CN109975260B - 一种基于纳米金荧光检测溶菌酶的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于纳米金荧光检测溶菌酶的方法及其应用，包括步骤如下：(1)溶菌酶标准溶液的配制：将溶菌酶标准品溶于磷酸盐缓冲溶液中，制得不同浓度的溶菌酶标准溶液；(2)标准曲线的测定：向不同浓度的溶菌酶标准溶液中加入纳米金溶液，于37℃下反应5min，加入罗丹明6G溶液，得混合溶液，测定混合溶液的荧光光谱并记录荧光强度，将每条曲线552nm处的荧光强度与对应的溶菌酶标准溶液浓度的对数值作图，得标准曲线；(3)待测样品溶菌酶的测定：测定待测样品的荧光强度，对照标准曲线计算其溶菌酶含量。本发明的定量检测限为0.1μg/mL，具有检测限低，操作过程简单，试剂用量少，检测方法快速、灵敏等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于纳米金荧光检测溶菌酶的方法及其应用，属于生物医药检测技术领域。
背景技术
溶菌酶是生物体内重要的蛋白质，可以促进口腔内细菌的清除，是一种通常存在于动植物组织液和某些微生物体内的蛋白。血清和尿液中的不正常的溶菌酶含量被认为与疾病相关，比如白血病、肾疾病、免疫系统紊乱和脑膜炎，因此溶菌酶可以作为系统、器官、组织等的结构或功能改变或可能发生改变的生化指标(参见：Selby D M,Valdez R,Schnitzer B,et al.Blood, 2003,101(7):2895-2895；Filippatos T D,Milionis H J,Elisaf M S.European journal of haematology, 2005,75(6):449-460.)。
目前用于检测溶菌酶的方法主要有高效液相色谱法、酶联免疫吸附法(ELISA)、毛细管电泳法以及分子印迹法等(参见：Jing T,Xia H,Guan Q,et al.Analytica chimicaacta,2011, 692(1-2):73-79；Zhang Z,Wang H,Wang H,et al.Analyst,2018,143(23):5849-5856.)。中国专利文件CN107064504A公开了一种检测蛋清中溶菌酶的方法，该方法包括如下步骤：用单克隆抗体包被ELISA板过夜，PBST洗涤并加入脱脂奶粉溶液封闭，再用PBST洗涤并加入系列稀释的溶菌酶标准溶液等孵育，加入TMB底物溶液，加入3mol/L硫酸终止反应并计算待测样品中鸡蛋蛋清中溶菌酶的含量。但是这些方法需要长时间的样品处理、复杂的实验操作或者昂贵的检测仪器，不适合快速、灵敏、微量地检测溶菌酶。
目前，基于纳米金荧光检测物质含量的方法，由于其具有灵敏度高、快速响应、操作简单和成本低等优点得到广泛关注(参见Chen J,Zheng A F,Chen A H,etal.Analytica chimica acta, 2007,599(1):134-142.)。因此，开发一种简单、经济、快速、灵敏的基于纳米金荧光检测溶菌酶的方法，对疾病的诊断和检测具有重要的参考价值和极大的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于纳米金荧光检测溶菌酶的方法及其应用。
本发明的技术方案如下：
一种基于纳米金荧光检测溶菌酶的方法，包括步骤如下：
(1)溶菌酶标准溶液的配制：将溶菌酶标准品溶于磷酸盐缓冲溶液中，制得不同浓度的溶菌酶标准溶液；
(2)标准曲线的测定：分别向步骤(1)制得的不同浓度的溶菌酶标准溶液中加入纳米金溶液，于37℃下反应5min，然后加入罗丹明6G溶液，得到混合溶液，分别取混合溶液，经激发光源激发，激发狭缝为2nm，发射狭缝为2nm，扫描其荧光光谱并记录荧光强度，将每条曲线552nm处的荧光强度与对应的溶菌酶标准溶液浓度的对数值作图，得到标准曲线；
(3)待测样品溶菌酶的测定：将待测样品溶于磷酸盐缓冲溶液中，按照步骤(2)的方法测试体系的荧光强度，通过测得的荧光强度对照标准曲线计算得到待测样品中溶菌酶的含量。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述的磷酸盐缓冲溶液包括：磷酸10mmol/L，NaCl138 mmol/L，KCl 2.7mmol/L，溶液的pH＝7.4。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述的溶菌酶标准溶液中溶菌酶的浓度为0.1～10μg/mL。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述的纳米金溶液的浓度为0.35nmol/L，所述的纳米金溶液的加入体积与溶菌酶标准溶液体积之比为1:1。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述的纳米金溶液的制备方法是现有技术，可按下述方法制备：
