CN109966275A - 醌式查尔酮化合物在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种醌式查尔酮化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述醌式查尔酮是A环具有异戊烯基的醌式查尔酮化合物，还提供了这类化合物在肿瘤疾病治疗中作为单药或联合用药的应用，该醌式查尔酮本身具有较强的抗肿瘤能力，与干扰素等抗肿瘤药物联用时，不但可以将分化的肿瘤细胞杀灭，还可以将进入休眠的肿瘤干细胞杀灭，具有彻底清除肿瘤细胞的效果。

Description

醌式查尔酮化合物在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种醌式查尔酮化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，同时涉及这类化合物在肿瘤疾病治疗中作为联合用药的应用，以及一种抗肿瘤药物制剂组合。

背景技术

恶性肿瘤是一种由细胞异常增殖所导致的疾病，肿瘤干细胞对肿瘤的存活、增殖、转移及复发均有重要作用。从本质上讲，肿瘤干细胞通过自我更新和无限增殖维持肿瘤细胞群的生命力，其运动和迁徙能力赋予了肿瘤细胞远端侵袭转移的能力。近年来研究报道显示，临床治疗过程中肿瘤干细胞可以长时间处于休眠状态并上调多种耐药分子表达而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感。肿瘤休眠(tumor dormancy)是一种偶然发现的临床状态，包括细胞休眠、肿瘤血管休眠和免疫状态休眠，是恶性肿瘤细胞的生物学特征之一，是导致临床肿瘤反复发作和远端侵袭转移的重要原因之一。传统的手术、放疗和化疗手段在取得一定治疗效果的同时，伴随有较严重临床副作用，且存在诱导肿瘤休眠的风险，寻找有效、毒副作用小的治疗方法提高患者生存质量已成为医学研究的重中之重。

体外采用杀伤性T细胞对癌细胞进行杀伤，理论上讲杀伤性T细胞数目越多，杀伤效果越显著，然而本案发明人在以黑色素瘤B16-OVA细胞为例的研究中发现，杀伤性T细胞对癌细胞的杀伤随浓度增加而增强，然而达到一定比例后即使增加T细胞数目也不能彻底清除B16-OVA细胞。这一现象提示着，癌细胞在临床治疗过程中存在着一群无法被特异性T细胞杀伤的休眠细胞，而这些休眠癌细胞在肿瘤患者体内埋下了隐患，目前的临床治疗中由于无法彻底清除休眠状态的癌细胞，而使得临床患者存在肿瘤复发或转移而导致死亡的风险。

虽然不断有抗肿瘤药物研究结果出现，寻找更有效的药物和手段的工作并没有停止，寻找清除休眠肿瘤细胞的方法，真正有效清除肿瘤，达到彻底治疗临床肿瘤患者体内癌细胞的目的，是业内人士努力寻求，也是全社会期盼的目标。

发明内容

本发明解决的技术问题之一是提供一类醌式查尔酮化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，利用这种特殊结构的小分子抑制剂，不仅能够杀伤肿瘤，更能够辅助干扰素的使用，达到杀灭休眠肿瘤细胞的效果。

本发明还提供了该醌式查尔酮作为活性分成的药物与干扰素联合用药在抗肿瘤治疗中的应用，以及提供一种活性成分包括该醌式查尔酮和干扰素的抗肿瘤制剂组合。

本发明的一个方面，提供了一类醌式查尔酮化合物在制备治疗肿瘤疾病的药物中的应用，所述醌式查尔酮为一组A环具有异戊烯基的醌式查尔酮化合物，中国专利申请CN201410220017.8中已对该醌式查尔酮化合物进行了详细的公开和阐述，故将相关内容均合并入本申请，成为本申请内容的一部分。

上述A环具有异戊烯基的醌式查尔酮化合物，具有如下通式结构Ⅰ：

该式Ⅰ中，R代表连接在B环上的1-4个取代基，可以是独立地选自：氢、羟基、巯基、甲氧基、氨基、硝基、卤素(例如比较常见的是氯、溴)、氰基、甲磺酸基或甲酸基等。

本案发明人在前期大量探索的基础上发现，使用一类具有上述醌式查尔酮结构的小分子抑制剂，作为单药使用，表现出了比较显著的抗肿瘤效果，而与临床抗肿瘤药联用，更可打破肿瘤细胞的休眠状态，相比单用抗肿瘤药物表现出更优的抑制和杀灭癌细胞的效果，这对于彻底清除患者体内的肿瘤细胞，治愈肿瘤疾病有着重要意义。

