IL-6剂量响应曲线
通过系列稀释的人类细胞检测IL-2和IL-6mRNA得到完整的剂量响应曲线。检测极限为Δ＝0的细胞数。Δ的定义为：正RLU-2×标准差-(负RLU+2×标准差)，结果由下表给出。
  试验   当前检测极限   IsoC/G检测极限   提高倍数
  IL-2   41,000   3,000   12.6
  IL-6   34,000   11,000   3.0
用isoC/G amp和ap代替具有天然序列的当前分子，IL-2试验灵敏度提高12.6倍，IL-6试验灵敏度提高3倍。天然序列的噪声越大，试验改进越大。
于是，本发明公开了在液相夹心杂交试验中产生靶依赖性更强的信号的新方法。另外还公开了合成2′-脱氧-异鸟苷的新方法。尽管已经详细地描述了本发明的优选实施方案，应当理解，不离开由下述权利要求限定的本发明实质与范围，本发明可以有许多显而易见的变化。

Claims (10)

1.一种用于检测样本中核酸分析物的核酸杂交方法，其包括：
(a)将样品与多种试验组分接触，每一组分含有至少一种杂交寡聚核苷酸片段，它们中的至少一种含有第一核苷酸单位，所述第一核苷酸单位是非天然核苷酸单位，在形成A-T和G-C碱基对的条件下不能有效地与腺苷(A)、胸苷(T)、胞苷(C)、鸟苷(G)或尿苷(U)形成碱基对；
(b)检测在分析物和至少一种寡聚核苷酸片段之间形成的杂交复合物。
2.权利要求1的核酸杂交方法，其中第一核苷酸单位能够与互补的第二核苷酸单位形成碱基对。
3.权利要求2的核酸杂交方法，其中第一和第二核苷酸单位可互换地选自下述互补碱基对：
Figure C951958800002C1
其中R是骨架，引入多聚核苷酸后允许第一和第二核苷酸单位与互补的碱基单位形成碱基对，R′是氢、甲基、α或β-丙炔基、溴、氟或碘。
4.一种用于检测样本中核酸分析物的液相夹心杂交方法，其包括：
(a)将样品与多种试验组分接触，每一组分含有至少一种杂交寡聚核苷酸片段，它们中的至少一种含有第一核苷酸单位，所述第一核苷酸单位是非天然核苷酸单位，在形成A-T和G-C碱基对的条件下不能有效地与腺苷(A)、胸苷(T)、胞苷(C)、鸟苷(G)或尿苷(U)形成碱基对；
(b)将分析物直接或间接结合到固相支持物上；
(c)标记分析物；
(d)检测与分析物相连的标记是否存在。
5.一种检测样本中核酸分析物的试剂盒，该试剂盒包含至少一种杂交寡聚核苷酸探针，所述探针的一个片段能与分析物形成杂交复合物；一种检测杂交复合物的装置；其中至少一种杂交寡聚核苷酸探针含有第一核苷酸单位，所述第一核苷酸单位是非天然核苷酸单位，在形成A-T和G-C碱基对的条件下不会有效地与腺苷(A)、胸苷(T)、胞苷(C)、鸟苷(G)或尿苷(U)形成碱基对。
6.权利要求5的试剂盒，其包含：
(a)一组捕获探针，它们含有第一核苷酸单位，该核苷酸单位是非天然核苷酸单位，在形成A-T和G-C碱基对的条件下不能有效地与A、T、C、G或U形成碱基对；
(b)一组含有第一和第二杂交寡聚核苷酸片段的捕获扩展物分子，其中第一杂交寡聚核苷酸片段能与捕获探针形成杂交复合物，第二杂交寡聚核苷酸片段能与核酸分析物的预定片段形成杂交复合物；
(c)含有第三和第四杂交寡聚核苷酸片段的标记扩展物分子，其中第三杂交寡聚核苷酸片段与核酸分析物的片段形成杂交复合物，该核酸分析物片段与捕获扩展物分子结合的片段不同；
(d)含有第七和第八杂交寡聚核苷酸片段的扩增多聚体，其中杂交寡聚核苷酸片段含有第一核苷酸单位，所述第一核苷酸单位是非天然核苷酸单位，在形成A-T和G-C碱基对的条件下不能有效地与A、T、C、G或U形成碱基对，并且其中扩增物多聚体能与标记扩展物分子或原扩增物分子和许多相同的寡聚核苷酸亚单位形成杂交复合物；
(e)含有标记的标记探针，它被设计成与相同的寡聚核苷酸亚单位形成杂交复合物，并且直接或间接提供可检测信号。
7.权利要求6的试剂盒，它还包含含有第五和第六杂交寡聚核苷酸片段的原扩增物分子，其中的杂交寡聚核苷酸片段含有第一核苷酸单位，所述第一核苷酸单位是非天然核苷酸单位，在形成A-T和G-C碱基对的条件下不能有效地与A、T、C、G或U形成碱基对，并且其中原扩增物分子能与标记扩增物分子和许多扩增多聚体形成杂交复合物。
8.用作适应子的寡聚核苷酸，其包含一种含有许多互补碱基对的分子内寡聚核苷酸杂交复合物，其中至少一种互补碱基对含有互补非天然核苷酸单位，它们在形成A-T和G-C碱基对的条件下不能有效地与腺苷(A)、胸苷(T)、胞苷(C)、鸟苷(G)或尿苷(U)形成碱基对，并且非天然核苷酸单位存在于一段寡聚核苷酸片段中，该片段不需要碱基对的特异性来维持适应子的二级结构。
9.一种制备适应子的方法，其包括：
(a)提供一种靶分子；
(b)在适于寡聚核苷酸与靶分子结合的条件下将靶分子与寡聚核苷酸随机物库接触；
(c)将结合靶分子并形成寡聚核苷酸—靶复合物的寡聚核苷酸从未结合靶分子的寡聚核苷酸中分离出来；
(d)从寡聚核苷酸—靶复合物中解离出寡聚核苷酸；
(e)用聚合酶链式反应扩增该寡聚核苷酸；
(f)重复步骤(b)到(e)至少一次，得到最终适应子结构；
(g)用在形成A-T和G-C碱基对的条件下不能有效地与腺苷(A)、胸苷(T)、胞苷(C)、鸟苷(G)或尿苷(U)形成碱基对的非天然核苷酸单位替换最终适应子结构中的一个或多个核苷酸单位。
10.一种含有第一和第二杂交片段的反义分子，其中第一杂交片段能与靶寡聚核苷酸形成杂交复合物，第二杂交片段含有至少一个核苷酸单位，它在形成A-T和G-C碱基对的条件下不能有效地与腺苷(A)、胸苷(T)、胞苷(C)、鸟苷(G)或尿苷(U)形成碱基对，并且第二杂交片段能与第二反义分子形成杂交复合物。
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