将β-环糊精溶液、四氯金酸溶液分别加入到去离子水中，加入碱液调节体系pH值为10.5，然后于60℃下搅拌3h，使四氯金酸充分被还原，得均一稳定的混合溶液，将所得的混合溶液在转速为9000r/min下离心20min，得到纳米金颗粒，所得纳米金颗粒分散在三次蒸馏水中，得到纳米金溶液；所述的β-环糊精溶液中的β-环糊精和四氯金酸溶液中的四氯金酸的摩尔比为10:1；所述的β-环糊精溶液和四氯金酸溶液的浓度均为0.01mol/L；所述的四氯金酸溶液和去离子水的体积之比为1:38-40；所述的碱性溶液为1mol/L的氢氧化钠溶液。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述的罗丹明6G溶液的浓度为0.1μmol/L，所述的罗丹明6G溶液的加入体积与溶菌酶标准溶液体积之比为1:1。
根据本发明，步骤(2)中所述的不同浓度的溶菌酶标准溶液的体积是相同的，每一组测试均平行进行三次，取平均值进行比较，测试温度为室温。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述的激发光源的激发波长为520nm。
根据本发明，上述基于纳米金荧光检测溶菌酶的方法，用于尿液中溶菌酶的检测。
本发明的原理如下：
本发明的基于纳米金荧光检测溶菌酶的方法检测溶菌酶时，在波长520nm激发光源激发下，当待检测样品中没有溶菌酶时，552nm处的荧光发射峰强度很弱，当待检测样品中含有溶菌酶时，552nm处的荧光强度增强，并且溶菌酶含量越多，552nm处的荧光强度越强。
本发明通过纳米金和罗丹明6G之间的荧光共振能量转移(FRET)效应达到检测溶菌酶的目的，纳米金能够通过FRET效应使罗丹明6G荧光猝灭，但当在pH＝7.4的条件下，带正电的溶菌酶加入到带负电的纳米金溶液中，溶菌酶和纳米金通过静电相互作用导致纳米金聚集，然后加入罗丹明6G，聚集后的纳米金不能再和罗丹明6G产生FRET效应，溶菌酶可以通过检测罗丹明6G产生的荧光达到量化检测的目的，并且溶菌酶的含量越多，罗丹明6G的荧光强度越强。
本发明的有益效果如下：
1、本发明基于纳米金荧光检测溶菌酶的方法，操作过程简单、成本低、检测准确、灵敏度高、定量检测限为0.1μg/mL。
2、本发明的方法具有试剂消耗少，样品处理时间短等优点，解决了现有检测方法复杂、成本高的问题。
3、本发明的检测溶菌酶的方法成功运用到检测尿液中的溶菌酶含量并且检测结果良好，为以后的临床诊断和应用发展提供了前景。
附图说明
图1为实施例中所用纳米金溶液的透射电子显微镜(TEM)照片。
图2为实施例1中不同浓度溶菌酶标准溶液的荧光光谱图，在552nm处荧光强度从下到上依次对应的溶菌酶标准溶液浓度分别为0.1、0.5、1、5、10μg/mL。
图3为实施例1中溶菌酶标准溶液浓度的对数值与荧光强度之间关系的标准曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明保护范围不限于此。
同时下述的实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
其中四氯金酸购买自中国萨恩化工技术(上海)有限公司。
实施例中所用纳米金溶液采用下述方法制备：
将0.01mol/L的β-环糊精溶液20mL、0.01mol/L的四氯金酸溶液2mL分别加入到78mL 去离子水中，加入1mol/L的氢氧化钠溶液0.2mL，调节体系的pH值为10.5，然后于60℃下搅拌3h，使四氯金酸充分被还原，得均一稳定的混合溶液，将所得的混合溶液在转速为9000 r/min条件下离心20min，得到纳米金颗粒，所得纳米金颗粒分散在三次蒸馏水中，得到浓度为0.35nmol/L的纳米金溶液。
将制备的纳米金溶液滴加到铜网上，用红外灯烤干在透射电子显微镜下观察，其透射电子显微镜(TEM)照片如图1所示，从图1中可以看出纳米金颗粒粒径约17nm，并且尺寸均匀，分散性良好。
实施例1
一种基于纳米金荧光检测溶菌酶的方法，包括步骤如下：
(1)溶菌酶标准溶液的配制：将溶菌酶标准品溶于磷酸盐缓冲溶液中，制得浓度分别为 0.1、0.5、1、5、10μg/mL的溶菌酶标准溶液；
所述的磷酸盐缓冲溶液包括：磷酸10mmol/L，NaCl 138mmol/L，KCl 2.7mmol/L，溶液的pH＝7.4。