根据本案发明人的研究结果，上述醌式查尔酮化合物是一类小分子抑制剂(本发明中以“HB”代表)作为单药或联用药，可适用的肿瘤疾病包括各种临床诊断的实体瘤和白血病，例如恶性黑色素瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌或白血病等。

根据本发明的方案，包含所述醌式查尔酮活性成分的治疗肿瘤疾病药物可以为单位制剂，更利于临床治疗中的使用。根据肿瘤类型和患者的病情，所述单位制剂的药物中可以包含1-5毫克作为活性成分的所述醌式查尔酮化合物。该药物组合物的剂型可以是注射剂型或口服剂型等。

根据本发明的方案，包含所述醌式查尔酮成分的药物可以用于单药治疗，也可以与目前的临床抗肿瘤药物联用，例如，所述治疗肿瘤疾病药物也可以为包括干扰素与所述醌式查尔酮化合物的制剂组合。

同样的考虑，制剂组合形式的所述治疗肿瘤疾病药物也可以为单位制剂。可以是包含1-5毫克作为活性成分的所述醌式查尔酮化合物和肿瘤治疗有效量的干扰素。在一个实施方案中，所述制剂组合形式的单位制剂的药物可以包含1×10⁷～4×10⁷U的干扰素，或根据肿瘤类型和患者病程确定剂量。

本发明的再一方面，提供了一种抗肿瘤药物的制剂组合，其中的治疗活性成分包括干扰素和所述的醌式查尔酮化合物。

本发明所使用的小分子抑制剂，目前被作为抗炎成分，例如CN201410220017.8中公开了可以用于血管和神经炎症性疾病和免疫性炎症疾病的治疗，但发明人的研究显示，其对于肿瘤细胞的杀灭作用和以及联合干扰素类抗肿瘤药物进一步提升对恶性肿瘤疾病治疗效果的协同功效，更是意想不到的。

关于该醌式查尔酮化合物的结构和理化性质及制备方法，均可参考中国专利申请CN201410220017.8。作为示例，以下列出部分适用的醌式查尔酮化合物：

发明人的研究证明，采用本发明提供的醌式查尔酮化合物作为活性成分制备的药物，可以作为单药用于肿瘤疾病治疗，达到至少能部分杀灭肿瘤功效，可以与干扰素类临床抗肿瘤药物联用，有效杀伤休眠状态肿瘤细胞，从而为彻底清除患者体内癌细胞提供可能。

另一方面，本发明提供的醌式查尔酮化合物(HB)作为活性成分制备的药物，用于抗肿瘤治疗中，也可以与其它的临床抗肿瘤药物联用，例如，与抗肿瘤疫苗联用，或者，与化疗药物联合使用等，都能够有效杀灭休眠肿瘤细胞，从而为彻底清除患者体内恶性癌细胞提供可能。

本发明涉及的醌式查尔酮可以商购或按照相关的公开内容(例如前述专利公开内容)自行合成制备，干扰素类药物IFN可以是目前临床使用的干扰素β和γ，即，IFN-β、IFN-γ。

为了研究和证明小分子抑制剂对休眠状态肿瘤细胞的杀伤和抑制，发明人采用3D胶对肿瘤细胞进行培养来获得肿瘤干细胞，相较于传统分离肿瘤干细胞的方法，3D胶培养技术获得的干细胞具有增殖能力强、耐药性高、成瘤能力强、远端侵袭转移能力高等特征。并且，发明人使用来自人或鼠肿瘤细胞实验和荷瘤小鼠模型的给药研究显示，小分子抑制剂不仅具有抑制和杀灭肿瘤的效果，更能显著地降低CD8+T细胞PD-1的表达，对于抑制Kyn介导的PD-1表达上调，增强特异性CD8+T细胞对相应肿瘤细胞的杀伤，更具有意想不到的效果，有理由预期，该小分子抑制剂联合目前临床抗肿瘤药IFN或抗肿瘤疫苗、化疗药等的抗肿瘤药物制剂组合不但可以将分化的肿瘤细胞杀灭，还可以将进入休眠的肿瘤干细胞杀灭。

如前所述，本发明提供的抗肿瘤单药和抗肿瘤药物制剂组合中，小分子抑制剂HB单药以及干扰素(IFN)均可以为单位制剂。所述单位制剂为满足一次给药所需有效成分的制剂，如一单位(针)针剂，也可以是一片(粒)或丸等作为单次用药即可满足剂量的制剂。患者一次施用所需的药物的量可以方便地通过计算患者的体重和该患者一次用药所需单位体重剂量的乘积得到。例如，在制备药物的过程中，一般认为成人体重为50-70kg，可以最初可以通过实验动物与人的单位体重剂量之间的等效剂量换算关系来确定用药量。例如，可以根据FDA、SFDA等药品管理机构提出的指导意见，也可参考(黄继汉等，“药理试验中动物间和动物与人体间的等效剂量换算”，《中国临床药理学与治疗学》,2004Sep；9(9):1069-1072)来确定。在本发明的实施方式中，可以使用按照人和小鼠的体表面积折算系数0.0026来换算人和小鼠的剂量。

