CN109890983A - 用于评估免疫应答的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了可用于评估样品的肿瘤免疫应答谱的基因表达的方法和组合物。特别地，提供了靶特异性引物组，其允许选择性扩增样品中的免疫应答靶序列。一方面，本发明涉及靶特异性引物，其可用于选择性扩增与免疫应答相关的一种或多种靶序列。在一些方面，使用所公开的方法获得的扩增的靶序列和组合物可以用于各种过程，包括核酸测序，并用于检测与免疫应答相关的一种或多种靶序列的遗传变体和/或表达水平的存在。

Description

用于评估免疫应答的组合物和方法

相关申请

本申请要求2016年9月23日提交的美国临时申请62/398,756和2016年11月8日提交的美国临时申请62/419,091的优先权和权益。每个前述申请的内容通过引用完整并入本文。

序列表

本申请在此以引用的方式并入与此同时提交的电子序列表材料。电子序列表中的材料以创建于2017年9月22日的标题为“LT01193_ST25.txt”的文本(.txt)文件提交，且通过引用完整并入本文。

背景技术

癌症免疫疗法的进展已经开始在肿瘤学中提供有希望的结果。与常规或靶向治疗相比，免疫检查点抑制剂、癌症疫苗和T细胞疗法在响应性群体中显示出可持续的结果。然而，有效识别响应候选者和/或监测响应已证明具有挑战性。急需更好地了解肿瘤微环境、肿瘤-淋巴细胞相互作用和药物反应生物标志物。特别地，例如，虽然已经报道PD-L1的存在是预测对抗PD-L1疗法的阳性反应的有希望的标志物，但是使用免疫组织化学来测量PD-L1蛋白水平的当前方法是低效且高度可变的。更高吞吐量、系统化和标准化的解决方案是更理想的替代方案。

发明内容

在本发明的一个方面，提供用于单流多重确定样品中的免疫应答的组合物。在一些实施方案中，所述组合物由多个引物对试剂组成，所述引物对试剂针对多个靶序列以测量样品中靶标的表达水平。提供的组合物靶向免疫应答基因和持家基因序列，其中多个免疫应答靶基因序列选自以下功能中的靶：检查点途径、T细胞相关信号传导途径、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的标志物、肿瘤标志物和持家基因。在一些实施方案中，所述多个免疫应答靶基因选自以下的靶：免疫检查点途径和靶标；T细胞和B细胞信号传导基因、淋巴细胞亚群标志物、干扰素信号传导基因、细胞因子信号传导基因；肿瘤标志物、肿瘤抗原和增殖标志物。在特定实施方案中，提供的组合物包括选自表2的多种引物对试剂。在一些实施方案中，提供了包含本发明组合物的多重测定。在一些实施方案中，提供了包含本发明组合物的测试试剂盒。

在本发明的另一方面，提供了用于确定生物样品中的免疫应答活性的方法。此类方法包括从含有靶序列的生物样品中进行多个靶表达序列的多重扩增。扩增包括在扩增条件下在聚合酶存在下使用多个靶特异性引物对接触包含多个目标靶序列的至少一部分样品，以产生多个扩增的靶表达序列。该方法还包括检测多个靶免疫应答序列中的每一个的表达水平，其中与对照样品相比，一种或多种靶免疫应答标志物的表达水平的变化确定了样品中免疫应答活性的变化。本文描述的方法使用本文提供的本发明的组合物。

附图说明

并入到说明书中且形成说明书的一部分的随附图式说明一个或多个示例性实施例且用以解释各个示例性实施例的原理。图式仅是示例性和解释性的，且不应理解为以任何方式限制或约束。

图1描绘了免疫应答研究测定的示例性可重复性结果。免疫应答测定在NSCLC、黑色素瘤和正常肝组织的FFPE研究样品的重复之间产生的相关性大于0.98。

图2A-2C描绘了免疫应答测定确定检测限度和动态范围的示例性结果：图2A描绘单独地测量的HL-60和人肺总RNA的样品的比率，以及在4种不同的比率下混合以评估动态范围；图2B描绘了纯的和混合的样品之间倍数变化的相关性的示例性结果；以及图2C描绘了在纯的和混合的样品之间的倍数变化的等级序列(rank order)的相关性的示例性结果。

图3描绘了定量RT-PCR检测与本发明的免疫应答NGS测定之间的相关性的示例性结果。选择了22个基因，并在NSCLC和黑色素瘤FFPE样品中通过定量RT-PCR进行了测试。结果表明定量RT-PCR和NGS之间的相关性为0.85至0.95。

图4描绘了新鲜冷冻和FFPE样品之间的相关性的示例性结果。NSCLC新鲜冷冻和FFPE样品显示大于0.96的相关性。

图5A-5D描绘了免疫应答测定的示例性结果。图5A是基因表达分布图；图5B是描述持家基因表达的条形图；图5C是样品相关性热图；图5D描绘了测试样品的两个主成分分析的结果。

图6描绘了免疫应答测定的样品相关性的示例性结果。

图7描绘了免疫应答测定的所有靶标的示例性热图结果。

图8描绘了应用来测量基因表达和计算倍数变化的模拟CPM归一化的结果。使用内源性对照准确估计倍数变化，因为虽然大多数基因在样品之间不变，但倍数变化估计可忽略不计；然而，当许多基因发生变化时，倍数变化估计非常不准确。

图9A-B描绘了表明持家基因控制允许更好的表达估计的结果。图9A描绘了各种基因中估计和真实表达的相关性的结果，包括仅由与白细胞抑制类别相关的5种基因进行的测定。假设只对白细胞抑制试验感兴趣，并且只使用那些基因，我们与真实表达没有获得高度相关性；添加白细胞迁移仅轻度有帮助(21个基因)；添加干性和肿瘤标志物(不相关的类别；27个基因)增加了相关性。然而，仅使用靶标和11个持家(HK)基因与包含非信息基因和真实表达一样有效。图9B描绘了比较HK归一化、CPM和没有持家基因的CPM的性能的结果，证明持家归一化随着表达降低而增加与真实表达的相关性。

具体实施方式

各种示例性实施方案的以下描述仅是示例性和说明性的，不应以任何方式解释为限制或限制性的。根据说明书和附图以及权利要求，本教导的其他实施方案、特征、目的和优点将显而易见。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解相同的含义。

如本文所用，术语“包含(comprises/comprising)”、“包括(includes/including)”、“具有(has/having)”或其任何其它变化形式打算涵盖非排它性的包括。举例来说，包含一列特征的工艺、方法、物件或设备不一定仅限于那些特征，而是可包括没有明确列出或这类工艺、方法、物件或设备所固有的其它特征。另外，除非明确相反地陈述，否则“或”是指包括性的或而不是排它性的或。

如本文中所使用，“扩增”或“扩增反应”和其派生词指用于将核酸分子(称为模板核酸分子)的至少一部分复写或复制到至少一个其它核酸分子中的任何作用或过程。其它核酸分子任选地包括与模板核酸分子的至少某一部分实质上一致或大体上互补的序列。模板核酸分子可以是单链或双链并且另一个核酸分子可以独立地是单链或双链。在一些实施方案中，扩增包括模板依赖性活体外酶催化反应，其用于制备核酸分子的至少某一部分的至少一个拷贝或制备与核酸分子的至少某一部分互补的核酸序列的至少一个拷贝。扩增任选地包括核酸分子的线性或指数复制。在一些实施方案中，使用等温条件进行这类扩增；在其它实施方案中，这类扩增可包括热循环。在一些实施方案中，扩增是多元扩增，其包括在单次扩增反应中同时扩增多个靶序列。至少一些靶序列可单次扩增反应中所包括的相同核酸分子或不同靶核酸分子上。在一些实施方案中，“扩增”包括单独或呈组合形式的基于DNA和RNA的核酸的至少某一部分的扩增。扩增反应可包括单链或双链核酸底物并且可进一步包括所属领域的一般技术人员已知的扩增方法中的任一种。在一些实施方案中，扩增反应包括聚合酶链反应(PCR)。

如本文中所使用，“扩增条件”和其派生词指适用于扩增一个或多个核酸序列的条件。这类扩增可以是线性或指数的。在一些实施方案中，扩增条件可包括等温条件或可包括热循环条件，或等温和热循环条件的组合。在一些实施方案中，适用于扩增一个或多个核酸序列的条件包括聚合酶链反应(PCR)条件。通常，扩增条件指足以扩增核酸(如一个或多个靶序列)或扩增接合到一个或多个衔接子的经扩增的靶序列(例如衔接子接合的经扩增的靶序列)的反应混合物。扩增条件包括用于扩增或用于核酸合成的催化剂，例如聚合酶；与待扩增的核酸具有一定程度的互补性的引物；以及核苷酸，诸如脱氧核糖核苷酸三磷酸酯(dNTP)，以促进与核酸杂交之后引物的延伸。扩增条件需要引物与核酸的杂交或粘接，引物的延伸和变性步骤，其中经延伸的引物与经历扩增的核酸序列分离。通常但未必，扩增条件可包括热循环，在一些实施方案中，扩增条件包括多个循环，其中重复粘接、延伸和分离步骤。通常，扩增条件包括阳离子，如Mg⁺⁺或Mn⁺⁺(例如MgCl₂等)，并且还可以包括多种离子强度调节剂。

如本文中所使用，“靶序列”或“目标靶序列”和其派生词指可根据本发明扩增或合成的任何单链或双链核酸序列，包括怀疑或预期样品中存在的任何核酸序列。在一些实施方案中，在添加靶特异性引物或附接衔接子之前，靶序列以双链形式存在并且包括待扩增或合成的具体核苷酸序列的至少一部分或其补体。靶序列可包括可与适用于扩增或合成反应的引物在聚合酶延伸之前杂交的核酸。在一些实施方案中，所述术语指核酸序列。其序列一致性、核苷酸的次序或位置由本发明的方法中的一种或多种测定。

如本文中所定义，“样品”和其派生词以其最广泛含义使用并且包括任何怀疑包括目标的样品、培养物等。在一些实施方案中，样品包含cDNA、RNA、PNA、LNA、嵌合、杂交或多重形式的核酸。样品可包括任何含有一个或多个核酸的基于生物、临床、手术、农业、大气压或水生的样品。所述术语还包括任何经分离的核酸样品，例如表达RNA、新鲜冷冻或福尔马林(formalin)固定的石蜡包埋的核酸样品。

如本文中所使用，当关于两种或更多种组分使用时，“接触”和其派生词是指用于促进或实现参考组分的接近、靠近、混合物或共混而未必需要这类组分的物理接触的任何过程，并且包括含有所述参考组分中的任一种或多种的溶液的彼此混合。所提及的组分可以任何具体顺序或组合接触并且组分引述的具体顺序不具限制性。例如，“使A与B和C接触”包括其中A首先与B然后与C接触的实施方案，以及其中C与A然后与B接触的实施方案，以及其中A和C的混合物与B接触的实施方案，等等。此外，这种接触不一定要求接触过程的最终结果是包括所有提及组分的混合物，只要在接触过程中的某些时间点，所有提及组分同时存在或同时包含在同一混合物或溶液中。当待接触的一个或多个提及组分包括多个(例如，“使靶序列与多个靶特异性引物和聚合酶接触”)时，所述多个中的每个成员可以被视为接触过程的单个组分，使得接触可以包括多个中的任何一个或多个成员与多个中的任何其他成员和/或与任何其他提及组分以任何顺序或组合接触(例如，多个靶特异性引物中的一些但不是全部可以接触靶序列，然后是聚合酶，然后与多个靶特异性引物的其他成员接触)。

如本文中所使用，术语“引物”和其派生物指可与相关靶序列杂交的任何多核苷酸。在一些实施方案中，引物也可以用于激活核酸合成。典型地，引物充当底物，其上可由聚合酶聚合核苷酸；然而，在一些实施方案中，引物可变得并入合成的核酸链中并且提供另一引物可杂交的位点以激活与所合成的核酸分子互补的新股的合成。引物可包含核苷酸或其类似物的任何组合，其可任选地连接以形成任何适合长度的线形聚合物。在一些实施方案中，引物是单链寡核苷酸或多核苷酸。(在本发明中，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换地使用并且未必指示两个核苷酸之间长度的任何差异)。在一些实施方案中，引物是单链，但其也可以是双链。引物任选地天然产生，如在纯化的限制消化中，或可以合成方式产生。在一些实施方案中，当暴露于扩增或合成条件时，引物充当用于扩增或合成的起始点；这类扩增或合成可以模板依赖性方式进行并且任选地形成与至少一部分靶序列互补的引物延伸产物。例示性扩增或合成条件可包括使引物与多核苷酸模板(例如包括靶序列的模板)、核苷酸和诱导剂(如聚合酶)在适合的温度和pH值下接触，以诱导靶特异性引物的末端上核苷酸的聚合。如果是双链，在用于制备引物延伸产物之前，引物可任选地经处理以分离其各股。在一些实施方案中，引物是寡脱氧核苷酸或寡核糖核苷酸。在一些实施方案中，引物可包括一个或多个核苷酸类似物。靶特异性引物的确切长度和/或组成(包括序列)可影响许多特性，包括熔融温度(Tm)、GC含量、次要结构的形成、重复核苷酸主结构、所预测的引物延伸产物的长度、跨越相关核酸分子的覆盖度的程度、单次扩增或合成反应中的引物数目、引物内是否存在核苷酸类似物或经修饰的核苷酸等。在一些实施方案中，引物可在扩增或合成反应内与相容的引物配对以形成由正向引物和反向引物组成的引物对。在一些实施方案中，引物对的正向引物包括基本上与核酸分子的一个股的至少一部分互补的序列，并且引物对中引物的反向引物包括基本上与所述股线的至少一部分一致的序列。在一些实施方案中，正向引物和反向引物能够与核酸双螺旋的相对股杂交。任选地，正向引物激活第一核酸链的合成，并且反向引物激活第二核酸链的合成，其中第一和第二股基本上彼此互补，或可杂交以形成双链核酸分子。在一些实施方案中，扩增或合成产物的一端由正向引物定义并且扩增或合成产物的另一端由反向引物定义。在一些实施方案中，当需要扩增或合成冗长引物延伸产物(如扩增外显子、编码区或基因)时，可产生若干引物对而非跨越所需长度以实现所述区域的足够扩增。在一些实施方案中，引物可包括一个或多个可裂解基团。在一些实施方案中，引物长度在约10到约60个核苷酸、约12到约50个核苷酸和约15到约40个核苷酸长度范围内。典型地，当在存在dNTP和聚合酶的情况下暴露于扩增条件时，引物能够与相应的靶序列杂交并且进行引物延伸。在一些情况下，具体核苷酸序列或引物的一部分在扩增反应开始时已知或可通过本文所披露的方法中的一种或多种测定。在一些实施方案中，引物在引物内的一个或多个位置包括一个或多个可裂解基团。

如本文中所使用，“靶特异性引物”和其派生物指单链或双链多核苷酸，通常是寡核苷酸，其包括至少一个与包括靶序列的核酸分子的至少一部分至少50％互补，通常至少75％互补或至少85％互补，更通常至少90％互补，更通常至少95％互补，更通常至少98％或至少99％互补或一致的序列。在这类情况下，靶特异性引物和靶序列描述成彼此“相应”。在一些实施方案中，靶特异性引物能够与其相应靶序列的至少一部分(或靶序列的补体)杂交；这类杂交可任选地在标准杂交条件下或在严格杂交条件下进行。在一些实施方案中，靶特异性引物不能与靶序列或其补体杂交，但能够与包括靶序列的核酸链的一部分或其补体杂交。在一些实施方案中，靶特异性引物包括至少一个与靶序列本身的至少一部分至少75％互补，通常至少85％互补，更通常至少90％互补，更通常至少95％互补，更通常至少98％互补或更通常至少99％互补的序列；在其它实施例中，靶特异性引物包括至少一个与除靶序列以外的核酸分子的至少一部分至少75％互补，通常至少85％互补，更通常至少90％互补，更通常至少95％互补，更通常至少98％互补或更通常至少99％互补的序列。在一些实施方案中，靶特异性引物基本上不与样品中的其它靶序列互补；任选地，靶特异性引物基本上不与样品中的其它核酸分子互补。在一些实施方案中，样品中不包括或对应于靶序列(或靶序列的补体)的核酸分子称为“非特异性”序列或“非特异性核酸”。在一些实施方案中，靶特异性引物经设计以包括基本上与其相应靶序列的至少一部分互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，靶特异性引物与包括其相应靶序列的核酸分子的至少一部分至少95％互补或至少99％互补或一致(跨越其全部长度)。在一些实施方案中，靶特异性引物可与其相应靶序列的至少一部分至少90％、至少95％互补、至少98％互补或至少99％互补或一致(跨越其全部长度)。在一些实施方案中，正向靶特异性引物和反向靶特异性引物定义靶特异性引物对，其可用于经由模板依赖性引物延伸来扩增靶序列。通常，靶特异性引物对中的每个引物包括至少一个与包括相应靶序列的核酸分子的至少一部分基本上互补，但与样品中的至少一个其它靶序列小于50％互补的序列。在一些实施方案中，扩增可在单次扩增反应中使用多个靶特异性引物对进行，其中每个引物对包括正向靶特异性引物和反向靶特异性引物，各自包括至少一个与样品中的相应靶序列基本上互补或基本上一致的序列，并且每个引物对具有不同的相应靶序列。在一些实施方案中，靶特异性引物可在其3'端或其5'端与扩增反应中的任何其它靶特异性引物是基本上非互补性。在一些实施方案中，靶特异性引物可包括扩增反应中与其它靶特异性引物的最小交叉杂交。在一些实施方案中，靶特异性引物包括与扩增反应混合物中非特异性序列的最小交叉杂交。在一些实施方案中，靶特异性引物包括最小自身互补性。在一些实施方案中，靶特异性引物可包括位于3'端的一个或多个可裂解基团。在一些实施方案中，靶特异性引物可包括位于靶特异性引物的中心核苷酸附近或周围的一个或多个可裂解基团。在一些实施方案中，更多个靶特异性引物中的一个仅包括靶特异性引物的5'端处的非可裂解核苷酸。在一些实施方案中，任选地在相同扩增反应中，与一个或多个不同靶特异性引物相比，靶特异性引物包括引物的3'端或5'端处的最小核苷酸序列重叠。在一些实施方案中，单一反应混合物中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种靶特异性引物包括以上实施例中的一个或多个。在一些实施方案中，单一反应混合物中基本上所有的多种靶特异性引物包括以上实施例中的一个或多个。

如本文中使用，“聚合酶”和其派生词指可催化核苷酸(包括其类似物)聚合成核酸链的任何酶。典型地但未必，这类核苷酸聚合可以模板依赖性方式进行。这类聚合酶可以包括(但不限于)天然存在的聚合酶和其任何子单元和截断、突变聚合酶、变异聚合酶、重组、融合或以其它方式工程改造的聚合酶、经化学修饰的聚合酶、合成分子或组件以及保留催化这类聚合的能力的任何类似物、衍生物或其片段。任选地，聚合酶可以是包含一个或多个突变的突变型聚合酶，所述突变涉及用其它氨基酸替换一个或多个氨基酸，来自聚合酶的一个或多个氨基酸的插入或缺失或两个或更多个聚合酶的部分的连接。典型地，聚合酶包含可以进行核苷酸结合和/或核苷酸聚合催化的一个或多个活性位点。一些例示性聚合酶包括(但不限于)DNA聚合酶和RNA聚合酶。如本文中所使用，术语“聚合酶”和其变化形式也指包含至少两个彼此连接的部分的融合蛋白，其中第一部分包含可以催化核苷酸聚合成核酸链的肽并且所述第一部分连接到包含第二多肽的第二部分。在一些实施方案中，第二多肽可以包括报导子酶或增强持续合成能力的结构域。任选地，聚合酶可具有5'外切核酸酶活性或末端转移酶活性。在一些实施方案中，聚合酶可任选地再活化，例如通过使用热、化学物质或将新的量的聚合酶再添加到反应混合物中。在一些实施方案中，聚合酶可包括可任选地再活化的热起始聚合酶或基于适体的聚合酶。

如本文中使用，术语“核苷酸”和其派生词包含任何可选择性结合于聚合酶或可通过聚合酶聚合的化合物，包括(但不限于)任何天然存在的核苷酸或其类似物。典型地但未必，核苷酸与聚合酶的选择性结合后面是核苷酸通过聚合酶聚合成核酸链；然而偶尔，核苷酸可从聚合酶解离而不变得掺入到核酸链中，这是在本文中被称为“非生产性”事件的事件。这类核苷酸不仅包括天然存在的核苷酸，而且包括可以与聚合酶选择性结合或可以通过聚合酶聚合的任何类似物(与其结构无关)。虽然天然存在的核苷酸典型地包含碱基、糖和磷酸酯部分，但本发明的核苷酸可以包括不具有这类部分中的任一个、一些或全部的化合物。在一些实施方案中，核苷酸可以任选地包括包含三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个磷原子的磷原子链。在一些实施方案中，磷链可以附接到糖环的任何碳，如5’碳。磷链可以用插入的O或S连接到糖。在一个实施方案中，链中的一个或多个磷原子可以是具有P和O的磷酸基的一部分。在另一个实施例中，链中的磷原子可以用插入的O、NH、S、亚甲基、经取代的亚甲基、亚乙基、经取代的亚乙基、CNH₂、C(O)、C(CH₂)、CH₂CH₂或C(OH)CH₂R(其中R可以是4-吡啶或1-咪唑)连接在一起。在一个实施方案中，链中的磷原子可具有含O、BH₃或S的侧基。在磷链中，具有除O以外的侧基的磷原子可以是经取代的磷酸基。在磷链中，具有除O以外的插入原子的磷原子可以是经取代的磷酸基。核苷酸类似物的一些实例描述于Xu的美国专利第7,405,281号中。在一些实施方案中，核苷酸包含标记并且在本文中称为“经标记的核苷酸”；经标记的核苷酸的标记在本文中称为“核苷酸标记”。在一些实施方案中，标记可呈连接到末端磷酸基(即距离糖最远的磷酸基)的荧光染料形式。可以用于所公开的方法和组合物中的核苷酸的一些实例包括(但不限于)核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、经修饰的核糖核苷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸聚磷酸、脱氧核糖核苷酸聚磷酸、经修饰的核糖核苷酸聚磷酸、经修饰的脱氧核糖核苷酸聚磷酸、肽核苷酸、经修饰的肽核苷酸、金属核苷酸、膦酸核苷和经修饰的磷酸-糖主链核苷酸，前述化合物的类似物、衍生物或变异体等。在一些实施方案中，核苷酸可包含非氧部分(如硫基或硼烷部分)代替氧部分，所述氧部分桥连核苷酸的α磷酸酯与糖、或核苷酸的α与β磷酸酯、或核苷酸的β与γ磷酸酯、或核苷酸的任何其它两种磷酸酯之间、或其任何组合。“核苷酸5'-三磷酸”指在5'位置具有三磷酸酯基并且有时表示为“NTP”或“dNTP”和“ddNTP”以具体指出核糖的结构特征的核苷酸。三磷酸酯基可包括多个氧的硫取代，例如α-硫基-核苷酸5'-三磷酸酯。关于核酸化学的综述，参见：Shabarova,Z.和Bogdanov,A.,《核酸的高级有机化学(AdvancedOrganic Chemistry of Nucleic Acids)》,VCH,New York,1994。

如本文中所使用，当关于既定引物使用时，术语“延伸”和其派生词包含涉及一个或多个核苷酸在现有核酸分子的末端上的聚合的既定聚合酶的任何体内或体外酶促活性特征。典型地但未必，这类引物延伸以模板依赖性方式进行；在模板依赖性延伸期间，通过既定碱基配对规则进行碱基的排序和选择，所述规则可包括沃森-克里克型碱基配对规则，或(并且尤其在涉及核苷酸类似物的延伸反应的情况下)通过一些其它类型的碱基配对范例进行。在一个非限制性实例中，延伸通过聚合酶经由核酸分子的3'OH端上核苷酸的聚合进行。

如本文所用，术语“部分”及其派生词，当用于提及给定的核酸分子例如引物或模板核酸分子时，在核酸分子的长度(包括核酸分子的部分或全部长度)内包含任何数目的连续核苷酸。

如本文所用，术语“同一性”和“相同的”及其派生词，当用于提及两个或更多个核酸序列时，是指两个或更多个序列(例如，核苷酸或多肽序列)的序列相似性。在两个或更多个同源序列的背景下，序列或其子序列的百分比同一性或同源性表示相同的所有单体单元(例如，核苷酸或氨基酸)的百分比(即，约70％同一性，优选75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)。当比较并对齐以在比较窗口上进行最大对应，或者使用具有下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动对齐和目视检查测量的指定区域时，百分比同一性可以在整个指定区域上。当在氨基酸水平或核苷酸水平上具有至少85％的同一性时，序列被称为“基本相同”。优选地，同一性存在于长度为至少约25、50或100个残基的区域上，或者在至少一个比较序列的整个长度上。确定序列一致性百分比和序列相似性的典型算法的实例是BLAST算法和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人Nuc.AcidsRes.25:3389-3402(1977)。其他方法包括Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2:482(1981)和Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)等的算法。两个核酸序列基本相同的另一指示是两个分子或它们的互补序列在严格条件下彼此杂交。

如本文中所使用，术语“互补”和“补体”以及其派生词指可在反平行定向(如在杂交双螺旋中)的两个或更多个个别相应位置经历累积碱基配对的任何两个或更多个核酸序列(例如部分或全部模板核酸分子、靶序列及/或引物)。这类碱基配对可根据任何现有规则集合进行，例如根据沃森-克里克碱基配对规则(Watson-Crick base pairing rules)或根据一些其它碱基配对范例。任选地，第一与第二核酸序列之间可以存在“完全”或“总体”互补性，其中第一核酸序列中的每个核苷酸可以经历与第二核酸序列上的相应的反平行位置中的核苷酸的稳定化碱基配对相互作用。“部分”互补性描述一个核酸序列的至少20％但少于100％的残基与另一个核酸序列残基互补的核酸序列。在一些实施方案中，一个核酸序列的至少50％但少于100％的残基与另一个核酸序列中的残基互补。在一些实施方案中，一个核酸序列的至少70％、80％、90％、95％或98％但少于100％的残基与另一个核酸序列中的残基互补。当一个核酸序列的至少85％的残基与另一个核酸序列中的残基互补时，序列被称为“基本上互补”。在一些实施方案中，两个互补或基本上互补序列能够在标准或严格杂交条件下彼此杂交。“非互补”描述其中一个核酸序列的少于20％的残基与另一个核酸序列中的残基互补的核酸序列。当一个核酸序列的少于15％的残基与另一个核酸序列中的残基互补时，序列被称为“基本上非互补”。在一些实施方案中，两个非互补或基本上非互补序列无法在标准或严格杂交条件下彼此杂交。“错配”存在于不互补的两个相对核苷酸中的任何位置。互补核苷酸包括在生理条件下在DNA复制期间通过与彼此相对的DNA聚合酶有效并入的核苷酸。在典型实施方案中，在彼此位于反平行位置的核苷酸及/或多核苷酸的核碱基之间，互补核苷酸可彼此形成碱基对，如通过特异性沃森-克里克型氢键形成的A-T/U和G-C碱基对，或通过某种其它类型的碱基配对范例形成的碱基对。其它人工碱基对的互补性可以是基于其它类型的氢键和/或碱基的疏水性和/或碱基之间的形状互补性。

如本文所用，“扩增的靶序列”及其衍生物是指通过使用靶特异性引物和本文提供的方法扩增/扩增靶序列而产生的核酸序列。扩增的靶序列可以是关于靶序列相同的有义(在第二轮和随后的偶数轮扩增中产生的正链)或反义(即在第一轮和随后的奇数轮扩增期间产生的负链)。出于本公开的目的，扩增的靶序列通常与反应中另一扩增的靶序列的任何部分互补小于50％。

如本文中所使用，术语“接合”和其派生词指用于将两个或更多个分子共价连接在一起(例如使两个或更多个核酸分子彼此共价连接)的动作或方法。在一些实施方案中，接合包括核酸的相邻核苷酸之间的结合口。在一些实施方案中，接合包括形成第一核酸分子的末端与第二核酸分子的末端之间的共价键。在一些实施方案中，例如其中待接合的核酸分子包括常规核苷酸残基的实施例，接合可包括形成一个核酸的5'磷酸基与第二核酸的3'羟基之间的共价键，从而形成经接合的核酸分子。在一些实施方案中，可使用任何用于在相邻核苷酸之间使5'磷酸与3'羟基接合或结合的方法。在例示性实施方案中，可使用酶，如连接酶。出于本公开的目的，经扩增的靶序列可与衔接子接合以产生衔接子接合的经扩增的靶序列。

如本文中所使用，“连接酶”和其派生词指任何能够催化两个底物分子的接合的试剂。在一些实施方案中，连接酶包括能够催化核酸的相邻核苷酸之间的接口的接合的酶。在一些实施方案中，连接酶包括能够催化一个核酸分子的5'磷酸与另一个核酸分子的3'羟基之间形成共价键，从而形成经接合的核酸分子的酶。适合的连接酶可包括(但不限于)T4DNA连接酶、T4RNA连接酶以及大肠杆菌(E.coli)DNA连接酶。

如本文所用，“连接条件”及其衍生物是指适合于将两个分子彼此连接的条件。在一些实施方案中，连接条件适合于密封核酸之间的切口或间隙。如本文所定义，“切口”或“间隙”是指在核酸序列的内部核苷酸内缺少单核苷酸戊糖环的5'磷酸直接与相邻单核苷酸戊糖环的3'羟基结合的核酸分子。如本文所用，术语切口或间隙与本领域术语的使用一致。通常，切口或间隙可以在适当的温度和pH下在酶例如连接酶的存在下连接。在一些实施方案中，T4DNA连接酶可在约70-72℃的温度在核酸之间加入切口。

如本文中所使用，“钝端连接”和其派生词指两个钝端双链核酸分子彼此连接。“钝端”指其中核酸分子的一个股的末端中的基本上所有核苷酸与同一个核酸分子的另一个股中的相对核苷酸碱基配对的双链核酸分子的末端。如果核酸分子具有包括长度超过两个核苷酸的单链部分的末端(本文中称为“悬垂物”)，那么其不是钝端的。在一些实施方案中，核酸分子的末端不包括任何单链部分，使得末端的一个股中的每个核苷酸与同一个核酸分子的另一个股中的相对核苷酸碱基配对。在一些实施方案中，变成彼此接合的两个钝端核酸分子的末端不包括任何重叠、共有或互补序列。通常，钝端接合不包括使用其它寡核苷酸衔接子帮助双链经扩增的靶序列与双链衔接子的接合，如2010年5月27日公开的Mitra和Varley,US2010/0129874中所描述的补丁寡核苷酸。在一些实施方案中，钝端接合包括接口平移反应以密封在接合过程期间产生的接口。

如本文中所使用，术语“衔接子”或“衔接子和其补体”以及其派生词指任何可与本发明的核酸分子接合的线形寡核苷酸。任选地，衔接子包括基本上不与样品内至少一个靶序列的3'端或5'端互补的核酸序列。在一些实施方案中，衔接子基本上不与样品中任何靶序列的3'端或5'端互补。在一些实施方案中，衔接子包括任何基本上不与经扩增的靶序列互补的单链或双链线形寡核苷酸。在一些实施方案中，衔接子基本上不与样品的至少一个、一些或全部核酸分子互补。在一些实施方案中，适合的衔接子长度在约10-100个核苷酸、约12-60个核苷酸和约15-50个核苷酸长度范围内。衔接子可包括核苷酸和/或核酸的任何组合。在一些方面中，衔接子可在一个或多个位置包括一个或多个可裂解基团。在另一个方面中，衔接子可包括与引物(例如通用引物)的至少一部分基本上一致或基本上互补的序列。在一些实施方案中，衔接子可包括条码或标签以辅助下游编目、鉴别或测序。在一些实施方案中，当与经扩增的靶序列接合时，尤其在存在聚合酶和dNTP的情况下在适合的温度和pH值下，单链衔接子可充当用于扩增的底物。

如本文所用，“再扩增(reamplifying或reamplification)”及其衍生物是指通过任何合适的扩增过程进一步扩增至少一部分扩增的核酸分子的任何过程(在一些实施方案中称为“二级”扩增或“再扩增”)，从而产生再扩增的核酸分子。二级扩增不需要与产生扩增的核酸分子的原始扩增过程相同；也不需要再扩增的核酸分子与扩增的核酸分子完全相同或完全互补；所需要的只是再扩增的核酸分子包括至少一部分扩增的核酸分子或其互补物。例如，再扩增可涉及使用不同的扩增条件和/或不同的引物，包括与初级扩增不同的靶特异性引物。

如本文中所定义，“可裂解基团”指在并入核酸后可在适当条件下裂解的任何部分。举例来说，可将可裂解基团并入样品的引物、经扩增的序列、衔接子或核酸分子中。在例示性实施例中，靶特异性引物可包括可裂解基团，其变成并入经扩增的产物中并且接着在扩增之后裂解，从而从经扩增的产物移除一部分或所有靶特异性引物。可裂解基团可裂解或以其它方式通过任何可接受的手段从样品的靶特异性引物、经扩增的序列、衔接子或核酸分子移除。举例来说，可通过酶促、热学、光氧化或化学处理从样品的靶特异性引物、经扩增的序列、衔接子或核酸分子移除可裂解基团。在一个方面中，可裂解基团可包括非天然存在的核碱基。举例来说，寡脱氧核苷酸可包括一个或多个RNA核碱基，如可通过尿嘧啶糖基化酶移除的尿嘧啶。在一些实施方案中，可裂解基团可包括一个或多个经修饰的核碱基(如7-甲基鸟嘌呤、8-侧氧基-鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶或5-甲基胞嘧啶)或一个或多个经修饰的核苷(即，7-甲基鸟苷、8-侧氧基-脱氧鸟苷、黄苷、肌苷、二氢尿苷或5-甲基胞啶)。可通过酶促、化学或热学手段从核酸移除经修饰的核碱基或核苷酸。在一个实施方案中，可裂解基团可包括在暴露于紫外光(即，溴脱氧尿苷)时，可在扩增(或合成)之后从引物移除的部分。在另一实施方案中，可裂解基团可包括甲基化胞嘧啶。通常，甲基化胞嘧啶可由引物裂解，例如在诱导扩增(或合成)之后、在亚硫酸氢钠处理时。在一些实施方案中，可裂解部分可包括限制位点。举例来说，引物或靶序列可包括对一种或多种限制酶具有特异性的核酸序列，并且在扩增(或合成)之后，引物或靶序列可用一种或多种限制酶处理使得移除可裂解基团。通常，可在一个或多个位置包括一个或多个可裂解基团以及样品的靶特异性引物、经扩增的序列、衔接子或核酸分子。

如本文所用，“裂解步骤”和其派生词是指可裂解基团从样品的靶特异性引物、经扩增的序列、衔接子或核酸分子裂解或以其它方式移除的任何过程。在一些实施方案中，裂解步骤可以涉及化学、热学、光氧化或消化过程。

如本文中所使用，术语“杂交”符合其在所属领域中的用途，并且指用于使两个核酸分子经历碱基配对相互作用的方法。当一个核酸分子的任何部分与另一个核酸分子的任何部分碱基配对时，两个核酸分子分子称为杂交；未必需要两个核酸分子跨越其全部各别长度杂交并且在一些实施方案中，至少一个核酸分子可包括不与另一个核酸分子杂交的部分。短语“在严格条件下杂交”和其派生词指可在存在高杂交温度和低离子强度的条件下进行靶特异性引物与靶序列的杂交的条件。在一个例示性实施方案中，严格杂交条件包括在约60-68℃下含有约30mM硫酸镁、约300mM Tris-硫酸盐(pH 8.9)和约90mM硫酸铵的水性环境或其等效物。如本文中所使用，短语“标准杂交条件”和其派生词指可在存在低杂交温度和高离子强度的情况下进行引物与寡核苷酸(即，靶序列)的杂交的条件。在一个例示性实施方案中，标准杂交条件包括在约50-55℃下含有约100mM硫酸镁、约500mM Tris-硫酸盐(pH 8.9)和约200mM硫酸铵的水性环境或其等效物。

如本文所用，“GC含量”及其衍生物是指核酸分子的胞嘧啶和鸟嘌呤含量。本公开的靶特异性引物(或衔接子)的GC含量为85％或更低。更典型地，本公开的靶特异性引物或衔接子的GC含量为15-85％。