(2)标准曲线的测定：分别向350μL步骤(1)制得的不同浓度的溶菌酶标准溶液中加入0.35nmol/L纳米金溶液350μL，于37℃下反应5min，然后加入0.1μmol/L罗丹明6G溶液350μL，将其置于荧光光谱仪中，设定激发波长为520nm，激发狭缝为2nm，发射狭缝为 2nm，室温下扫描体系的荧光光谱并记录其荧光强度，每一组测试均平行进行三次，取平均值进行比较，将每条曲线552nm处的荧光强度与对应的溶菌酶标准溶液的浓度的对数值作图，得到标准曲线；不同浓度溶菌酶标准溶液的荧光光谱图如图2所示，标准曲线如图3所示；
(3)待测样品溶菌酶的测定：将待测样品溶于磷酸盐缓冲溶液中，按照步骤(2)的方法测试体系的荧光强度，将552nm处的荧光强度对照标准曲线计算得到待测样品中溶菌酶的含量。
实施例2
一种基于纳米金荧光检测尿液中溶菌酶的方法，包括步骤如下：
(1)将正常人尿液用磷酸盐缓冲溶液稀释10倍，向其中加入溶菌酶标准品，制得溶菌酶的浓度分别为1、5、10μg/mL的尿液样品；
所述的磷酸盐缓冲溶液包括：磷酸10mmol/L，NaCl 138mmol/L，KCl 2.7mmol/L，溶液的pH＝7.4；
(2)分别向350μL步骤(1)得到的不同溶菌酶浓度的尿液样品中加入350μL的0.35nmol/L的纳米金溶液，于37℃下水浴反应5min；之后加入350μL的0.1μmol/L的罗丹明 6G溶液，将其置于荧光光谱仪中，设定激发波长为520nm，激发狭缝为2nm，发射狭缝为2 nm，检测552nm处的荧光强度，每一组测试均平行进行三次，取平均值进行比较，测试温度为室温。根据实施例1中的标准曲线，计算尿液样品中溶菌酶的含量，并计算回收率(Recovery) 和相对标准偏差(RSD)。计算结果如表1所示。
表1
从表1可以看出，本发明的方法能够快速、灵敏地对尿液中的溶菌酶进行有效检测。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。
Claims (5)
1.一种基于纳米金荧光检测溶菌酶的方法，包括步骤如下：
(1)溶菌酶标准溶液的配制：将溶菌酶标准品溶于磷酸盐缓冲溶液中，制得不同浓度的溶菌酶标准溶液；
(2)标准曲线的测定：分别向步骤(1)制得的不同浓度的溶菌酶标准溶液中加入纳米金溶液，于37℃下反应5min，然后加入罗丹明6G溶液，得到混合溶液，分别取混合溶液，经激发光源激发，激发狭缝为2nm，发射狭缝为2nm，扫描其荧光光谱并记录荧光强度，将每条曲线552nm处的荧光强度与对应的溶菌酶标准溶液浓度的对数值作图，得到标准曲线；所述的纳米金溶液的浓度为0.35nmol/L；所述的纳米金溶液的加入体积与溶菌酶标准溶液体积之比为1:1；所述的罗丹明6G溶液的浓度为0.1μmol/L；所述的罗丹明6G溶液的加入体积与溶菌酶标准溶液体积之比为1:1；
所述的纳米金溶液按下述方法制备：
将β-环糊精溶液、四氯金酸溶液分别加入到去离子水中，加入碱液调节体系pH值为10.5，然后于60℃下搅拌3h，使四氯金酸充分被还原，得均一稳定的混合溶液，将所得的混合溶液在转速为9000r/min下离心20min，得到纳米金颗粒，所得纳米金颗粒分散在三次蒸馏水中，得到纳米金溶液；所述的β-环糊精溶液中的β-环糊精和四氯金酸溶液中的四氯金酸的摩尔比为10:1；所述的β-环糊精溶液和四氯金酸溶液的浓度均为0.01mol/L；所述的四氯金酸溶液和去离子水的体积之比为1:38-40；所述的碱性溶液为1mol/L的氢氧化钠溶液；
(3)待测样品溶菌酶的测定：将待测样品溶于磷酸盐缓冲溶液中，按照步骤(2)的方法测试体系的荧光强度，通过测得的荧光强度对照标准曲线计算得到待测样品中溶菌酶的含量。
2.根据权利要求1所述的基于纳米金荧光检测溶菌酶的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的磷酸盐缓冲溶液包括：磷酸10mmol/L，NaCl 138mmol/L，KCl2.7mmol/L，溶液的pH＝7.4。
3.根据权利要求1所述的基于纳米金荧光检测溶菌酶的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的溶菌酶标准溶液中溶菌酶的浓度为0.1～10μg/mL。
4.根据权利要求1所述的基于纳米金荧光检测溶菌酶的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的激发光源的激发波长为520nm。
5.权利要求1-4任一项所述的基于纳米金荧光检测溶菌酶的方法，用于尿液中溶菌酶的检测。
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