在本发明的实施方案中，针对体重为20g的小鼠，小分子抑制剂HB以5mg/kg小鼠体重的量施用，IFN-β则是以5×10⁴-1×10⁵U的量施用。例如，将HB抑制剂用水或药物溶剂配制为溶液，按照设计剂量给小鼠灌服或实施瘤内注射，而IFN-β一般是瘤内注射给药。

更进一步的，根据针对小鼠的实验结果，转换为针对正常体重范围的人(例如50-70kg体重)给药设计，HB单位制剂药物中包含1-5mgg活性成分，IFN单位制剂中包含1×10⁷～4×10⁷U的IFN。配成制剂组合时，HB和干扰素的含量也满足上述剂量。

本发明提供的抗肿瘤药物和药物制剂组合的给药方式为：对有治疗需要的患肿瘤个体(可以是人或哺乳动物)施用包含所述HB抑制剂的药物或所述抗肿瘤药物制剂组合，例如，单药治疗时口服(灌胃)或注射(静脉、注射、腹腔内或瘤内注射)HB药物；联合用药时，静脉、腹腔内或者瘤内注射IFN，联合口服(灌胃)或注射(静脉注射、腹腔内或瘤内注射)HB药物。

本发明使用的含有HB作为活性成分的药物，可是按照制药技术制成的任何药物组合物或制剂，作为活性成份的HB的含量可以为例如0.1～95％重量，可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。治疗中可以单位剂量形式给药，给药途径可为体内给药或局部给药，例如肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等；可为注射给药，包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等；还可以是液体剂型、固体剂型，如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型；其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。

本发明还提供了一种治疗或预防肿瘤的方法，包括给予患有肿瘤的个体或具有肿瘤发生趋势的个体(可以是人或哺乳动物)施用所述抗肿瘤药物或抗肿瘤药物制剂组合的过程。例如，单药治疗时，给予口服(灌胃)或注射(静脉注射、腹腔内或瘤内注射)HB药物；联合用药时，给予注射IFN(静脉、腹腔或瘤内注射)，联合口服(灌胃)或注射(静脉注射、腹腔内或瘤内注射)给药HB。

根据本发明的方案，所述醌式查尔酮化合物药物和干扰素的治疗给药剂量均可以根据需要控制，推荐的，可以制备不同剂量的单位制剂，方便对不同阶段的肿瘤患者的给药。

采用HB联合干扰素给药时，给药顺序没有特别要求和限制，例如，可以同时给药、或二种药顺序施用，二种药之间一般不建议太大的给药间隔，例如，可以是30分钟到60分钟内完成给药，也可以1-12小时内，或者1-2天内完成给药，也可以根据医嘱将每种药的按照各自的给药程序或周期施用。

干扰素(例如IFN-β或者IFN-γ)是一种由成纤维细胞分泌产生的细胞因子，具有抗病毒、调节固有免疫反应及抗肿瘤特性，是一种常见的抗肿瘤生物因子。在本申请人研究中发现，干扰素在临床治疗的应用中虽然具有比较好的抗肿瘤效果，但仍有一定量治疗后的患者会出现肿瘤复发乃至转移的情况，原因在于单独使用IFN-β或者IFN-γ只能杀死部分处于分化状态的肿瘤细胞，未被杀死的肿瘤细胞具有干细胞特性，并进入休眠状态，正是这些休眠肿瘤细胞的存在，使得临床肿瘤患者在一段时间(若干年)后又会面临肿瘤复发或转移的风险。本申请人经过大量实验研究发现，上述的Α环具有异戊烯的醌式查尔酮作为活性成分的药物不仅自身能杀死肿瘤细胞，与IFN-β或者IFN-γ组合给药，在杀死分化的肿瘤细胞的同时，更能够实现对休眠肿瘤细胞杀伤的目的，而且在显著增效的同时也实现降低单药的使用剂量。

本发明提供的抗肿瘤药物制剂组合，还可以为活性成分是上述醌式查尔酮化合物和临床抗肿瘤药物的联合，例如临床上使用的抗肿瘤疫苗、各类化疗药物，患病个体的治疗中联合给予本发明的醌式查尔酮化合物为活性成分的药物，该药物的剂型、给药剂量及给药途径和方式，均参照前述。