如本文中所使用，当关于核酸分子(例如靶序列或经扩增的靶序列)使用时，术语“末端”和其派生词可包括核酸分子的末端30个核苷酸、末端20和甚至更通常末端15个核苷酸。包含一连串相邻核苷酸的线形核酸分子通常包括至少两个末端。在一些实施方案中，核酸分子的一端可包括3’羟基或其等效物，并且可称为“3’端”和其衍生物。任选地，3'端包括未连接到单核苷酸戊糖环的5'磷酸基的3'羟基。典型地，3'端包括经定位与包括未连接的3'羟基的核苷酸相邻的一个或多个5'连接的核苷酸，通常经定位与3'羟基相邻的30个核苷酸，通常末端20个并且甚至更通常末端15个核苷酸。一个或多个连接的核苷酸可表示成寡核苷酸中存在的核苷酸的百分比，或可以与未连接的3'羟基相邻的许多连接的核苷酸形式提供。举例来说，3'端可占寡核苷酸的核苷酸长度的小于50％。在一些实施方案中，3'末端不包括任何未连接的3'羟基，但可包括任何能够充当核苷酸通过引物延伸和/或核苷酸聚合进行的连接的位点的部分。在一些实施方案中，例如当参考靶特异性引物时，术语“3'端”可包括3'端处的末端10个核苷酸、末端5个核苷酸、末端4、3、2或更少个核苷酸。在一些实施方案中，当参考靶特异性引物时，术语“3'端”可包括位于核苷酸位置10的核苷酸或更少的来自3'端的核苷酸。

如本文中所使用，“5'端”和其派生词指核酸分子(例如靶序列或经扩增的靶序列)的末端，其包括自由5'磷酸基或其等效物。在一些实施方案中，5'端包括未连接到相邻单核苷酸戊糖环的3'羟基的5'磷酸基。通常，5'端包括经定位与5'磷酸相邻的一个或多个连接的核苷酸，通常经定位与包括5'磷酸基的核苷酸相邻的30个核苷酸，通常末端20个并且甚至更通常末端15个核苷酸。一个或多个连接的核苷酸可表示成寡核苷酸中存在的核苷酸的百分比，或可以与5'磷酸相邻的许多连接的核苷酸形式提供。举例来说，5'端可小于寡核苷酸的核苷酸长度的50％。在另一个例示性实施例中，5'端可包括与包括末端5'磷酸的核苷酸相邻的约15个核苷酸。在一些实施方案中，5'端不包括任何未连接的5'磷酸基，但可包括任何能够充当与3'羟基或另一个核酸分子的3'端的连接位点的部分。在一些实施方案中，例如当参考靶特异性引物时，术语“5'端”可包括5'端处的末端10个核苷酸、末端5个核苷酸、末端4、3、2或更少个核苷酸。在一些实施方案中，当参考靶特异性引物时，术语“5'端”可包括位于核苷酸位置10的核苷酸或更少的来自5'端的核苷酸。在一些实施方案中，靶特异性引物的5'端可仅包括非可裂解核苷酸，例如不含如本文中所披露的一个或多个可裂解基团的核苷酸，或可由所属领域的一般技术人员容易地测定的可裂解核苷酸。

如本文中所使用，“DNA条码”或“DNA标记序列”和其派生词是指可充当‘用于区分或分离样品中多个经扩增的靶序列'的衔接子内的独特短(6-14个核苷酸)核酸序列。出于本发明的目的，DNA条形码或DNA标记序列可以并入衔接子的核苷酸序列中。

如本文所用，短语“两轮靶特异性杂交”或“两轮靶特异性选择”及其衍生物是指相同靶序列经历两轮连续的基于杂交的靶特异性选择的任何过程，其中靶序列与靶特异性序列杂交。每轮基于杂交的靶特异性选择可以包括针对靶特异性序列的至少一些部分的多个靶特异性杂交。在一个示例性实施方案中，一轮靶特异性选择包括涉及靶序列的第一区域的第一靶特异性杂交和涉及靶序列的第二区域的第二靶特异性杂交。第一和第二区域可以相同或不同。在一些实施方案中，每轮基于杂交的靶特异性选择可包括使用两种靶特异性寡核苷酸(例如，正向靶特异性引物和反向靶特异性引物)，使得每轮选择包括两个靶特异性杂交。

如本文所用，“可比较的最大最小解链温度”及其衍生词是指切割可切割基团后单个衔接子或靶特异性引物的每个核酸片段的解链温度(Tm)。比较由单个衔接子或靶特异性引物产生的每个核酸片段的杂交温度，以确定防止靶特异性引物或衔接子的任何核酸片段与靶序列杂交所需的最大最小温度。一旦知道最大杂交温度，就可以操作衔接子或靶特异性引物，例如通过沿着引物的长度移动可切割基团的位置，以获得相对于每个核酸片段的可比较的最大最小解链温度。

如本文所用，“仅添加”及其衍生词是指一系列步骤，其中将试剂和组分加入第一或单一反应混合物中。通常，该系列步骤不包括将反应混合物从第一容器移至第二容器以完成一系列步骤。仅添加过程不包括在含有反应混合物的容器外操作反应混合物。通常，仅添加过程适合自动化和高吞吐量。

如本文所用，“合成”及其衍生词是指涉及聚合酶的核苷酸聚合的反应，任选地以模板依赖性方式。聚合酶通过将核苷一磷酸从核苷三磷酸(NTP)、脱氧核苷三磷酸(dNTP)或双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)转移至延伸的寡核苷酸链的3'羟基来合成寡核苷酸。出于本公开的目的，合成包括通过从脱氧核苷三磷酸转移核苷一磷酸来连续延伸杂交的衔接子或靶特异性引物。

如本文所用，“聚合条件”及其衍生词是指适合于核苷酸聚合的条件。在典型的实施方案中，这种核苷酸聚合由聚合酶催化。在一些实施方案中，聚合条件包括引物延伸的条件，任选地以模板依赖性方式，导致合成的核酸序列的产生。在一些实施方案中，聚合条件包括聚合酶链反应(PCR)。通常，聚合条件包括使用足以合成核酸的反应混合物，并包括聚合酶和核苷酸。聚合条件可包括使靶特异性引物与靶序列退火和在聚合酶存在下以模板依赖性方式延伸引物的条件。在一些实施方案中，可以使用热循环实施聚合条件。另外，聚合条件可包括多个循环，其中重复退火、延伸和分离两条核酸链的步骤。通常，聚合条件包括阳离子如MgCl₂。一个或多个核苷酸的聚合以形成核酸链包括核苷酸通过磷酸二酯键彼此连接，然而，在特定核苷酸类似物的背景下，替代连接可能是可能的。

如本文所用，术语“核酸”是指天然核酸、人工核酸、其类似物或其组合，其包括多核苷酸和寡核苷酸。如本文所用，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指核苷酸的单链和双链聚合物，包括但不限于2'-脱氧核糖核苷酸(核酸)和核糖核苷酸(RNA)，其通过核苷酸间磷酸二酯键接例如3'-5'和2'-5'、反向连接例如3'-3'和5'-5'、支链结构或类似物核酸连接。多核苷酸具有相关的抗衡离子，例如H⁺、NH₄ ⁺、三烷基铵、Mg²⁺、Na⁺等。寡核苷酸可完全由脱氧核糖核苷酸、完全由核糖核苷酸或其嵌合混合物组成。寡核苷酸可由核碱基和糖类似物组成。当它们在本领域中更常被称为寡核苷酸时，多核苷酸的大小通常在几个单体单元的范围内，例如5-40，当它们在本领域中更常被称为多核苷酸时，到数千个单体核苷酸单元；然而，为了本公开的目的，寡核苷酸和多核苷酸都可以具有任何合适的长度。除非另外指出，否则每当呈现寡核苷酸序列时，都应了解，核苷酸从左到右是按5'到3'的顺序并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示胸苷，并且“U”表示脱氧尿苷。寡核苷酸被称为具有“5'末端”和“3'末端”，因为单核苷酸通常通过将5'磷酸或一个核苷酸的等同基团连接到(任选地通过磷酸二酯或其他合适的键)其相邻核苷酸的3'羟基或等同基团而反应形成寡核苷酸。

如本文所定义，术语“切口平移”及其派生词包括核酸链内的一个或多个切口或间隙易位至沿核酸链的新位置。在一些实施方案中，当双链衔接子与双链扩增的靶序列连接时，可以形成切口。在一个实例中，引物可在其5'末端包含磷酸基团，其可连接至双链扩增的靶序列，在衔接子和互补链中的扩增的靶序列之间留下切口。在一些实施方案中，切口平移导致切口移动到核酸链的3'末端。在一些实施方案中，移动切口可以包括在衔接子连接的扩增的靶序列上进行切口平移反应。在一些实施方案中，切口平移反应可以是偶联的5'至3'DNA聚合/降解反应，或偶联至5'至3'DNA聚合/链置换反应。在一些实施方案中，移动切口可包括在切口位点处进行DNA链延伸反应。在一些实施方案中，移动切口可包括在切口上进行单链外切核酸酶反应以形成衔接子连接的扩增的靶序列的单链部分，并在衔接子连接的扩增的单链靶序列上进行DNA链延伸反应至新位置。在一些实施方案中，在与连接位点相对的核酸链中形成切口。

如本文所用，术语“聚合酶链式反应”(“PCR”)是指K.B.Mullis美国专利4,683,195和4,683,202的方法，在此通过引用并入，其描述用于在不进行克隆或纯化的情况下增加基因组DNA的混合物中相关多核苷酸的片段的浓度的方法。这种用于扩增相关多核苷酸的过程由以下组成：将大量过量的两种寡核苷酸引物引入含有所需相关多核苷酸的DNA混合物，接着是在DNA聚合酶存在下热循环的精确序列。两种引物与相关双链多核苷酸的其相应股互补。为了实现扩增，使混合物变性，并且然后将引物粘接到相关多核苷酸分子内的其互补序列。在粘接之后，用聚合酶使引物延伸以形成一对新互补股。变性、引物粘接和聚合酶延伸的步骤可以重复多次(即，变性、粘接和延伸构成一个“循环”；可以存在众多“循环”)以获得所需相关多核苷酸的高浓度的扩增的片段。所需相关多核苷酸的扩增的片段(扩增子)的长度通过引物相对于彼此的相对位置测定，并且因此这一长度是可控制参数。借助于重复所述过程，所述方法被称为“聚合酶链反应”(在下文中“PCR”)。因为相关多核苷酸的所需扩增的片段变为混合物中的主要核酸序列(就浓度来说)，所以其被称为“PCR扩增的”。如本文中所定义，包括多种靶核酸分子的样品内的靶核酸分子经由PCR而扩增。在上文所论述的方法的一个改进中，靶核酸分子可以使用多种不同引物对、在一些情况下一种或多种引物对/相关标靶核酸分子而PCR扩增，由此形成多重PCR反应。使用多重PCR，有可能同时从样品扩增多种相关核酸分子以形成经扩增的靶序列。还可能通过数种不同方法(例如，用生物分析仪或qPCR定量，用经标记的探针杂交；并入生物素化的引物，接着进行抗生物素蛋白-酶结合物检测；将经³²P标记的脱氧核苷酸三磷酸酯(例如dCTP或dATP)并入到经扩增的靶序列中)检测扩增的靶序列。任何寡核苷酸序列可用适合的引物集合扩增，从而实现靶核酸分子从RNA、cDNA、福马林固定的链烷烃嵌入型DNA、细针穿刺活检(fine-needle biopsies)和多种其它来源的扩增。具体来说，由如本文中所披露的多重PCR过程产生的经扩增的靶序列本身是用于后续PCR扩增或多种下游分析或操作的有效底物。

如本文中所定义，“多重扩增”是指样品内的两种或更多种靶序列使用至少一种靶特异性引物的选择性并且非随机的扩增。在一些实施方案中，进行多重扩增，使得一些或全部靶序列在单一反应容器内扩增。既定多重扩增的“重数(plexy)”或“重(plex)”是指在所述单一多重扩增期间扩增的不同目标特异性序列的数目。在一些实施方案中，重数可以是约12重、24重、48重、74重、96重、120重、144重、168重、192重、216重、240重、264重、288重、312重、336重、360重、384重或398重。

除非另外指出，否则本主题的实践可以采用在本领域的技能内的有机化学、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学和生物化学的常规技术和描述。这些常规技术包括但不限于合成多核苷酸的制备、聚合技术、聚合物颗粒的化学和物理分析、核酸文库的制备、核酸测序和分析等。合适技术的具体说明可以参看本文提供的实例使用。也可以使用其它等效的常规程序。这些常规技术和描述可以在标准实验室手册中找到，例如GenomeAnalysis:A Laboratory Manual Series(Vols.I-IV),PCR Primer:A LaboratoryManual,and MolecularCloning:A Laboratory Manual(均来自Cold Spring HarborLaboratory Press),Hermanson,Bioconjugate Techniques,第二版(Academic Press,2008)；Merkus,Particle Size Measurements(Springer,2009)；Rubinstein and Colby,Polymer Physics(Oxford University Press,2003)；等等。

我们开发了多重下一代测序工艺流程，用于测量参与免疫应答的基因表达，例如检查点途径、T细胞相关信号传导途径、不同肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)亚群的标志物和肿瘤标志物，以确定样品中的免疫应答。本发明的免疫应答测定组合物和方法为生物标记物筛选和理解与肿瘤免疫应答有关的机制提供了特异且稳健的解决方案。因此，提供了多重基因表达组合物，其用于多重文库制备，并与下一代测序技术和工艺流程解决方案(例如，IonTorrent^TM NGS工艺流程)结合使用，手动或自动地，以评估保护肿瘤免受免疫应答的途径。

因此，提供了用于单流多重确定样品中的免疫应答的组合物。在一些实施方案中，所述组合物由多组引物对试剂组成，所述引物对试剂针对多个靶序列以测量样品中靶标的表达水平，其中靶基因选自由以下功能组成的免疫应答基因：检查点途径、T细胞相关信号传导途径、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)标志物、肿瘤标志物和持家基因。在一些实施方案中，靶基因选自由表A的一个或多个功能组成的免疫应答基因。在一些实施方案中，所述靶基因选自以下功能的免疫应答基因：免疫检查点途径和靶标；T细胞和B细胞信号传导基因、淋巴细胞亚群标志物、干扰素信号传导基因、细胞因子信号传导基因；肿瘤标志物、肿瘤抗原和增殖标志物；和持家基因。在一些实施方案中，靶基因是从阐明T和B淋巴细胞的功能，从激活到抗原加工的免疫应答基因选择，包括，例如，由下列功能组成的基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞活化、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、B细胞受体信号传导、T细胞受体信号传导、T细胞调节和TCR共表达。在一些实施方案中，靶基因选自这样的免疫应答基因，其阐明炎症和活化以及辅助细胞的合作的水平，包括例如由以下功能组成的基因：趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、I型干扰素信号传导和II型干扰素信号传导。在一些实施方案中，靶基因鉴定各种相关细胞类型的存在，包括例如选自由以下功能组成的免疫应答基因的基因：B细胞标志物、树突细胞、树突细胞/巨噬细胞、辅助T细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、NK激活、NK细胞和T细胞分化。在一些实施方案中，靶基因阐明了作用机制，包括例如选自由以下功能组成的免疫应答基因的基因：检查点途径、PD-信号传导和药物靶标。在一些实施方案中，靶基因证明肿瘤细胞的增殖活性和/或干性特征，包括例如选自由以下功能组成的免疫应答基因的基因：粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。总之，包含本发明提供的多重组的基因的各种功能提供了肿瘤微环境的复杂活性的全面图像。

在一些实施方案中，免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞激活、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、B细胞受体信号传导、T细胞受体信号传导、T细胞调节、TCR共表达、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、I型干扰素信号传导、II型干扰素信号传导、B细胞标志物、树突细胞、树突状细胞/巨噬细胞、辅助T细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、NK活化、NK细胞、T细胞分化、检查点途径、PD信号传导、药物靶标、粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。

表A：免疫应答基因

在一些实施方案中，免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞激活、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、B细胞受体信号传导、T细胞受体信号传导、T细胞调节、TCR共表达、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、I型干扰素信号传导、II型干扰素信号传导、B细胞标志物、树突细胞、树突状细胞/巨噬细胞、辅助T细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、NK活化、NK细胞、T细胞分化、检查点途径、PD信号传导和药物靶标。在一些实施方案中，免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞激活、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、B细胞受体信号传导、T细胞受体信号传导、T细胞调节、TCR共表达、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、I型干扰素信号传导、II型干扰素信号传导、B细胞标志物、树突细胞、树突状细胞/巨噬细胞、辅助T细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、NK活化、NK细胞、T细胞分化、粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。在一些实施方案中，免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞激活、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、B细胞受体信号传导、T细胞受体信号传导、T细胞调节、TCR共表达、检查点途径、PD信号传导、药物靶标、粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。在一些实施方案中，免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞激活、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、B细胞受体信号传导、T细胞受体信号传导、T细胞调节、TCR共表达、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、I型干扰素信号传导、II型干扰素信号传导、B细胞标志物、树突细胞、树突状细胞/巨噬细胞、辅助T细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、NK活化、NK细胞、T细胞分化、检查点途径、PD信号传导、药物靶标、粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。在一些实施方案中，免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：TCR共表达、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、I型干扰素信号传导、II型干扰素信号传导、B细胞标志物、树突细胞、树突状细胞/巨噬细胞、辅助T细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、NK活化、NK细胞、T细胞分化、检查点途径、PD信号传导、药物靶标、粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。

在某些实施方案中，靶免疫应答序列针对具有与癌症相关的异常表达的序列。在一些实施方案中，靶序列或扩增的靶序列针对具有与一种或多种实体瘤癌相关的异常表达的序列，所述实体瘤癌选自头颈癌(例如，HNSCC、鼻咽、唾液腺)，脑癌(例如，胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质肉瘤、多形性胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤)，乳腺癌(例如，TNBC、曲妥珠单抗耐药的HER2+乳腺癌、ER+/HER-乳腺癌)，妇科(例如，子宫、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、输卵管癌)，结肠直肠癌，胆囊癌，食道癌，胃肠癌，胃癌，膀胱癌，前列腺癌，睾丸癌，尿路上皮癌，肝癌(如肝细胞癌、HCC)，肺癌(如非小细胞肺、小细胞肺)，肾(肾细胞)癌，胰腺癌(如腺癌、导管)，甲状腺癌，胆管癌，垂体瘤，维尔姆斯肿瘤，卡波西肉瘤，毛细胞癌，骨肉瘤，胸腺癌，皮肤癌，黑色素瘤，心脏癌，口腔癌和喉癌，神经母细胞瘤，间皮瘤和其他实体瘤(胸腺、骨、软组织、口腔SCC、骨髓纤维化、滑膜肉瘤)。在一个实施方案中，突变可包括取代、插入、反转、点突变、缺失、错配和易位。在一些实施方案中，靶序列或扩增的靶序列针对具有与一种或多种血液/血液癌相关的异常表达的序列，所述血液/血液癌选自多发性骨髓瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，白血病，急性髓性白血病(AML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，骨髓增生异常综合征。在一个实施方案中，与癌症相关的异常表达位于表1中提供的至少一种基因中。

在一些实施方案中，一种或多种异常表达免疫应答序列位于选自以下的至少一种基因中：CD63、CD69、CXCL1、KLRD1、HLA-DOB、CXCR5、IL12B、PTK7、CEACAM1、CXCL9、IL13、NT5E、VEGFA、ABCF1、CD38、JAML、S100A8、MYC、IRF1、CCL22、CXCR2、IFIT1、IFIT2、CD68、M6PR、SH2D1A、ISG20、GBP1、TBP、STAT6、ID3、CX3CL1、KLRB1、TNFSF4、CD52、IL10RA、HLA-DOA、IFNB1、CCR5、IKZF3、STAT1、CD6、BRCA1、CORO1A、TBX21、KLRK1、CXCR6、PTEN、PMEL、DMBT1、IFI44L、LAPTM5、CD226、TNFSF13B、ICOS、CD160、TRIM29、LST1、ZBTB46、VTCN1、KREMEN1、PDCD1LG2、TUBB、CLEC4C、CD86、HAVCR2、GZMH、NFATC1、CD8B、BCL2、GADD45GIP1、CBLB、ITGA1、CD8A、IL2RA、EIF2AK2、MADCAM1、PTPN6、LRG1、ADGRE5、SH2D1B、ITGB2、HLA-DPA1、DGAT2、IGF1R、TAGAP、LMNA、NCAM1、TIGIT、IL17F、HLA-F-AS1、CD247、CD79B、IDO2、IL4、TYROBP、BTLA、AKT1、IL2RG、POLR2A、ITGAX、IL1B、CSF2RB、DDX58、KIAA0101、CD274、LAMP3、TNFAIP8、FOXP3、IL12A、SAMHD1、SIT1、CD3E、ICOSLG、HGF、MELK、IGSF6、GNLY、TDO2、KRT7、HLA-E、HLA-DM、LAMP1、NTN3、CD28、TARP、EGFR、CCR4、MAGEA3、BATF、KLRG1、IRS1、CSF1R、CTLA4、TNFSF18、POU2AF1、GZMA、PIK3CA、ITK、IFI27、EOMES、LCN2、CD80、CD83、CXCL13、MTOR、FCER1G、TFRC、RORC、MMP9、BST2、PIK3CD、FCGR2B、TNFRSF14、OAS3、GRAP2、CCNB2、MLANA、MAGEA12、VCAM1、CDKN3、NCR1、FAS、GZMB、IRF9、IFITM2、TNFSF14、HLA-B、SDHA、NRP1、EBI3、EFNA4、PVR、BUB1、SKAP2、PRF1、CCL20、TNFRSF18、CTSS、NKG7、ISG15、PDCD1、SNAI1、CXCL11、CIITA、IFI35、TNFSF9、TNFSF10、MMP2、EGR3、MAGEA1、CD163、IL6、KLRF1、B3GAT1、C1QA、OAS1、IKZF2、TLR9、KLF2、GUSB、NFKBIA、IL23A、HERC6、SLAMF8、IL15、TLR7、OAS2、HLA-DR、CRTAM、MAGEC2、ICAM1、CD4、MAPK14、C1QB、NOTCH3、NCR3、STAT3、TLR8、CYBB、IKZF4、IFIH1、LCK、BCL2L11、ITGAM、ITGB7、JCHAIN、CD209、SLAMF7、IL10、IL1A、FCGR3A、IFNA17、EGR2、TOP2A、C10orf54、FOXM1、AXL、MS4A1、IFI6、CD3D、GPR18、CD3G、ZAP70、HMBS、IL7、IFIT3、RB1、PTGS2、TGFB1、NCF1、TWIST1、CA4、SELL、LILRB1、CD14、ALOX15B、PECAM1、NOS2、FASLG、CD44、ENTPD1、CMKLR1、CD53、TNF、CXCL8、CD40LG、HLA-F、GATA3、LYZ、ARG1、IL2RB、NECTIN2、MPO、CCR2、BRCA2、ADORA2A、G6PD、TAP1、MX1、HLA-DQB2、CD27、CD276、STAT4、PTPN7、PTPRC、PSMB9、CD244、CXCR4、MAPK1、TP63、IRF4、CCL3、CCL18、IL7R、HLA-DRB1、CEACAM8、CXCL10、CCL2、SRGN、CD19、ITGB1、IFITM1、CCL21、MRC1、PGF、ITGAL、ID2、CD22、CCL17、ITGAE、IL3RA、CCR7、CD1C、MAD2L1、PYGL、CD40、LY9、HLA-G、TLR3、CD48、STAT5A、FCRLA、BCL6、ZEB1、CCL5、IDO1、IL18、TNFRSF9、HIF1A、HLA-DPB1、FOXO1、CD33、S100A9、HLA-DMB、HLA-A、SNAI2、TNFRSF17、LRP1、MAGEA4、HLA-DQA1、CD1D、RPS6、MKI67、GZMK、CD79A、CD37、FUT4、AIF1、CCR1、PRDM1、CD47、CD74、LAG3、TNFRSF4、CD2、CCL4、BAGE、LEXM、CCR6、CD70、CDK1、CTAG1B、CTAG2、CX3CR1、CX3CR1、CX3CR1、CX3CR1、GAGE1,GAGE12I,GAGE12F、GAGE12J、GAGE2C,GAGE2A,GAGE2E、GAGE10、GAGE13、IKZF1、IL17A、IL2、IL21、IL22、KIR2DL2、KIR2DL3、MAGEA10、MIF、PTPRCAP、SSX2、TCF7、XAGE1B、CEACAM8、CXCR3、FCGR1A、FCGR3B、FYB、HLA-C、HLA-DQA2、IFNG、KIR2DL1、KRT5、LMNA、和PTPN11。在一些实施方案中，一种或多种异常表达序列指示癌症活性。

在一些实施方案中，一种或多种异常表达序列指示患者对治疗剂的反应的可能性。在一些实施方案中，一种或多种异常表达序列指示患者不对治疗剂有响应的可能性。在某些实施方案中，相关治疗剂可以是免疫疗法，包括但不限于检查点阻断、T细胞疗法和治疗性疫苗。在一些实施方案中，治疗剂可以修饰选自以下的免疫应答基因：PD1(例如纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、AMP-244、MEDI0680、AMP-514、pidlizumab)，CTLA4(例如伊匹单抗(ipilimumab)、曲美母单抗(tremelimumab))，PD-L1(例如阿特珠单抗(atezolizumab)、MDX1105-01、MEDI4736、阿维鲁单抗(avelumab))，KIR(例如lirilumab、NCC0141-0000-0100)，CD9/NKG2A(例如IPH2201)，LAG3(例如BMS986016)，GITR(例如TRX518)，OX40(例如MEDI6383、MEDI6489、MOXR0916)，IDO(例如indoximod(NLG8189)、INCB024360、F001287、NLG919)，TGFbeta(例如sotaracept、fresolumimab、trabedersen、lucanix)，TGFbetaR(例如LY2157299、ACE536)，CD137(例如urelumab)，CD137/41BB(例如pf05082566)，CD289/TLR9(例如MGN1703)，MUC1/CD227(例如OINT-10、ASN-004)，CD27(例如varlilumab)，CD27L(例如AMG172)，SLAMF7/CD1(例如埃罗妥珠单抗(elotuzumab))，CD20(例如DI-Leu16-IL2)，talimogene laherparepvec，CD70(例如ARGX110)，IL10(例如AM0010)，PSA(例如PROSTVAC)，GP100(例如MDX1379)，STAT3(例如AZD9150)，CVAC，IL12(例如veledimex、INXN2001、MSB0010360N、IMMUNOPULSE、GEN-1、INO-9012；IL2：MSB0010445、RG7813/RO6895882)，IL33(例如警报素IL33)，ICT140，CNDO-109，hTERT(例如INO-1400)，发育不良组织(例如ADXS-HPV)，SMAC-模拟物(例如birinapant)，ImmTAC(例如IMCgp100)和CD40(例如RO7009789)。在某些实施方案中，相关治疗剂是选自检查点阻断、T细胞疗法和治疗性疫苗的免疫疗法。在一些实施方案中，治疗剂修饰选自以下任一种的免疫应答基因：PD1(例如纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、AMP-244、MEDI0680、AMP-514、pidlizumab)，CTLA4(例如伊匹单抗(ipilimumab)、曲美母单抗(tremelimumab))，PD-L1(例如阿特珠单抗(atezolizumab)、MDX1105-01、MEDI4736、阿维鲁单抗(avelumab))，KIR(例如lirilumab、NCC0141-0000-0100)，CD9/NKG2A(例如IPH2201)，LAG3(例如BMS986016)，GITR(例如TRX518)，OX40(例如MEDI6383、MEDI6489、MOXR0916)，IDO(例如indoximod(NLG8189)、INCB024360、F001287、NLG919)，TGFbeta(例如sotaracept、fresolumimab、trabedersen、lucanix)，TGFbetaR(例如LY2157299、ACE536)，CD137(例如urelumab)，CD137/41BB(例如pf05082566)，CD289/TLR9(例如MGN1703)，MUC1/CD227(例如OINT-10、ASN-004)，CD27(例如varlilumab)，CD27L(例如AMG172)，SLAMF7/CD1(例如埃罗妥珠单抗(elotuzumab))，CD20(例如DI-Leu16-IL2)，talimogene laherparepvec，CD70(例如ARGX110)，IL10(例如AM0010)，PSA(例如PROSTVAC)，GP100(例如MDX1379)，STAT3(例如AZD9150)，CVAC，IL12(例如veledimex、INXN2001、MSB0010360N、IMMUNOPULSE、GEN-1、INO-9012；IL2：MSB0010445、RG7813/RO6895882)，IL33(例如警报素IL33)，ICT140，CNDO-109，hTERT(例如INO-1400)，发育不良组织(例如ADXS-HPV)，SMAC-模拟物(例如birinapant)，ImmTAC(例如IMCgp100)和CD40(例如RO7009789)。

在一些实施方案中，针对与癌症相关的突变引导靶序列或经扩增的靶序列。在一些实施方案中，靶序列或扩增的靶序列针对具有与一种或多种实体瘤癌相关的突变，所述实体瘤癌选自头颈癌(例如，HNSCC、鼻咽、唾液腺)，脑癌(例如，胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质肉瘤、多形性胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤)，乳腺癌(例如，TNBC、曲妥珠单抗耐药的HER2+乳腺癌、ER+/HER-乳腺癌)，妇科(例如，子宫、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、输卵管癌)，结肠直肠癌，胆囊癌，食道癌，胃肠癌，胃癌，膀胱癌，前列腺癌，睾丸癌，尿路上皮癌，肝癌(如肝细胞癌、HCC)，肺癌(如非小细胞肺、小细胞肺)，肾(肾细胞)癌，胰腺癌(如腺癌、导管)，甲状腺癌，胆管癌，垂体瘤，维尔姆斯肿瘤，卡波西肉瘤，毛细胞癌，骨肉瘤，胸腺癌，皮肤癌，黑色素瘤，心脏癌，口腔癌和喉癌，神经母细胞瘤，间皮瘤和其他实体瘤(胸腺、骨、软组织、口腔SCC、骨髓纤维化、滑膜肉瘤)。在一个实施方案中，突变可包括取代、插入、反转、点突变、缺失、错配和易位。在一个实施方案中，突变可包括拷贝数的变化。在一个实施方案中，突变可包括生殖系或体细胞突变。在一些实施方案中，靶序列或扩增的靶序列针对具有与一种或多种血液/血液癌相关的突变的序列，所述血液/血液癌选自多发性骨髓瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，白血病，急性髓性白血病(AML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，骨髓增生异常综合征。在一个实施方案中，与癌症相关的突变位于表1中提供的至少一种基因中。

在一些实施方案中，与癌症相关的免疫应答序列中的一个或多个突变位于选自以下的至少一种基因中：CD63、CD69、CXCL1、KLRD1、HLA-DOB、CXCR5、IL12B、PTK7、CEACAM1、CXCL9、IL13、NT5E、VEGFA、ABCF1、CD38、JAML、S100A8、MYC、IRF1、CCL22、CXCR2、IFIT1、IFIT2、CD68、M6PR、SH2D1A、ISG20、GBP1、TBP、STAT6、ID3、CX3CL1、KLRB1、TNFSF4、CD52、IL10RA、HLA-DOA、IFNB1、CCR5、IKZF3、STAT1、CD6、BRCA1、CORO1A、TBX21、KLRK1、CXCR6、PTEN、PMEL、DMBT1、IFI44L、LAPTM5、CD226、TNFSF13B、ICOS、CD160、TRIM29、LST1、ZBTB46、VTCN1、KREMEN1、PDCD1LG2、TUBB、CLEC4C、CD86、HAVCR2、GZMH、NFATC1、CD8B、BCL2、GADD45GIP1、CBLB、ITGA1、CD8A、IL2RA、EIF2AK2、MADCAM1、PTPN6、LRG1、ADGRE5、SH2D1B、ITGB2、HLA-DPA1、DGAT2、IGF1R、TAGAP、LMNA、NCAM1、TIGIT、IL17F、HLA-F-AS1、CD247、CD79B、IDO2、IL4、TYROBP、BTLA、AKT1、IL2RG、POLR2A、ITGAX、IL1B、CSF2RB、DDX58、KIAA0101、CD274、LAMP3、TNFAIP8、FOXP3、IL12A、SAMHD1、SIT1、CD3E、ICOSLG、HGF、MELK、IGSF6、GNLY、TDO2、KRT7、HLA-E、HLA-DM、LAMP1、NTN3、CD28、TARP、EGFR、CCR4、MAGEA3、BATF、KLRG1、IRS1、CSF1R、CTLA4、TNFSF18、POU2AF1、GZMA、PIK3CA、ITK、IFI27、EOMES、LCN2、CD80、CD83、CXCL13、MTOR、FCER1G、TFRC、RORC、MMP9、BST2、PIK3CD、FCGR2B、TNFRSF14、OAS3、GRAP2、CCNB2、MLANA、MAGEA12、VCAM1、CDKN3、NCR1、FAS、GZMB、IRF9、IFITM2、TNFSF14、HLA-B、SDHA、NRP1、EBI3、EFNA4、PVR、BUB1、SKAP2、PRF1、CCL20、TNFRSF18、CTSS、NKG7、ISG15、PDCD1、SNAI1、CXCL11、CIITA、IFI35、TNFSF9、TNFSF10、MMP2、EGR3、MAGEA1、CD163、IL6、KLRF1、B3GAT1、C1QA、OAS1、IKZF2、TLR9、KLF2、GUSB、NFKBIA、IL23A、HERC6、SLAMF8、IL15、TLR7、OAS2、HLA-DR、CRTAM、MAGEC2、ICAM1、CD4、MAPK14、C1QB、NOTCH3、NCR3、STAT3、TLR8、CYBB、IKZF4、IFIH1、LCK、BCL2L11、ITGAM、ITGB7、JCHAIN、CD209、SLAMF7、IL10、IL1A、FCGR3A、IFNA17、EGR2、TOP2A、C10orf54、FOXM1、AXL、MS4A1、IFI6、CD3D、GPR18、CD3G、ZAP70、HMBS、IL7、IFIT3、RB1、PTGS2、TGFB1、NCF1、TWIST1、CA4、SELL、LILRB1、CD14、ALOX15B、PECAM1、NOS2、FASLG、CD44、ENTPD1、CMKLR1、CD53、TNF、CXCL8、CD40LG、HLA-F、GATA3、LYZ、ARG1、IL2RB、NECTIN2、MPO、CCR2、BRCA2、ADORA2A、G6PD、TAP1、MX1、HLA-DQB2、CD27、CD276、STAT4、PTPN7、PTPRC、PSMB9、CD244、CXCR4、MAPK1、TP63、IRF4、CCL3、CCL18、IL7R、HLA-DRB1、CEACAM8、CXCL10、CCL2、SRGN、CD19、ITGB1、IFITM1、CCL21、MRC1、PGF、ITGAL、ID2、CD22、CCL17、ITGAE、IL3RA、CCR7、CD1C、MAD2L1、PYGL、CD40、LY9、HLA-G、TLR3、CD48、STAT5A、FCRLA、BCL6、ZEB1、CCL5、IDO1、IL18、TNFRSF9、HIF1A、HLA-DPB1、FOXO1、CD33、S100A9、HLA-DMB、HLA-A、SNAI2、TNFRSF17、LRP1、MAGEA4、HLA-DQA1、CD1D、RPS6、MKI67、GZMK、CD79A、CD37、FUT4、AIF1、CCR1、PRDM1、CD47、CD74、LAG3、TNFRSF4、CD2、CCL4、BAGE、LEXM、CCR6、CD70、CDK1、CTAG1B、CTAG2、CX3CR1、CX3CR1、CX3CR1、CX3CR1、GAGE1,GAGE12I,GAGE12F、GAGE12J、GAGE2C,GAGE2A,GAGE2E、GAGE10、GAGE13、IKZF1、IL17A、IL2、IL21、IL22、KIR2DL2、KIR2DL3、MAGEA10、MIF、PTPRCAP、SSX2、TCF7、XAGE1B、CEACAM8、CXCR3、FCGR1A、FCGR3B、FYB、HLA-C、HLA-DQA2、IFNG、KIR2DL1、KRT5、LMNA、和PTPN11。

在一些实施方案中，扩增的靶序列针对表1中提供的任何一种或多种基因。在一些实施方案中，扩增的靶序列包含表1中提供的任何一种或多种扩增子序列。在一些实施方案中，扩增的靶序列由表1中提供的任何一种或多种扩增子序列组成。在一些实施方案中，扩增的靶序列包括表1中提供的每个扩增子序列。