综上，本发明的方案具有以下效果：

1、本申请利用所述醌式查尔酮(例如实施例的HB-2及其结构类似物)制备的抗肿瘤药物制剂单独使用可以部分杀伤肿瘤细胞，而与干扰素β联合使用，或与其它临床抗肿瘤药物联用，不但可以杀灭分化的肿瘤细胞，而且可以杀伤进入休眠的肿瘤细胞，具有彻底清除肿瘤细胞的效果。

2、本发明的抗肿瘤药物制剂组合不仅可以通过增强全身免疫反应，实现杀灭肿瘤的效果，也可以不通过调节全身免疫反应而对肿瘤产生直接杀伤作用，因而具有安全性高、无毒副作用的优点。

附图说明

图1显示小分子抑制剂HB诱导3D培养下的实体瘤和白血病肿瘤再生细胞凋亡效果。

图中的A-F分别显示了DMF、HB-2等醌式查尔酮结构类似物诱导3D培养下A375、A549、HepG2、MCF-7、PANC-1及HL-60肿瘤再生细胞凋亡的效果。

图2为小分子抑制剂HB对实体瘤和白血病体内生长的抑制。

图中A-F分别显示了采用DMF、HB-2等醌式查尔酮结构类似物对A375、A549、HepG2、MCF-7、PANC-1及HL-60荷瘤小鼠的治疗效果。

图3显示HB-2联合使用IFN-β对3D培养的肿瘤再生细胞凋亡的影响。

图中：

A为采用IFNβ与HB-2联用处理3D培养条件下的人恶性黑色素瘤细胞A375，检测其细胞凋亡百分比；

B为采用IFNβ与HB-2联用处理3D培养条件下的人肺癌细胞A549，检测其细胞凋亡百分比；

C为采用IFNβ与HB-2联用处理3D培养条件下的人肝癌细胞HepG2，检测其细胞凋亡百分比；

D为采用IFNβ与HB-2联用处理3D培养条件下的人乳腺癌细胞MCF-7，检测其细胞凋亡百分比；

E为采用IFNβ与HB-2联用处理3D培养条件下的人胰腺癌细胞PANC-1，检测其细胞凋亡百分比；

F为采用IFNβ与HB-2联用处理3D培养条件下的人白血病细胞HL-60，检测其细胞凋亡百分比。

图4为HB-2与IFNβ联用对实体瘤荷瘤小鼠生长的影响。

图中显示了DMF、HB-2、IFN-β以及联合IFN-β与HB-2减少小鼠黑色素瘤B16瘤重的效果。

图5显示HB-2对体外培养的小鼠CD8⁺T细胞PD-1表达的影响。

图6显示HB-2联合特异性CD8⁺T细胞过继对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明方案和实施效果，但不能认为是对本发明可实施范围的限定。

下述实验实施中使用的肿瘤细胞、药物及实验动物：

OVA-B16肿瘤细胞系、B16小鼠黑色素瘤细胞系(也称B16肿瘤细胞系)、A375人黑色素瘤细胞系、A549人肺癌细胞系、HepG2人肝癌细胞系、MCF-7人乳腺癌细胞系，PANC-1人胰腺癌细胞系、HL-60人白血病细胞系均可从美国ATCC中心或北京协和医学院基础研究院细胞中心购买。

荧光素酶标记的HL-60细胞为HL-60细胞转染荧光素酶报告基因质粒后筛选出的稳定表达该荧光素酶基因的单克隆细胞。

实验动物：健康雌性Balb/c小鼠、C57BL/C小鼠、或者雌性NOD-SCID小鼠，4-6周龄，购自中国医学科学院协和医学院实验动物中心，且该动物实验获得中国医学科学院动物伦理委员会批准。

DMF(二甲基甲酰胺的简称)，购自美国SIGMA公司，根据实验设计要求配制成相应浓度或剂量的溶液剂；

人源或鼠源IFN-β，细胞因子购自美国PeproTech公司，根据实验设计要求配制成相应浓度或剂量的溶液剂；

小分子抑制剂HB-2，HB-3，HB-7，HB-19，HB-25，HB-31，HB-33以及HB-46，来自于中国医学科学院药物所合成产物，也可以按照中国专利申请CN 201410220017.8公开的方法自行合成，为本发明所述的A环具有异戊烯基的醌式查尔酮化合物(简称“小分子抑制剂HB”)，具体结构如下，根据实验设计要求配制成相应浓度或剂量的溶液剂。

3D纤维蛋白软凝胶(3D胶)、RPMI-1640培养基、PBS均可商购获得。

以下实施例中实验数据的统计学结果在对应附图中均有相应显示，图中标记“*”、“**”和“***”分别代表该结果相比于对照组结果的统计学差异P<0.05、P<0.01和P<0.001。

第一部分：小分子抑制剂HB单用对实体瘤和白血病的作用检测

实施例1：本发明的醌式查尔酮化合物单药使用可有效诱导3D培养条件下的实体瘤和白血病细胞凋亡。

1、实验步骤

采用3D胶技术培养A375、A549、HepG2、MCF-7、PANC-1和HL-60细胞，细胞数约10000左右/孔，2天后观察细胞状态，良好的情况下，每种培养细胞均分别依以下组别进行加药：

对照组(control)：添加有谷氨酰胺的普通培养基(例如RPMI-1640培养基)；

实验组：添加有谷氨酰胺的普通培养基(例如RPMI-1640培养基)中加入10μmol/mlHB-2、HB-3、HB-7、HB-19、HB-25、HB-31、HB-33、HB-46，DMF作为阳性对照。

加药时先将药物与培养基均匀混合再加入到各组实验细胞中，加药开始记为第0天，96小时(第4天)对3D胶中的细胞进行凋亡检测。

2、实验结果

各组别的统计结果见图1，结果显示，所有实验组(包括阳性对照DMF)的药物均可均不同程度诱导实体瘤及白血病细胞凋亡，与对照组相比具有显著差异，其中，HB-2为代表的多数抑制剂诱导实体瘤及白血病细胞凋亡的效果更加突出，且显著优于阳性对照DMF。

实施例2：小分子抑制剂HB-2及其结构类似物对实体瘤和白血病体内生长的抑制。

1.实验步骤

(1)A375荷瘤小鼠的构建：NON-SCID小鼠皮下接种1×10⁵个A375细胞，待瘤体成长至5mm x 5mm时，将荷瘤小鼠等数量随机分成10组，每组7只，给予荷瘤小鼠以下不同治疗方式：

对照组(control)：灌胃给予PBS；

阳性对照组：灌胃给予DMF(10mg/kg)，每两天1次。

实验组(8组)：每组分别灌胃给予HB-2、HB-3、HB-7、HB-19、HB-25、HB-31、HB-33、HB-46，10mg/kg体重，每两天给药一次；

第21天将小鼠处死后，剥离皮下肿瘤，称取并统计各组瘤重。

(2)A549荷瘤小鼠的构建：NON-SCID小鼠皮下接种1×10⁵个A549细胞，待瘤体成长至5mm x 5mm时，将荷瘤小鼠等数量随机分成10组，每组7只，给予荷瘤小鼠以下不同治疗方式：

对照组(control)：灌胃给予PBS；

阳性对照组：灌胃给予DMF(10mg/kg体重)，每两天1次。

实验组(8组)：灌胃给予HB-2、HB-3、HB-7、HB-19、HB-25、HB-31、HB-33、HB-46，10mg/kg体重，每两天给药一次；

第28天将鼠处死后，剥离皮下肿瘤，称取并统计各组瘤重。

(3)HepG2荷瘤小鼠的构建：NON-SCID小鼠皮下接种2×10⁶个HepG2细胞，待瘤体成长至5mm x 5mm时，将荷瘤小鼠等数量随机分成10组，每组7只，给予荷瘤小鼠以下不同治疗方式：

对照组(control)：灌胃给予PBS；

阳性对照组：灌胃给予DMF(10mg/kg体重)，每两天1次。

实验组(8组)：每组灌胃给予HB-2、HB-3、HB-7、HB-19、HB-25、HB-31、HB-33、HB-46，10mg/kg体重，每两天给药一次；

第42天将小鼠处死后，剥离皮下肿瘤，称取并统计各组瘤重。

(4)MCF-7荷瘤小鼠的构建：NON-SCID小鼠皮下接种2×10⁶个MCF-7细胞，待瘤体成长至5mm x 5mm时，将荷瘤小鼠等数量随机分成10组，每组7只，给予荷瘤小鼠以下不同治疗方式：

对照组(control)：灌胃给予PBS；

阳性对照组：灌胃给予DMF(10mg/kg体重)，每两天1次。

实验组(8组)：灌胃给予HB-2、HB-3、HB-7、HB-19、HB-25、HB-31、HB-33、HB-46，10mg/kg体重，每两天给药一次；

第56天将小鼠处死后，剥离皮下肿瘤，称取并统计各组瘤重。

(5)PANC-1荷瘤小鼠的构建：NON-SCID小鼠小鼠皮下接种5×10⁶个PANC-1细胞，待瘤体成长至3mm x 3mm时，将荷瘤小鼠等数量随机分成10组，每组7只，给予荷瘤小鼠以下不同治疗方式：