在一些实施方案中，组合物包含表2中提供的任何一种或多种免疫应答靶特异性引物对。在一些实施方案中，组合物包含表2中提供的所有免疫应答靶特异性引物对。在一些实施方案中，表2中提供的任何一种或多种免疫应答靶特异性引物对可用于扩增样品中存在的靶序列，如本文所述的方法所公开的。

在一些实施方案中，来自表2的免疫应答靶特异性引物可包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、40、60、80、100、150、200、250、300、350、398或更多个靶特异性引物对。在一些实施方案中，扩增的靶序列可包括表1中提供的任何一种或多种扩增的靶序列(例如，使用表2中提供的扩增子ID靶特异性引物)。在一些实施方案中，与癌症相关的至少一个靶特异性引物与选自SEQ ID NOs:399-1194的至少一个核酸序列至少90％同一。在一些实施例中，与免疫反应相关的靶特异性引物中的至少一个跨越其全部长度与样品中的至少一个靶序列互补。在一些实施方案中，与免疫反应相关的靶特异性引物中的至少一个包括3'端处的非可裂解核苷酸。在一些实施方案中，3'端处的非可裂解核苷酸包括末端3'核苷酸。在一个实施方案中，经扩增的靶序列针对具有与癌症相关的异常表达的一个或多个个别外显子。在一个实施方案中，经扩增的靶序列针对具有与癌症相关的突变的个别外显子。在一些实施方案中，提供的方法包括样品中超过一个靶序列的选择性扩增和与癌症相关的突变的检测和/或鉴别。在一些实施方案中，经扩增的靶序列包括两个或更多个表2中提供的核苷酸序列。在一些实施方案中，扩增的靶序列可包括使用表2中提供的靶特异性引物产生的任何一种或多种扩增的靶序列。在一个实施方案中，扩增的靶序列包括表1中的10、50、100、150、200、250、300、350或更多个扩增子。在一些实施方案中，方法包括检测和任选地鉴定临床上可行标志物。如本文中所定义，术语“临床上可行标志物”包括已知的或可由所属领域的一般技术人员与(但不限于)癌症治疗的预后相关联的临床上可行的突变和/或临床上可行的表达模式。在一个实施方案中，癌症治疗的预后包括与癌症对药物、药物组合或治疗方案起反应或不起反应相关的突变和/或表达模式的鉴别。在一个实施方案中，方法包括多个靶序列从与癌症的发作、进展或缓解有关或相关的核酸分子群体的扩增。

在一些实施方案中，持家基因包含在免疫应答测定中。在某些实施方案中，一种或多种持家基因序列包括在测定中。在特定实施方案中，一种或多种持家基因选自ABCF1、G6PD、GUSB、HMBS、LMNA、LRP1、POLR2A、SDHA、TBP、TFRC和TUBB。

本文提供了用于确定样品中的免疫应答活性的方法。在一些实施方案中，该方法包括多重扩增来自生物样品的多个靶表达序列，其中扩增包括在扩增条件下使至少一部分样品与针对多个靶序列的多组引物对试剂和聚合酶接触，从而产生扩增的靶表达序列。该方法还包括检测样品中靶序列的表达水平，其中与对照相比，一种或多种免疫应答标志物的表达水平的变化决定了样品中免疫应答活性的变化。在一些实施方案中，所述方法的靶表达序列选自由以下功能组成的免疫应答基因：检查点途径、T细胞相关信号传导途径、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的标志物、肿瘤标志物和持家基因。在一些实施方案中，所述靶基因选自以下功能的免疫应答基因：免疫检查点途径和靶标；T细胞和B细胞信号传导基因、淋巴细胞亚群标志物、干扰素信号传导基因、细胞因子信号传导基因；肿瘤标志物、肿瘤抗原和增殖标志物；和持家基因。在一些实施方案中，所述方法的靶基因选自由下列功能组成的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞活化、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、B细胞受体信号传导、T细胞受体信号传导、T细胞调节和TCR共表达。在一些实施方案中，所述方法的靶基因选自由下列功能组成的免疫应答基因：趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、I型干扰素信号传导和II型干扰素信号传导。在一些实施方案中，所述方法的靶基因选自由下列标志物功能组成的免疫应答基因：B细胞标志物、树突细胞、树突细胞/巨噬细胞、辅助T细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、NK激活、NK细胞和T细胞分化。在一些实施方案中，所述方法的靶基因选自免疫应答基因，所述免疫应答基因由标记物的以下功能组成：检查点途径、PD-信号传导和药物靶标。在一些实施方案中，所述方法的靶基因选自免疫应答基因，所述免疫应答基因由以下标志物功能组成：粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。

在一些实施方案中，所述方法的免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞激活、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、B细胞受体信号传导、T细胞受体信号传导、T细胞调节、TCR共表达、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、I型干扰素信号传导、II型干扰素信号传导、B细胞标志物、树突细胞、树突状细胞/巨噬细胞、辅助T细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、NK活化、NK细胞、T细胞分化、检查点途径、PD信号传导、药物靶标、粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。

在一些实施方案中，所述的方法免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞激活、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、B细胞受体信号传导、T细胞受体信号传导、T细胞调节、TCR共表达、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、I型干扰素信号传导、II型干扰素信号传导、B细胞标志物、树突细胞、树突状细胞/巨噬细胞、辅助T细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、NK活化、NK细胞、T细胞分化、检查点途径、PD信号传导和药物靶标。在一些实施方案中，所述方法的免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞激活、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、B细胞受体信号传导、T细胞受体信号传导、T细胞调节、TCR共表达、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、I型干扰素信号传导、II型干扰素信号传导、B细胞标志物、树突细胞、树突状细胞/巨噬细胞、辅助T细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、NK活化、NK细胞、T细胞分化、粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。在一些实施方案中，所述方法的免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞激活、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、B细胞受体信号传导、T细胞受体信号传导、T细胞调节、TCR共表达、检查点途径、PD信号传导、药物靶标、粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。在一些实施方案中，所述方法的免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：抗原呈递、抗原加工、先天免疫反应、白细胞抑制、白细胞迁移、淋巴细胞激活、淋巴细胞发育、淋巴细胞浸润、B细胞受体信号传导、T细胞受体信号传导、T细胞调节、TCR共表达、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、I型干扰素信号传导、II型干扰素信号传导、B细胞标志物、树突细胞、树突状细胞/巨噬细胞、辅助T细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、NK活化、NK细胞、T细胞分化、检查点途径、PD信号传导、药物靶标、粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。在一些实施方案中，所述方法的免疫应答靶序列选自以下功能的免疫应答基因：TCR共表达、趋化因子信号传导、细胞因子信号传导、干扰素信号传导、I型干扰素信号传导、II型干扰素信号传导、B细胞标志物、树突细胞、树突状细胞/巨噬细胞、辅助T细胞、巨噬细胞、骨髓、中性粒细胞、NK活化、NK细胞、T细胞分化、检查点途径、PD信号传导、药物靶标、粘附/迁移、细胞凋亡、增殖、肿瘤抗原和肿瘤标志物。

在某些实施方案中，所述方法的靶免疫应答序列针对具有与癌症相关的异常表达的序列。在一些实施方案中，所述方法的靶序列或扩增的靶序列针对具有与一种或多种实体瘤癌相关的异常表达的序列，所述实体瘤癌选自头颈癌(例如，HNSCC、鼻咽、唾液腺)，脑癌(例如，胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质肉瘤、多形性胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤)，乳腺癌(例如，TNBC、曲妥珠单抗耐药的HER2+乳腺癌、ER+/HER-乳腺癌)，妇科(例如，子宫、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、输卵管癌)，结肠直肠癌，胆囊癌，食道癌，胃肠癌，胃癌，膀胱癌，前列腺癌，睾丸癌，尿路上皮癌，肝癌(如肝细胞癌、HCC)，肺癌(如非小细胞肺、小细胞肺)，肾(肾细胞)癌，胰腺癌(如腺癌、导管)，甲状腺癌，胆管癌，垂体瘤，维尔姆斯肿瘤，卡波西肉瘤，毛细胞癌，骨肉瘤，胸腺癌，皮肤癌，黑色素瘤，心脏癌，口腔癌和喉癌，神经母细胞瘤，间皮瘤和其他实体瘤(胸腺、骨、软组织、口腔SCC、骨髓纤维化、滑膜肉瘤)。在某些实施方案中，突变可包括取代、插入、反转、点突变、缺失、错配和易位的任一种。在一些实施方案中，靶序列或扩增的靶序列针对具有与一种或多种血液/血液癌相关的异常表达的序列，所述血液/血液癌选自多发性骨髓瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，白血病，急性髓性白血病(AML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，骨髓增生异常综合征。在某些实施方案中，与癌症相关的异常表达涉及表1中提供的至少一种基因。

在一些实施方案中，所述方法的一种或多种异常表达免疫应答序列是选自以下的至少一种基因：CD63、CD69、CXCL1、KLRD1、HLA-DOB、CXCR5、IL12B、PTK7、CEACAM1、CXCL9、IL13、NT5E、VEGFA、ABCF1、CD38、JAML、S100A8、MYC、IRF1、CCL22、CXCR2、IFIT1、IFIT2、CD68、M6PR、SH2D1A、ISG20、GBP1、TBP、STAT6、ID3、CX3CL1、KLRB1、TNFSF4、CD52、IL10RA、HLA-DOA、IFNB1、CCR5、IKZF3、STAT1、CD6、BRCA1、CORO1A、TBX21、KLRK1、CXCR6、PTEN、PMEL、DMBT1、IFI44L、LAPTM5、CD226、TNFSF13B、ICOS、CD160、TRIM29、LST1、ZBTB46、VTCN1、KREMEN1、PDCD1LG2、TUBB、CLEC4C、CD86、HAVCR2、GZMH、NFATC1、CD8B、BCL2、GADD45GIP1、CBLB、ITGA1、CD8A、IL2RA、EIF2AK2、MADCAM1、PTPN6、LRG1、ADGRE5、SH2D1B、ITGB2、HLA-DPA1、DGAT2、IGF1R、TAGAP、LMNA、NCAM1、TIGIT、IL17F、HLA-F-AS1、CD247、CD79B、IDO2、IL4、TYROBP、BTLA、AKT1、IL2RG、POLR2A、ITGAX、IL1B、CSF2RB、DDX58、KIAA0101、CD274、LAMP3、TNFAIP8、FOXP3、IL12A、SAMHD1、SIT1、CD3E、ICOSLG、HGF、MELK、IGSF6、GNLY、TDO2、KRT7、HLA-E、HLA-DM、LAMP1、NTN3、CD28、TARP、EGFR、CCR4、MAGEA3、BATF、KLRG1、IRS1、CSF1R、CTLA4、TNFSF18、POU2AF1、GZMA、PIK3CA、ITK、IFI27、EOMES、LCN2、CD80、CD83、CXCL13、MTOR、FCER1G、TFRC、RORC、MMP9、BST2、PIK3CD、FCGR2B、TNFRSF14、OAS3、GRAP2、CCNB2、MLANA、MAGEA12、VCAM1、CDKN3、NCR1、FAS、GZMB、IRF9、IFITM2、TNFSF14、HLA-B、SDHA、NRP1、EBI3、EFNA4、PVR、BUB1、SKAP2、PRF1、CCL20、TNFRSF18、CTSS、NKG7、ISG15、PDCD1、SNAI1、CXCL11、CIITA、IFI35、TNFSF9、TNFSF10、MMP2、EGR3、MAGEA1、CD163、IL6、KLRF1、B3GAT1、C1QA、OAS1、IKZF2、TLR9、KLF2、GUSB、NFKBIA、IL23A、HERC6、SLAMF8、IL15、TLR7、OAS2、HLA-DR、CRTAM、MAGEC2、ICAM1、CD4、MAPK14、C1QB、NOTCH3、NCR3、STAT3、TLR8、CYBB、IKZF4、IFIH1、LCK、BCL2L11、ITGAM、ITGB7、JCHAIN、CD209、SLAMF7、IL10、IL1A、FCGR3A、IFNA17、EGR2、TOP2A、C10orf54、FOXM1、AXL、MS4A1、IFI6、CD3D、GPR18、CD3G、ZAP70、HMBS、IL7、IFIT3、RB1、PTGS2、TGFB1、NCF1、TWIST1、CA4、SELL、LILRB1、CD14、ALOX15B、PECAM1、NOS2、FASLG、CD44、ENTPD1、CMKLR1、CD53、TNF、CXCL8、CD40LG、HLA-F、GATA3、LYZ、ARG1、IL2RB、NECTIN2、MPO、CCR2、BRCA2、ADORA2A、G6PD、TAP1、MX1、HLA-DQB2、CD27、CD276、STAT4、PTPN7、PTPRC、PSMB9、CD244、CXCR4、MAPK1、TP63、IRF4、CCL3、CCL18、IL7R、HLA-DRB1、CEACAM8、CXCL10、CCL2、SRGN、CD19、ITGB1、IFITM1、CCL21、MRC1、PGF、ITGAL、ID2、CD22、CCL17、ITGAE、IL3RA、CCR7、CD1C、MAD2L1、PYGL、CD40、LY9、HLA-G、TLR3、CD48、STAT5A、FCRLA、BCL6、ZEB1、CCL5、IDO1、IL18、TNFRSF9、HIF1A、HLA-DPB1、FOXO1、CD33、S100A9、HLA-DMB、HLA-A、SNAI2、TNFRSF17、LRP1、MAGEA4、HLA-DQA1、CD1D、RPS6、MKI67、GZMK、CD79A、CD37、FUT4、AIF1、CCR1、PRDM1、CD47、CD74、LAG3、TNFRSF4、CD2、CCL4、BAGE、LEXM、CCR6、CD70、CDK1、CTAG1B、CTAG2、CX3CR1、CX3CR1、CX3CR1、CX3CR1、GAGE1,GAGE12I,GAGE12F、GAGE12J、GAGE2C,GAGE2A,GAGE2E、GAGE10、GAGE13、IKZF1、IL17A、IL2、IL21、IL22、KIR2DL2、KIR2DL3、MAGEA10、MIF、PTPRCAP、SSX2、TCF7、XAGE1B、CEACAM8、CXCR3、FCGR1A、FCGR3B、FYB、HLA-C、HLA-DQA2、IFNG、KIR2DL1、KRT5、LMNA、和PTPN11。在一些实施方案中，一种或多种异常表达序列指示癌症活性。在一些实施方案中，一种或多种异常表达序列指示患者对治疗剂的反应的可能性。在一些实施方案中，一种或多种异常表达序列指示患者不对治疗剂有响应的可能性。在某些实施方案中，相关治疗剂可以是免疫疗法，包括但不限于检查点阻断、T细胞疗法和治疗性疫苗。在一些实施方案中，治疗剂可以修饰选自以下的免疫应答基因：PD1(例如纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、AMP-244、MEDI0680、AMP-514、pidlizumab)，CTLA4(例如伊匹单抗(ipilimumab)、曲美母单抗(tremelimumab))，PD-L1(例如阿特珠单抗(atezolizumab)、MDX1105-01、MEDI4736、阿维鲁单抗(avelumab))，KIR(例如lirilumab、NCC0141-0000-0100)，CD9/NKG2A(例如IPH2201)，LAG3(例如BMS986016)，GITR(例如TRX518)，OX40(例如MEDI6383、MEDI6489、MOXR0916)，IDO(例如indoximod(NLG8189)、INCB024360、F001287、NLG919)，TGFbeta(例如sotaracept、fresolumimab、trabedersen、lucanix)，TGFbetaR(例如LY2157299、ACE536)，CD137(例如urelumab)，CD137/41BB(例如pf05082566)，CD289/TLR9(例如MGN1703)，MUC1/CD227(例如OINT-10、ASN-004)，CD27(例如varlilumab)，CD27L(例如AMG172)，SLAMF7/CD1(例如埃罗妥珠单抗(elotuzumab))，CD20(例如DI-Leu16-IL2)，talimogene laherparepvec，CD70(例如ARGX110)，IL10(例如AM0010)，PSA(例如PROSTVAC)，GP100(例如MDX1379)，STAT3(例如AZD9150)，CVAC，IL12(例如veledimex、INXN2001、MSB0010360N、IMMUNOPULSE、GEN-1、INO-9012；IL2：MSB0010445、RG7813/RO6895882)，IL33(例如警报素IL33)，ICT140，CNDO-109，hTERT(例如INO-1400)，发育不良组织(例如ADXS-HPV)，SMAC-模拟物(例如birinapant)，ImmTAC(例如IMCgp100)和CD40(例如RO7009789)。在某些实施方案中，相关治疗剂是选自检查点阻断、T细胞疗法和治疗性疫苗的免疫疗法。在一些实施方案中，治疗剂修饰选自以下任一种的免疫应答基因：PD1(例如纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、AMP-244、MEDI0680、AMP-514、pidlizumab)，CTLA4(例如伊匹单抗(ipilimumab)、曲美母单抗(tremelimumab))，PD-L1(例如阿特珠单抗(atezolizumab)、MDX1105-01、MEDI4736、阿维鲁单抗(avelumab))，KIR(例如lirilumab、NCC0141-0000-0100)，CD9/NKG2A(例如IPH2201)，LAG3(例如BMS986016)，GITR(例如TRX518)，OX40(例如MEDI6383、MEDI6489、MOXR0916)，IDO(例如indoximod(NLG8189)、INCB024360、F001287、NLG919)，TGFbeta(例如sotaracept、fresolumimab、trabedersen、lucanix)，TGFbetaR(例如LY2157299、ACE536)，CD137(例如urelumab)，CD137/41BB(例如pf05082566)，CD289/TLR9(例如MGN1703)，MUC1/CD227(例如OINT-10、ASN-004)，CD27(例如varlilumab)，CD27L(例如AMG172)，SLAMF7/CD1(例如埃罗妥珠单抗(elotuzumab))，CD20(例如DI-Leu16-IL2)，talimogene laherparepvec，CD70(例如ARGX110)，IL10(例如AM0010)，PSA(例如PROSTVAC)，GP100(例如MDX1379)，STAT3(例如AZD9150)，CVAC，IL12(例如veledimex、INXN2001、MSB0010360N、IMMUNOPULSE、GEN-1、INO-9012；IL2：MSB0010445、RG7813/RO6895882)，IL33(例如警报素IL33)，ICT140，CNDO-109，hTERT(例如INO-1400)，发育不良组织(例如ADXS-HPV)，SMAC-模拟物(例如birinapant)，ImmTAC(例如IMCgp100)和CD40(例如RO7009789)。

在一些实施方案中，所述方法的靶序列或经扩增的靶序列针对与癌症相关的突变。在一些实施方案中，靶序列或扩增的靶序列针对具有与一种或多种实体瘤癌相关的突变，所述实体瘤癌选自头颈癌(例如，HNSCC、鼻咽、唾液腺)，脑癌(例如，胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质肉瘤、多形性胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤)，乳腺癌(例如，TNBC、曲妥珠单抗耐药的HER2+乳腺癌、ER+/HER-乳腺癌)，妇科(例如，子宫、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、输卵管癌)，结肠直肠癌，胆囊癌，食道癌，胃肠癌，胃癌，膀胱癌，前列腺癌，睾丸癌，尿路上皮癌，肝癌(如肝细胞癌、HCC)，肺癌(如非小细胞肺、小细胞肺)，肾(肾细胞)癌，胰腺癌(如腺癌、导管)，甲状腺癌，胆管癌，垂体瘤，维尔姆斯肿瘤，卡波西肉瘤，毛细胞癌，骨肉瘤，胸腺癌，皮肤癌，黑色素瘤，心脏癌，口腔癌和喉癌，神经母细胞瘤，间皮瘤和其他实体瘤(胸腺、骨、软组织、口腔SCC、骨髓纤维化、滑膜肉瘤)。在一个实施方案中，突变可包括取代、插入、反转、点突变、缺失、错配和易位。在一个实施方案中，突变可包括拷贝数的变化。在一个实施方案中，突变可包括生殖系或体细胞突变。在一些实施方案中，靶序列或扩增的靶序列针对具有与一种或多种血液/血液癌相关的突变的序列，所述血液/血液癌选自多发性骨髓瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，白血病，急性髓性白血病(AML)，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，骨髓增生异常综合征。在一个实施方案中，与癌症相关的突变位于表1中提供的至少一种基因中。

在一些实施方案中，与癌症相关的免疫应答序列中的一个或多个突变位于选自以下的至少一种基因中：CD63、CD69、CXCL1、KLRD1、HLA-DOB、CXCR5、IL12B、PTK7、CEACAM1、CXCL9、IL13、NT5E、VEGFA、ABCF1、CD38、JAML、S100A8、MYC、IRF1、CCL22、CXCR2、IFIT1、IFIT2、CD68、M6PR、SH2D1A、ISG20、GBP1、TBP、STAT6、ID3、CX3CL1、KLRB1、TNFSF4、CD52、IL10RA、HLA-DOA、IFNB1、CCR5、IKZF3、STAT1、CD6、BRCA1、CORO1A、TBX21、KLRK1、CXCR6、PTEN、PMEL、DMBT1、IFI44L、LAPTM5、CD226、TNFSF13B、ICOS、CD160、TRIM29、LST1、ZBTB46、VTCN1、KREMEN1、PDCD1LG2、TUBB、CLEC4C、CD86、HAVCR2、GZMH、NFATC1、CD8B、BCL2、GADD45GIP1、CBLB、ITGA1、CD8A、IL2RA、EIF2AK2、MADCAM1、PTPN6、LRG1、ADGRE5、SH2D1B、ITGB2、HLA-DPA1、DGAT2、IGF1R、TAGAP、LMNA、NCAM1、TIGIT、IL17F、HLA-F-AS1、CD247、CD79B、IDO2、IL4、TYROBP、BTLA、AKT1、IL2RG、POLR2A、ITGAX、IL1B、CSF2RB、DDX58、KIAA0101、CD274、LAMP3、TNFAIP8、FOXP3、IL12A、SAMHD1、SIT1、CD3E、ICOSLG、HGF、MELK、IGSF6、GNLY、TDO2、KRT7、HLA-E、HLA-DM、LAMP1、NTN3、CD28、TARP、EGFR、CCR4、MAGEA3、BATF、KLRG1、IRS1、CSF1R、CTLA4、TNFSF18、POU2AF1、GZMA、PIK3CA、ITK、IFI27、EOMES、LCN2、CD80、CD83、CXCL13、MTOR、FCER1G、TFRC、RORC、MMP9、BST2、PIK3CD、FCGR2B、TNFRSF14、OAS3、GRAP2、CCNB2、MLANA、MAGEA12、VCAM1、CDKN3、NCR1、FAS、GZMB、IRF9、IFITM2、TNFSF14、HLA-B、SDHA、NRP1、EBI3、EFNA4、PVR、BUB1、SKAP2、PRF1、CCL20、TNFRSF18、CTSS、NKG7、ISG15、PDCD1、SNAI1、CXCL11、CIITA、IFI35、TNFSF9、TNFSF10、MMP2、EGR3、MAGEA1、CD163、IL6、KLRF1、B3GAT1、C1QA、OAS1、IKZF2、TLR9、KLF2、GUSB、NFKBIA、IL23A、HERC6、SLAMF8、IL15、TLR7、OAS2、HLA-DR、CRTAM、MAGEC2、ICAM1、CD4、MAPK14、C1QB、NOTCH3、NCR3、STAT3、TLR8、CYBB、IKZF4、IFIH1、LCK、BCL2L11、ITGAM、ITGB7、JCHAIN、CD209、SLAMF7、IL10、IL1A、FCGR3A、IFNA17、EGR2、TOP2A、C10orf54、FOXM1、AXL、MS4A1、IFI6、CD3D、GPR18、CD3G、ZAP70、HMBS、IL7、IFIT3、RB1、PTGS2、TGFB1、NCF1、TWIST1、CA4、SELL、LILRB1、CD14、ALOX15B、PECAM1、NOS2、FASLG、CD44、ENTPD1、CMKLR1、CD53、TNF、CXCL8、CD40LG、HLA-F、GATA3、LYZ、ARG1、IL2RB、NECTIN2、MPO、CCR2、BRCA2、ADORA2A、G6PD、TAP1、MX1、HLA-DQB2、CD27、CD276、STAT4、PTPN7、PTPRC、PSMB9、CD244、CXCR4、MAPK1、TP63、IRF4、CCL3、CCL18、IL7R、HLA-DRB1、CEACAM8、CXCL10、CCL2、SRGN、CD19、ITGB1、IFITM1、CCL21、MRC1、PGF、ITGAL、ID2、CD22、CCL17、ITGAE、IL3RA、CCR7、CD1C、MAD2L1、PYGL、CD40、LY9、HLA-G、TLR3、CD48、STAT5A、FCRLA、BCL6、ZEB1、CCL5、IDO1、IL18、TNFRSF9、HIF1A、HLA-DPB1、FOXO1、CD33、S100A9、HLA-DMB、HLA-A、SNAI2、TNFRSF17、LRP1、MAGEA4、HLA-DQA1、CD1D、RPS6、MKI67、GZMK、CD79A、CD37、FUT4、AIF1、CCR1、PRDM1、CD47、CD74、LAG3、TNFRSF4、CD2、CCL4、BAGE、LEXM、CCR6、CD70、CDK1、CTAG1B、CTAG2、CX3CR1、CX3CR1、CX3CR1、CX3CR1、GAGE1,GAGE12I,GAGE12F、GAGE12J、GAGE2C,GAGE2A,GAGE2E、GAGE10、GAGE13、IKZF1、IL17A、IL2、IL21、IL22、KIR2DL2、KIR2DL3、MAGEA10、MIF、PTPRCAP、SSX2、TCF7、XAGE1B、CEACAM8、CXCR3、FCGR1A、FCGR3B、FYB、HLA-C、HLA-DQA2、IFNG、KIR2DL1、KRT5、LMNA、和PTPN11。

在一个方面，本发明的组合物和方法用于鉴定响应、敏感性和/或无应答的生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于比较源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自无应答患者的样品之间的绝对或相对基因表达变化。表现出显著不同表达水平(例如，应答组高、非应答组低)的任何一种或多种基因被认为是预测药物应答的生物标志物。在某些实施方案中，这种应答的生物标志物用于对患者进行免疫应答治疗的分层。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于鉴定治疗后监测免疫应答的生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于比较与已建立的临床制剂(例如，PD-L1、NY-ESO-1、MAGE)的免疫组织化学读数相关的绝对或相对基因表达变化。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于比较与任何治疗靶标、药效学标志物或免疫原性抗原的变化相关的绝对或相对基因表达变化。显示与这些读数相关的向上或向下表达的任何基因或基因组合可以被认为是药物应答的预测标志物。在一些实施方案中，所提供的组合物和方法用于比较与含有高水平肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和含有低水平TIL的样品相关的绝对或相对基因表达变化，如病理学综述所报道的。在这两组之间表达显著不同的任何基因或基因组合可以被认为是药物应答的预测因子。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于比较与不同分子亚型的样品相关的绝对或相对基因表达变化(例如，结肠直肠癌的实例包括但不限于微卫星不稳定免疫；超突变，微卫星不稳定和强免疫激活；上皮和明显的代谢失调；间充质[http://www.nature.com/nm/journal/vaop/ncurrent/full/nm.3967.html])。任何基因或基因组合在任何这些组之间的表达显著不同可被认为是药物应答的预测因子。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于比较与不同组织病理学亚型的样品相关的绝对或相对基因表达变化(例如，非小细胞肺的实例包括但不限于腺癌、鳞状细胞癌，除非另行指定；结肠直肠的例子)。在这两组之间表达显著不同的任何基因或基因组合可以被认为是药物应答的预测因子。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的T细胞信号传导途径。任何表现出显著不同表达水平的基因(一组高，另一组低)可被认为是预测药物反应的潜在生物标志物。

在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的T细胞调节途径。任何表现出显著不同表达水平的基因(一组高，另一组低)可被认为是预测药物反应的潜在生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的抗原加工和/或抗原呈递。任何表现出显著不同表达水平的基因(一组高，另一组低)可被认为是预测药物反应的潜在生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的细胞因子信号传导途径。任何表现出显著不同表达水平的基因(一组高，另一组低)可被认为是预测药物反应的潜在生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如来自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的I型或II型干扰素途径。任何表现出显著不同表达水平的基因(一组高，另一组低)可被认为是预测药物反应的潜在生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的淋巴细胞发育和/或淋巴细胞迁移。任何表现出显著不同表达水平的基因(一组高，另一组低)可被认为是预测药物反应的潜在生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的免疫检查点途径。任何表现出显著不同表达水平的基因(一组高，另一组低)可被认为是预测药物反应的潜在生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估在源自响应于免疫疗法治疗的患者的样品和来自无应答者的样品之间在组中包含的任何基因(例如，PD-1、PD-L1、CTLA4等)或其组合的表达水平。任何表现出显著不同表达水平的基因(一组高，另一组低)可被认为是药物反应的潜在生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和来自无应答者的样品之间的抗原(例如，癌症睾丸抗原(GAGE)、黑素瘤抗原(MAGE))的基因或同种型的表达水平。任何表现出显著不同表达水平的基因(一组高，另一组低)可被认为是药物反应的潜在生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估在源自响应于免疫疗法治疗的患者的样品和来自无应答者的样品之间在组中包含的任何基因或其组合(例如，PD-1、PD-L1、CTLA4等)的原始读数或归一化读数的不同数学、定量或定性转化的表达水平。任何表现出显著不同表达水平的基因(一组高，另一组低)可被认为是药物反应的潜在生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于分析肿瘤微环境中的不同免疫亚群(例如：细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、骨髓衍生的抑制细胞)的炎性水平和丰度。来自治疗的应答者和非应答者的样品之间的这些标志物的表达水平的任何差异可以被认为是预测应答的生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于确定HLA类型及其与抗原呈递、T细胞和B细胞活化和药物反应的相关性。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于基于另一种测定法定义的分类器将肿瘤样品分类为治疗剂的可能的应答者或非应答者。在具体的实施方案中，提供的组合物和方法用于鉴定基因的子集，从中可以衍生另一组以用于本文所述的目的。在一个具体的实施方案中，可以将额外的引物组添加到当前组以产生可以用于本文所述目的的另外的组。

在另一个方面，提供的组合物和方法用于评估由免疫检查点调节剂上调或下调的基因的表达水平。见，例如https://en.wikipedia.org/wiki/Immune_checkpoint。由任何特定治疗剂调节的一种或多种基因的身份可用于阐明该药剂的作用机制。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估免疫检查点途径(包括例如PD-L1信号传导途径)中涉及的基因的表达水平。由任何特定治疗剂调节的一种或多种基因的身份可用于阐明该药剂的作用机制。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估涉及趋化因子信号传导、细胞因子信号传导和/或干扰素信号传导的基因的表达水平。由任何特定治疗剂调节的一种或多种基因的身份可用于阐明该药剂的作用机制。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估涉及肿瘤细胞粘附、肿瘤细胞迁移、肿瘤细胞增殖或癌症干性的基因的表达水平。与每种治疗剂相关的表达模式可用于推断该药剂的作用机制。在具体的实施方案中，提供的组合物和方法用于检测组中任何一种或多种基因表达的治疗后变化。这些基因的高或低表达水平将用于阐明经处理的药剂的作用机制。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于检测包含在组中的任何细胞内或细胞外蛋白质编码基因的表达的治疗后变化。这些基因的高或低表达水平可用于阐明该药剂的作用机制。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于研究响应于治疗剂或调节细胞外蛋白的药剂的治疗而改变的细胞内蛋白编码基因的表达。这些基因的高或低表达水平可用于阐明这些药剂的作用机制。在另外的实施方案中，提供的组合物和方法用于研究在不同时间点或治疗条件下包含在组中的任何基因的表达。这些基因的高或低表达水平可用于阐明药剂的作用机制。在具体的实施方案中，提供的组合物和方法用于研究在不同时间点或治疗条件下用不同治疗剂的包含在组中的任何基因的表达。被认为是互补的表达模式可以提供将相应的药剂组合以获得更大益处的理由。在具体的实施方案中，提供的组合物和方法用于研究在不同时间点或治疗条件下用不同治疗剂的包含在组中的任何基因的表达。被认为是互补的表达模式可以提供将相应的药剂组合以降低不良事件风险的理由。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于研究通过任何放射疗法、化学疗法、靶向疗法或免疫疗法调节的任何基因的表达。表达补充的互补模式可以提供将相应的药剂组合以获得更大益处或降低不良事件风险的理由。在其他实施方案中，提供的组合物和方法用于研究由T细胞疗法和免疫抑制疗法调节的任何基因的表达。表达的互补模式可以提供将相应的药剂组合以获得更大益处或降低不良事件风险的理由。

在一些实施方案中，所述方法的扩增的靶序列针对表1中提供的任何一种或多种基因。在一些实施方案中，所述方法的扩增的靶序列包含表1中提供的任何一种或多种扩增子序列。在一些实施方案中，所述方法的扩增的靶序列由表1中提供的任何一种或多种扩增子序列组成。在一些实施方案中，所述方法的扩增的靶序列包括表1中提供的每个扩增子序列。

在一些实施方案中，所提供的方法中使用的组合物包含表2中提供的任何一种或多种免疫应答靶特异性引物对。在一些实施方案中，与所提供的方法结合使用的组合物包含表2中提供的所有免疫应答靶特异性引物对。在一些实施方案中，表2中提供的任何一种或多种免疫应答靶特异性引物对可用于扩增样品中存在的靶序列，如本文所述的方法所公开的。

在一些实施方案中，所述方法利用表2的免疫应答靶特异性引物并且包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、40、60、80、100、150、200、250、300、350、398或更多个靶特异性引物对。在一些实施方案中，方法包括靶向扩增的靶序列，其包括表1中产生的一种或多种扩增的靶序列(例如，使用表2中提供的扩增子靶特异性引物)。在一些实施方案中，方法包括使用至少一种靶特异性引物对，其中每种引物与选自SEQ ID NOs:399-1194的至少一个核酸序列至少90％同一。在一些实施方案中，方法包括使用与癌症相关的靶特异性引物中的至少一个跨越其全部长度与样品中的至少一个靶序列互补。在一些实施方案中，方法包括使用与癌症相关的靶特异性引物中的至少一个包括3'端处的非可裂解核苷酸。在一些实施方案中，方法包括使用靶特异性引物，其中3'末端的不可切割核苷酸包括末端3'核苷酸。在一个实施方案中，方法包括使用针对具有与癌症相关的异常表达的一个或多个个别外显子的经扩增的靶序列。在一个实施方案中，方法包括使用针对具有与癌症相关的突变的个别外显子的经扩增的靶序列。在一些实施方案中，提供的方法包括样品中超过一个靶序列的选择性扩增和与癌症相关的突变的检测和/或鉴别。在一些实施方案中，方法包括使用扩增的靶序列，其包括表2中提供的两个或更多个核苷酸序列。在一些实施方案中，方法包括使用扩增的靶序列，其包括使用表2中提供的靶特异性引物产生的任何一种或多种扩增的靶序列。在一个实施方案中，方法包括使用扩增的靶序列，其包括包括表1中的10、50、100、150、200、250、300、350或更多个扩增子。在一些实施方案中，方法包括检测和任选地鉴定临床上可行标志物。如本文中所定义，术语“临床上可行标志物”包括已知的或可由所属领域的一般技术人员与(但不限于)癌症治疗的预后相关联的临床上可行的突变和/或临床上可行的表达模式。在一个实施方案中，癌症治疗的预后包括与癌症对药物、药物组合或治疗方案起反应或不起反应相关的突变和/或表达模式的鉴别。在一个实施方案中，方法包括多个靶序列从与癌症的发作、进展或缓解有关或相关的核酸分子群体的扩增。