对照组(control)：灌胃给予PBS；

阳性对照组：灌胃给予DMF(10mg/kg体重)，每两天1次。

实验组(8组)：灌胃给予HB-2、HB-3、HB-7、HB-19、HB-25、HB-31、HB-33、HB-46，10mg/kg体重，每两天给药一次；

第56天将小鼠处死后，剥离皮下肿瘤，称取并统计各组瘤重。

(6)HL-60白血病小鼠模型的构建：NON-SCID小鼠尾静脉注射1×10⁶个荧光素酶标记的HL-60细胞，将小鼠等数量随机分成10组，每组7只，7天后，给予小鼠以下不同治疗方式：

对照组(control)：灌胃给予PBS；

阳性对照组：灌胃给予DMF(10mg/kg体重)，每两天1次。

实验组(8组)：灌胃给予HB-2、HB-3、HB-7、HB-19、HB-25、HB-31、HB-33、HB-46，10mg/kg体重，每两天给药一次；

第42天，将小鼠麻醉后利用小动物活体成像系统检测并统计白血病细胞体内分布情况。

2.实验结果

各组荷瘤小鼠肿瘤生长情况统计结果显示于图2中A-F。

可以看出，同对照组相比，所有HB单药和DMF单药均可不同程度延缓和抑制实体瘤A375、A549、HepG2、MCF-7、PANC-1及白血病细胞HL-60的生长，但相比DMF，HB-2效果更加显著。

可以证明，本发明所述小分子抑制剂HB均有不同程度对实体瘤及白血病细胞体内生长的抑制作用，有效抑制其恶性生长。

第二部分：小分子抑制剂HB-2和IFNβ对实体瘤和白血病的作用检测

实施例3：IFN-β与HB-2联用显著诱导3D培养条件下的实体瘤细胞和白血病细胞凋亡。

1、实验步骤

将实体瘤细胞A375、A549、HepG2、MCF-7、PANC-1和白血病细胞HL-60分别进行3D胶培养(24孔板，细胞密度为8000/孔)，第二天观察细胞状态，细胞存活状态良好的情况下，分别按以下分组进行加药处理：

对照组1(control)：普通培养基和药物溶剂；

对照组2(IFNβ)：普通培养基加入6ng/ml鼠用或10ng/ml人用IFNβ；

实验组3(HB-2)：普通培养基加入10μmol/ml的HB-2；

实验组4(IFNβ+DMF)：普通培养基加入6ng/ml鼠用或10ng/ml人用IFNβ和20μmol/mlμM的DMF；

实验组5(IFNβ+HB-2)：普通培养基加入6ng/ml鼠用或10ng/ml人用IFNβ和10μmol/ml的HB-2；

加药时需先将药物与培养基均匀混合再加入到各组实验细胞中，培养48小时，采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。

注：实验中使用“鼠用IFNβ”或“人用IFNβ”根据所培育肿瘤细胞的属性确定，以下实施例均相同。

2、实验结果

将各组细胞凋亡率结果以对照方式显示于图3中A-F。

可以看到，IFNβ和HB-2单用对3D胶培养下的实体瘤细胞的杀伤具有一定效果，但IFNβ与小分子抑制剂联用相比使用单药可显著提高对实体瘤细胞的杀伤能力，而IFNβ与HB-2联用时对肿瘤的杀伤效果更是显著高于IFNβ单用、HB-2单用和IFNβ与DMF联用。

实施例4：联合应用IFN-β和HB-2能抑制实体瘤荷瘤小鼠肿瘤生长，延长荷瘤小鼠生存期。

2、联合应用IFN-β和HB-2对C57BL/C小鼠肿瘤的治疗实验

1)实验步骤

构建荷瘤小鼠：B16黑色素瘤细胞接种于4-6周龄C57BL/C小鼠(接种量为1×10⁵个细胞)，将35只小鼠随机分为5组，小鼠体重为20g左右，7天左右即可观察到肿瘤生成；待瘤体成长至5mm x 5mm时，依组别给予荷瘤小鼠以下不同治疗方式：