在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于比较来自具有良好预后(由持久应答、总体存活率或5年存活率定义)和预后不良的患者的样品之间的绝对或相对基因表达变化。例如，显示显著不同表达水平的基因(例如，一组中高，另一组中低)可被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，所提供的组合物和方法用于比较与含有高水平肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和含有低水平TIL的样品相关的绝对或相对基因表达变化，如病理学综述所报道的。例如，基因或基因组合在这两组之间的表达显著不同可被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于比较与不同组织病理学亚型分子亚型(乳腺癌的实例包括腔A、腔B、基底样、HER2阳性)的样品相关的绝对或相对基因表达变化。例如，在任何这些组之间表达显著不同的基因或基因组合可以被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于比较与不同组织病理学亚型(例如，对于乳腺癌，包括例如ER+、PR+、HER2+、三阴性)的样品相关的绝对或相对基因表达变化。例如，在这两组之间表达显著不同的基因或基因组合可以被认为是预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的T细胞信号传导途径。例如，显示显著不同表达水平的基因(例如，一组中高，另一组中低)可被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的T细胞调节途径。例如，显示显著不同表达水平的基因(一组中高，另一组中低)可被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的抗原加工和/或抗原呈递的基因表达。例如，显示显著不同表达水平的基因(一组中高，另一组中低)可被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的细胞因子信号传导途径的基因表达。例如，显示显著不同表达水平的基因(一组中高，另一组中低)可被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如来自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的I型或II型干扰素途径。例如，显示显著不同表达水平的基因(一组中高，另一组中低)可被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的淋巴细胞发育和迁移。例如，显示显著不同表达水平的基因(一组中高，另一组中低)可被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估不同途径和功能的绝对或相对基因表达水平，例如源自响应免疫疗法治疗的患者的样品和源自非应答者的样品之间的免疫检查点途径。例如，显示显著不同表达水平的基因(一组中高，另一组中低)可被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估在源自响应于免疫疗法治疗的患者的样品和来自无应答者的样品之间在组中包含的任何基因(例如，如PD-1、PD-L1、CTLA4等)或其组合的表达水平。例如，显示显著不同表达水平的基因(一组中高，另一组中低)可被认为是潜在的预后生物标志物。在某些实施方案中，提供的组合物和方法用于评估在源自响应于免疫疗法治疗的患者的样品和来自无应答者的样品之间在组中包含的任何基因或其组合(例如，如PD-1、PD-L1、CTLA4等)的原始读数或归一化读数的不同数学、定量或定性转化的表达水平。例如，显示显著不同表达水平的基因(一组中高，另一组中低)可被认为是潜在的预后生物标志物。在一些实施方案中，提供的组合物和方法用于分析肿瘤微环境中的不同免疫亚群(例如：细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、骨髓衍生的抑制细胞)的炎性水平和存在。来自治疗的应答者和非应答者的样品之间的这些标志物的表达水平的任何差异可以被认为是潜在的预后生物标志物。

在一些实施方案中，持家基因与免疫应答测定中提供的方法结合使用。在某些实施方案中，一种或多种持家基因序列包括在测定方法中。在特定方法实施方案中，一种或多种持家基因选自ABCF1、G6PD、GUSB、HMBS、LMNA、LRP1、POLR2A、SDHA、TBP、TFRC和TUBB。

在一些实施方案中，本公开内容提供了来自表达的核酸分子群的多个靶特异性序列的扩增。在一些实施方案中，所述方法包括将一个或多个靶特异性引物对杂交到靶序列，延伸引物对的第一引物，使来自核酸分子群体的延伸第一引物产物变性，将引物对的第二引物杂交到延伸第一引物产物，延伸第二引物以形成双链产物，和远离双链产物消化靶特异性引物对来产生多个扩增靶序列。在一些实施方案中，消化包括从扩增的靶序列中部分消化一种或多种靶特异性引物。在一些实施方案中，扩增靶序列可以连接到一个或多个衔接子。在一些实施方案中，衔接子可以包括一个或多个DNA条码或标记序列。在一些实施方案中，扩增靶序列一旦连接到衔接子，可以经历切口平移反应和/或进一步扩增来产生衔接子连接的扩增靶序列库。

在一些实施方案中，提供的方法包括制备和形成多种免疫应答靶特异性扩增子。在一些实施方案中，该方法包括将一个或多个靶特异性引物对与核酸分子杂交，延伸引物的第一引物，使来自核酸分子的延伸的第一引物变性，将引物对的第二引物与延伸的第一引物产物杂交，并延伸第二引物，消化靶特异性引物对以产生多个靶特异性扩增子。在一些实施方案中，可以在进行切口平移反应之前将衔接子连接至靶特异性扩增子的末端，以产生适合于核酸测序的多个靶特异性扩增子。在一些实施方案中，可以使用桥式扩增或emPCR扩增一种或多种靶特异性扩增子，以产生适合于核酸测序的多种克隆模板。在一些实施方案中，本公开提供了用于制备靶特异性扩增子文库的方法，用于多种下游过程或测定例如核酸测序或克隆扩增中。在一个实施方案中，本公开提供了使用具有可切割基团的引物对具有多个表达的靶序列的核酸样品进行靶特异性多重PCR的方法。

在某些实施方案中，待测序的文库和/或模板制备可以使用自动化系统，例如IonChef^TM系统，使用本文提供的组合物从核酸样品群自动制备。

在一个实施方案中，使用Ion Torrent PGM 318^TM或Ion Torrent S5520^TM或IonTorrent S5 530^TM系统测序的核酸模板可以使用本文概述的靶特异性扩增技术从核酸分子群制备。。任选地，在靶特异性扩增后，可以进行二级和/或三级扩增过程，包括但不限于文库扩增步骤和/或克隆扩增步骤如emPCR。

在一些实施方案中，提供了包含多个靶特异性引物对的组合物，每个引物对包含正向引物和反向引物，所述反向引物具有至少一个可切割基团，其位于a)3'末端或5'末端，和/或b)在靶特异性引物的中心核苷酸位置附近，并且其中靶特异性引物对可以与组合物中的其他引物对基本上不互补。在一些实施方案中，组合物包含至少50、100、150、200、250、300、350、398或更多个靶特异性引物对。在一些实施方案中，靶特异性引物对包含长度为约15个核苷酸至约40个核苷酸，其中至少一个核苷酸被可切割基团取代。在一些实施例中，可裂解基团可以是尿苷核苷酸。在一些实施方案中，靶特异性引物组被设计用于扩增与临床或病理状况相关的基因组的外显子、基因、外显子组或区域，例如，与癌症相关的一种或多种表达序列的扩增，其中表达的增加和/或降低与免疫应答的变化有关。在一些实施方案中，靶特异性引物组被设计为扩增与免疫应答的变化相关的基因组的外显子、基因、外显子组或区域，其中表达的增加和/或减少指示癌症患者应答一种或多种治疗剂的可能性。在一些实施方案中，靶特异性引物组被设计为扩增与临床或病理状况相关的基因组的外显子、基因、外显子组或区域，例如，与癌症相关的一种或多种突变的扩增。在一些实施方案中，当与靶序列杂交并如本文所概述的那样扩增时，靶特异性引物对可以产生长度为约100至约500个碱基对的衔接子连接的扩增靶序列文库。在一些实施方案中，与文库中衔接子连接的扩增的靶序列的其余部分相比，文库中没有一个衔接子连接的扩增的靶序列过表达超过30％。在一些实施方案中，衔接子连接的扩增的靶序列文库相对于GC含量、扩增的靶序列长度或解链温度(Tm)基本上是同源的。

在一些实施方案中，提供了用于进行多重PCR的试剂盒，其包含多个具有可切割基团的靶特异性引物、DNA聚合酶、衔接子、dATP、dCTP、dGTP和dTTP。在一些实施例中，可裂解基团可以是尿嘧啶核苷酸。试剂盒可以进一步包括一种或多种抗体、核酸条形码、纯化溶液或柱。

在一些实施方案中，提供了用于产生靶特异性扩增子文库的试剂盒，其包含多个具有可切割基团的靶特异性引物、DNA聚合酶、衔接子、dATP、dCTP、dGTP、dTTP和切割试剂。在一些实施方案中，试剂盒还包含一种或多种抗体、核酸条形码、纯化溶液或柱。

在一个实施方案中，提供了用于从单个核酸来源或样品扩增多个靶特异性序列的方法。在另一个实施方案中，提供了用于来自两种或更多种核酸来源、样品或物种的两种或更多种靶序列的靶特异性扩增的方法。例如，本公开内容设想单个核酸样品可包括表达的RNA或固定的福尔马林石蜡包埋的(FFPE)RNA。还设想样品可来自单个个体，来自遗传相关成员的核酸样品的集合，来自遗传无关成员的多个核酸样品，来自单个个体的(匹配的)多个核酸样品(例如肿瘤样品)和正常组织样品，或来自单一来源的遗传物质，所述单一来源含有两种不同形式的遗传物质，例如从母体受试者获得的母体和胎儿RNA，或含有植物或动物核酸的样品中存在污染细菌RNA。在一些实施方案中，核酸材料源可包括从新生儿获得的核酸，例如通常作为用于新生儿筛选的血液样品获得的核酸。

核酸样品可包括高分子量物质，例如表达的RNA或cDNA。样品可包括低分子量材料，例如从FFPE获得的核酸分子或存档的RNA样品。在另一个实施方案中，低分子量材料包括酶促或机械剪切的核酸样品。样品可包括无细胞循环RNA，例如从母体受试者获得的材料。在一些实施方案中，样品可包括从活组织检查、肿瘤、刮屑、拭子、血液、粘液、尿液、血浆、精液、毛发、激光捕获微解剖、手术切除和其他临床或实验室获得的样品获得的核酸分子。在一些实施方案中，样品可包括从动物例如人或哺乳动物来源获得的核酸分子。在另一个实施方案中，样品可包括从非哺乳动物来源例如植物、细菌、病毒或真菌获得的核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子的来源可以是存档的或灭绝的样品或物种。

在一些实施方案中，提供的方法包括选择性扩增正常或患病的含有组织、活组织检查、核心、肿瘤、细针抽吸物、细针活组织检查、肿瘤微环境、血液、血清或其他样品中的至少一种靶序列。在一些实施方案中，提供的方法包括选择性扩增至少一种靶序列和检测和/或鉴定患病组织、活组织检查、核心、肿瘤、细针抽吸物、细针活组织检查、肿瘤微环境、血液、血清或其他样品中的突变。在一些实施方案中，患病或正常样品可包括完整转录组RNA、福尔马林固定的石蜡包埋组织(FFPE)、剪切或酶处理的RNA。在一些实施方案中，本公开内容涉及至少一种靶序列的选择性扩增和临床上可行的突变或表达模式的检测和/或鉴定。在一些实施方案中，本公开内容涉及检测和/或鉴定与药物抗性或药物敏感性相关的突变或表达。

在一些实施方案中，提供的方法包括在无细胞循环RNA中选择性扩增至少一种靶序列。在一些实施方案中，样品中至少一种靶序列的选择性扩增包括不同核酸分子的混合物。选择性扩增可任选地伴随检测和/或鉴定在循环RNA中观察到的突变。在一些实施方案中，选择性扩增可任选地伴随检测和/或鉴定与癌症或遗传性疾病例如代谢、神经肌肉、发育，心血管、自身免疫或其他遗传性疾病相关的突变。

在一些实施方案中，靶特异性引物和引物对是可以扩增核酸分子的特定区域的靶特异性序列。在一些实施方案中，靶特异性引物可以扩增表达的RNA或cDNA。在一些实施方案中，靶特异性引物可以扩增哺乳动物RNA，例如人RNA或由其制备的cDNA。在一些实施方案中，选择性扩增所需的RNA量可为约1ng至1微克。在一些实施方案中，选择性扩增一种或多种靶序列所需的RNA量可为约1ng、约5ng或约10ng。在一些实施方案中，选择性扩增靶序列所需的RNA量为约10ng至约200ng。

在一些实施方案中，至少一种靶序列的选择性扩增还包括扩增的靶序列的核酸测序。任选地，所述方法进一步包括检测和/或鉴别经由经扩增的靶序列的核酸测序鉴别的样品中的突变。

在一个实施方案中，可以使用本文公开的任何一种或多种靶特异性引物扩增含有一种或多种靶序列的样品。在另一个实施方案中，使用本文公开的方法(和相关组合物、系统、设备和试剂盒)获得的扩增的靶序列可以与下游过程相联，例如但不限于核酸测序。例如，一旦已知扩增的靶序列的核酸序列，就可以将该核酸序列与一种或多种参考样品例如Hg19基因组进行比较。Hg19基因组通常在基因组学领域中用作人类的参考基因组样品。

设想本领域普通技术人员可以使用本文公开的引物标准容易地制备一种或多种靶特异性引物，而无需过多的实验。还设想本领域普通技术人员可以使用本文公开的标准容易地制备一种或多种靶特异性引物，以鉴定至少一种医学相关的多态性。在某些情况下，医学相关的多态性可用于法医或人类鉴定目的。医学相关突变包括与多个群体(例如，欧洲高加索人群)中的至少一种疾病状态相关的突变。在一些实施方案中，医学相关的多态性包括下文概述的任何一种或多种多态性。

在一些实施方案中，提供了用于减少多重PCR中扩增假象的形成的方法(和相关组合物、系统、装置和试剂盒)。在一些实施方案中，与现有技术的标准多重PCR相比，以较低的数量或产率获得引物二聚体或非特异性扩增产物。在一些实施方案中，扩增假象的减少部分地由多重PCR反应中靶特异性引物对的使用决定。在一个实施方案中，多重PCR反应中靶特异性引物对的数量可以大于50、100、150、200、250、300或更多。在一些实施方案中，提供了使用含有可切割基团的靶特异性引物进行多重PCR的方法(和相关组合物、系统、装置和试剂盒)。在一个实施方案中，含有可切割基团的靶特异性引物可以包括每个引物对的每个引物的一个或多个可切割部分。在一些实施方案中，含有可切割基团的靶特异性引物包括通常不存在于非患病样品中的核苷酸，也不是经历多重PCR的核酸群体的天然核苷酸。例如，靶特异性引物可包括一种或多种非天然核酸分子，例如但不限于胸腺嘧啶二聚体、8-氧代-2'-脱氧鸟苷、肌苷、脱氧尿苷、溴脱氧尿苷、脱嘌呤核苷酸等。

在一些实施方案中，提供的方法(和相关的组合物，系统等)涉及从核酸群体进行靶序列的初级扩增，任选地使用靶特异性引物。在一些实施方案中，提供的方法涉及使用靶特异性正向和反向引物对扩增靶序列。靶特异性正向和反向引物对可任选地包括一个或多个内含子特异性和/或外显子特异性正向和反向引物对。在一些实施方案中，每个引物对针对单个或离散的外显子。在一些实施方案中，提供的方法涉及使用含有至少一个可切割基团的外显子特异性正向和反向引物对扩增靶序列。在一些实施方案中，靶特异性正向和反向引物对含有尿嘧啶核苷酸作为一个或多个可切割基团。在一个实施方案中，靶特异性引物对可以在每个引物对的每个正向和反向引物中包含尿嘧啶核苷酸。在一个实施方案中，靶特异性正向或反向引物含有一个、两个、三个或更多个尿嘧啶核苷酸。在一些实施方案中，提供的方法涉及使用含有至少两个尿嘧啶核苷酸的正向和反向引物对从具有多个靶序列的核酸群扩增至少10、50、100、150、200、250、300、350、398或更多个靶序列。

在一些实施方案中，可以使用根据指定设计标准产生寡核苷酸序列的算法从头设计靶特异性引物(包括但不限于内含子特异性和外显子特异性引物，其可以是正向和/或反向引物)。例如，可以根据本文指定的任何一种或多种标准选择引物。在一些实施方案中，选择或设计一种或多种靶特异性引物以满足以下标准中的任何一个或多个：(1)在引物序列内包含两个或更多个修饰的核苷酸，其中至少一个包括在引物的末端附近或末端处，并且其中至少一个包含在引物序列的中心核苷酸位置处或附近；(2)引物长度约15至约40个碱基；(3)T_m为约60℃至约70℃；(4)与靶基因组或目标样品中存在的非靶序列的低交叉反应性；(5)对于给定反应中的每个引物，至少前四个核苷酸的序列(从3'到5'方向)与同一反应中存在的任何其他引物内的任何序列不互补；(6)没有扩增子包括与任何其他扩增子内的任何序列互补的至少5个核苷酸的任何连续段。

在一些实施方案中，靶特异性引物包括一个或多个引物对，其设计用于扩增来自样品的靶序列，其长度为约100个碱基对至约500个碱基对。在一些实施方案中，靶特异性引物包括设计用于扩增靶序列的多个引物对，其中预测扩增的靶序列的长度彼此变化不超过50％，通常不超过25％，甚至通常不超过10％或5％。例如，如果选择或预测一个靶特异性引物对以扩增长度为100个核苷酸的产物，则选择或预测其他引物对以扩增长度在50-150个核苷酸之间的产物，通常长度为75-125个核苷酸，甚至更通常为90-110个核苷酸，或95-105个核苷酸，或长度为99-101个核苷酸。

在一些实施方案中，根据任何预定的选择标准，不是从头设计扩增反应中的至少一个引物对。例如，至少一个引物对可以是随机选择或产生的寡核苷酸序列，或者先前为其他应用选择或产生的寡核苷酸序列。在一个示例性实施方案中，扩增反应可包括至少一种选自探针试剂(Roche Molecular Systems)的引物对。试剂包括标记的探针，尤其可用于测量样品中存在的靶序列的量，可选地实时进行。TaqMan技术的一些例子公开在美国专利5,210,015、5,487,972、5,804,375、6,214,979、7,141,377和7,445,900中，其全部内容在此引入作为参考。

在一些实施方案中，扩增反应中的至少一种引物可以例如用光学可检测的标记进行标记，以促进特定的目标应用。例如，标记可以促进靶模板和/或扩增产物的定量、靶模板和/或扩增产物的分离等等。

在一些实施方案中，扩增反应中的一个或多个引物可用于核酸样品的基因分型。

在一些实施方案中，靶特异性引物可以作为一组靶特异性引物对在单个扩增容器中提供。在一些实施方案中，靶特异性引物可以以一个或多个等分的靶特异性引物对提供，所述靶特异性引物对可以在单个扩增容器或反应室中进行多重PCR反应之前合并。在一个实施方案中，靶特异性引物可以作为靶特异性正向引物库和单独的靶特异性反向引物库提供。在另一个实施方案中，可以将靶特异性引物对合并成子集，例如非重叠的靶特异性引物对。在一些实施方案中，靶特异性引物对的库可以在单个反应室或微孔中提供，例如在PCR板上提供，以使用热循环仪进行多重PCR。在一些实施方案中，靶特异性正向和反向引物对可以与靶序列基本上互补。

在一些实施方案中，进行多重PCR扩增的方法包括使具有正向和反向引物的多个靶特异性引物对与靶序列群体接触以形成多个模板/引物双螺旋；持续足够时间并在足够温度下将DNA聚合酶和dNTP混合物添加到所述多个模板/引物双螺旋中以经由模板依赖性合成延伸每一靶特异性引物对中的正向或反向引物(或两者)，进而产生多个延伸引物产物/模板双螺旋；使延伸引物产物/模板双螺旋变性；将来自靶特异性引物对的互补引物结合到延伸引物产物；以及在DNA聚合酶和dNTP存在下延伸结合引物以形成多个靶特异性双链核酸分子。在一些实施方案中，扩增PCR方法的步骤可以以任何顺序进行。在一些情况下，可以进一步优化本文公开的方法以去除一个或多个步骤，并且仍然获得足够的扩增的靶序列以用于各种下游过程。例如，可以修改纯化或清除步骤的数量以包括比本文公开的更多或更少的步骤，条件是以足够的产率产生扩增的靶序列。

在一些实施方案中，靶特异性引物对在引物的3'或5'末端不含有共同的延伸(尾部)。在另一个实施方案中，靶特异性引物不含Tag或通用序列。在一些实施方案中，靶特异性引物对被设计为消除或减少促进非特异性扩增形成的相互作用。

在一个实施方案中，靶特异性引物对包含每个正向和反向靶特异性引物的至少一个可切割基团。在一个实施方案中，可切割基团可以是尿嘧啶核苷酸。在一个实施方案中，在产生扩增的靶序列后部分或基本上除去靶特异性引物对。在一个实施方案中，去除可以包括酶、热或碱处理作为扩增的靶序列的一部分的靶特异性引物对。在一些实施方案中，进一步处理扩增的靶序列以形成平端扩增产物，在本文中称为平端扩增的靶序列。

需要新的方法、计算机可读介质和系统，用于鉴定或设计使用PCR来富集一个或多个目标基因组区域(其可以是例如1kb至1Mb的累积区域)用于后续测序的产品或试剂盒。

需要用于鉴定或设计产品或试剂盒的新方法、计算机可读介质和系统，所述产品或试剂盒包括使一种或多种基因组区域或目标靶标的覆盖最大化同时使脱靶杂交、引物数量和引物库数量的一种或多种最小化的引物或测定法。

根据本申请中体现的教导内容和原理，提供了新的方法、计算机可读介质和系统，其坚定或设计使用PCR来富集一个或多个目标基因组区域或靶标以用于后续测序的产品或试剂盒，和/或包括使一个或多个目的基因组区域或靶标的覆盖度最大化同时使脱靶杂交、引物数量和引物库数量的一种或多种最小化的引物或测定法。

根据示例性实施方案，提供了一种方法，包括：(1)接收或提供基因组靶区域和所述基因组靶区域的一组候选扩增子作为输入；(2)生成包括源顶点、与该组候选扩增子对应排列的一组扩增子顶点和汇顶点的图形；(3)确定与通过扩增子顶点从源顶点到汇顶点的图形上的一条或多条路径相关联的成本；(4)从相关联的成本最低的图中一条或多条路径中的一条路径提取扩增子顶点。

在各种实施方案中，所述一条或多条路径可包含扩增子序列，其中扩增子序列中第一扩增子的插入物的末端部分与扩增子序列中第二扩增子的插入物的起始部分重叠。扩增子序列中第二扩增子插入物的末端部分可以与扩增子序列中第三扩增子插入物的起始部分重叠。扩增子序列中第三扩增子插入物的末端部分可以与扩增子序列中第四扩增子插入物的起始部分重叠。

在各种实施方案中，所述一条或多个条路径可包含N个扩增子的序列，N为正整数，其中扩增子序列中扩增子amp的插入物的末端部分与扩增子序列中扩增子amp+1的插入物的起始部分重叠，其中amp是取数值1,...,N-1的整数。一条或多条路径可以包括L＝N+M个扩增子的序列，N和M是正整数，其中扩增子序列中的扩增子amp的插入物的末端部分重叠(可以仅包括触摸)扩增子序列中扩增子amp+1的插入物的起始部分，其中amp是取值为1,...,N-1的整数；其中扩增子序列中扩增子amp插入物的末端部分与扩增子序列中扩增子amp+1的插入物的起始部分重叠(可仅包括触摸)，其中amp是取值为N+1,...,N+M-1的整数；并且其中在扩增子amp＝N的插入物的末端部分和扩增子amp＝N+1的插入物的起始部分之间存在间隙。

在各种实施方案中，与一条或多条路径中的每一条相关联的成本可以是链接两个扩增子顶点的路径的每个边缘的成本的总和。与连接两个扩增子顶点的路径的每个边缘相关联的成本可以是与边缘的目的地扩增子顶点的成本相关的第一项和与边缘的目的地扩增子的插入物和边缘的起源扩增子的插入物之间的重叠的成本相关的第二项的总和。可以通过混合因子对第一项和第二项进行加权，使得第一项乘以混合因子或其函数，并且第二项乘以1减去混合因子或其函数。扩增子顶点的成本可以是沿第一值和第二值之间的标度的数值，所述第一值表示选自至少包含脱靶扩增水平和引物二聚体倾向水平的组的一个或多个不期望特征的较低水平，所述第二值表示所述一个或多个不期望特征的较高水平。边缘的目的地扩增子的插入物与边缘的起源扩增子的插入物之间的重叠的成本可以基于由重叠插入物引入的冗余来确定。边缘的目的地扩增子的插入物与边缘的起源扩增子的插入物之间的重叠的成本可以是边缘的目的地扩增子的插入物与边缘的起源扩增子的插入物之间的重叠中碱基对的数量和边缘的目的地扩增子的插入物与边缘的起源扩增子的插入物的联合中碱基对数量之间的商的函数。

根据示例性实施方案，提供了一种包括指令的非暂时性机器可读存储介质，所述指令在由处理器执行时使处理器执行包括以下步骤的方法：(1)接收或提供基因组靶区域和所述基因组靶区域的一组候选扩增子作为输入；(2)生成包括源顶点、与该组候选扩增子对应排列的一组扩增子顶点和汇顶点的图形；(3)确定与通过扩增子顶点从源顶点到汇顶点的图形上的一条或多条路径相关联的成本；(4)从相关联的成本最低的图中一条或多条路径中的一条路径提取扩增子顶点。在一些实施方案中，这种方法可以扩展到通过使用对应于提取的顶点的扩增子作为输入在多个库中汇集扩增子的方法。

根据示例性实施方案，提供了一种系统，其包括：(1)机器可读存储器；和(2)处理器，其被配置为执行机器可读指令，当由处理器执行时，所述指令使得系统执行包括以下的步骤：(a)接收或提供基因组靶区域和所述基因组靶区域的一组候选扩增子作为输入；(b)生成包括源顶点、与该组候选扩增子对应排列的一组扩增子顶点和汇顶点的图形；(c)确定与通过扩增子顶点从源顶点到汇顶点的图形上的一条或多条路径相关联的成本；(d)从相关联的成本最低的图中一条或多条路径中的一条路径提取扩增子顶点。在一些实施方案中，通过使用对应于提取的顶点的扩增子作为输入，这样的系统可以扩展到用于跨多个库汇集扩增子的系统。

根据各种示例性实施方案，可以使用适当配置和/或编程的硬件和/或软件元件来执行或实施上述教导内容和/或示例性实施方案中的任一个或多个的一个或多个特征。确定是否使用硬件和/或软件元件来实施实施方案可以基于任何数量的因素，如期望的计算速率、功率水平、耐热性、处理周期预算、输入数据速率、输出数据速率、存储器资源、数据总线速度等以及其它设计或性能限制。

硬件元件的实例可以包括通过以下各项通信耦合的处理器、微处理器、一个或多个输入设备和/或一个或多个输出设备(I/O)(或外围设备)：本地接口电路、电路元件(例如晶体管、电阻器、电容器、电感器等)、集成电路、专用集成电路(ASIC)、可编程逻辑设备(PLD)、数字信号处理器(DSP)、现场可编程门阵列(FPGA)、逻辑门、寄存器、半导体设备、芯片、微芯片、芯片组等。本地接口可以包括例如一个或多个总线或其它有线或无线连接、控制器、缓冲器(高速缓存器)、驱动器、中继器和接收器等以允许硬件组件之间的适当通信。处理器是用于执行软件的硬件设备，尤其是储存在存储器中的软件。处理器可以是任何定制的或市售的处理器、中央处理单元(CPU)、与计算机相关联的若干处理器中的辅助处理器、基于半导体的微处理器(例如呈微芯片或芯片组的形式)、宏处理器、或用于执行软件指令的任何设备。处理器还可以表示分布式处理架构。I/O设备可以包括输入设备，例如键盘、鼠标、扫描仪、麦克风、触摸屏、用于各种医疗设备和/或实验室仪器的接口、条形码读取器、触笔、激光读取器、射频设备读取器等。此外，I/O设备还可以包括输出设备，例如打印机、条形码打印机、显示器等。最后，I/O设备可以进一步包括作为输入件和输出件进行通信的设备，例如调制器/解调器(调制解调器；用于访问另一个设备、系统或网络)、射频(RF)或其它收发器、电话接口、桥接器、路由器等

软件的实例可以包括软件组件、程序、应用、计算机程序、应用程序、系统程序、机器程序、操作系统软件、中间件、固件、软件模块、例程、子例程、函数、方法、过程、软件接口、应用程序接口(API)、指令集、计算代码、计算机代码、代码段、计算机代码段、单词、值、符号或其任何组合。存储器中的软件可以包括一个或多个单独的程序，所述程序可以包括用于实施逻辑函数的有序的可执行指令列表。存储器中的软件可以包括用于根据本教导内容标识数据流的系统和任何合适的定制或市售的操作系统(O/S)，其可以控制其它计算机程序如系统的执行，并提供调度、输入输出控制、文件和数据管理、存储管理、通信控制等。

根据各种示例性实施方案，可以使用可以储存指令或指令集的适当地配置和/或编程的非暂时性机器可读介质或物件来执行或实施上述教导内容和/或示例性实施方案中的任一个或多个的一个或多个特征，所述指令或指令集如果由机器执行，则可以使机器执行根据示例性实施方案的方法和/或操作。这样的机器可以包括例如任何合适的处理平台、计算平台、计算设备、处理设备、计算系统、处理系统、计算机、处理器、科学或实验室仪器等，并且可以使用硬件和/或软件的任何合适的组合来实施。机器可读介质或物件可以包括例如任何合适类型的存储器单元、存储器设备、存储器物件、存储器介质、储存设备、储存物件、储存介质和/或储存单元，例如存储器、可移动介质或不可移动介质、可擦除介质或不可擦除介质、可写或可重写介质、数字或模拟介质、硬盘、软盘、只读存储器光盘(CD-ROM)、可刻录光盘(CD-R)、可重写光盘(CD-RW)、光盘、磁介质、磁光介质、可移动存储卡或磁盘、各种类型的数字多功能光盘(DVD)、磁带、磁带盒等，包括适用于计算机的任何介质。存储器可以包括易失性存储器元件(例如随机存取存储器(RAM，如DRAM、SRAM、SDRAM等))和非易失性存储器元件(例如ROM、EPROM、EEROM、闪存器、硬盘驱动器、磁带、CDROM等)中的任一个或组合。此外，存储器可以并入电子、磁性、光学和/或其它类型的储存介质。存储器可以具有分布式架构，其中各种组件远离彼此定位，但仍然通过处理器访问。指令可以包括使用任何合适的高级的、低级的、面向对象的、可视的、编译的和/或解释的编程语言实施的任何合适类型的代码，如源代码、编译代码、解释代码、可执行代码、静态代码、动态代码、加密代码等。

根据各种示例性实施方案，可以至少部分地使用分布式、群集、远程或云计算资源来执行或实施上述教导内容和/或示例性实施方案中的任一个或多个的一个或多个特征。

根据各种示例性实施方案，可以使用源程序、可执行程序(对象代码)、脚本或包含一组待执行指令的任何其它实体来执行或实施上述教导内容和/或示例性实施方案中的任一个或多个的一个或多个特征。当源程序时，所述程序可以通过可以包括或不包括在存储器中的编译器、汇编器、解释器等翻译以便与O/S一起正确地操作。指令可以使用以下各项来书写：(a)具有数据类和方法类的面向对象的编程语言；或(b)具有例程、子例程和/或函数的过程编程语言，可以包括例如C、C++、Pascal、Basic、Fortran、Cobol、Perl、Java和Ada。

根据各种示例性实施方案，上述示例性实施方案中的一个或多个可以包括向使用者接口设备、计算机可读储存介质、本地计算机系统或远程计算机系统发送、显示、储存、打印或输出与可以通过这类示例性实施例生成、访问或使用的任何信息、信号、数据和/或中间结果或最终结果有关的信息。举例来说，这种发送、显示、储存、打印或输出的信息可以采用可搜索和/或可过滤的运行和报告、图片、表格、图表、图形、电子表格、相关性、序列和其组合列表的形式。

可以通过重复、添加或替换在一个或多个上述示例性实施方案中阐述的任何一般或具体描述的特征和/或组件和/或物质和/或步骤和/或操作条件来导出各种另外的示例性实施方案。此外，应该理解，只要步骤或动作的目的仍然可以实现，步骤的顺序或执行某些动作的顺序是不重要的，除非另外特别说明。此外，除非特别说明，否则可以同时进行两个或更多个步骤或动作，只要步骤或动作的目标仍然可实现。此外，除非另外特别说明，在上述示例性实施方案的一个中提到的任何一个或多个特征、组件、方面、步骤或其他特征可以被认为是上述示例性实施方案的任何另一个的潜在的可选特征、组件、方面、步骤或其他特征，只要上述示例性实施方案的该任何另一个的目的仍然是可实现的。

在一些实施方案中，通过本文公开的方法产生的扩增的靶序列代表从多个靶序列扩增的一个或多个外显子的至少60％、70％、80％、90％或更多。在一个实施方案中，本发明的扩增的靶序列长度为约90至约140个碱基对，长度为约100至约200个碱基对，长度为约100至约300个碱基对，或长度约100至约400个碱基对。在一个实施方案中，扩增的靶序列包括每个引物对的正向引物的长度和互补反向引物的长度。在另一个实施方案中，扩增的靶序列长度包括反向引物的长度和互补正向引物的长度。在一些实施方案中，扩增的靶序列的长度减去正向和反向引物长度为约40个碱基对至约350个碱基对。在一些实施方案中，在多重PCR反应中产生的扩增的靶序列的长度基本相同。如本文所定义，关于通过本文公开的方法产生的扩增的靶序列的长度，“基本上相同”是指在扩增的靶序列的总数上核苷酸长度的偏差不超过30％。在一个实施方案中，扩增子的GC含量百分比小于85％、小于75％、小于65％、小于60％或小于50％。在一个实施方案中，反应中基本上所有扩增的靶序列含有30％至小于85％的GC含量。在一个实施方案中，其中核酸分子是从存档的或FFPE RNA样品中获得的，扩增的靶序列的长度通常为约100至约200个碱基对的长度。在一个实施方案中，如果核酸样品是从表达的RNA或cDNA衍生或获得的，则扩增的靶序列的长度可以是约100至约500个碱基对的长度。

在一些实施方案中，所提供方法的扩增的靶序列可以在进行或不进行进一步纯化或操作的情况下用于各种下游分析或测定。例如，可以通过本领域已知的技术克隆扩增的靶序列，例如桥式扩增或emPCR，以产生可用于下一代测序的模板文库。在一些实施方案中，所提供方法的扩增靶序列或所得模板文库可用于单核苷酸多态性(SNP)分析，基因分型或表观遗传分析，拷贝数变异分析，基因表达分析，基因突变分析，包括但不限于检测、预后和/或诊断，检测和分析罕见或低频等位基因突变，核酸测序，包括但不限于从头测序、靶向重测序和合成装配分析。在一个实施方案中，扩增的靶序列可用于检测小于5％等位基因频率的突变。在一些实施方案中，本文公开的方法可用于检测核酸群中的突变，其具有小于4％、3％、2％或约1％的等位基因频率。在另一个实施方案中，可以对如本文所述制备的扩增的靶序列进行测序以检测和/或鉴定来自核酸分子群的种系或体细胞突变。

在一些实施方案中，靶特异性引物对中的正向和/或反向靶特异性引物可以与核酸分子群“互补”或“基本上互补”。如本文所述，“与核酸分子群基本上互补”是指引物与引物将与之杂交的核酸分子之间的互补百分比。如本文所用的术语“基本上互补”是指至少70％的互补性。因此，基本上互补是指引物和核酸分子之间的互补性的至少70％但小于100％的互补性范围。互补引物是与核酸分子具有100％互补性的引物。在一个实施方案中，设计每个靶特异性引物对以使在相同多重PCR反应中与另一引物(或引物对)的交叉杂交最小化(即，降低引物二聚体的普遍性)。在另一个实施方案中，设计每个靶特异性引物对以使与核酸分子群中的非特异性核酸序列的交叉杂交最小化(即，使靶外杂交最小化)。在一个实施方案中，设计每种靶特异性引物以使自身互补性、发夹结构或其他二级结构的形成最小化。

在一些实施方案中，扩增的靶序列通过聚合酶链式反应形成。可以使用一种或多种DNA聚合酶完成靶特异性引物的延伸。在一个实施方案中，聚合酶可以是任何家族A DNA聚合酶(也称为pol I家族)或任何家族B DNA聚合酶。在一些实施方案中，与非重组DNA聚合酶相比，DNA聚合酶可以是能够以更高的准确度和产率延伸靶特异性引物的重组形式。例如，聚合酶可包括高保真聚合酶或热稳定聚合酶。在一些实施方案中，靶特异性引物延伸的条件可包括“热启动”条件，例如热启动聚合酶，例如AmplitaqDNA聚合酶(AppliedBiosciences)、Taq DNA聚合酶高保真(Invitrogen)或KOD热启动DNA聚合酶(EMD Biosciences)。“热启动”聚合酶包括热稳定聚合酶和一种或多种在环境温度下抑制DNA聚合酶和3'-5'核酸外切酶活性的抗体。在某些情况下，“热启动”条件可包括适体。

在一些实施方案中，聚合酶可以是酶，例如Taq聚合酶(来自水生栖热菌(Thermusaquaticus))，Tfi聚合酶(来自Thermus filiformis)，Bst聚合酶(来自嗜热脂肪芽孢杆菌)，Pfu聚合酶(来自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus))，Tth聚合酶(来自嗜热菌(Thermus thermophilus)，Pow聚合酶(来自Pyrococcus woesei)，Tli聚合酶(来自斜纹热球菌(Thermococcus litoralis))，Ultima聚合酶(来自海栖热袍菌(Thermotogamaritima))，KOD聚合酶(来自极端嗜热古生菌(Thermococcus kodakaraensis))，Pol I和II聚合酶(来自Pyrococcus abyssi)和Pab(来自Pyrococcus abyssi)。在一些实施方案中，DNA聚合酶可包括至少一种聚合酶，例如AmplitaqDNA聚合酶(AppliedBiosciences)，DNA聚合酶的Stoffel片段(Roche)，KOD聚合酶(EMDBiosciences)，KOD热启动聚合酶(EMD Biosciences)，Deep Vent^TMDNA聚合酶(New EnglandBiolabs)，Phusion聚合酶(New England Biolabs)，Klentaq1聚合酶(DNA PolymeraseTechnology，Inc)，Klentaq Long Accuracy polymerase(DNA Polymerase Technology，Inc)，Omni KlenTaq^TMDNA聚合酶(DNA)Polymerase Technology，Inc)，Omni KlenTaq^TMLADNA聚合酶(DNA Polymerase Technology，Inc)，Taq DNA聚合酶(Invitrogen)，Hemo Klentaq^TM(New England Biolabs)，Taq DNAPolymerase High Fidelity(Invitrogen)，Pfx(Invitrogen)，Accuprime^TMPfx(Invitrogen)，或Accuprime^TMTaq DNAPolymerase High Fidelity(Invitrogen)。

在一些实施方案中，DNA聚合酶可以是热稳定的DNA聚合酶。在一些实施方案中，dNTP的混合物可以以随机或定义的顺序同时或顺序施用。在一些实施方案中，多重反应中存在的DNA聚合酶的量显著高于相应的单重PCR反应中使用的DNA聚合酶的量。如本文所定义，术语“显著更高”是指与相应的单重PCR反应相比，多重PCR反应中存在的DNA聚合酶浓度至少高3倍。

在一些实施方案中，扩增反应不包括扩增产物的环化，例如通过滚环扩增所公开的。

在一些实施方案中，本公开内容的方法包括选择性扩增含有多个核酸分子的样品中的靶序列，并将扩增的靶序列连接至至少一个衔接子和/或条形码。用于分子生物学文库制备技术的衔接子和条形码是本领域技术人员熟知的。本文使用的衔接子和条形码的定义与本领域中使用的术语一致。例如，条形码的使用允许每个多重反应检测和分析多个样品、来源、组织或核酸分子群。条形码和扩增的靶序列含有独特的核酸序列，通常是短的6-15个核苷酸序列，其鉴定和区分一个扩增的核酸分子与另一个扩增的核酸分子，即使当减去条形码的两个核酸分子都包含相同的核酸序列时也是如此。衔接子的使用允许以均匀的方式扩增每个扩增的核酸分子并有助于减少链偏差。衔接子可以包括通用衔接子或专用衔接子，这两者都可以在下游使用以执行一个或多个不同的功能。例如，通过本文公开的方法制备的扩增的靶序列可以连接到可以在下游用作克隆扩增平台的衔接子。衔接子可以作为模板链用于随后使用第二组引物进行扩增，因此允许衔接子连接的扩增靶序列的通用扩增。在一些实施方案中，靶核酸的选择性扩增以产生扩增子库可以进一步包括将一个或多个条形码和/或衔接子连接至扩增的靶序列。结合条形码的能力提高了样品通量，并允许同时分析多个样品或材料来源。在一个实例中，通过提供的方法制备的扩增的靶核酸分子可以连接到Ion Torrent^TM测序衔接子(A和P1衔接子，作为Ion Fragment Library Kit的组分出售，Life Technologies，部件号4466464)或Ion Torrent^TMDNA条形码(Life Technologies，部件号4468654)。

本文公开的方法涉及通过聚合酶链式反应(PCR)扩增多个靶序列。在一些实施方案中，多重PCR包括将一个或多个靶特异性引物对与核酸分子杂交，在DNA聚合酶和dNTP存在下通过模板依赖性合成延伸靶特异性引物对的引物；重复杂交和延伸步骤足够的时间和足够的温度，产生多个扩增的靶序列。在一些实施方案中，多重扩增反应方法的步骤可以以任何顺序进行。

成功多重扩增所需的核酸材料的量可为约1ng。在一些实施方案中，核酸材料的量可为约10ng至约50ng、约10ng至约100ng或约1ng至约200ng的核酸材料。可以使用更高量的输入材料，然而本公开的一个方面是从大约低(ng)的起始材料选择性地扩增多个靶序列。

本文公开的多重PCR扩增反应可包括通常在热循环仪上进行的多个“循环”。每个循环包括至少一个退火步骤和至少一个延伸步骤。在一个实施方案中，进行多重PCR扩增反应，其中靶特异性引物对与靶序列杂交；延伸杂交的引物，产生延伸的引物产物/核酸双链体；使延伸的引物产物/核酸双链体变性，使互补引物与延伸的引物产物杂交，其中延伸互补引物以产生多个扩增的靶序列。在一个实施方案中，本文公开的方法每个预扩增反应具有约5至约18个循环。每个循环的退火温度和/或退火持续时间可以相同；可以包括增量增加或减少，或两者的组合。每个循环的延伸温度和/或延伸持续时间可以相同；可以包括增量增加或减少，或两者的组合。例如，退火温度或延伸温度可以每循环保持恒定。在一些实施方案中，退火温度可以在每个循环中保持恒定，并且延伸持续时间可以每个循环递增地增加。在一些实施方案中，持续时间的增加或减少可以以15秒、30秒、1分钟、2分钟或4分钟的增量发生。在一些实施方案中，温度的升高或降低可以发生为0.5、1、2、3或4摄氏度的偏差。在一些实施方案中，可以使用热启动PCR技术进行扩增反应。这些技术包括在聚合开始之前使用加热步骤(>60℃)，以减少不期望的PCR产物的形成。其他技术，例如反应的一种或多种关键试剂例如镁或DNA聚合酶的可逆失活或物理分离，可以在蜡珠中隔离，其在变性步骤中加热反应时熔化，仅在更高的温度下释放试剂。DNA聚合酶也可以通过与适体或抗体结合而保持活性状态。这种结合在较高温度下被破坏，释放出可以不受阻碍地进行PCR的功能性DNA聚合酶。

在一些实施方案中，所公开的方法可任选地包括破坏一种或多种含引物的扩增假象，例如引物-二聚体、二聚体-二聚体或超级扩增子。在一些实施方案中，破坏可任选地包括处理引物和/或扩增产物，以便切割引物和/或扩增产物中存在的特定可切割基团。在一些实施方案中，治疗可包括一种或多种靶特异性引物的部分或完全消化。在一个实施方案中，治疗可包括从扩增产物中除去至少40％的靶特异性引物。可裂解处理可包括酶、酸、碱、热、光或化学活性。可切割的处理可导致引物的一个或多个核苷酸之间或扩增产物的一个或多个核苷酸之间的连接的切割或其他破坏。引物和/或扩增产物可任选地包括一个或多个修饰的核苷酸或核碱基。在一些实施方案中，切割可以选择性地发生在这些位点，或与修饰的核苷酸或核碱基相邻。在一些实施方案中，扩增的靶序列的切割或处理可导致磷酸化的扩增的靶序列的形成。在一些实施方案中，扩增的靶序列在5'末端被磷酸化。

在一些实施方案中，模板、引物和/或扩增产物包括可被特定酶识别的核苷酸或核碱基。在一些实施方案中，核苷酸或核碱基可以被特定酶结合。任选地，特定酶还可以在一个或多个位点切割模板、引物和/或扩增产物。在一些实施方案中，此类切割可发生在模板、引物和/或扩增产物内的特定核苷酸处。例如，模板、引物和/或扩增产物可包括一个或多个核苷酸或核碱基，其包括尿嘧啶，其可被酶识别和/或切割，例如尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG，也称为UNG)或甲脒嘧啶DNA糖基化酶(Fpg)。模板、引物和/或扩增产物可包括一个或多个核苷酸或核碱基，包括RNA特异性碱基，其可被酶如RNAseH识别和/或切割。在一些实施方案中，模板、引物和/或扩增产物可包括一个或多个无碱基位点，其可使用各种校正聚合酶或腺苷三磷酸双磷酶处理来识别和/或切割。在一些实施方案中，模板、引物和/或扩增产物可包括7,8-二氢-8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)核碱基，其可被酶如Fpg识别或裂解。在一些实施方案中，一种或多种扩增的靶序列可以被FuPa试剂部分消化。

在一些实施方案中，引物和/或扩增产物包括一种或多种修饰的核苷酸，其包括通过化学键与其他核苷酸(例如互补核酸链中的核苷酸)结合的碱基(例如碱基对)。在一些实施方案中，化学键受到特定的化学攻击，其选择性地切割修饰的核苷酸(或选择性地切割修饰的核苷酸和引物和/或扩增产物内的相邻核苷酸之间的一个或多个共价连接)，但使其他核苷酸不受影响。例如，在一些实施方案中，修饰的核苷酸可以与互补链中的其他核苷酸形成亚硫酸氢盐键。这种亚硫酸氢盐键可以通过合适的处理进行氧化。类似地，某些修饰的核苷酸可以通过可以通过碱处理选择性破坏的连接与互补核酸链中的其他核苷酸碱基配对。在一些实施方案中，引物和/或扩增产物包括一个或多个修饰的核苷酸，其通过相对于天然碱基之间形成的典型碱基配对键表现出降低的热稳定性的键，与互补核酸链中的其他核苷酸结合(例如碱基对)。通过在扩增后将引物和/或扩增产物暴露于升高的温度，可以选择性地破坏这种降低热稳定性的连接。

在一个示例性实施方案中，扩增引物在设计上是亚硫酸氢盐，具有与3'靶特异性正向引物连接的5'通用正向扩增序列，或与3'靶特异性反向引物连接的5'通用反向扩增序列。两种引物都含有修饰的核苷酸。

在一些实施方案中，合成与核酸模板链的不连续区段互补并且可与其杂交的引物，包括：可与模板的5'区域杂交的引物，其包含与正向或反向扩增引物互补的序列。在一些实施方案中，正向引物、反向引物或两者不共享共同的核酸序列，使得它们与不同的核酸序列杂交。例如，可以制备靶标特异性正向和反向引物，其不与引物库内的其他引物对竞争以扩增相同的核酸序列。在该实例中，不与引物库中的其他引物对竞争的引物对有助于减少非特异性或假扩增产物。在一些实施方案中，每个引物对的正向和反向引物是独特的，因为每个引物的核苷酸序列是非互补的并且与引物对中的其他引物不同。在一些实施方案中，引物对的差异可以是至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、或至少90％的核苷酸同一性。在一些实施方案中，每个引物对中的正向和反向引物与引物库或多重反应中的其他引物对是非互补的或不相同的。例如，引物库或多重反应中的引物对可以与引物库或多重反应中的其他引物对相差至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、或至少70％的核苷酸同一性。引物设计用于最小化引物-二聚体、二聚体-二聚体或其他非特异性扩增产物的形成。通常，优化引物以在扩增反应期间降低GC偏差和低熔解温度(T_m)。在一些实施方案中，引物被设计拥有约55℃至约72℃的T_m。在一些实施方案中，引物库的引物可以具有约59℃至约70℃、60℃至约68℃、或60℃至约65℃的T_m。在一些实施方案中，引物库可以具有偏差不超过5℃的T_m。

在一些实施方案中，靶特异性引物不含碳-间隔基或末端接头。在一些实施方案中，靶特异性引物或扩增的靶序列不含酶、磁、光或荧光标记。

模板可以包括3'区域，其包含围绕特定基因或感兴趣区域的上游或下游区域的序列，使得感兴趣区域被正向扩增/上游基因特异性融合以及反向扩增/下游感兴趣区域融合引物括起来。在一些实施方案中，内部分离子序列可以分离可以与扩增和基因特异性引物杂交的模板区域，并且这可以充当后续下游应用(例如测序等)的密钥或条形码。在一些实施方案中，条形码或者密钥可以结合到每个扩增产物中以辅助数据分析和例如编目。在一些实施方案中，条形码可以是Ion Torrent^TM DNA条形码(Life Technologies)。

在一些实施方案中，引物包括足够数量的经修饰的核苷酸以允许通过切割处理在功能上完全降解引物，但不能在这种切割处理之前干扰引物的特异性或功能性太多，例如在扩增反应中。在一些实施方案中，引物包括至少一个修饰的核苷酸，但引物的不超过75％的核苷酸被修饰。

在一些实施方案中，包括至少一种修饰的核苷酸的多种不同引物可用于单一扩增反应。例如，可以将包含修饰的核苷酸的多重引物添加到扩增反应混合物中，其中每个引物(或引物组)选择性地与核酸群体内的不同靶核酸分子杂交并促进其扩增。在一些实施方案中，可以以至少约12重、24重、48重、74重、96重、120重、144重、168重、192重、216重、240重、264重、288重、312重、336重、360重、384重或398重的重数将不同的引物组合添加到扩增反应中。在一些实施方案中，修饰的引物在引物的末端附近或末端含有至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰的引物在引物序列内含有两个或更多个修饰的核苷酸。在一个示例性实施方案中，引物序列在引物序列的末端附近或末端含有尿嘧啶。出于本公开的目的，引物序列的“附近”或“在末端”是指距引物序列的末端多达10个核苷酸。在一些实施方案中，引物序列含有位于引物序列的中心核苷酸位置处或附近的尿嘧啶。出于本公开的目的，“在引物序列的中心核苷酸位置处或附近”是指在引物序列的中心核苷酸处或在8个核苷酸内以3'或5'方向掺入尿嘧啶部分，在中心核苷酸侧翼。在一个实施方案中，靶特异性引物序列可以在中心核苷酸位置处或附近含有修饰的核碱基，并且在3'和/或5'末端含有修饰的核碱基。在一些实施方案中，正向或反向引物序列的长度可以是约15至约40个碱基的长度。在一些实施方案中，多重反应中使用的引物序列的T_m可为约55℃至约72℃。在一些实施方案中，引物对被设计为扩增来自靶核酸分子或扩增子的序列，其长度为约100个碱基对至约500个碱基对。

在一些实施方案中，扩增反应在单个反应阶段内并行进行(例如，在单个管内的相同扩增反应混合物内)。在一些情况下，扩增反应可以产生产物的混合物，包括预期的扩增子产物以及非预期的、不需要的非特异性扩增假象，例如引物-二聚体。扩增后，然后用任何合适的试剂处理反应，所述试剂将选择性地切割或以其他方式选择性破坏过量未掺入的引物和扩增假象内的修饰核苷酸的核苷酸键，而不切割或破坏规格扩增产物。例如，引物可包括含尿嘧啶的核碱基，其可使用UNG/UDG(任选地加热和/或碱)选择性裂解。在一些实施方案中，引物可包括含尿嘧啶的核苷酸，其可使用UNG和Fpg选择性裂解。在一些实施方案中，裂解处理包括暴露于氧化条件以选择性裂解二硫醇，用RNAseH处理以选择性裂解修饰的核苷酸，包括RNA特异性部分(例如核糖等)等。该切割处理可以有效地将原始扩增引物和非特异性扩增产物分裂成小核酸片段，每个核酸片段包含相对较少的核苷酸。此类片段通常不能在升高的温度下促进进一步扩增。通过本领域已知的各种扩增后净化程序(例如，离心柱、NaEtOH沉淀等)，也可以相对容易地从反应池中除去这些片段。

在一些实施方案中，任选地处理修饰核苷酸的核苷酸键的切割或其他选择性破坏后的扩增产物，以产生在5'末端具有磷酸的扩增产物。在一些实施方案中，磷酸化处理包括酶促操作以产生5'磷酸化的扩增产物。在一个实施方案中，酶如聚合酶可用于产生5'磷酸化的扩增产物。例如，T4聚合酶可用于制备5'磷酸化扩增子产物。Klenow可以与一种或多种其他酶一起使用以产生具有5'磷酸的扩增产物。在一些实施方案中，本领域已知的其他酶可用于制备具有5'磷酸基团的扩增产物。例如，含有尿嘧啶核苷酸的扩增产物与酶UDG、Fpg和T4聚合酶的孵育可用于产生在5'末端具有磷酸的扩增产物。对于本领域技术人员显而易见的是，除了本文具体描述的那些之外的其他技术可用于产生磷酸化的扩增子。应当理解，应用于实践本文公开的方法、系统、试剂盒、组合物和装置而不诉诸过度实验的这些变化和修改被认为在本公开的范围内。

在一些实施方案中，掺入预期的(特异性)扩增产物中的引物，这些引物被类似地切割或破坏，导致在特定扩增产物内形成“粘性末端”(例如，5'或3'突出端)。这种“粘性末端”可以用几种方式解决。例如，如果要克隆特异性扩增产物，可以设计突出区域以补充引入克隆载体中的突出端，从而使得实现比平端连接更快速和有效的粘性末端连接。或者，可能需要修复突出端(与几种新一代测序方法一样)。这种修复可以通过仅使用仅由天然碱基组成的正向和反向扩增引物(例如，对应于A和P1引物)的二次扩增反应来完成。以这种方式，随后的几轮扩增重建双链模板，在引物破坏之前具有原始链的完整序列的扩增子的新生拷贝。或者，可以使用某些形式的填充和连接处理去除粘性末端，其中正向和反向引物与模板退火。然后可以使用聚合酶来延伸引物，然后可以使用连接酶，任选的热稳定连接酶来连接所得的核酸链。这显然也可以通过各种其他反应途径实现，例如循环延伸-连接等。在一些实施方案中，连接步骤可以使用一种或多种DNA连接酶进行。

在一些实施方案中，提供了用于单管多重PCR的方法。在一些实施方案中，用于单管多重PCR的方法可包括靶特异性或外显子特异性引物。在一些实施方案中，外显子特异性或靶特异性引物可包括至少一个尿嘧啶核苷酸。在一些实施方案中，单管多重PCR可包括使用靶特异性或外显子特异性尿嘧啶基引物选择性扩增至少10、50、100、150、200、250、300、350、398或更多个靶核酸分子。

在一些实施方案中，提供了用于产生靶特异性或外显子特异性扩增子文库的方法。在一些实施方案中，使用靶特异性或外显子特异性引物产生的扩增子文库可与人癌症中的异常表达相关。在一些实施方案中，使用靶特异性或外显子特异性引物产生的扩增子文库可与人癌症的突变相关。在一些实施方案中，扩增子文库可以由表达的RNA或cDNA或福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织产生。在一些实施方案中，使用本文公开的方法制备的扩增子文库的扩增子长度可为约100至约300个碱基对、长度为约100至约250个碱基对、长度为约120至约220个碱基对或约135至约205个碱基对。在一些实施方案中，可以使用靶向癌症特异性突变的引物对来制备扩增子文库。在一些实施方案中，引物对可用于产生一旦通过任何测序平台测序的扩增子，包括半导体测序技术可用于检测遗传突变，例如倒位、缺失、点突变和拷贝数的变化。

在一些实施方案中，用于产生扩增子文库的引物对可导致具有以下一种或多种指标的靶特异性核酸分子的扩增：如果归一化至100x平均覆盖深度，则在20x下大于97％的靶覆盖率；平均值大于0.2倍下，大于97％的碱基；大于90％的碱基，而没有链偏差；大于95％的所有靶上读数；平均值大于0.01倍下，大于99％的碱基；和每个碱基精度超过99.5％。

在一些实施方案中，扩增子文库可用于检测和/或鉴定样品中的已知突变或从头突变。

在一些实施方案中，使用靶特异性引物对制备的扩增子文库可用于下游富集应用，例如乳液PCR或桥式PCR。在一些实施方案中，扩增子文库可用于富集应用和测序应用。例如，可以使用任何合适的DNA测序平台对扩增子文库进行测序。在一些实施方案中，可以使用Ion Torrent PGM测序仪(Life Technologies)对扩增子文库进行测序。在一些实施方案中，PGM测序仪可以与服务器耦合，所述服务器应用参数或软件以确定扩增的靶核酸分子的序列。在一些实施方案中，可以在不到24小时内制备、富集和测序扩增子文库。在一些实施方案中，扩增子文库可在约9小时内制备、富集和测序。在一些实施方案中，扩增子文库可以是配对文库，即包含来自肿瘤样品的扩增子和来自未患病样品的扩增子的文库。每对可以比对，以检测和/或鉴定靶核酸分子中存在的突变。

在一些实施方案中，用于产生扩增子文库的方法可包括：使用外显子特异性或靶特异性引物扩增RNA表达或cDNA靶以产生扩增子；从输入的RNA或cDNA和引物中纯化扩增子；磷酸化扩增子；将衔接子连接到磷酸化的扩增子上；纯化连接的扩增子；对扩增的扩增子进行切口平移；并纯化切口平移的扩增子以产生扩增子文库。在一些实施方案中，可以在扩增RNA表达靶标以产生扩增子的步骤之后进行另外的扩增子文库操作。在一些实施方案中，可以以任何顺序进行另外的反应的任何组合，并且可以包括：纯化；磷酸化；连接衔接子；缺口平移；扩增和/或测序。在一些实施方案中，可以省略或可以重复这些反应中的任何一种。对于本领域技术人员来说显而易见的是，该方法可以重复或省略任何一个或多个上述步骤。对于本领域技术人员来说显而易见的是，可以修改步骤的顺序和组合以产生所需的扩增子文库，因此不限于所提供的示例性方法。

磷酸化的扩增子可以与衔接子连接以进行切口平移反应，随后的下游扩增(例如，模板制备)，或用于附着到颗粒(例如珠子)或两者。例如，与磷酸化扩增子连接的衔接子可以与附着于颗粒的寡核苷酸捕获引物退火，并且可以进行引物延伸反应以产生附着于颗粒或表面的扩增子的互补拷贝，从而将扩增子连接到表面或颗粒上。衔接子可具有一个或多个扩增引物杂交位点、测序引物杂交位点、条形码序列及其组合。在一些实施方案中，通过本文公开的方法制备的扩增子可以与一个或多个Ion Torrent^TM相容的衔接子连接以构建扩增子文库。通过这些方法产生的扩增子可以连接到一个或多个衔接子用于文库构建，以与下一代测序平台兼容。例如，通过本公开内容的教导产生的扩增子可以连接到IonFragment Library Kit(Life Technologies，目录号4466464)中提供的衔接子上。

在一些实施方案中，表达的RNA靶标或FFPE样品的扩增可以使用2x AmpliSeq HiFi Master Mix进行。在一些实施方案中，AmpliSeq Hi Fi预混合物可包括甘油、dNTP和DNA聚合酶，例如Taq DNA聚合酶高保真度。在一些实施方案中，2x AmpliSeq HiFi Master Mix可进一步包括以下中的至少一种：防腐剂、硫酸镁、三硫酸盐和/或硫酸铵。

在一些实施方案中，表达的RNA靶标或FFPE样品的扩增可以使用5x Ion AmpliSeqHi Fi Master Mix进行。在一些实施方案中，5x Ion AmpliSeq Hi Fi Master Mix可包括甘油、dNTP和DNA聚合酶，例如Taq DNA聚合酶保真度。在一些实施方案中，5xIon AmpliSeq Hi Fi Master Mix可进一步包括以下中的至少一种：防腐剂、氯化镁、硫酸镁、三硫酸盐和/或硫酸铵。

在一些实施方案中，扩增子的磷酸化可以使用FuPa试剂进行。在一些实施方案中，FuPa试剂可包括DNA聚合酶、DNA连接酶、至少一种尿嘧啶裂解或修饰酶，和/或储存缓冲液。在一些实施方案中，FuP试剂可进一步包括以下中的至少一种：防腐剂和/或去污剂。

在一些实施方案中，扩增子的磷酸化可以使用FuPa试剂进行。在一些实施方案中，FuPa试剂可包括DNA聚合酶、至少一种尿嘧啶裂解或修饰酶、抗体和/或储存缓冲液。在一些实施方案中，FuPa试剂可进一步包括以下中的至少一种：防腐剂和/或去污剂。在一些实施方案中，提供抗体以在环境温度下抑制DNA聚合酶和3'-5'核酸外切酶活性。

在一些实施方案中，通过本公开内容的教导产生的扩增子文库的产率足以用于多种下游应用，包括使用Ion Torrent^TM PGM系统的Ion Xpress^TM模板试剂盒(例如，PCR介导的添加核酸片段文库扩增到Ion Sphere^TM颗粒上(Life Technologies，部件号4467389)。例如，可以在Ion Xpress模板试剂盒用户指南(Thermo Fisher Scientific)中找到从扩增子文库制备模板文库的说明。在离子测序用户指南(Thermo Fisher Scientific)中描述了将后续模板库加载到Ion Torrent^TM芯片上用于核酸测序的说明。在一些实施方案中，通过本公开内容的教导产生的扩增子文库可以用于配对末端测序(例如，Ion Torrent^TM PGM系统(Thermo Fisher Scientific)上的配对末端测序)。

对于本领域普通技术人员显而易见的是，用于克隆扩增的许多其他技术、平台或方法，例如野火PCR和桥扩增，可以与本公开的扩增的靶序列结合使用。还设想本领域普通技术人员在进一步改进或优化本文提供的条件时可以直接进行核酸测序(例如使用IonTorrent PGM^TM或Proton^TM测序仪，Life Technologies)而不进行克隆扩增步骤。

在一些实施方案中，待克隆扩增的至少一个扩增的靶序列可以连接到载体或颗粒上。载体可由任何合适的材料构成，并具有任何合适的形状，包括例如平面、球状或颗粒。在一些实施方案中，载体是如美国公开申请20100304982中所述的支架聚合物颗粒，将其以全文引用的方式并入本文中。

在一些实施方案中，通过本公开内容的教导产生的扩增的靶序列的核酸测序包括从头测序或靶向重测序。在一些实施方案中，核酸测序还包括将扩增的靶序列的核酸测序结果与参考核酸样品进行比较。在一些实施方案中，参考样品可以是正常组织或充分记录的肿瘤样品。在一些实施方案中，扩增的靶序列的核酸测序还包括确定核酸序列内是否存在突变。在一些实施方案中，该方法还包括将突变的存在与药物敏感性、治疗预后和/或器官排斥相关联。在一些实施方案中，核酸测序包括鉴定与癌症相关的遗传标记。在一些实施方案中，核酸测序包括鉴定研究中的样品中的拷贝数变异。

在一些实施方案中，提供了试剂盒，用于在单一反应中扩增来自核酸分子群的多种免疫应答靶表达序列。在一些实施方案中，试剂盒包括含有一个或多个可切割基团的多个靶特异性引物对、一个或多个DNA聚合酶、dNTP的混合物和至少一种切割试剂。在一个实施方案中，可裂解基团可以是8-氧代-脱氧鸟苷、脱氧尿苷或溴脱氧尿苷。在一些实施方案中，至少一种裂解试剂包括RNaseH、尿嘧啶DNA糖基化酶、Fpg或碱。在一个实施方案中，切割试剂可以是尿嘧啶DNA糖基化酶。在一些实施方案中，提供试剂盒以在单个反应室或容器中进行多重PCR。在一些实施方案中，试剂盒包括至少一种DNA聚合酶，其可以是热稳定DNA聚合酶。在一些实施方案中，与单个PCR反应相比，一种或多种DNA聚合酶的浓度以3倍过量存在。在一些实施方案中，每种靶特异性引物对的最终浓度以约25nM至约50nM存在。在一个实施方案中，每种靶特异性引物对的最终浓度可以以比常规单重PCR反应低50％的浓度存在。在一些实施方案中，所述试剂盒在单个反应室中提供来自核酸分子群的至少100、150、200、250、300、350、398或更多个靶免疫应答表达序列的扩增。在特定实施方案中，本发明提供的试剂盒是测试试剂盒。。

在一些实施方案中，试剂盒还包含一种或多种衔接子、条形码和/或抗体。

RNA表达分析研究中的一个共同关注点是确定不同样品之间基因表达如何变化。用于RNA测序的当前方法通常需要扩增步骤，然后对选择的扩增产物(例如转录物)进行序列分析至固定数量的读数。特别地，利用本发明提供的方法，可以通过扩增代表转录物的扩增子(例如，扩增子穿过选定的外显子/外显子连接)来推断每个基因的表达。由于选择的扩增，在与特定基因转录物相关的读数数量与所有其他基因产生的读数数量之间存在依赖性。这种相互依赖性意味着可以通过两种不同的生物学过程诱导明显相同的倍数变化：特定基因表达比率的增加，或所测量的所有其他基因的表达比率的降低。为准确测量两种情况中的哪一种，在进行样品的交叉比较之前，应在每个样品中正确归一化读数。归一化已经进行了全转录组RNA测序分析的研究。在这些研究中，log RPM(每百万读取计数)已被广泛接受以提供可解释的基因表达测量，其强有力地反映样品之间表达的差异。然而，该测量的准确性取决于所测量的大多数基因不是差异表达的基本假设。这种假设倾向于适用于转录组学研究，其中相同组织的超过20,000个基因通常被分析。然而，对于较小的基因组，对于包含极低表达基因的组，或对于关注相似生物过程的组，例如本文提供的方法和组合物，这种假设不太可能总是适用。作为一个简单的例子，考虑一个由2个功能类别组成的20个基因的目标小组，一个有16个，另一个有4个基因，其中一个功能的每个基因与其他基因完全相关。在该实例中，样品1和样品2中的RNA分子的实际数量是已知的，并且可以精确比例读取序列。当应用标准RPM计算来测量每个基因的表达并使用我们的估计表达式计算倍数变化时，较小类别增加2倍，倍数变化估计保持对真实倍数变化的相当准确的估计(图8，左图)。然而，如果更大类别的16个基因中的分子数量增加2倍，基于RPM的估计倍数变化表明，我们减少了4个基因，而不是增加了16个基因(图8，中图)。因此，在具有少量总基因和大多数基因的强相关结构的靶向组中，标准RPM归一化提供了不准确的倍数变化估计。然而，如果我们假设一个较小的类别是一组标准的内源性对照，例如管家(HK)基因，并且在样品间具有可比性，那么这组基因作为参考点准确测量16个基因的目标功能集的表达。使用后一种策略可以提供准确的倍数变化结果(图8，右图)。了解基因之间的相互关系，为标准表达测量是否会偏向于小型靶向RNA-seq组提供了一些指导。

因此，结合本发明的组合物和方法，提供的组合物包括用于测定一组持家基因表达的引物对和方法，用于一种或多种作为内源对照，以及用于表达水平归一化和确定样品上的表达变化的有效手段。

各种示例性实施方案的以下描述仅是示例性和说明性的，不应以任何方式解释为限制或限制性的。根据说明书和附图以及权利要求，本教导的其他实施方案、特征、目的和优点将显而易见。

尽管本说明书详细描述了某些示例性实施方案，但是其他实施方案也是可能的并且在本发明的范围内。考虑到说明书和附图以及权利要求书、说明书和附图中描述的教导的实践，变化和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。

例证说明

材料和方法

提供的免疫应答测定组合物包括针对395个免疫应答标记物的试剂，所述免疫应答标记物设计用于表达的靶序列的文库制备技术。通常，从样品中提取的RNA(例如各种类型肿瘤样品，例如新鲜、冷冻、FFPE，例如肺肿瘤、NSCLC)被逆转录；产生文库，制备模板，例如使用Ion Chef^TM或Ion OneTouch^TM 2系统，然后使用下一代测序技术例如Ion S5^TM、IonPGM^TM系统对制备的样品进行测序。

从样品中提取总RNA，首先将10ng总RNA逆转录并用作模板以扩增靶(例如，表1中的靶表达序列)，其中免疫应答测定包含表2中的引物对。使用Ion AmpliSeq^TMLibrary Kit2.0进行手动文库制备，然后使用Ion OneTouch^TM2系统或Ion Chef^TM仪器进行模板化。使用适用于Chef DL8和Ion Chef^TM仪器的Ion AmpliSeq^TM试剂盒进行自动化文库制备和模板化。测序在Ion S5^TM系统或Ion PGM^TM系统上进行。使用Ion Torrent Suite^TM软件量化基因表达。

HL-60和人正常肺(AM7968)分别购自ATCC和Ambion。去识别的黑素瘤和NSCLCFFPE样品分别从Asterand和Research Dx获得。

表1：免疫应答测定的基因和扩增子插入序列

表2：免疫应答测定的引物对序列

RNA和cDNA制备

根据制造商的说明，使用RecoverAll^TM总核酸分离试剂盒(Ambion,Inc.)从样品提取总RNA，并且例如使用Qubit^TMRNA HS测定试剂盒(Thermo Fisher)Qubit^TMRNA HS测定试剂盒(Thermo Fisher)进行量化，以量化RNA。根据制造商的说明，使用VILO^TMcDNA合成试剂盒(Thermo Fisher,目录号11754050)，将总计10ng的总RNA逆转录至cDNA。使用包含表2中的引物对的免疫应答测定法将制备的模板用于扩增靶标。

PCR扩增RNA靶标

进行多重聚合酶链式反应以在RNA表达样品上扩增398个单独的扩增子。表1中提供了基因列表和产生的扩增子序列。引物对列于表2中。向96孔PCR板的单个孔中加入4微升免疫应答引物库，其含有398个引物对，浓度为TE中15μM，10微升制备的cDNA和4微升的扩增反应混合物(5x AmpliSeq HiFi Master Mix)，其可以包括甘油、dNTP和Taq高保真DNA聚合酶(Invitrogen，目录号11304)，用DNase/RNase游离水(LifeTechnologies，CA，部件号600004)达到最终体积为20微升。

将PCR板密封并装入热循环仪(PCR系统9700双96-孔热循环仪(Life Technologies，CA，部件号N8050200和4314445))并在以下温度曲线下运行以产生预扩增的扩增子文库。

初始保持阶段在99℃下进行2分钟，然后进行19个循环，在99℃下变性15秒，并在60℃下退火和延伸阶段4分钟。循环后，将预扩增的扩增子文库保持在10℃直至进行。

部分消化扩增子

在进行之前，将样品短暂离心以收集内容物。向预扩增的扩增子文库(～20微升)中加入2微升FuPa试剂。将反应混合物密封，充分混合以确保均匀性和在50℃温育10分钟，55℃下10分钟，60℃下20分钟，然后在10℃保持达1小时。在进行之前，将样品短暂离心以收集内容物。

连接衔接子至扩增子并且纯化

温育后，反应混合物直接进行连接步骤。这里，将现在含有磷酸化扩增子文库的反应混合物与2微升A/P1衔接子(作为Ion Fragment Library Kit的组分出售，ThermoFisher)、4微升Switch溶液(作为Fragment Library Kit的组分出售，Thermo Fisher)和2微升的最后加入的DNA连接酶(作为Ion Fragment Library Kit的组分出售，ThermoFisher)组合，然后按下面温育：22℃下30分钟，72℃下10分钟，然后在10℃保持达1小时。在进行之前，将样品短暂离心以收集内容物。

在温育步骤后，将45微升(1.5x样品体积)的室温 试剂(Beckman Coulter，CA)加入到连接的DNA中。彻底吸移混合物以使珠悬浮液与连接的DNA混合。将混合物脉冲旋转并在室温下温育5分钟。样品经历另一次脉冲旋转并放置在磁架例如DynaMag^TM-2旋转磁体(Life Technologies，CA，部件号123-21D)上两分钟。溶液澄清后，弃去上清液。在不从磁架移除管的情况下，将150微升新鲜制备的70％乙醇引入样品中，并在轻轻旋转磁架上的管的同时孵育。溶液澄清后，弃去上清液而不干扰沉淀。进行第二次乙醇洗涤，弃去上清液。通过脉冲旋转管除去任何剩余的乙醇并小心地除去残留的乙醇，同时不干扰沉淀。将沉淀在室温下风干约5分钟。

将沉淀重悬于20微升DNase/RNase游离水(Life Technologies，CA，部件号600004)中并涡旋以确保样品充分混合。将样品脉冲旋转并置于磁架上两分钟。在溶液澄清后，将含有连接的DNA的上清液转移到新的Eppendorf LoBind^TM管中以进行长期储存。定量后，确定导致浓度为～100pM的稀释因子，这适用于使用Ion模板试剂盒制备模板。

量化文库

根据制造商的说明，使用Qubit^TM 2.0或3.0荧光计和/或通过使用Ion Library定量试剂盒(目录号4468802)的qPCR，量化连接的文库。

扩增和纯化文库

将连接的预扩增文库(～20微升)与50微升PCR SuperMix HighFidelity(Thermo Fisher，以Ion Fragment Library Kit的组分出售)和2微升LibraryAmplification Primer Mix(以Ion Fragment Library Kit的组分出售)组合。将溶液应用于96孔PCR板的单个孔中并密封。将板加载到热循环仪(PCR系统9700双96-孔热循环仪(Life Technologies，CA，部件号N8050200和4314445))中，并在以下温度曲线上运行以产生最终的扩增子文库：保持在在98℃下2分钟，然后进行5个循环，在98℃下变性15秒，并在64℃下退火和延伸阶段1分钟。循环后，将最终的扩增子文库保持在4℃直至进行下面概述的最终纯化步骤。