对照组1(control)：仅瘤内注射PBS；

实验组2(IFN-β)：IFN-β单独处理荷瘤小鼠，每只小鼠瘤内注射1×10⁵U的IFN-β，每两天注射一次，共注射10天；

实验组3(IFN-β/DMF)：小鼠分别给予IFN-β和DMF(即联合应用IFN-β和DMF)，给药方式同实验组4，DMF的给药量也与HB-2相同。

实验组4(HB-2)：HB-2单独处理荷瘤小鼠，HB-2用量为每两天按照5mg/kg小鼠体重给药，方式为瘤内注射，共注射10天；

实验组5(IFN-β+HB-2)：小鼠分别给予IFN-β和HB-2，IFN-β给药方式为：瘤内给药1×10⁵U的IFN-β，每两天瘤内注射一次，共注射10天；HB-2给药方式为：每两天瘤内注射给药HB-2(药量为5mg/kg小鼠体重)，共给药10天；IFN-β和HB-2的给药顺序没有限制，每次可同时给药或依序连续给药；

第28天处死小鼠后取肿瘤称重。

2)实验结果

各组小鼠的瘤体情况情况见图4：

可以看到，同对照组相比，虽然实验组的治疗对于抑制黑色素瘤生长具有较明显的优势，但IFN-β联用DMF和IFN-β联用HB-2则表现出可更显著抑制黑色素瘤肿瘤生长，而HB-2表现出比DMF更好的效果。

第三部分：小分子抑制剂HB-2对CD8⁺T细胞PD-1表达的影响

实施例5：HB-2能降低小鼠CD8⁺T细胞PD-1的表达，增强T细胞的杀伤功能。

1、检测HB-2对激活的小鼠CD8+T细胞PD-1表达的影响

1)实验步骤

磁珠分选获得小鼠脾脏CD8+T细胞，种于U型底96孔板(10万/孔)，同时加入抗CD3/CD28磁珠激活T细胞，培养基为RPMI-1640加10ng/mL小鼠IL-2和50nMβ巯基乙醇。激活的T细胞按以下分组加药：

对照组1(PBS)：培养基中加PBS；

实验组2(Kyn)：培养基中加入Kyn 200μmol/ml；

实验组3(Kyn+DMF)：培养基中同时加入Kyn 200μmol/ml和DMF 10μmol/ml；

实验组4(Kyn+HB-2)：培养基中同时加入Kyn 200μmol/ml和HB-2 10μmol/ml；

加药后培养48小时，采用流式细胞术检测每组T细胞的PD-1表达水平。

2)实验结果

各组检测T细胞PD-1表达水平结果统计示于图5，图中从左至右柱形图依序为对照组1(PBS)、实验组2(Kyn)、实验组3(Kyn+DMF)和实验组4(Kyn+HB-2)的统计结果。

可以看出，HB-2比DMF能更有效地抑制Kyn(犬尿氨酸，kynurenine)介导的CD8+T细胞PD-1上调，且结果具有显著性差异，说明HB-2比DMF能更有效地抑制小分子受体。

实施例6：HB-2联合特异性CD8+T细胞过继治疗小鼠实体肿瘤的效果显著。

1、实验步骤

构建荷瘤小鼠：OVA-B16黑色素瘤细胞接种于4-6周C57BL/6小鼠(接种量为1×10⁵个细胞)，将小鼠随机分为7组，每组5只，小鼠体重为20g左右，7天左右即可观察到肿瘤生成；待瘤体成长至5mm x 5mm时，依组别给予荷瘤小鼠以下不同治疗方式：

对照组1(PBS)：仅瘤内注射PBS；

实验组2(CD8+T)：OT-1小鼠CD8+T细胞静脉过继荷瘤小鼠，5天一次，共3次，每次过继4x 10⁶CD8+T细胞；

实验组3(DMF)：DMF单药瘤内注射荷瘤小鼠，每两天一次，共10次，每次用量为5mg/kg荷瘤小鼠体重；

实验组4(HB-2)：HB-2单药瘤内注射荷瘤小鼠，每两天一次，共10次，每次用量为5mg/kg荷瘤小鼠体重；

实验组5(CD8+T+DMF)：OT-1小鼠CD8+T细胞静脉过继联合DMF瘤内注射，方法和剂量同实验组2和3，过继和给药操作各自遵循设定的给药周期；

实验组6(CD8+T+HB-2)：OT-1小鼠CD8+T细胞静脉过继联合HB-2瘤内注射，方法和剂量同实验组2和4，过继和给药操作各自遵循设定的给药周期；

给药实验开始每日测量瘤体尺寸，计算肿瘤体积变化。

2、实验结果

各组实验小鼠的瘤体变化统计结果示于图6。

可以看出，单纯CD8+T细胞过继或HB-2单药对于荷瘤小鼠的实体肿瘤都有一定的治疗效果，但是CD8+T细胞过继联合小分子抑制剂治疗效果相对较好，更突出的是CD8+T细胞过继联合HB-2疗效显著优于CD8+T细胞过继联合DMF。