进行最终文库的两轮纯化。将25μL(0.5X样品体积)的Agencourt^TM AMPure^TM XP试剂加入到含有～50μL样品的每个板孔中。上下吸移珠子悬浮液以使珠子悬浮液与最终扩增子文库彻底混合。然后将样品脉冲旋转并在室温下温育5分钟。将含有最终扩增子文库的平板置于磁架例如DynaMag^TM-侧磁体(Thermo Fisher)上5分钟以捕获珠子。一旦溶液澄清，小心转移上清液而不干扰珠粒。进行第二轮纯化，向每个含有样品的板孔中加入60微升(1.2X样品体积)的Agencourt^TM AMPure^TM XP试剂。将珠子悬浮液上下吸移以彻底混合珠子悬浮液并在室温下温育5分钟。将含有最终扩增子文库的平板置于磁架上3分钟以捕获珠子。在不从磁架上取下板的情况下，将150微升新制备的70％乙醇引入含有珠子的样品中。将样品温育30秒，同时在磁架上轻轻旋转管。溶液澄清后，弃去上清液而不干扰沉淀。进行第二次乙醇洗涤，弃去上清液。通过脉冲旋转管除去任何剩余的乙醇并小心地除去残留的乙醇，同时不干扰沉淀。将沉淀在室温下风干约5分钟。

一旦管干燥，将管从磁架上取下并加入50微升Low TE(Thermo Fisher)，移液并涡旋以确保样品充分混合。将样品脉冲旋转并置于磁架上两分钟。在溶液澄清后，使用Qubit^TM荧光计和Qubit^TM dsDNA HS测定试剂盒根据制造商的说明分析含有最终扩增子文库的上清液，以定量文库并计算模板制备和测序的稀释因子。将文库稀释至约50pM用于模板制备或储存在1.5-mL Eppendorf LoBind^TM管中用于长期储存。

模板制备和测序

根据制造商的说明，使用Ion OneTouch^TM 2系统或Ion Chef^TM仪器将等分试样的最终文库用于模板制备。

测序在Ion S5^TM系统或Ion PGM^TM系统上进行。根据制造商的说明，使用IonTorrent Suite^TM软件对基因表达进行定量，根据制造商的说明进行分析和测序。

自动化过程

或者，可以使用如上所述制备的cDNA，与用于Chef DL8的Ion AmpliSeq^TM试剂盒和Ion Chef^TM仪器一起进行自动化文库制备和模板化，这根据制造商说明并在Ion ChefSystem上的Ion AmpliSeq文库制备(Thermo Fisher Scientific出版号MAN0013432)中进行描述，在此引入作为参考。

多文库制备

对多个文库进行排序时，将为每个文库连接不同的条形码。来自相同样品的DNA和RNA文库也需要不同的条形码。IonCode衔接子以适当的浓度提供，并在单个孔中包含正向和反向衔接子。对于选择的每个条形码，制备一个Ion P1衔接子和IonXpress条形码X(Thermo Fisher)的混合物，每个衔接子的最终稀释度为1：4。在上述连接反应中，将2uL的条形码接头混合物替换为Ion AmpliSeq衔接子；并根据需要扩大规模。通过在模板制备之前组合相同体积的每个文库，可以在单个芯片上对多个条形码文库进行测序。制造商建议最多8个库用于以下芯片：Ion 318芯片v2(最多4个)、Ion 520芯片(最多4个)、Ion530芯片(最多8个)。通过将所有单个文库稀释至50pM浓度来制备组合文库；将10uL的每个文库组合在单个管中(优选Eppendorf LoBind管)。合并最后文库后，通过上下吸移5次彻底混合，然后短暂离心以收集在管底部。根据需要进行模板化和测序。

数据分析

使用Torrent Suite^TM RNA插件进行基因表达水平定量，该插件从序列读数数据产生基因转录物定量。该插件利用靶区域.bed文件和相关的参考库.fasta文件，并可选地接受secont.bed文件，该文件指定允许样品聚类的靶基因子集。得出的报告包括基因表达计数(给定靶序列的比对读数)、数据分析总结和QC图。可以使用Affymetrix转录组分析控制台(TAC)3.1软件(Thermo Fisher Scientific)确定归一化的基因水平计数数据。从Torrent Suite^TM插件生成的CHP文件可以直接与Transcriptome分析控制台(用于差异基因表达分析的TAC³软件)一起使用。转录组分析控制台(TAC)软件免费提供，http：//www.affymetrix.com/。

表达的归一化

为了观察所选靶标免疫应答基因之间的表达谱如何在大量样品中变化，在18个癌症研究中我们从ICGC数据库[Zhang等，2011]中下载并处理了超过9,600个患者样品。为了确保高质量的RNA谱，我们排除了所有样品，其文库大小小于2000万个读数，映射到转录组，最终得到9,148个完整的转录组数据集。对于该研究，我们使用每个基因的log2CPM全转录组(FT)表达作为‘真实’表达值和映射到基因的读数总数作为群组中每个样品的‘真实’归一化常数。

结果

从例如NSCLC FFPE样品的样品中提取的总RNA被逆转录。在Ion Chef ^TM或IonOneTouch^TM2系统上生成文库，并在Ion S5^TM或Ion PGM^TM系统上测序。由于输入要求低至10ng总RNA，我们能够测量稳健表达，包括来自样品的低表达转录物(例如，IFN、IL2、IL21、IL10、IL23)，例如NSCLC FFPE样品、CRC样品。结果显示灵敏度高、特异性强、动态范围宽、重复性好。技术重复是高度可重复的(参见图1)，在各种样品类型中是一致的(参见图4)，并且测定结果是高度特异性的，当用gDNA和水对照样品平行测试时具有可忽略的背景。确定测定的动态范围，例如，分别测量HL-60和人肺总RNA的表达谱，并以4种不同的比例混合以评估动态范围(参见图2)。将纯样品和混合样品之间的倍数变化相关联，并比较纯样品和混合样品之间倍数变化相关性的等级顺序。从纯样品计算预期的倍数变化，并且通过将线拟合至混合样品得到观察到的倍数变化(参见表3)。在自动和手动工作流程中进行的重复实验中证实了能够可靠地检测到该组的低表达标志物，即使对于非常低表达的基因(例如，IL2、IL21、IL2B、IL13、IL23A、IL10)和更高表达白细胞介素(例如，IL1A、IL12A、IL15、IL6、IL7、IL2RB)，也证明了一致的结果。数据未显示。来自所提供的免疫应答测定的测序数据也显示出与使用定量实时PCR评估的平行样品的结果高度一致(参见图3)。使用参考RNA检查超过50个基因的结果的更大的一致性研究产生了类似的一致性。数据未显示。

表3.对2倍和4倍差异表达的敏感性和特异性

分析报告文件包括，例如，样品摘要报告(列出每个样品的表、总读数、对齐读数、对齐百分比)；绝对读数计数数据(每个样品的基因的绝对读数)，RPM数据(通过每个样品的总读数计数归一化)，平均持家标度log2RPM数据(对于每个样品)，通过RPM归一化的CHP文件，通过平均持家基因归一化的CHP文件，以及基因组DNA和水样的表达数据。参见图5和图6。分析输出产生的数据证明基因的分布，显示具有相似和差异读数的基因的频率。参见图5A。曲线绘制在相同的轴刻度上；并使用默认的R‘密度'函数将计数数据拟合到高斯核。持家基因在样品中的表达证明了与样品类型无关的相似表达水平。参见图5B。r值的热图相关性比较log2RPM读取对相关样品，证明了样品中整个表达测定的相关性。样品读数显示样品的每个靶标的相关性。参见图5C和图6(上图显示回归线的Pearson相关r值；对角线图显示每个样品的单个log(RPM+1)值的频率密度图；下图显示对个整个图的每个条形码对作图的log2RPM+1值，其中报告了重叠的线性最小二乘回归线和线斜率)。通过读数计数测量的表达水平也可以描绘为热图，描绘了条形码上表示的最大变化，如通过具有至少一个具有至少100RPM读数的样品的基因的归一化读数计数的系数变化所测量的。对于该图，如果样品总共少于10⁵个读数，则将其消除。图7显示了在整个组中显示高和低表达基因的示例性热图分析。

因此，我们验证了在细胞系滴定实验的混合浓度下我们的测定中的倍数变化的线性和无偏估计。图2.通过实现技术重复的高相关性(r>.99)，以及即使在低输入量(10ngRNA)下的稳健表达估计，我们的测定为癌症免疫疗法中的生物标志物研究提供了有价值的解决方案。

使用内源性对照准确估计倍数变化。当大多数基因在样品之间不变化时，倍数变化估计具有可忽略的误差。当大多数基因发生变化时，倍数变化估计非常不准确。参看图8。因此，当使用内源性对照时，我们准确地测量倍数变化。对癌症类型的9148个样品的基因表达进行计算机分析评估。见表4。应用标准CPM归一化来测量每个基因的表达并计算所得的倍数变化。完整的转录组分析提供了对表达的真实估计，可能是因为在总数上，预计仅有少数20,000+基因差异表达。我们评估了完整的转录组表达数据以及免疫应答测定表达数据。虽然免疫应答测定子类别中基因的相对数量不同，但在整个测定中没有一个类别使用大多数基因，并且多个基因类别必须改变以支配测定基因的比例。尽管免疫应答测定不如完整转录组那么大，但是不相关基因类别的相对多样性需要样品之间的差异表达以偏向表达估计。因此，在不相关基因类别在样品之间差异表达的情况下，持家基因归一化提供了有效估计靶向表达倍数变化估计的有效优化方法。

首先要了解如何仅测定来自共同功能的基因可以影响表达的估计，进行了仅包含与白细胞迁移类别(ITGAL、ITGAM、ITGB7、SELL、VCAM1)相关的5个基因的测定。仅测定那些基因不能提供准确的表达估计。通过2个白细胞抑制和19个TCR共表达基因(CCR7、CD247、CD3D、CD3E、CD3G、CD6、CD8A、CD8B、CRTAM、GPR18、GRAP2、IKZF3、IL2RB、IL7R、ITK、LAMP3、LCK、PTPRCAP、TIGIT)扩展测定不会增加相关性。然而，从无关的肿瘤标志物类别(AKT1、BRCA1、BRCA2、CDKN2A、EFNA4、EGFR、EGR3、IRS1、KRT5、KRT7、MAPK1、MMP2、MMP9、MYC、NOTCH3、PGF、PTGS2、PTK7、RB1、RPS6、SNAI1、SNAI2、TCF7、TP63、TRIM29、TWIST1、ZEB1)或11个管家(HK)基因(ABCF1、G6PD、GUSB、HMBS、LMNA、LRP1、POLR2A、SDHA、TBP、TFRC、TUBB)测定27个基因改善了与真实的表达值的关系。参见图9A。HK基因彼此不相关，然而，与肿瘤标志物(彼此也不相关)不同，HK基因提供低方差并且能够以高精度测量。例如，当我们比较各种指标的性能和稳健性以获得准确的倍数变化估计时，我们发现持家基因的几何平均值提供了比标准CPM计算(有或没有持家基因)更准确的倍数变化估计。参见图9B。单独的持家基因可以仅在小组测定中校正表达估计。使用不相关的基因类别也具有与归一化相似的效果。此外，使用仅HK基因之和的倒数作为归一化因子提供了比使用小组中所有基因的总和更强的相关性。

表4：跨癌症类型的样品分布

研究ID	癌症类型	样品量
			BLCA-US	膀胱尿路上皮癌	318
BRCA-US	乳腺癌	1195
			CESC-US	宫颈鳞状细胞癌	264
COAD-US	结肠癌	516
			HNSC-US	头颈部鳞状细胞癌	524
KIRC-US	肾脏肾透明细胞癌	598
			KIRP-US	肾脏肾乳头状细胞癌	254
LIHC-US	肝脏肝细胞癌	345
			LUAD-US	肺腺癌	543
LUSC-US	肺鳞癌	473
			OV-US	卵巢浆液性囊腺癌	530
PAAD-US	胰腺癌	145
			PRAD-US	前列腺肿瘤	870
READ-US	直肠腺癌	163
			SKCM-US	皮肤皮肤黑色素瘤	868
STAD-US	胃腺癌	900
			THCA-US	头颈部甲状腺癌	566
UCEC-US	子宫内膜癌	541

因此，我们还发现使用内源对照(持家基因)的归一化为具有高度相关基因的小组测定提供了准确的倍数变化估计。不相关的基因类别可以与持家基因在归一化方面具有相同的效果，然而，不相关的基因类别在样品之间差异表达的紧密情况将在不使用持家基因时偏向表达估计。本文提供的持家基因归一化方法可以改善与表达测定的真实值的相关性。特别地，持家基因归一化可以改善所提供的免疫应答测定的亚组中的表达评估，并且可以与本文提供的相对大的免疫应答测定结合使用。

从先前的分析，清楚的是使用持家基因结合本发明的组合物和方法进行归一化对于准确估计倍数变化表达是必需的。同样清楚的是，仅使用持家基因来计算归一化常数是估计基因表达以进行准确倍数变化估计的优选方式。使用持家基因计算归一化常数的一个重要因素是确定哪个基因计数的度量提供最准确的倍数变化估计。因此，我们在18项癌症研究中比较了6个指标；对于每项研究，我们计算并确定与以下指标的相关性：持家计数的总和的log10(类似于RPM归一化)，持家计数的几何平均值的log10，持家计数的log10的中位数，持家计数的log10的第75分位数，以及修正的平均值(HK计数的log10的15％和25％)。有趣的是，持家计数的总和不提供最佳相关值，而是几何平均值提供最高的平均相关性和R平方大于0.5的癌症数量(数据未显示)。在更强大的措施中，15％的修正均值提供了最高的平均R平方。为了进一步估计哪个度量标准最稳健，我们通过将每个样品的随机持家基因设置为0读数来模拟每个样品的随机持家基因的丢失。然后，我们重现相同的分析，以使用丢失样品比较各种指标。有趣的是，即使在丢失样品中，几何平均值仍然提供与完整转录组归一化常数的最高相关性，而15％修正平均值也显示出高性能(数据未显示)。这表明几何平均值是一个最佳度量，因为它与真正的归一化常数值高度相关，并且对丢失具有鲁棒性。另外，我们对各种感兴趣的癌症类型之间的归一化常数、相关性和丢失相关性进行了分析，并且甚至在各种样品类型中确认了本组合物和在感兴趣的群体中一致地进行的方法中提供的持家基因组。

持家基因(HK)常数：

让X是对免疫应答测定每一个基因的计数的矢量，让HKgenes是一组持家基因；添加假计数1到矢量X的每个条目，创建新的矢量y。

查找持家基因的计数的几何平均值，计算为10^平均值(log10(y_HKgenes))，其中y_HKgenes是y矢量的子集以仅包括与持家基因相关的计数。这种几何平均值将被标注为HKnorm。

将每个y条目乘以(10^6HKnorm)的每个条目，创建新的矢量z。

最后在z取各条目的的log 2值并添加，创建最终持家基因归一化表达估计。

一旦建立，通过采用我们的11个持家基因的几何平均值并使用所提供的免疫应答测定的398个基因将我们的归一化策略与标准RNA-seq RPM测量值进行比较来计算HKnorm常数。由于该测定由相对大量平均彼此不相关的基因组成，因此可以提出有效的论据，即持家基因对于测定是不必要的并且不提供额外的信息。为了解决这个问题，我们比较了HKnorm常数与标准RPM常数和当从测定中移除持家基因时的RPM常数。我们首先评估了这些归一化策略与所有样品中的完整转录组常数的比较，其中我们发现去除持家基因导致RPM常数与标准RPM计算相关性降低，但是，即使是标准RPM计算与HKnorm相比，表现逊色。(数据未显示)。然后，我们检查了哪种归一化策略对于我们评估的每项癌症研究都是最佳的，并且发现除了LIHC-US之外，HKnorm在所有研究中都大大优于RPM策略，其中没有归一化策略特别好并且所有策略产生相同的结果。当在本发明的免疫应答测定中观察跨靶基因的每种策略的性能时，我们看到HKnorm如所预期的那样优于所有基因中的RPM策略。有趣的是，方差较小的基因与FT值的相关性小于方差较大的基因。参见图9B。此外，具有低表达的基因和具有高平均表达的基因也具有比接近平均表达值的平均值的那些更小的相关值(数据未显示)。

参考文献

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序列表

<110> 生命技术公司

<120> 用于评估免疫应答的组合物和方法

<130> LT01193PCT

<140> 一起提交PCT/US

<141> 2017-09-22

<150> US临时申请62/398,756

<151> 2016-09-23

<150> US临时申请62/419,091

<151> 2016-11-08

<160> 1194

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1

cccgactcct gctgcattaa tgttactgtg ggctgtggga ttaatttcaa cgagaaggcg 60

atccataagg agggctgtgt ggagaagatt gggggctggc tgaggaaa 108

<210> 2

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 2

gttcctgtcc tgtgtgctgt aatgaatgtg gtcttcatca ccattttaat catagctctc 60

attgccttat cagtgggcca atacaattgt ccaggccaat acacattc 108

<210> 3

<211> 102

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 3

taagaaaatc atcgaaaaga tgctgaacag tgacaaatcc aactgaccag aagggaggag 60

gaagctcact ggtggctgtt cctgaaggag gccctgccct ta 102

<210> 4

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 4

cggcatctct gtgcttctca gaaatccagc ctgcttcagc ttcaaaacac agatgaactg 60

gattttatga gctccagtca acaattttac tggattggac tctc 104

<210> 5

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 5

ctccagaaga ttttgtgatt caggcaaagg ctgactgtta cttcaccaac gggacagaaa 60

aggtgcagtt tgtggtcaga ttcatcttta acttggagga gtatgtac 108

<210> 6

<211> 99

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 6

ggtgactcac agccggcaca gccatgaact acccgctaac gctggaaatg gacctcgaga 60

acctggagga cctgttctgg gaactggaca gattggaca 99

<210> 7

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 7

caaaggaggc gaggttctaa gccattcgct cctgctgctt cacaaaaagg aagatggaat 60

ttggtccact gatattttaa aggaccagaa agaacccaaa aataagac 108

<210> 8

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 8

ttgcctgacc caggccacac caaaacctac agttgtctgg tacagaaacc agatgctcat 60

ctcagaggac tcacggttcg aggtcttcaa gaatgggacc ttgcgcatc 109

<210> 9

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 9

gtcactggct gcaacaggac cacagtcaag acgatcatag tcactgagct aagtccagta 60

gtagcaaagc cccaaatcaa agccagcaag accacagtca caggagat 108

<210> 10

<211> 101

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 10

ccaagggact atccacctac aatccttgaa agaccttaaa caatttgccc caagcccttc 60

ctgcgagaaa attgaaatca ttgctacact gaagaatgga g 101

<210> 11

<211> 110

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 11

caacgtgtca ggctgcagtg ccatcgagaa gacccagagg atgctgagcg gattctgccc 60

gcacaaggtc tcagctgggc agttttccag cttgcatgtc cgagacacca 110

<210> 12

<211> 102

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 12

tgaggggtgt ggacgtcgtg gtgggaggac actccaacac atttctttac acaggcaatc 60

caccttccaa agaggtgcct gctgggaagt acccattcat ag 102

<210> 13

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 13

cagatgtgac aagccgaggc ggtgagccgg gcaggaggaa ggagcctccc tcagggtttc 60

gggaaccaga tctctcacca ggaaagactg atacagaacg atcga 105

<210> 14

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 14

tgatgtgttg ctgtgtgagc aggaggtggt agcagatgag acaccagcag tccaggctgt 60

tcttcgagct gacaccaagc gattgaagct gctggaagag gagcggcgg 109

<210> 15

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 15

tccagcggga catgttcacc ctggaggaca cgctgctagg ctaccttgct gatgacctca 60

catggtgtgg tgaattcaac acttccaaaa taaactatca atcttgccc 109

<210> 16

<211> 110

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 16

ctttcagttg agcttgggga ctgcagctgt ggggagattt cagtgcattg cctcccctgg 60

gtgctcttca tcttggattt gaaagttgag agcagcatgt tttgcccact 110

<210> 17

<211> 95

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 17

gggaatttcc atgccgtcta cagggatgac ctgaagaaat tgctagagac cgagtgtcct 60

cagtatatca ggaaaaaggg tgcagacgtc tggtt 95

<210> 18

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 18

gcagctgctt agacgctgga tttttttcgg gtagtggaaa accagcagcc tcccgcgacg 60

atgcccctca acgttagctt caccaacagg aactatgacc tcgactacg 109

<210> 19

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 19

ggaggtggag caggccctga ctccagcact gtcgccatgt gctgtcagca gcactctccc 60

cgactggcac atcccagtgg aagttgtgcc ggacagcacc agtgatctg 109

<210> 20

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 20

gctgtggcgc ttcaagcaac tgaggcaggc ccctacggcg ccaacatgga agacagcgtc 60

tgctgccgtg attacgtccg ttaccgtctg cccctgcgcg tggtga 106

<210> 21

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 21

agcccagcga cccagtcagg atttaagttt acctcaaaaa tggaagattt taacatggag 60

agtgacagct ttgaagattt ctggaaaggt gaagatctta gtaatta 107

<210> 22

<211> 101

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 22

acagcaacca tgagtacaaa tggtgatgat catcaggtca aggatagtct ggagcaattg 60

agatgtcact ttacatggga gttatccatt gatgacgatg a 101

<210> 23

<211> 100

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 23

gcagctgcct gaaccgagcc ctgccgaaca gctgagaatt gcactgcaac catgagtgag 60

aacaataaga attccttgga gagcagccta cggcaactaa 100

<210> 24

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 24

tgggtgaggc ggttcagcca tgaggctggc tgtgcttttc tcgggggccc tgctggggct 60

actggcagcc caggggacag ggaatgactg tcctcacaaa aaatcagc 108

<210> 25

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 25

tcactgggga ttctgagctt tggctactcc agtttcccac gacacgatgt tccctttcta 60

cagctgctgg aggactggac tgctactact actcctggct gtggcag 107

<210> 26

<211> 102

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 26

aacaggttct tggagtgctg agacagcacc tggggtacat aaaagatatt tccggaaaat 60

aaaaaatctc atttcagcat ttcagaagcc agatcaaggc at 102

<210> 27

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 27

ggcgtgaggc caagctggac cactgcaggc gtgtctccct gcgggtgctg agtgagcgcc 60

tcctgcacaa gagcatccag aacagcctgc ttggacacag ctcggtgg 108

<210> 28

<211> 101

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 28

tttctccctg gacttggaag cagatggaca acccctcaca ccagatgagt acctgacata 60

ctccctgaag ctgaagaaag gtaccagtca aaaagatgaa a 101

<210> 29

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 29

ccaagaagaa agtgaacatc atggatcaga acaacagcct gccaccttac gctcagggct 60

tggcctcccc tcagggtgcc atgactcccg gaatccctat ctttagtc 108

<210> 30

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 30

ggggcctgga agtgcccgct gagaaaggga gaagacagca gaggggttgc cgaggcaacc 60

tccaagtccc agatcatgtc tctgtggggt ctggtctcca agatgccc 108

<210> 31

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 31

atcctacagc gcgtcatcga ctacattctc gacctgcagg tagtcctggc cgagccagcc 60

cctggacccc ctgatggccc ccaccttccc atccagacag ccgagc 106

<210> 32

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 32

aagatacctg tagctttgct catccactat caacagaacc aggcatcatg cggcaaacgc 60

gcaatcatct tggagacgag acagcacagg ctgttctgtg ccgacccg 108

<210> 33

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 33

ttgccctgaa acttagctgt gctgggatta ttctccttgt cttggttgtt actgggttga 60

gtgtttcagt gacatcctta atacagaaat catcaataga aaaatgc 107

<210> 34

<211> 92

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 34

acaatttacc gaatataaga aggagaaagg tttcatcctc acttcccaaa aggaggatga 60

aatcatgaag gtgcagaaca actcagtcat ca 92

<210> 35

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 35

ccaagacagc cacgaagatc ctaccaaaat gaagcgcttc ctcttcctcc tactcaccat 60

cagcctcctg gttatggtac agatacaaac tggactctca ggaca 105

<210> 36

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 36

tccaccacat cctccactgg acacccatcc caaatcagtc tgaaagtacc tgctatgaag 60

tggcgctcct gaggtatgga atagagtcct ggaactccat ctcc 104

<210> 37

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 37

tgattaaagc accagagtgt aatggccctc agagcagggc tggtcctggg gttccacacc 60

ctgatgaccc tcctgagccc gcaggaggca ggggccacca aggctgac 108

<210> 38

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 38

gtggaaatcc taaggaactt ttacttcatt aacagactta caggttacct ccgaaactga 60

agatctccta gcctgtgcct ctgggactgg acaattgctt caagcat 107

<210> 39

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 39

cgttccccta caagaaactc tccccgggtg gaacaagatg gattatcaag tgtcaagtcc 60

aatctatgac atcaattatt atacatcgga gccctgccaa aaaatcaa 108

<210> 40

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 40

gtgtggatta tcctgcatca gcttcaatgt cttaatggtt cataagcgaa gccatactgg 60

tgaacgccca ttccagtgta atcagtgtgg ggcatctttt actcaga 107

<210> 41

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 41

agtgctgagt tggcagtttt cttctgtcac caaaagaggt ctcaatgtgg accagctgaa 60

catgttggga gagaagcttc ttggtcctaa cgccagcccc gatggtctc 109

<210> 42

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 42

gcaggttcca gatgccaccc ttggaggaag gacttgaaga gttgcatgcc tcccacatcc 60

caactgccaa ccctggacac tgcattacag acccgccatc cctgggccc 109

<210> 43

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 43

ctgagtgaca aggaattggt ttcagatgat gaagaaagag gaacgggctt ggaagaaaat 60

aatcaagaag agcaaagcat ggattcaaac ttaggtgaag cagc 104

<210> 44

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 44

ggccctgatc tgtgaggcca gcgggggagg ggccttcctg gtgctgcccc tgggcaagac 60

tggacgtgtg gacaagaatg cgcccacggt ctgtggccac acagcc 106

<210> 45

<211> 111

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 45

tttgggaaac taaagctcac aaacaacaag ggggcgtcca acaatgtgac ccagatgatt 60

gtgctccagt ccctccataa gtaccagccc cggctgcata tcgttgaggt g 111

<210> 46

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 46

ctcacccaac ctactaacaa taattgaaat gcagaaggga gactgtgcac tctatgcctc 60

gagctttaaa ggctatatag aaaactgttc aactccaaat acgtac 106

<210> 47

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 47

gcatctctgc tggtgttcat cagaacagac accatggcag agcatgatta ccatgaagac 60

tatgggttca gcagtttcaa tgacagcagc caggaggagc atcaa 105

<210> 48

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 48

tatctagtac ttactttaac aaaaaatgat cttgacaaag caaataaaga caaagccaac 60

cgatactttt ctccaaattt taaggtgaag ctgtacttca caaaa 105

<210> 49

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 49

ccagagtgga cagaagccca gagacttgac tgctggagag gtggtcaagt gtccctcaag 60

gtcagtaatg atgggcctac actgattggt gcaaatgcct ccttct 106

<210> 50

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 50

agcaccaacc tgctctgtct gccaaatcac atgcaagcca gtgtgagcag gagctatctc 60

caatccttgg gcttttctgc cagtgacctt gtcatttcca cctgga 106

<210> 51

<211> 99

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 51

cttcaagaca actttttaaa catgagtaga tctatgactt ctcaaagccg ggtcatgaat 60

gtccataaaa tgctaggcat tcctatttcc aatattttg 99

<210> 52

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 52

catggaagtg cccacctatc tcaacttcaa gtccatgaac cacatgaatt acctccccag 60

ccaggaggat atgcctcata accagttcat caagatgatg atcatcttt 109

<210> 53

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 53

gtcacagtct cagactcggg gctttaccgc tgctacttgc aggccagcgc aggagaaaac 60

gaaaccttcg tgatgagatt gactgtagcc gagggtaaaa ccga 104

<210> 54

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 54

ctcagcttta aaaggggaag tgccctagaa gaaaaagaga ataaaatatt ggtcaaagaa 60

actggttact tttttatata tggtcaggtt ttatatactg ataag 105

<210> 55

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 55

tattacttct gcaacctatc aatttttgat cctcctcctt ttaaagtaac tcttacagga 60

ggatatttgc atatttatga atcacaactt tgttgccagc tgaag 105

<210> 56

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 56

ctgggcctgc tgacagcgtg caggatgctg ttggaacccg gcagaggctg ctgtgccctg 60

gccatcctgc tggcaattgt ggacatccag tctggtggat gcatta 106

<210> 57

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 57

gaatcatagc accgtgacag tggaggaggc caaggccgag aaggagacgg agctgtcatt 60

gcaaaaggag cagctgcagc tcaagatcat tgagattgag gatgaagc 108

<210> 58

<211> 98

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 58

ccagcccctg atcatttcgc ctaaaagagc aaggactaga gttcctgacc tccaggccag 60

tccctgatcc ctgacctaat gttatcgcgg aatgatga 98

<210> 59

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 59

gcctgctgtc gctgaaggcc gacgtgctgg gggatgacgg ctccctgctg ttcgagtacc 60

tgcccagagg ggcccactcg ctgtccctga atgagttcac ggtg 104

<210> 60

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 60

ggcagcggca gctccactca gccagtaccc agatacgctg ggaaccttcc ccagccatgg 60

cttccctggg gcagatcctc ttctggagca taattagcat catcatta 108

<210> 61

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 61

aagatacttc tgcacgtcac attcaaatcc catcgtgttc ctgcttcagg ggaccttagg 60

gattgtcatc aaccagggac ttcgggggaa atctggagca ttt 103

<210> 62

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 62

caccagatag cagctttatt cacagtgaca gtccctaagg aactgtacat aatagagcat 60

ggcagcaatg tgaccctgga atgcaacttt gacactggaa gtcatgtg 108

<210> 63

<211> 110

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 63

tggccagatc tttagaccag acaactttgt atttggtcag tctggggcag gtaacaactg 60

ggccaaaggc cactacacag agggcgccga gctggttgat tctgtcctgg 110

<210> 64

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 64

tgaccctgca tggtgtgcgg tgccctcctg cctcaggccg cgaagaagga tctaagggct 60

tggcttgttt gaaagaacca caccccgaaa gtaacatctt tggagaa 107

<210> 65

<211> 98

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 65

tgtgatggcc ttcctgctct ctggtgctgc tcctctgaag attcaagctt atttcaatga 60

gactgcagac ctgccatgcc aatttgcaaa ctctcaaa 98

<210> 66

<211> 111

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 66

tcccaggcat aatgaatgat gaaaaattta acctgaagtt ggtcatcaaa ccagccaagg 60

tcacccctgc accgactcgg cagagagact tcactgcagc ctttccaagg a 111

<210> 67

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 67

gagaagagtc ggaagaggtg tggcggcatc ctagtgagaa aggactttgt gctgacagct 60

gctcactgcc agggaagctc cataaatgtc accttggggg cccaca 106

<210> 68

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 68

gcgagagcct gaagagttgg accagttgta cctggatgac gtaaatgaaa taatacgaaa 60

tgacctctcc agcacgagca cccactccta gttgccacat tggagca 107

<210> 69

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 69

ctgcatgatc gtcgggagcc ccgagctgac cttcgggaag ggaactcagc tgagtgtggt 60

tgatttcctt cccaccactg cccagcccac caagaagtcc accctca 107

<210> 70

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 70

ggcacctgca cacctggatc caggataacg gaggctggga tgcctttgtg gaactgtacg 60

gccccagcat gcggcctctg tttgatttct cctggctgtc tctg 104

<210> 71

<211> 100

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 71

ggcgaccatg caggagtcgc tgcgggtgaa gcagctggcc gaagagcaga agcgtcggga 60

gagggagcag cacatcgcag agtgcatggc caagatgcca 100

<210> 72

<211> 111

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 72

cggcgccgaa agaactaaaa ttccagatgg caaactcaat gaatggcaga aaccctggtg 60

gtcgaggagg aaatccccga aaaggtcgaa ttttgggtat tattgatgct a 111

<210> 73

<211> 100

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 73

gacacagcaa gaaaggaggc attcacggaa gcccggggtg cccgaagagg agttaaaaaa 60

gtcatggtta ttgtgacaga tggagagtct catgacaatc 100

<210> 74

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 74

gtccccggcc tgtggtcaaa tcgggagaca agcccagcct ttcggcgaga tacgtctaac 60

cctgtgcaac agccactaca ttacttcaaa ctgagatcct tcct 104

<210> 75

<211> 98

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 75

tggggactgc tcacgttcat catggtgcct ggctgccagg cagagctctg tgacgatgac 60

ccgccagaga tcccacacgc cacattcaaa gccatggc 98

<210> 76

<211> 100

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 76

ccacacttcc gtgattatct gcgtgcattt tggacaaagc ttccaaccag gatacgggaa 60

gaagaaatgg ctggtgatct ttcagcaggt ttcttcatgg 100

<210> 77

<211> 95

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 77

caacaggctc gtccaaacct gcgggtgacc agctgcccgc ggctctgtgg accagcagtg 60

cggtgctggg actgctgctc ctggccttgc ccacc 95

<210> 78

<211> 110

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 78

ctatccccca gccatgaaga atgcccatgc caaggcctcc cgcacctcgt ccaaacacaa 60

ggaggatgtg tatgagaacc tgcacactaa gaacaagagg gaggagaaag 110

<210> 79

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 79

gcagacagcg accaaaaagc ccagggggca ttcaacccca tgtttctaga actctgttcc 60

tgctgctgct gttggcagcc tcagcctggg gggtcaccct gagcccc 107

<210> 80

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 80

tcttcgacga tcggagcttg gtgctgacct atgtgtttac catcctcaac tgcctgcagg 60

gcgccttcct ctacctgctg cactgcctgc tcaacaagaa ggttcggga 109

<210> 81

<211> 102

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 81

ttgctgctca aggaaggggt ggatggcaac tttcttttaa gagacagcga gtcgatacca 60

ggagtcctgt gcctctgtgt ctcgtttaaa aatattgtct ac 102

<210> 82

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 82

tgaccgtgca ggttcttccc cagtgtgagt gccggtgccg ggaccagagc agagaccgca 60

gcctctgcca tggcaagggc ttcttggagt gcggcatctg caggtg 106

<210> 83

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 83

tccatatcag agctgtgatc ttgagagccc tctccttggc tttcctgctg agtctccgag 60

gagctggggc catcaaggcg gaccatgtgt caacttatgc cgcgtttg 108

<210> 84

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 84

aggtccaagg tggaaaagca gctacaggtc atctcagtgc tccagtgggt cctgtccttc 60

cttgtactgg gagtggcctg cagtgccatc ctcatgtaca tattctgca 109

<210> 85

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 85

catgccttgg tctccttgtc cttcctaaaa aaccttcgcc tcatcctagg agaggagcag 60

ctagaaggga attactcctt ctacgtcctc gacaaccaga acttgcagc 109

<210> 86

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 86

tgctcaccct ggagaatgac cagagcctgt catttgaagc ccagaaggac ctgaacaaca 60

aggtgaagac actggtggaa ttcctcattg ataactgctt tgaaata 107

<210> 87

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 87

aaggagctga aagcgcgcaa taccaagaag gagggtgacc tgatagctgc tcaggctcgg 60

ctgaaggacc tggaggctct gctgaactcc aaggaggccg cactgagc 108

<210> 88

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 88

ctgaacaagt gtggcctgtt catgtgcatt gcggtcaacc tgtgtggaaa agccgggccc 60

ggggccaagg gcaaggacat ggaggagggc aaggccgcct tctcgaaa 108

<210> 89

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 89

caggggagta cttctgcatc tatcacacct accctgatgg gacgtacact gggagaatct 60

tcctggaggt cctagaaagc tcagtggctg agcacggtgc caggttcc 108

<210> 90

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 90

aagagcttcc tgcacaaagt aagccaccag cgcaacatga cagtgaagac cctgcatggc 60

ccagccatgg tcaagtactt gctgctgtcg atattggggc ttgc 104

<210> 91

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 91

ctgcagctgt gctcacacct ggaggaaacc tcaatggtca catcctcttt cctgtgtcaa 60

gaagcatcgt ccggggaggt gagaagaaga cagtcctccc tagaattg 108

<210> 92

<211> 100

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 92

ggaaggcgct tttcaccgcg gccatcctgc aggcacagtt gccgattaca gaggcacaga 60

gctttggcct gctggatccc aaactctgct acctgctgga 100

<210> 93

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 93

ccagggctgc ggcacagagc tgcgagtcat gggattcagc accttggcac agctgaagca 60

gaggaacacg ctgaaggatg gtatcatcat gatccagacg ctgctg 106

<210> 94

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 94

caagctcatg tggacaagat gcccctgctg agctgccagt tcctgaaggg tcaccgggag 60

cagcgcctgg cccacctggt cctgagcttc ctcaccatgg gtta 104

<210> 95

<211> 97

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 95

ttcctgaaac ggctcgacag gaacctctgg ggcctggcgg gcttgaattc ctgtcctgtg 60

aaggaagcca accagagtac gttggaaaac ttcttgg 97

<210> 96

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 96

tcaggagctc cagggtcaga ggtcggatgt ctacagcgac ctcaacacac agaggccgta 60

ttacaaatga gcccgaatca tgacagtcag caacatgata cctgg 105

<210> 97

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 97

ggaactggga aattattttg ggtcttcttc ttaatcccat atctggacat ctggaacatc 60

catgggaaag aatcatgtga tgtacagctt tatataaaga gacaatc 107

<210> 98

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 98

gtgaaggagg gttggctgca caaacgaggg gagtacatca agacctggcg gccacgctac 60

ttcctcctca agaatgatgg caccttcatt ggctacaagg agcggccgc 109

<210> 99

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 99

atctctgttg gctccatggg attgattatc agccttctct gtgtgtattt ctggctggaa 60

cggacgatgc cccgaattcc caccctgaag aacctagagg atct 104

<210> 100

<211> 101

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 100

tcttcctgcg ctgcatcgag tccaacatgc tgacagatat gaccctgcag ggcatcgagc 60

agatcagcaa ggtgtacatg cacttgccac agacagacaa c 101

<210> 101

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 101

gttctaagaa cctgcttggg agccgtgacc tccaaagctc tgtgaccttg gacctggccc 60

tcgaccctgg ccgcctgagt ccccgtgcca ccttccagga aac 103

<210> 102

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 102

tgataagccc actctacagc tggagagtgt agatcccaaa aattacccaa agaagaagat 60

ggaaaagcga tttgtcttca acaagataga aatcaataac aagctgg 107

<210> 103

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 103

ggcagagaaa cacataaaga gctcagtgaa catccagatg gcccctccat ccctcaacgt 60

gaccaaggat ggagacagct acagcctgcg ctgggaaaca atga 104

<210> 104

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 104

ctgaatgttt aattaatcag gaatgtgaag aaattctaca gatttgctct actaagggga 60

tgatggcagg tgcagagaaa ttggtggaat gccttctcag atc 103

<210> 105

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 105

aaggaattgg agaattcttt aggttgtccc ctaaagattc tgaaaaagag aatcagattc 60

ctgaagaggc aggaagcagt ggcttaggaa aagcaaagag aaaagca 107

<210> 106

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 106

tggtggtgcc gactacaagc gaattactgt gaaagtcaat gccccataca acaaaatcaa 60

ccaaagaatt ttggttgtgg atccagtcac ctctgaacat gaactgac 108

<210> 107

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 107

agtgcgtgag tgaacagagc ctccagttgt cagcccacct gcaggtgaaa acaaccgatg 60

tccaacttca agcctttgat tttgaagatg accactttgg aaatgtgg 108

<210> 108

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 108

ttatgcactc cgaagcagaa gaatccaagg aagtggccac agatgtcttt aattccaaaa 60

acctggccgt tcaggcacaa aagaagatct tgggtaaaat ggtgtcc 107

<210> 109

<211> 110

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 109

gaagggcagg gcacaatgtc tcctccagag agagatggta cagtctctgg agcagcagct 60

ggtgctggag aaggagaagc tgagtgccat gcaggcccac ctggctggga 110

<210> 110

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 110

gaccatgaat gcaaagcttc tgatggatcc taagaggcag atctttctag atcaaaacat 60

gctggcagtt attgatgagc tgatgcaggc cctgaatttc aac 103

<210> 111

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 111

atattttgtt cagtggtgtg cagacagaaa tttcaccaag ccgcaggatg gcgatgttat 60

agccccactc ataacacctc aaaaaaagga atggaacgac agtact 106

<210> 112

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 112

tctgcagcca tgagcagagg cgacaactgc acggatctac tcgcactggg aatcccctcc 60

ataacccagg cctggggact gtgggtcctc ttaggggctg tgacgc 106

<210> 113

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 113

ctgggggctt gctgctgctg gtttactact ggagcaagaa tagaaaggcc aaggccaagc 60

ctgtgacacg aggagcgggt gctggcggca ggcaaagggg aca 103

<210> 114

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 114

gccaatccct gggattccag gaggttttga gcgttgaggt tacactgcat gtggcagcaa 60

acttcagcgt gcccgtcgtc agcgcccccc acagcccctc ccagg 105

<210> 115

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 115

gaacatggaa gacttacatc gtcatatctt ctgggaacca gatgcaagta agctgaatga 60

gaattactgc cgaaatccag atgatgatgc tcatggaccc tgg 103

<210> 116

<211> 101

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 116

aaaaatcatg gataaaaaca cactagggag tgatttgccc cggatcaaaa cggagattga 60

ggccttgaag aacctgagac atcagcatat atgtcaactc t 101

<210> 117

<211> 1371

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 117

ttgagttcca catgcagagc agatgcgaca gctagaagtg agtagggccc agaccctggc 60

ccaggaagat ccactaaagg aggccatcct tccgccttct tctgcaggag tcaggatgga 120

aaggcagatg taaagtccct catggcgaaa tataacacgg ggggcaaccc gacagaggat 180

gtctcagtca atagccgacc cttcagagtc acagggccaa actcatcttc aggaatacaa 240

gcaagaaaga acttattcaa caaccaagga aatgccagcc ctcctgcagg acccagcaat 300

gtacctaagt ttgggtcccc aaagccacct gtggcagtca aaccttcttc tgaggaaaag 360

cctgacaagg aacccaagcc cccgtttcta aagcccactg gagcaggcca aagattcgga 420

acaccagcca gcttgaccac cagagacccc gaggcgaaag tgggatttct gaaacctgta 480

ggccccaagc ccatcaactt gcccaaagaa gattccaaac ctacatttcc ctggcctcct 540

ggaaacaagc catctcttca cagtgtaaac caagaccatg acttaaagcc actaggcccg 600

aaatctgggc ctactcctcc aacctcagaa aatgaacaga agcaagcgtt tcccaaattg 660

actggggtta aagggaaatt tatgtcagca tcacaagatc ttgaacccaa gcccctcttc 720

cccaaacccg cctttggcca gaagccgccc ctaagtaccg agaactccca tgaagacgaa 780

agccccatga agaatgtgtc ttcatcaaaa gggtccccag ctcccctggg agtcaggtcc 840

aaaagcggcc ctttaaaacc agcaagggaa gactcagaaa ataaagacca tgcaggggag 900

atttcaagtt tgccctttcc tggagtggtt ttgaaacctg ctgcgagcag gggaggccca 960

ggtctctcca aaaatggtga agaaaaaaag gaagatagga agatagatgc tgctaagaac 1020

accttccaga gcaaaataaa tcaggaagag ttggcctcag ggactcctcc tgccaggttc 1080

cctaaggccc cttctaagct gacagtgggg gggccatggg gccaaagtca ggaaaaggaa 1140

aagggagaca agaattcagc caccccgaaa cagaagccat tgcctccctt gtttaccttg 1200

ggtccacctc caccaaaacc caacagacca ccaaatgttg acctgacgaa attccacaaa 1260

acctcttctg gaaacagtac tagcaaaggc cagacgtctt actcaacaac ttccctgcca 1320

ccacctccac catcccatcc ggccagccaa ccaccattgc cagcatctca c 1371

<210> 118

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 118

tcctgcccgt gcctggccca ggagggcccc cagggtgacc tgttgaccaa aacacaggag 60

ctgggccgtg actacaggac ctgtctgacg atagtccaaa aactga 106

<210> 119

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 119

gccttttcac catgagtggg tgcccatttt taggaaacaa ctttggatat acttttaaaa 60

aactccccgt agaaggcagc gaagaagaca aatcacaaac tggtgtg 107

<210> 120

<211> 458

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 120

tcatcgacaa ggtgcggttc ctggagcagc agaacaaggt tctggacacc aagtggaccc 60

tgctgcagga gcagggcacc aagactgtga ggcagaacct ggagccgttg ttcgagcagt 120

acatcaacaa cctcaggagg cagctggaca gcatcgtggg ggaacggggc cgcctggact 180

cagagctgag aaacatgcag gacctggtgg aagacttcaa gaacaagtat gaggatgaaa 240

tcaacaagcg taccactgct gagaatgagt ttgtgatgct gaagaaggat gtagatgctg 300

cctacatgaa caaggtggag ctggaggcca aggttgatgc actgatggat gagattaact 360

tcatgaagat gttctttgat gcggagctgt cccagatgca gacgcatgtc tctgacacct 420

cagtggtcct ctccatggac aacaaccgca acctggac 458

<210> 121

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 121

tctgaggcgg agcaccagag agcctacctg gaagacacat gcgtggagtg gctccacaaa 60

tacctggaga aggggaagga gacgctgctt cacctggagc ccccaaag 108

<210> 122

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 122

ctgctggaga atgtgctgtg tggcgtggcc tttggcctgg gtgtgctggg catcatcgtg 60

ggcattgttc tcatcatcta cttccggaag ccttgctcag gtgac 105

<210> 123

<211> 111

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 123

atggtgaaaa atggcaacgg gaccgcgtgc ataatggcca acttctctgc tgccttctca 60

gtgaactacg acaccaagag tggccctaag aacatgacct ttgacctgcc a 111

<210> 124

<211> 95

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 124

ccctggccgt gccctgagtg accgtcgggc ttgcagggcc tgcgactgtc acccggttgg 60

tgctgctggc aagacctgca accagaccac aggcc 95

<210> 125

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 125

agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc 60

ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg tgg 103

<210> 126

<211> 101

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 126

caattgttca aaagatgcaa atgatacact actgctgcag ctcacaaaca cctctgcata 60

ttacatgtac ctcctcctgc tcctcaagag tgtggtctat t 101

<210> 127

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 127

ggcccgagac ccccagcgct accttgtcat tcagggggat gaaagaatgc atttgccaag 60

tcctacagac tccaacttct accgtgccct gatggatgaa gaa 103

<210> 128

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 128

gcctcacaga ccttcctcag agccgctttc agaaaagcaa gctgcttctg gttgggccca 60

gacctgcctt gaggagcctg tagagttaaa aaatgaaccc cacgga 106

<210> 129

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 129

cggcctgacg tcggtggagg gaagcaggcg caggctccgt gaggaggcaa ggttctgagg 60

agacaggccc cggagcagca ctagctcctg cccacactcc tacc 104

<210> 130

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 130

cagccatgcc tcacagctcc gacagcagtg actccagctt cagccgctct cctccccctg 60

gcaaacagga ctcatctgat gatgtgagaa gagttcagag gagggaga 108

<210> 131

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 131

ggtctgagga acaattctgg ctggaggtgg gaagatggat cacctctaaa cttctcaagg 60

atttcttcta atagctttgt gcagacatgc ggtgccatca acaaaaat 108

<210> 132

<211> 100

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 132

taagcgccta tgccagcatc agtttccaga agcagccaga ggaccgtcag tagctcaact 60

ggacatcaca gcagaatgaa gacctaaatg acctcagcaa 100

<210> 133

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 133

agggcaacag ttatactttc atcgacccca cgcagctgcc ttacaacgag aagtgggagt 60

tcccccggaa caacctgcag tttggtaaga ccctcggagc tggagc 106

<210> 134

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 134

ggcaacggaa cccagattta tgtaattgat ccagaaccgt gcccagattc tgacttcctc 60

ctctggatcc ttgcagcagt tagttcgggg ttgttttttt atagc 105

<210> 135

<211> 100

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 135

gatcatcctg gaagctgtgg ctcttttgct caatagttat gttgctattt ctttgctcct 60

tcagttggct aatctttatt tttctccaat tagagactgc 100

<210> 136

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 136

aaaaggcaac atcctgtcac aggccatgct ctggcaaaaa cccacagctc cggagcaagc 60

cccagccccg gcccggccat accagggcgt ccgtgtgaag gagccag 107

<210> 137

<211> 100

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 137

ggtcctactt agtcttgaca gaaaaaccat ctgtgctggg gctttgattg caaaagactg 60

ggtgttgact gcagctcact gtaacttgaa caaaaggtcc 100

<210> 138

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 138

aagagtacct tgttccaatc ccaggtggaa tgaatggctg aattatgata tatacattcc 60

tgatcttcct cgtgctgctc gactttgcct ttccatttgc tctgtt 106

<210> 139

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 139

ctgaagacaa caggcgacca ctttgggaac ctgaagaaac tgtggtcatt gccttatatg 60

actaccaaac caatgatcct caggaactcg cactgcggcg caacga 106

<210> 140

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 140

cacattctca ggaactctcc ttctttgggt ctggctgaag ttgaggatct cttactctct 60

aggccacgga attaacccga gcaggcatgg aggcctctgc tctcac 106

<210> 141

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 141

aatgtgttcg tagaggtggt gctggcggac cccaaccact ggcgcttcca ggggggcaaa 60

tgggtgacct gtggcaaagc cgacaataac atgcagggca acaaa 105

<210> 142

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 142

gatcccagcc ccacctctga gcaaggtccc tctgcagcag aacttccagg acaaccaatt 60

ccaggggaag tggtatgtgg taggcctggc agggaatgca attctc 106

<210> 143

<211> 100

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 143

gctcttggtg ctggctggtc tttctcactt ctgttcaggt gttatccacg tgaccaagga 60

agtgaaagaa gtggcaacgc tgtcctgtgg tcacaatgtt 100

<210> 144

<211> 100

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 144

ctcggggaca tacaggtgca ctctgcagga cccggatggg cagagaaacc taagtggcaa 60

ggtgatcttg agagtgacag gatgccctgc acagcgtaaa 100

<210> 145

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 145

ttatccctag acgcttcatt gatcgaattc aaatcttgcc ccgtgggaat ggttgtccaa 60

gaaaagaaat catagtctgg aagaagaaca agtcaattgt gtgtg 105

<210> 146

<211> 102

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 146

ttggggaaag gaacgtgaaa ggcatgtttg aggtgctgga gcccttgcat gctatgatgg 60

aacggggccc ccagactctg aaggaaacat cctttaatca gg 102

<210> 147

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 147

ccagcagtgg tcttgctctt actccttttg gttgaacaag cagcggccct gggagagcct 60

cagctctgct atatcctgga tgccatcctg tttctgtatg gaattgt 107

<210> 148

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 148

caatcacact cagtttccac catctcggtc atcaggattg cctaatatac ctgtccagac 60

aatctccaga gctgctgcag aaaagctgtt tgggaatatg gaaggag 107

<210> 149

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 149

tgtgccgggc ctacaatgct gacaaccgca cggtcttttt tgaaggcaaa tacggtggca 60

tggagctgtt ccgagccttg ggctgcagcg agctcatcag ctccat 106

<210> 150

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 150

ggcttctgcc cggaccaagg atacagtttg ttcctcgtgg cggcgcatga gttcggccac 60

gcgctgggct tagatcattc ctcagtgccg gaggcgctca tgtacccta 109

<210> 151

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 151

caacaagagc tgaccgaggc ccagaagggc tttcaggatg tggaggccca ggccgccacc 60

tgcaaccaca ctgtgatggc cctaatggct tccctggatg cag 103

<210> 152

<211> 111

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 152

ggctccttcg ccatcaagtc gctgcggaaa ctgacggacg atgagctgtt ccagtacctg 60

ctgcagctgg tgcaggtgct caagtacgag tcctacctgg actgcgagct g 111

<210> 153

<211> 111

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 153

ggggatcatt gtggctgtgg tcactgggat tgctgtagcg gccattgttg ctgctgtagt 60

ggccttgatc tactgcagga aaaagcggat ttcagctctc ccaggatacc c 111

<210> 154

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 154

ccaagtgcag ctggctggtg acgaaggccg gagctgggac cagcagctcc cactgggtat 60

ggtggtttct ctcagggagc ctcgtcatcg tcattgtttg ctcc 104

<210> 155

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 155

ttcgcccagc caagttgaag aacctaatct tgctggtgaa gcactggtac caccaggtgt 60

gcctacaggg gttgtggaag gagacgctgc ccccggtcta tgccctgga 109

<210> 156

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 156

tgatttcact gcttcaggtg aggatgaact gagctttcac actggagatg ttttgaagat 60

tttaagtaac caagaggagt ggtttaaggc ggagcttggg agcc 104

<210> 157

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 157

acttcttaag gcgagcatca aaagccgggg aggttgatgt tgaacagcac actttagcca 60

agtatttgat ggagctgact ctcatcgact atgatatggt gcattatca 109

<210> 158

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 158

tcctgggagt cttactgctc atcggctgtt ggtattgtag aagacgaaat ggatacagag 60

ccttgatgga taaaagtctt catgttggca ctcaatgtgc cttaac 106

<210> 159

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 159

cggcctgacg tcggtggagg gaagcaggcg caggctccgt gaggaggcaa ggttctgagg 60

agacaggccc cggagcagca ctagctcctg cccacactcc tacc 104

<210> 160

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 160

aatggattct gtgcccacag taaggcaggc tgtaaaagaa ttgcaagtct acatatcacc 60

caagaataca gttatttctg tgaatccatc cacaaagctg caag 104

<210> 161

<211> 100

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 161

aatcgcagat ggagggactc ctgacatagc cagctgctgt gaaataatgg aagagcttac 60

aacctgcctt aaaaattacc gaaaaacctt aatacactgc 100

<210> 162

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 162

gacgggactc cagaaagacc atgccctctg ggatcacact gcccagaatc tccttcggat 60

gggcctggcc tttctagtcc tggtggctct agtgtggttc ctggttg 107

<210> 163

<211> 102

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 163

cagttgagac tcagaacttg gaaggcctgc atcatgatgg ccaattctgc cataagccct 60

gtcctccagg tgaaaggaaa gctagggact gcacagtcaa tg 102

<210> 164

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 164

gtgcgaatct gacttacgcc attattacga cagtaccatt gagttgtgcg tgggggaccc 60

agagattaaa aagacttcct ttaaggggga ctctggaggc cctcttg 107

<210> 165

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 165

cttatcacag tgaagatgga gcaggccttt gcccgatact tgctggagca gactccagag 60

cagcaggcag ccattctgtc cctggtgtag agcctggggg acc 103

<210> 166

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 166

cgcctactcc gtgaagtcta gggacaggaa gatggttggc gacgtgaccg gggcccaggc 60

ctatgcctcc accgccaagt gcctgaacat ctgggccctg attctg 106

<210> 167

<211> 110

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 167

gaagggaaag ctgggggctc cccactgcac ttgccacctg agtcacattt tcagaagcct 60

ctggaaagtc gtgcacagcc caggagtgtt gagcaatttc ggtttcctct 110

<210> 168

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 168

ctggagaacg ggaaggacaa gctggagcgc gctgaccccc caaagacaca cgtgacccac 60

caccccatct ctgaccatga ggccaccctg aggtgctggg ccctggg 107

<210> 169

<211> 99

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 169

acatcggaac tgcgactcag catgcagaag tcaatgcaaa atcatgctgc cgtgttccgt 60

gtgggaagcg tgttgcaaga aggttgtggg aaaatcagc 99

<210> 170

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 170

tcctaccgag agtggataca ggtagacttg ggccttctgc gctttgtcac ggctgtcggg 60

acacagggcg ccatttcaaa agaaaccaag aagaaatatt atgtc 105

<210> 171

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 171

gctgcgcgct tccaccgggt ggggcccatt gaagccacgt ccttcatcct cagggctgtg 60

cggccccgag ccaggtacta cgtccaagtg gcggctcagg acctcacag 109

<210> 172

<211> 101

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 172

ggagaggaag tctgagtcag cccatcctgt tgggagccct ggagagagtg gcacatcagg 60

gtggcgaggg ggggacactc ccagccccct ctgtctcttg c 101

<210> 173

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 173

cctgcaaggt ggagcacgag agctttgaga agcctcagct gctgactgtg aacctcaccg 60

tgtactaccc cccagaggta tccatctctg gctatgataa caactgg 107

<210> 174

<211> 102

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 174

tatcttcagc ttgtgataaa gagtcaaata tggaacgaag agtgatcacg atttctaaat 60

cagaatattc tgtgcactca tctttggcat ccaaagttga tg 102

<210> 175

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 175

atgaataaca ctctaagaaa ggatggaaag aaagattgct gttttgaaat ctctgctcct 60

gataaacgta tatatcagtt tacagcagct tctcccaaag atg 103

<210> 176

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 176

agtttccatg tggtacacac tcccccgctg caccctgact tcaagagggc cctcggggac 60

ctgccccacc acttcaacgc ctccacccag cccgcctacc tcaggc 106

<210> 177

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 177

tccaaaacag acttgggtga aatatattgt gcgtctcctc agtaaaaaag tcaagaacat 60

gtaaaaactg tggcttttct ggaatggaat tggacatagc ccaaga 106

<210> 178

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 178

gactgcatgt gtgtccagcc tgaattccac tgcggagacc cttgctgcac gacctgccgg 60

caccaccctt gtcccccagg ccagggggta cagtcccagg ggaaattc 108

<210> 179

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 179

gaaaacctat ggcaaacaat acaaggaaaa gaatgaagaa gcagtacgac gtctcatctg 60

ggaaaagaat ctaaagtttg tgatgcttca caacctggag catt 104

<210> 180

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 180

ctcctggtcc ttctacctgg gctgggtctc agctatcctc ttgctctgta caggtgccct 60

gagcctgggt gctcactgtg gcggtccccg tcctggctat gaaacct 107

<210> 181

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 181

caggagcttg tgccgtggcc cacagcccac agcccacagc catgggctgg gacctgacgg 60

tgaagatgct ggcgggcaac gaattccagg tgtccctgag cagctcc 107

<210> 182

<211> 101

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 182

gactccccag acaggccctg gaaccccccc accttctccc cagccctgct cgtggtgacc 60

gaaggggaca acgccacctt cacctgcagc ttctccaaca c 101

<210> 183

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 183

tacagcgagc tgcaggactc taatccagag tttaccttcc agcagcccta cgaccaggcc 60

cacctgctgg cagccatccc acctccggag atcctcaacc ccaccgcc 108

<210> 184

<211> 100

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 184

gttgttcaag gcttccccat gttcaaaaga ggacgctgtc tttgcatagg ccctggggta 60

aaagcagtga aagtggcaga tattgagaaa gcctccataa 100

<210> 185

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 185

ggacctggct ggagaagaag agattgagct ctactcagaa cccgacacag acaccatcaa 60

ctgcgaccag ttcagcaggc tgttgtgtga catggaaggt gat 103

<210> 186

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 186

tagtttccaa tttgcggatc cactgccctc tgcttgcggg ctctgctctg atcacctttg 60

atgaccccaa agtggctgag caggtgctgc aacaaaagga gcacacg 107

<210> 187

<211> 87

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 187

ggcccaaaat gttctgctga tcgatgggcc cctgagctgg tacagtgacc caggcctggc 60

aggcgtgtcc ctgacggggg gcctgag 87

<210> 188

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 188

gcagatgcag gacaagtact ccaaaagtgg cattgcttgt ttcttaaaag aagatgacag 60

ttattgggac cccaatgacg aagagagtat gaacagcccc tgctgg 106

<210> 189

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 189

tgagaaggat ggcaagtacg gcttctgtcc ccatgaagcc ctgttcacca tgggcggcaa 60

cgctgaagga cagccctgca agtttccatt ccgcttccag ggcacatc 108

<210> 190

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 190

ccaactgcct gacaatctgt accccgagga gatccccagc gcgctcaacc tcttctccgg 60

cagcagcgac tcggtagtcc attacaatca gatggctaca gagaa 105

<210> 191

<211> 111

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 191

ctgagggacg gcgtagagtt cggccgaagg aacctgaccc aggctctgtg aggaggcaag 60

gttttcaggg gacaggccaa cccagaggac aggattccct ggaggccaca g 111

<210> 192

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 192

gtccttcaga gcaagtggcc tctgtaatct gctcaggaaa ccagtcccaa acactgtcct 60

cgtgcaattc atcgtctttg ggcccaacaa ggcctaccat tcc 103

<210> 193

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 193

agtgaggaac aagccagagc tgtgcagatg agtacaaaag tcctgatcca gttcctgcag 60

aaaaaggcaa agaatctaga tgcaataacc acccctgacc caacc 105

<210> 194

<211> 97

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 194

gaatatctgg aaccgtgaat ggtattctca ctttgacttt gatctccttg atcctgttgg 60

tttctcaggg agtattgcta aaatgccaaa aaggaag 97

<210> 195

<211> 110

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 195

ccagttgggc cggactctcc aaacctgctt ccgcaatggg tgggttgtga gtgctggtaa 60

tgaggagccg tgggtgcagc cagccttgga gatgccgaag agacgggaca 110

<210> 196

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 196

acaggaggca gaggcatcat ggagggtccc cggggatggc tggtgctctg tgtgctggcc 60

atatcgctgg cctctatggt gaccgaggac ttgtgccgag cacc 104

<210> 197

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 197

aattgtaaga agaagcttgg gaagctgcca cctcagtatg ccctggagct cctgacggtc 60

tatgcttggg agcgagggag catgaaaaca catttcaaca cagcccag 108

<210> 198

<211> 102

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 198

gcccaatgtg cttatggtac ataaaaggag tcacactggt gaacgcccct tccactgtaa 60

ccagtgtgga gcttctttta ctcagaaggg caaccttctg ag 102

<210> 199

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 199

cccctgcccc ccagcatggg tttctgccgc agcgccctgc acccgctgtc tctcctggtg 60

caggccatca tgctggccat gaccctggcc ctgggtacct tgcctgcc 108

<210> 200

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 200

cgcgggctgc ggcaagacct acaccaagag ttcgcatctg aaggcgcatc tgcgcacgca 60

cacaggtgag aagccctacc actgcaactg ggacggctgc ggctgg 106

<210> 201

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 201