可以说明HB-2比DMF能更有效地抑制CD8+T细胞小分子受体，下调其PD-1抑制性受体表达，增强CD8+T细胞体内杀伤功能。

以上仅是申请人大量研究中的部分实验结果，但已经可以说明：

本发明的小分子抑制剂(例如实验中使用的HB-2及其结构类似物)单独使用可有效抑制实体瘤和白血病的恶性生长；

当联合使用小分子抑制剂HB(例如HB-2等)和IFNβ时，可在大幅降低单药使用剂量的前提下取得更优治疗效果，这提示着小分子抑制剂HB协同IFNβ不仅可以降低有效治疗使用剂量，而且显著增强疗效，临床使用可以达到增强杀伤效果及延缓瘤体生长。

本发明的小分子抑制剂(例如实验中使用的HB-2及其结构类似物)与DMF相比较，能更显著地降低CD8+T细胞PD-1的表达，更加抑制Kyn介导的PD-1上调，增强特异性CD8+T细胞对相应肿瘤细胞的杀伤。

Claims (19)

1.一种醌式查尔酮化合物在制备治疗肿瘤疾病药物中的应用，所述醌式查尔酮化合物具有如下式Ⅰ结构：

该式Ⅰ中，R代表连接在B环上的1-4个取代基，可以是独立地选自：氢、羟基、巯基、甲氧基、氨基、硝基、卤素、氰基、甲磺酸基或甲酸基。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述醌式查尔酮化合物包括：

2-肉桂酰基-3,5-二羟基-6,6-二异戊烯基环己-2,4-二烯酮；

2-(4-氯肉桂酰基)-3,5-二羟基-6,6-二异戊烯基环己-2,4-二烯酮；

2-(4-甲氧基肉桂酰基)-3,5-二羟基-6,6-二异戊烯基环己-2,4-二烯酮；

2-(4-羟基肉桂酰基)-3,5-二羟基-6,6-二异戊烯基环己-2,4-二烯酮；

2-(4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基)-3,5-二羟基-6,6-二异戊烯基环己-2,4-二烯酮；

2-(3,4,5-三甲氧基肉桂酰基)-3,5-二羟基-6,6-二异戊烯基环己-2,4-二烯酮；

2-(4-溴肉桂酰基)-3,5-二羟基-6,6-二异戊烯基环己-2,4-二烯酮；

2-(4-氟肉桂酰基)-3,5-二羟基-6,6-二异戊烯基环己-2,4-二烯酮。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述肿瘤疾病包括恶性黑色素瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、脑瘤或白血病。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其中，所述治疗肿瘤疾病药物包括注射剂型和口服剂型。

5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其中，所述治疗肿瘤疾病药物为单位制剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述单位制剂的药物中包含1-5毫克作为活性成分的所述醌式查尔酮化合物。

7.根据权利要1或2所述的应用，其中，所述治疗肿瘤疾病药物为包括干扰素与所述醌式查尔酮化合物的制剂组合。

8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述治疗肿瘤疾病药物为单位制剂。

9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述单位制剂的药物中包含1-5毫克作为活性成分的所述醌式查尔酮化合物和肿瘤治疗有效量的干扰素。

10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述单位制剂的药物中包含1×10⁷～4×10⁷U的干扰素。

11.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其中，所述治疗肿瘤疾病药物为包括临床抗肿瘤药物与所述醌式查尔酮化合物的制剂组合。

12.根据权利要求11所述的应用，其中，所述临床抗肿瘤药物包括抗肿瘤疫苗或化疗药物。

13.一种抗肿瘤药物的制剂组合，其中的治疗活性成分包括干扰素和权利要求1或2中记载的醌式查尔酮化合物。

14.根据权利要求13所述的制剂组合，其中，所述药剂组合为单位制剂。

15.根据权利要求14所述的制剂组合，其中，所述单位制剂中包含1-5毫克作为活性成分的所述醌式查尔酮化合物和肿瘤治疗有效量的干扰素。

16.根据权利要求15所述的制剂组合，其中，所述单位制剂中包含1×10⁷～4×10⁷U的干扰素。

17.根据权利要求13-16所述的制剂组合，所述干扰素选自干扰素β或干扰素γ。

18.一种抗肿瘤药物的制剂组合，其中的治疗活性成分包括权利要求1或2所述醌式查尔酮化合物和临床抗肿瘤药物。

19.根据权利要求18所述的制剂组合，其中，所述临床抗肿瘤药物包括抗肿瘤疫苗或化疗药物。