ttgcagggtt tcaccaggat ccacctctga tgttcactga agagtaccag aaaagtctgc 60

tagagcagta ccatctgggt ctggatcaaa aacgcagaaa atacg 105

<210> 202

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 202

gtcaatgctc aggagccctg taatggccgg actgcccttc acctcgcagt ggacctgcaa 60

aatcctgacc tggtgtcact cctgttgaag tgtggggctg atgtca 106

<210> 203

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 203

gagatggctg tgacccccaa ggactcaggg acaacagtca gttctgcttg caaaggatcc 60

accagggtct gattttttat gagaagctgc taggatcgga tattt 105

<210> 204

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 204

ctgtgtgtga aatgagtaaa caatctttgc aagtcctaaa gaagtgttgg gcatttttgc 60

aagaatcttc tctgaatccg ctgatccaga tgcttaaagc agcc 104

<210> 205

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 205

atgtgctgct ggtggtggtg cctgtctcgc tgctcctgat gctggttact ctcttctctg 60

cctggcactg gtgcccctgc tcagggaaaa agaaaaagga tgtccatgc 109

<210> 206

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 206

cactgccttc gaagtccggc gccccccggg agggaactgg gtggccgcac cctcccggct 60

gcggtggctg tcgcccccca ccctgcagcc aggactcgat ggagaa 106

<210> 207

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 207

caaccagacc tctacattcc attttggaag aagactaaaa atggtgtttc caatgtggac 60

actgaagaga caaattctta tcctttttaa cataatccta atttcca 107

<210> 208

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 208

aatgcactgg gtcagctgag ttctggctcc acacccagcc ccgaggttta tgcagggctc 60

attgatctgt ataaatcctc ggacctcccg ggaggagagt tttctacct 109

<210> 209

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 209

caaagaagaa catgtgatca tccaggccga gttctatctg aatcctgacc aatcaggcga 60

gtttatgttt gactttgatg gtgatgagat tttccatgtg gatatggc 108

<210> 210

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 210

gtaagcacaa aggaagtgaa agtgattgtg ctggcaactc ctttcaagcc aatcctggaa 60

gcttcagtta tcagaaagca aaatggagaa gaacatgttg tactc 105

<210> 211

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 211

gcagaggagg cccaggcagt gccaggagtc aaggcctgtt ggatctcatc atccatatcc 60

ctgttgatac gtttacctgc tgctcctgaa gaagtcgtca tgcctcccg 109

<210> 212

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 212

gccctgatgg gcagtcaaca gctaaaacct tcctcaccgt gtactggact ccagaacggg 60

tggaactggc acccctcccc tcttggcagc cagtgggcaa gaacct 106

<210> 213

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 213

cgcctgtttg agaagcagcg ggcaagaaag acgcaagccc agaggccctg ccatttctgt 60

gggctcaggt ccctactggc tcaggcccct gcctccctcg gcaaggcc 108

<210> 214

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 214

ttgctcagta ccacgatcct gatgatgaac cagtggccga tccttatgat cagtcctttg 60

aaagcaggga cctccttata gatgagtgga aaagcctgac ctatgatg 108

<210> 215

<211> 88

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 215

ccaggaggcg tctgacacag tatgatgatg aagatcccat ggggcagcat cccagtactg 60

atgttgctcc tgctcctggg cctaatcg 88

<210> 216

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 216

ctgtgcctgt cttcctgggt ttgagggtca gaattgtgaa gtgaacgtgg acgactgtcc 60

aggacaccga tgtctcaatg gggggacatg cgtggatggc gtcaacacc 109

<210> 217

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 217

tccccttcgc caactgggac atcttccgac atggcctgga tgctgttgct catcttgatc 60

atggtccatc caggatcctg tgctctctgg gtgtcccagc cccctgag 108

<210> 218

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 218

ggccgaggtc ctgagctggc agttctcctc caccaccaag cgaggactga gcatcgagca 60

gctgactaca ctggcagaga aactcttggg acctggtgtg aatta 105

<210> 219

<211> 101

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 219

ccattctgcg ctgctgcaag ttacggaatg aaaaattaga acaacagaaa catggaaaac 60

atgttccttc agtcgtcaat gctgacctgc attttcctgc t 101

<210> 220

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 220

tgcagatctg ctgcaactgc tggagagcca gatgcaggaa aggaacaatg ccggcttcct 60

cagctacaac atctacctca ctggctggga tgagtctcag gccaatc 107

<210> 221

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 221

taatggaatc tttattttgt gaaagtagcg gggactcatc tctggagaag gagttcctcg 60

gggccccagt ggggccctcg gtgagcaccc ccaacagcca gcactc 106

<210> 222

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 222

tgccattgca gatgcaacca gagaagatcc atttaaagag aaacttctag aaataatgac 60

aaggattcaa acttattgtc aaatgagtcc aatgtcagat tttgga 106

<210> 223

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 223

ggggatccca ggatctcaca atctcaggga ccatgggctg tggctgcagc tcacacccgg 60

aagatgactg gatggaaaac atcgatgtgt gtgagaactg cca 103

<210> 224

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 224

caaatcaaca caaaccccaa gtcctccttg ccaggccttc aaccactatc tcagtgcaat 60

ggcttccatg aggcaggctg aacctgcaga tatgcgccca gagatatgg 109

<210> 225

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 225

ggagcgcttg ccctctcact ccgactttct ggctgagctt cggaaggccc ccgtggtgaa 60

ctgctccatc gctgtctgcc agagaatcca gtgtgacatc ccgttc 106

<210> 226

<211> 110

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 226

gagaaggagc agcaacaact caactggaag caggacagta atcctctcta caaaagtgcc 60

atcacgacca ccatcaatcc tcgctttcaa gaggcagaca gtcccactct 110

<210> 227

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 227

agtcaagatg aagaaccatt tgcttttctg gggagtcctg gcggttttta ttaaggctgt 60

tcatgtgaaa gcccaagaag atgaaaggat tgttcttgtt gaca 104

<210> 228

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 228

gaagtaaccg cttcacctgg atgggacttt cagatctaaa tcaggaaggc acgtggcaat 60

gggtggacgg ctcacctctg ttgcccagct tcaagcagta ttggaacag 109

<210> 229

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 229

atacggttta ctccactgtg gaaataccga aaaagatgga aaatccccac tcactgctca 60

cgatgccaga cacaccaagg ctatttgcct atgagaatgt tatc 104

<210> 230

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 230

gcctttaata agctccaaga gaaaggcatc tacaaagcca tgagtgagtt tgacatcttc 60

atcaactaca tagaagccta catgacaatg aagatacgaa actgaga 107

<210> 231

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 231

gaagcagtga aatttgacat gggtgcttat aagtcatcaa aggatgatgc taaaattacc 60

gtgattctaa gaatctcaaa aactcaattg tatgtgactg ccc 103

<210> 232

<211> 317

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 232

ccctcagtga cccggtgcag ctagaagtcc atatcggctg gctgttgctc caggcccctc 60

ggtgggtgtt caaggaggaa gaccctattc acctgaggtg tcacagctgg aagaacactg 120

ctctgcataa ggtcacatat ttacagaatg gcaaaggcag gaagtatttt catcataatt 180

ctgacttcta cattccaaaa gccacactca aagacagcgg ctcctacttc tgcagggggc 240

tttttgggag taaaaatgtg tcttcagaga ctgtgaacat caccatcact caaggtttgg 300

cagtgtcaac catctca 317

<210> 233

<211> 97

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 233

caaagactca cttctataac caccacgagt tgaatcaaaa ttttcaaatg ttttcagcag 60

tgtaaagaag cgtcgtgtat acctgtgcag gcactag 97

<210> 234

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 234

cccaatgccg aactgggagg cccctttgac cagatgaacg gagtggccgg agatggcatg 60

atcaacattg acatgactgg agagaagagg tcgttggatc tccca 105

<210> 235

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 235

ccaactttga tgtgcgtgaa attgtaaata acatcaggcg tttgatggat ggagaagaac 60

ctttgccaat gcttccaagt tacaagaact tcaagggtac tat 103

<210> 236

<211> 110

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 236

gcggcctcta ctgctgcctg gtggtggaga tcaggcacca ccactcggag cacagggtcc 60

atggtgccat ggagctgcag gtgcagacag gcaaagatgc accatccaac 110

<210> 237

<211> 111

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 237

ctttgaaaga catctatacg tggattgagg accactttcc ctactttaag cacattgcca 60

agccaggctg gaagaactcc atccgccaca acctttccct gcacgacatg t 111

<210> 238

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 238

tcgcctgaag cagcctgcgg actgtctgga tggactgtat gccttgatgt cgcggtgctg 60

ggagctaaat ccccaggacc ggccaagttt tacagagctg cgggaagat 109

<210> 239

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 239

ggagactcag gagttttgag agcaaaatga caacacccag aaattcagta aatgggactt 60

tcccggcaga gccaatgaaa ggccctattg ctatgcaatc tggtc 105

<210> 240

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 240

cagcaggctc cgggctgaag attgcttctc ttctctcctc caaggtctag tgacggagcc 60

cgcgcgcggc gccaccatgc ggcagaaggc ggtatcgctt ttcttgtgc 109

<210> 241

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 241

tcattatcga atgtgccaga gctgtgtgga gctggatcca gccaccgtgg ctggcatcat 60

tgtcactgat gtcattgcca ctctgctcct tgctttggga gtc 103

<210> 242

<211> 102

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 242

atgctcatct ctcacacaga cttttgatgg acaggagttt ctaagtatca tgcctaccaa 60

caagctgtaa aatgatcacc ctgaacaatc aagatcaacc tg 102

<210> 243

<211> 101

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 243

gaggaggaat tgaactcagg actcagagta gtccaggtgt tctcctccta ttcagttccc 60

agaatcaaag caatgcattt tggaaagctc ctagcagaga g 101

<210> 244

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 244

cggcccacga gcggatgccc tggtaccaca gcagcctgac gcgtgaggag gccgagcgca 60

aactttactc tggggcgcag accgacggca agttcctgct gaggccgc 108

<210> 245

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 245

gctgtgggcc agggggcctt gggcgtggaa gtgcgagcca aggaccagga catcttggat 60

ctggtgggtg tgctgcacga tcccgagact ctgcttcgct gcatcgct 108

<210> 246

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 246

gagcttgctc ctgctccagt tgcggtcatc atgactacgc ccgcctcccg cagaccatgt 60

tccatgtttc ttttaggtat atctttggac ttcctcccct gatcctt 107

<210> 247

<211> 102

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 247

ggaatcagta agctaaaaac aaaatcaacc gggaccccag cttttcagaa ctgcagggaa 60

acagccatca tgagtgaggt caccaagaat tccctggaga aa 102

<210> 248

<211> 101

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 248

aaacaaatat tttgcagtat gcttccacca ggccccctac cttgtcacca atacctcaca 60

ttcctcgaag cccttacaag tttcctagtt cacccttacg g 101

<210> 249

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 249

agtcttttaa tgagtaccgc aaacgcttta tgctgaagcc ctatgaatca tttgaagaac 60

ttacaggaga aaaggaaatg tctgcagagt tggaagcact ctatggt 107

<210> 250

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 250

aaagtggagc agcacgtgga gctgtaccag aaatacagca acaattcctg gcgatacctc 60

agcaaccggc tgctggcacc cagcgactcg ccagagtggt tatctt 106

<210> 251

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 251

gtaccgcgac agacatcacc ggccccatca tcctgcagac gtaccgcgcc attgccaact 60

acgagaagac ctcgggctcc gagatggctc tgtccacggg ggacgtgg 108

<210> 252

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 252

gggggcctgg tccatgtccg cgtcccacta gcaggcggag ccccccaccc cctcagcagg 60

gccggagacc tagatgtcat tgtttccaga gaaggagaaa atgg 104

<210> 253

<211> 110

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 253

ccaggccaaa cagttgcacc tgcactggtc cgacttgcca tataagggct cggagcacag 60

cctcgatggg gagcactttg ccatggagat gcacatagta catgagaaag 110

<210> 254

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 254

acccttgtgc taagtcaaga ggctcaatgg gctgcagaag aactagagaa ggaccaagca 60

aagccatgat atttccatgg aaatgtcaga gcacccagag ggactt 106

<210> 255

<211> 98

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 255

ggccgtcatc ctactgctcc tcctcctcct cctcctcttc ctcatcctcc gacatcgacg 60

tcagggcaaa cactggacat cgacccagag aaaggctg 98

<210> 256

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 256

gcacttccag agcctgtccg gagctcagag gttcggaaga cttatcgacc atggagcgcg 60

cgtcctgctt gttgctgctg ctgctgccgc tggtgcacgt ctctgc 106

<210> 257

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 257

caccctgcac atcaacacac tcgcccggga gctgcttatc gtgccagggc aggtggtgga 60

caggtccaca ggcatcggca ttgaaggctt ctctgagttg atacag 106

<210> 258

<211> 110

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 258

tccagccatg gctgccatta cctgaccagc gccacagccg gtctctctgc aggcgccggg 60

agaagtgacc agagcaattt ctgcttttca cagggcgggt ttctcaacgg 110

<210> 259

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 259

gggactgggc agttctagac agtcccgaag ttctcaaggc acaggtctct tcctggtttg 60

actgtcctta ccccggggag gcagtgcagc cagctgcaag cccc 104

<210> 260

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 260

tttcatggtt ctggttgcct tggtaggatt gggcctgggg atgtttcagc tcttccacct 60

acagaaggag ctggcagaac tccgagagtc taccagccag atgc 104

<210> 261

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 261

cttttacacc ttttctactg tacaccccat cccagacgaa gacagtccct ggatcaccga 60

cagcacagac agaatccctg ctaccacttt gatgagcact agtgctac 108

<210> 262

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 262

tggccaagag gaaggtgcct atggctggat tactatcaac tatctgctgg gcaaattcag 60

tcagaaaaca aggtggttca gcatagtccc atatgaaacc aataatc 107

<210> 263

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 263

ggagacatgg aggaggaaga ggctgagggg aagatggaag aaggagggaa ggaaggagaa 60

atctttgctt ttgggtaatc aggtgtttct agctgtgtac agggact 107

<210> 264

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 264

ggtcttgaag gacactggga tcctgtaaca cagccccgga tatctgtgtt accagccttg 60

tctcggccac ctcaaggata atcactaaat tctgccgaaa ggact 105

<210> 265

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 265

tgtagcaaac cctcaagctg aggggcagct ccagtggctg aaccgccggg ccaatgccct 60

cctggccaat ggcgtggagc tgagagataa ccagctggtg gtgcc 105

<210> 266

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 266

ttctgcagct ctgtgtgaag gtgcagtttt gccaaggagt gctaaagaac ttagatgtca 60

gtgcataaag acatactcca aacctttcca ccccaaattt atcaa 105

<210> 267

<211> 100

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 267

tgtgttacag tgggctgaaa aaggatacta caccatgagc aacaacttgg taaccctgga 60

aaatgggaaa cagctgaccg ttaaaagaca aggactctat 100

<210> 268

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 268

tcccagacgc ggaggttggg gtcatggcgc cccgaagcct cctcctgctg ctctcagggg 60

ccctggccct gaccgatact tgggcgggct cccactcctt gag 103

<210> 269

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 269

ctgtgcaacg cctgcgggct ctatcacaaa atgaacggac agaaccggcc cctcattaag 60

cccaagcgaa ggctgtctgc agccaggaga gcagggacgt cctgtgcg 108

<210> 270

<211> 102

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 270

aaggtgtgag ttggccagaa ctctgaaaag attgggaatg gatggctaca ggggaatcag 60

cctagcaaac tggatgtgtt tggccaaatg ggagagtggt ta 102

<210> 271

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 271

aaaggctggt ctgcttgaga aacttaaaga acaagagtgt gatgtgaagg attatgggga 60

cctgcccttt gctgacatcc ctaatgacag tccctttcaa attg 104

<210> 272

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 272

cccagctgag ctcagagcat ggaggagacg tccagaagtg gctctcttcg cccttcccct 60

catcgtcctt cagccctggc ggcctggcac ctgagatctc gccactag 108

<210> 273

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 273

tgccgtgggc atgggccgcg ctgagcaggt catctttgtc cgagagaccc ccaacacagc 60

aggcgcaggg gccacaggcg gcatcatcgg gggcatcatc gccgccat 108

<210> 274

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 274

gcccggaaga tcgtgggggc catggtccag atcatcactt accgggacta cctgcccctg 60

gtgctggggc caacggccat gaggaagtac ctgcccacgt accgttcc 108

<210> 275

<211> 98

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 275

tgctgagaag cctgacatac caggactgcc tgagacaagc cacaagctga acagagaaag 60

tggattgaac aaggacgcat ttccccagta catccaca 98

<210> 276

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 276

ctgtacttca gggccgtaca ctgctcaaat cattcctggt acaggaaaca agcttctgat 60

gtcttctcct aattgtgaga tatattatca aagtccttta tcact 105

<210> 277

<211> 102

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 277

gccatccgca tcccgctccg gtacaatggc ttggtgaccg gcacgagggc taagggcatc 60

attgccatct gctgggtgct gtcgtttgcc atcggcctga ct 102

<210> 278

<211> 110

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 278

gacgtccgtg atgagaaggt caaggtgttg aaatgcatct cagaggtgca ggccaacaat 60

gtggtcctgg gccagtacgt ggggaacccc gatggagagg gcgaggccac 110

<210> 279

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 279

ctggaccact agtatttcag gtatgctgct gaaagtggga atcctctaca ttggtgggca 60

gctggtgacc agtggggctg taagcagtgg gaaccttgtc acatt 105

<210> 280

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 280

cgaagtggac atcgcaaaag ctgatccagc tgctgcatcc caccctctat tactgaatgg 60

agatgctact gtggcccaga aaaatccagg ctcggtggct gaga 104

<210> 281

<211> 101

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 281

gctgagcacc ccagtggctg aggccagaga ctttcccaag gatttcttgg tccagtttaa 60

gggcatgtgc tacttcacca acgggacaga gcgcgtgcgc g 101

<210> 282

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 282

ccgggggtct ccttctctcc tgaccaccac acccggcccc actgtgagag ctgtcggcac 60

tgtaactctg gtcttctcgt tcgcaactgc accatcactg ccaatgct 108

<210> 283

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 283

catccctgag gctgcagcgc gtgcgtgtgg cggacgaggg cagcttcacc tgcttcgtga 60

gcatccggga tttcggcagc gctgccgtca gcctgcaggt ggccgctcc 109

<210> 284

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 284

gggactgtga ggggcgcttc tgactttgga cttgagcact gcctgggacc tgtgctgaga 60

gagcgctagc atgtctcagt ggaatcaagt ccaacagtta gaaatca 107

<210> 285

<211> 110

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 285

tctgcgcact gctggacacc cccttacccg ctgggccctt cagcgccagc cacccagccc 60

caagcaactg gaagaagaat tcttgaagat cccttcaaac tttgtcagcc 110

<210> 286

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 286

gacaaccacc ctcagccttg cacaccacag ctctgctgcc ttacctgcac gcacctccaa 60

caccaccatc acagcgaaca cctcagatgc ctaccttaat gcctctg 107

<210> 287

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 287

atcagctata aatatcgaga ggacttgtct gcacatctca tggtagctgg ctgggaccaa 60

cgtgaaggag gtcaggtata tggaaccctg ggaggaatgc tgactcg 107

<210> 288

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 288

ctcaggactg tcagaatgcc catcaggaat tcagattttg gccgtttttg gtgatcatcg 60

tgattctaag cgcactgttc cttggcaccc ttgcctgctt ctgtg 105

<210> 289

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 289

ggggatcagt atatacactt cagataacta caccgaggaa atgggctcag gggactatga 60

ctccatgaag gaaccctgtt tccgtgaaga aaatgctaat ttcaataa 108

<210> 290

<211> 101

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 290

tttgtcagga caagggctca gaggactgga cgtgctcaga catcggtgtt cttcttccca 60

gttcttgacc cctggtcctg tctccagccc gtcttggctt a 101

<210> 291

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 291

atccagcgtt tcgtagaaac cccagctcat ttctcttgga aagaaagtta ttaccgatcc 60

accatgtccc agagcacaca gacaaatgaa ttcctcagtc cag 103

<210> 292

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 292

tatgcttgtg ccccacctga gtcccaggct cccggagtcc ccacagagcc aagcataagg 60

tctgccgaag ccttggcgtt ctcagactgc cggctgcaca tctgcctgt 109

<210> 293

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 293

tcatagctga ctactttgag acgagcagcc agtgctccaa gcccggtgtc atcttcctaa 60

ccaagcgaag ccggcaggtc tgtgctgacc ccagtgagga gtggg 105

<210> 294

<211> 98

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 294

tattctgaaa ccagccccca gtgccccaag ccaggtgtca tcctcctaac caagagaggc 60

cggcagatct gtgctgaccc caataagaag tgggtcca 98

<210> 295

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 295

ttaatacatc acacttgcaa aagaagtatg taaaagtttt aatgcacgat gtagcttacc 60

gccaggaaaa ggatgaaaac aaatggacgc atgtgaattt atccagc 107

<210> 296

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 296

acaggattcc tgagctgaaa tgcagatgac cacattcaag gaagaacttt ctgccccggc 60

tttgcaggat gaaaagcttt cctgcttggc agttattctt ccaca 105

<210> 297

<211> 102

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 297

gtgaaataca gaacccagcg agtgcaaact tcagtgaccc agtcaccctg aatgtcctct 60

atggcccaga tgcccccacc atttcccctt cagacaccta tt 102

<210> 298

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 298

aatttactga aagcagttag caaggaaagg tctaaaagat ctccttaaaa ccagagggga 60

gcaaaatcga tgcagtgctt ccaaggatgg accacacaga ggctg 105

<210> 299

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 299

gcaagtgtcc caaagaagct gtgatcttca agaccattgt ggccaaggag atctgtgctg 60

accccaagca gaagtgggtt caggattcca tggaccacct ggac 104

<210> 300

<211> 98

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 300

tgccttgaag aaaaaggacc aatgttcgaa ctacttccag gtgaatccaa caagatcccc 60

cgtctgagga ctgacctttt tccaaagacg agaatcca 98

<210> 301

<211> 984

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 301

tggggggctt ctacctgtgc cagccggggc ccccctctga gaaggcctgg cagcctggct 60

ggacagtcaa tgtggagggc agcggggagc tgttccggtg gaatgtttcg gacctaggtg 120

gcctgggctg tggcctgaag aacaggtcct cagagggccc cagctcccct tccgggaagc 180

tcatgagccc caagctgtat gtgtgggcca aagaccgccc tgagatctgg gagggagagc 240

ctccgtgtct cccaccgagg gacagcctga accagagcct cagccaggac ctcaccatgg 300

cccctggctc cacactctgg ctgtcctgtg gggtaccccc tgactctgtg tccaggggcc 360

ccctctcctg gacccatgtg caccccaagg ggcctaagtc attgctgagc ctagagctga 420

aggacgatcg cccggccaga gatatgtggg taatggagac gggtctgttg ttgccccggg 480

ccacagctca agacgctgga aagtattatt gtcaccgtgg caacctgacc atgtcattcc 540

acctggagat cactgctcgg ccagtactat ggcactggct gctgaggact ggtggctgga 600

aggtctcagc tgtgactttg gcttatctga tcttctgcct gtgttccctt gtgggcattc 660

ttcatcttca aagagccctg gtcctgagga ggaaaagaaa gcgaatgact gaccccacca 720

ggagattctt caaagtgacg cctcccccag gaagcgggcc ccagaaccag tacgggaacg 780

tgctgtctct ccccacaccc acctcaggcc tcggacgcgc ccagcgttgg gccgcaggcc 840

tggggggcac tgccccgtct tatggaaacc cgagcagcga cgtccaggcg gatggagcct 900

tggggtcccg gagcccgccg ggagtgggcc cagaagaaga ggaaggggag ggctatgagg 960

aacctgacag tgaggaggac tccg 984

<210> 302

<211> 98

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 302

ctcaatgaaa gacgatttgg agaatgtaaa aagtcttgga acagatctga tgaatgaaat 60

gaggaggatt acttcggact tcagaattgg atttggct 98

<210> 303

<211> 100

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 303

cgtgaagtct agggacagga agatggttgg cgacgtgacc ggggcccagg cctatgcctc 60

caccgccaag tgcctgaaca tctgggccct gattctgggc 100

<210> 304

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 304

aagggctcca aaggctgcaa gaggactgag cggtcacaga cccctaaagg gccatagccc 60

agtgagcagc ctggagccct ggagacccca ccagcctcac cagcgct 107

<210> 305

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 305

ggaaccacag acaatctgtg ctccagaggt tatgaagcca tgtatacgct actaggcaat 60

gccaatggag caacctgtgc attcccgttc aagtttgaaa acaag 105

<210> 306

<211> 100

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 306

gcccatcctg tgtctccctg ctgcgctgca ccggctgctg cggcgatgag aatctgcact 60

gtgtgccggt ggagacggcc aatgtcacca tgcagctcct 100

<210> 307

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 307

ccagaacacc tatctgagtg gcctgtgtta cctcttccgc cagaatctgc agggtcccat 60

gctgcagggg cgccctggtt ttcaggaatg tatcaagggc aac 103

<210> 308

<211> 100

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 308

tgtggctgaa taagcggtgt tcatgatttc ttttattctt tgcacaacaa caacaacaac 60

aaattcacgg aatcttttaa gtgctgaact tatttttcaa 100

<210> 309

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 309

cgtgggcccg ggaaggtcgg aagaagtgtt cctgcaagtg cagtatgccc cggaaccttc 60

cacggttcag atcctccact caccggctgt ggagggaagt caagtcg 107

<210> 310

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 310

tctgaggact gctccaggga tgccatcgtt tttgtaactg tgcagggcag ggccatctgt 60

tcggacccca acaacaagag agtgaagaat gcagttaaat acctgc 106

<210> 311

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 311

atatctttca acaaatctct atatgaggga ctgaatgcag agaaccacag aactaagatc 60

actgtcgtct tcctgaaaga tgagaagtac cattctttgc ctatca 106

<210> 312

<211> 100

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 312

gacctgggac cttaacagaa atgtgaccga tatcgagtgt gttaaagacg ccgactattc 60

tatgccggca gtgaacaata gctattgcca gtttggagca 100

<210> 313

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 313

aggtatgcct gtgtcaagat gaggtcacgg acgattacat cggagacaac accacagtgg 60

actacacttt gttcgagtct ttgtgctcca agaaggacgt gcgg 104

<210> 314

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 314

tatggtttaa gaagcactgc tcatatcagg acatcctgtg agactcttcc ccctgactcc 60

cccattgtgt taagaaccca gcaacccagg agcctagtac aata 104

<210> 315

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 315

tccctggcca tggcgctgca gctctcccgg gagcagggaa tcaccctgcg cgggagcgcc 60

gaaatcgtgg ccgagttctt ctcattcggc atcaacagca ttttat 106

<210> 316

<211> 111

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 316

gcagcctatg gatacggcat tcggtatgaa tatgggattt tcaatcagaa gatccgagat 60

ggatggcagg tagaagaagc agatgattgg ctcagatatg gaaacccttg g 111

<210> 317

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 317

cacactgcca ccagcacaaa tactgcgacc ccaacctagg gcttcgggtc cagcagaagg 60

gcacctcaga aacagacacc atctgcacct gtgaagaagg ctggcac 107

<210> 318

<211> 101

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 318

atcaccccaa cctcacatgc acagccagca accctgtcag caggagttcc caccagtttc 60

tttctgagaa catctgttca ggacctgaga gaaacacaaa g 101

<210> 319

<211> 325

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 319

gcagaccctg cgcggctact acaaccagag cgaggccagt tctcacaccc tccagtggat 60

gattggctgc gacctggggt ccgacggacg cctcctccgc gggtatgaac agtatgccta 120

cgatggcaag gattacctcg ccctgaacga ggacctgcgc tcctggaccg cagcggacac 180

tgcggctcag atctccaagc gcaagtgtga ggcggccaat gtggctgaac aaaggagagc 240

ctacctggag ggcacgtgcg tggagtggct ccacagatac ctggagaacg ggaaggagat 300

gctgcagcgc gcggaccccc ccaag 325

<210> 320

<211> 102

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 320

ttgaactaga agcaattgtt aacagcatca aaagaagcag aaaaattatt tttgttataa 60

cacaccatct attaaaagac ccattatgca aaagattcaa gg 102

<210> 321

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 321

gcagcaagaa tggcacggtc tgcctcagtc caccctgtac cctggcccgg tcctttggag 60

tagaatggat tgcaagttgg ctagtggtca cggtgcccac cat 103

<210> 322

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 322

ggagtaccac caagccacgg gcaccctcag tgcccacttc aggaacatgt cactgaagag 60

gatcaagcgt gctgaccggc ggggtgcaga gtccgtgaca gagg 104

<210> 323

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 323

caaaaggcag acagcgggca ctaccactgc agtggcatct tccagagccc tggtcctggg 60

atcccagaaa cagcatctgt tgtggctatc acagtccaag aactg 105

<210> 324

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 324

cactctggag agaagcccta caaatgcgaa acctgcggag ccagatttgt acaggtggcc 60

cacctccgtg cccatgtgct tatccacact ggtgagaagc cctatcc 107

<210> 325

<211> 101

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 325

ccccaggtgt aagcgcagaa agcaggcgaa cccgcggcgc aataacgtta caaattataa 60

tactgtggta gaaacaaatt cagattcaga tgatgaagac a 101

<210> 326

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 326

actgccctct gcgctcctgc atctgcctcc ccatattcct cggacaccac accctgctgc 60

tttgcctaca ttgcccgccc actgccccgt gcccacatca aggagtatt 109

<210> 327

<211> 101

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 327

ctggccagct tcgagaaaga gttgagaagt taaacatgct cagcattgat catctcacag 60

accacaagtc acagcgcctt gcacgtctag ttctgggatg c 101

<210> 328

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 328

cagcttcggg aagaggaaag gaacctcaga ccttccagat cgcttcctct cgcaacaaac 60

tatttgtcgc aggaataaag atggctgctg aaccagtaga agacaa 106

<210> 329

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 329

gttgttaaac ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 60

gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttcc 104

<210> 330

<211> 102

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 330

ggtggatatg tctgggttga aactcaagca actgtcatat ataacaccaa gaattctcaa 60

ccacagtgca ttgtatgtgt gaattacgtt gtgagtggta tt 102

<210> 331

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 331

ggtgctgctc acatctgtgg tccagggcag ggccactcca gagaattacc ttttccaggg 60

acggcaggaa tgctacgcgt ttaatgggac acagcgcttc ctgga 105

<210> 332

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 332

aaggataagg gtgacagcaa cagctcggcg ggctggaaga attcaattcg tcataatctg 60

tccctacaca gcaagttcat tcgtgtgcag aatgaaggaa ctgga 105

<210> 333

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 333

cttctttcgg atggagagag gaagtaccaa atacagttac aaatctcccc agctctctgt 60

gcatgtgaca gacttgaccc acaggcccaa aatcctcatc cctggc 106

<210> 334

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 334

tctgcaaaat tttctcaaga aggagaataa gaatgaaaag gtcatagaac acatcatgga 60

ggacctggac acaaatgcag acaagcagct gagcttcgag gagttc 106

<210> 335

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 335

ggggctcctg agcccatcct tcgggactgg acacctgggc tgtcccccat gcagaccctg 60

aaggtttctg tgtctgcagt gactctgggc ctgggcctca tcatcttc 108

<210> 336

<211> 100

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 336

acacggaatg tgaaggccca gtcacagact gaccgagtgg acctggggac cctgcgcggc 60

tactacaacc agagcgaggc cggttctcac accatccaga 100

<210> 337

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 337

taccttgtgt ttgcaagatc tgcggcaagg cgttttccag accctggttg cttcaaggac 60

acattagaac tcacacgggg gagaagcctt tttcttgccc tcactg 106

<210> 338

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 338

tattttgaca gtttgttgca tgcttgcata ccttgtcaac ttcgatgttc ttctaatact 60

cctcctctaa catgtcagcg ttattgtaat gcaagtgtga ccaat 105

<210> 339

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 339

ggcccaatgg gctaagcctg gacatcccgg ctgggcgcct ctactgggtg gatgccttct 60

acgaccgcat cgagacgata ctgctcaatg gcacagaccg gaagat 106

<210> 340

<211> 168

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 340

cgcagcttga gactggcgga gggaagcccg cccaggctct ataaggagac aaggttctga 60

gcagacaggc caaccggagg acaggattcc ctggaggcca cagaggagca ccaaggagaa 120

gatctgcctg tgggtcccca ttgcccagct tttgcctgca ctcttgcc 168

<210> 341

<211> 345

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 341

ttcctccctt ctgctgatga gatttatgac tgcaaggtgg agcactgggg cctggaccag 60

cctcttctga aacactggga gcctgagatt ccagccccta tgtcagagct cacagagact 120

gtggtctgtg ccctggggtt gtctgtgggc ctcatgggca ttgtggtggg cactgtcttc 180

atcatccaag gcctgcgttc agttggtgct tccagacacc aagggccatt gtgaatccca 240

tcctggaagg gaaggtgcat cgccatctac aggagcagaa gaatggactt gctaaatgac 300

ctagcactat tctctggccc gatttatcat atcccttttc tcctc 345

<210> 342

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 342

ggcctccttg agtcagggaa gtcggaactg aagaagcaag tgaagcccaa ggcctggctg 60

tcccgtggcc ccagtcctgg ccctggccgt ctgctgctgg tgtgcca 107

<210> 343

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 343

atgagaagcg tatggccaca gaagttgctg ctgacgctct gggtgaagaa tggaagggtt 60

atgtggtccg aatcagtggt gggaacgaca aacaaggttt cccca 105

<210> 344

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 344

ctcttctgac cctgatgaga aagctcaaga ttccaaggcc tattcaaaaa tcactgaagg 60

aaaagtttca ggaaatcctc aggtacatat caagaatgtc aaaga 105

<210> 345

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 345

gtatggcgga catcacgttt gtggaggtgt tctgattgat ccacagtggg tgctgacagc 60

agcccactgc caatatcggt ttaccaaagg ccagtctccc actgtggt 108

<210> 346

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 346

gatgcctggg ggtccaggag tcctccaagc tctgcctgcc accatcttcc tcctcttcct 60

gctgtctgct gtctacctgg gccctgggtg ccaggccctg tggatg 106

<210> 347

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 347

accatccaaa agtacggcac caaccccgag gagaccgcgg ccgaggagag ctgggactat 60

gtgcagttcc agctgcgctg ctgcggctgg cactacccgc aggactggt 109

<210> 348

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 348

gcagtggtat agcatatcct cacatttcta gtgcccttga gactgtgcta tggaaccaat 60

cttgaacata catgcattga cttgacaagt tactgagtaa gcagcata 108

<210> 349

<211> 106

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 349

tgactttctc aggatgatgc tgggcaagag atctgccatc ctaaaaatga tcctgatgta 60

tgaggaaaaa gcgagagaaa aggaaaagcc aacaggcccc ccagcc 106

<210> 350

<211> 95

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 350

accagagaga agccgggatg gaaactccaa acaccacaga ggactatgac acgaccacag 60

agtttgacta tggggatgca actccgtgcc agaag 95

<210> 351

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 351

caaggaatct gcttttcaag tatgccacca acagtgaaga ggttattgga gtgatgagta 60

aagaatacat accaaagggc acacgttttg gacccctaat aggt 104

<210> 352

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 352

ctacagggat attaatatta cttcactact atgtgtttag tacagcgatt ggattaacct 60

ccttcgtcat tgccatattg gttattcagg tgatagccta tatcc 105

<210> 353

<211> 109

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 353

aagcccactg acgctccacc gaaagtactg accaagtgcc aggaagaggt cagccacatc 60

cctgctgtcc acccgggttc attcaggccc aagtgcgacg agaacggca 109

<210> 354

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 354

ggatgtgagc caggcccagg ctgggaccta cacctgccat atccatctgc aggaacagca 60

gctcaatgcc actgtcacat tggcaatcat cacagtgact cccaaatc 108

<210> 355

<211> 85

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 355

cctcagaagt gggagtgagc ggaagcagct gtgcacggcc acacaggaca cagtctgccg 60

ctgccgggcg ggcacccagc ccctg 85

<210> 356

<211> 102

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 356

tcaatatatg atacaaaagg aaaaaatgtg ttggaaaaaa tatttgattt gaagattcaa 60

gagagggtct caaaaccaaa gatctcctgg acttgtatca ac 102

<210> 357

<211> 99

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 357

gctgccttct gctctccagc gctctcagca ccaatgggct cagaccctcc caccgcctgc 60

tgcttttctt acactgcgag gaagcttcct cgcaacttt 99

<210> 358

<211> 117

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 358

ggcctgagcg gtaggagtgg ggctggagca gtaagatggc ggccagagcg gtttttctgg 60

cattgtctgc ccagctgctc caagccaggc tgatgaagga ggagtcccct gtggtga 117

<210> 359

<211> 101

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 359

ctccaagggg tcaggtgcaa aggcctgcca gatgattatg ggaagctgga acccagtagg 60

tgtgggccgc tacctcaaca cctggctgat ggagacaaag g 101

<210> 360

<211> 92

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 360

tttctacaac cagcttgcat tttttctgcc cacaatgagc ggggaatcaa tgaatttcag 60

cgatgttttc gactccagtg aagattattt tg 92

<210> 361

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 361

gcatccagcg cttcgcacag gctcagcagc agctgccgct cgagtcactt gggtgggacg 60

tagctgagct gcagctgaat cacacaggac ctcagcagga cccc 104

<210> 362

<211> 111

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 362

ggtgactgat gatctaagtt tcccgaggtt tctcagagcc tctctggttc tttcactggt 60

gaccagccag cccctcctct ttcttcctcc ggtgctggcg gaagagcccc c 111

<210> 363

<211> 247

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 363

gctgcagatg cggggccagg gggccggaga gccgcctgct tgagttctac ctcgccatgc 60

ctttcgcgac acccatggaa gcagagctgg cccgcaggag cctggcccag gatgccccac 120

cgcttcccgt gccaggggtg cttctgaagg agttcactgt gtccggcaac atactgacta 180

tccgactgac tgctgcagac caccgccaac tgcagctctc catcagctcc tgtctccagc 240

agctttc 247

<210> 364

<211> 356

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 364

ctctcccccg accaggggcg gttctgaagg acttcaccgt gtccggcaac ctactgttta 60

tgtcagttcg ggaccaggac agggaaggcg ctgggcggat gagggtggtg ggttgggggc 120

tgggatccgc ctccccggag gggcagaaag ctagagatct cagaacaccc aaacacaagg 180

tctcagaaca gagacctggt acaccaggcc cgccgccacc cgagggagcc cagggagatg 240

ggtgcagagg tgtcgccttt aatgtgatgt tctctgcccc tcacatttag ccgactgact 300

gctgcagacc accgccaact gcagctctcc atcagctcct gtctccagca gctttc 356

<210> 365

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 365

gctgactgca gggcctgctc cctgcccccc acctccaggt tggggccttc accatggatc 60

agttccctga atcagtgaca gaaaactttg agtacgatga tttgg 105

<210> 366

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 366

gtggctgact ggcagatcca gaggttccct tggcagtcca cgccaggcct tcaccatgga 60

tcagttccct gaatcagtga cagaaaactt tgagtacgat gatttgg 107

<210> 367

<211> 130

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 367

gcgtttaagt tggcagactt ggatttcagg aagagctctc tggcttctgg gtggagaatg 60

gccagtgggg ccttcaccat ggatcagttc cctgaatcag tgacagaaaa ctttgagtac 120

gatgatttgg 130

<210> 368

<211> 85

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 368

ctcggaacac cacagcgact agaggccttc accatggatc agttccctga atcagtgaca 60

gaaaactttg agtacgatga tttgg 85

<210> 369

<211> 116

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 369

acctattatc ggcctagacc aagacgctac gtagagcctc ctgaaatgat tgggcctatg 60

cggcccgagc agttcagtga tgaagtggaa ccagcaacac ctgaagaagg ggaacc 116

<210> 370

<211> 116

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 370

acctattatc ggcctagacc aagacgctac gtagagcctc ctgaaatgat tgggcctatg 60

cggcccgagc agttcagtga tgaagtggaa ccagcaacac ctgaagaagg ggaacc 116

<210> 371

<211> 116

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 371

acctattatc ggcctagacc aagacgctac gtagagcctc ctgaaatgat tgggcctatg 60

cggcccgagc agttcagtga tgaagtggaa ccagcaacac ctgaagaagg ggaacc 116

<210> 372

<211> 116

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 372

acctattatc ggcctagacc aagacgctac gtagagcctc ctgaaatgat tgggcctatg 60

cggcccgagc agttcagtga tgaagtggaa ccagcaacac ctgaagaagg ggaacc 116

<210> 373

<211> 116

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 373

acctattatc ggcctagacc aagacgctac gtagagcctc ctgaaatgat tgggcctatg 60

cggcccgagc agttcagtga tgaagtggaa ccagcaacac ctgaagaagg ggaacc 116

<210> 374

<211> 112

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 374

gacatgtccc aagtttcagg gaaggaaagc ccccctgtaa gcgatactcc agatgagggc 60

gatgagccca tgccgatccc cgaggacctc tccaccacct cgggaggaca gc 112

<210> 375

<211> 87

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 375

ctcagattac tacaaccgat ccacctcacc ttggaatctc caccgcaatg aggaccctga 60

gagatatccc tctgtgatct gggaggc 87

<210> 376

<211> 85

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 376

cttaatcagc aatatcaacg taatagttct ggaactaaag ggatctgaaa caacattcat 60

gtgtgaatat gctgatgaga cagca 85

<210> 377

<211> 82

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 377

cttccacaaa tgcagggaga agacagaaac acagactaac atgcccttca tgtgattctt 60

atgagaaaaa accacccaaa ga 82

<210> 378

<211> 86

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 378

gacgttcgtc tcattgggga gaaactgttc cacggagtca gtatgagtga gcgctgctat 60

ctgatgaagc aggtgctgaa cttcac 86

<210> 379

<211> 722

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 379

ccatgtcgct catggtcgtc agcatggcgt gtgttgggtt cttcttgctg cagggggcct 60

ggccacatga gggagtccac agaaaacctt ccctcctggc ccacccaggt cccctggtga 120

aatcagaaga gacagtcatc ctgcaatgtt ggtcagatgt caggtttgag cacttccttc 180

tgcacagaga ggggaagtat aaggacactt tgcacctcat tggagagcac catgatgggg 240

tctccaaggc caacttctcc atcggtccca tgatgcaaga ccttgcaggg acctacagat 300

gctacggttc tgttactcac tccccctatc agttgtcagc tcccagtgac cctctggaca 360

tcgtcatcac aggtctatat gagaaacctt ctctctcagc ccagccgggc cccacggttt 420

tggcaggaga gagcgtgacc ttgtcctgca gctcccggag ctcctatgac atgtaccatc 480

tatccaggga gggggaggcc catgaacgta ggttctctgc agggcccaag gtcaacggaa 540

cattccaggc cgactttcct ctgggccctg ccacccacgg aggaacctac agatgcttcg 600

gctctttccg tgactctccc tatgagtggt caaactcgag tgacccactg cttgtttctg 660

tcacaggaaa cccttcaaat agttggcctt cacccactga accaagctcc aaaaccggta 720

ac 722

<210> 380

<211> 103

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 380

ctatgagtgg tcaaactcga gtgacccact gcttgtttct gtcacaggaa acccttcaaa 60

tagttggcct tcacccactg aaccaagctc caaaaccggt aac 103

<210> 381

<211> 79

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 381

tgggacacca cagagcagca ctgaaggaga agacctgcct gtgggtcccc atcgcccaag 60

tcctgcccac actcccacc 79

<210> 382

<211> 113

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 382

tccgagctca cccagcagct ggcgcaggcc accggcaagc ccccccagta catcgcggtg 60

cacgtggtcc cggaccagct catggccttc ggcggctcca gcgagccgtg cgc 113

<210> 383

<211> 133

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 383

tcacttctcg ctcgacacag ccagagctgg aggtgggtgc ccggcacgga ggggcctgcg 60

gaccaatggc tctgccctgc accttagggc tcgggatgct gctggccctg ccaggggcct 120

tgggctcggg tgg 133

<210> 384

<211> 116

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 384

ctcggagaaa atcttctatg tgtatatgaa gagaaagtat gaggctatga ctaaactagg 60

tttcaaggcc accctcccac ctttcatgtg taataaacgg gccgaagact tccagg 116

<210> 385

<211> 122

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 385

ctctctacga acatttcaac agcccacatc ccacccctgc acctgcggac atcagccaga 60

agcaagttca caggcctctg cagacccctg acctctctgg cttctactcc ctgacctcag 120

gc 122

<210> 386

<211> 78

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 386

agataatacc taaagaggaa cactgtaaaa tgccagaagc aggtgaagag caaccacaag 60

tttaaatgaa gacaagct 78

<210> 387

<211> 102

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 387

gtgaaataca gaacccagcg agtgcaaact tcagtgaccc agtcaccctg aatgtcctct 60

atggcccaga tgcccccacc atttcccctt cagacaccta tt 102

<210> 388

<211> 127

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 388

caccaaagca gaggggcagg cagcacacca cccagcagcc agagcaccag cccagccatg 60

gtccttgagg tgagtgacca ccaagtgcta aatgacgccg aggttgccgc cctcctggag 120

aacttca 127

<210> 389

<211> 105

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 389

ccattgctca ggcatgggaa agcatcgcta cacatcagca ggaatatctg tcactgtgaa 60

agagctattt ccagctccag tgctgaatgc atctgtgaca tcccc 105

<210> 390

<211> 102

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 390

agcggctcct acttctgcag ggggcttgtt gggagtaaaa atgtgtcttc agagactgtg 60

aacatcacca tcactcaagg tttggcagtg tcaaccatct ca 102

<210> 391

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 391

ctggaaacag tactagcaaa ggccagacgt cttactcaac aacttccctg ccaccacctc 60

caccatccca tccggccagc caaccaccat tgccagcatc tcac 104

<210> 392

<211> 104

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 392

gcagcacgag gggctgcaag agcccctcac cctgagctgg gagccatctt cccagcccac 60

catccccatc atgggcatcg ttgctggcct ggctgtcctg gttg 104

<210> 393

<211> 97

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 393

aggaaggtgc atcaccatct acaggagaag aagaatggac ttgctaaatg acctagcact 60

attctctggc ctgatttatc atatcccttt tctcctc 97

<210> 394

<211> 100

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 394

gtgtggagac catcaaggaa gacatgaatg tcaagttttt caatagcaac aaaaagaaac 60

gagatgactt cgaaaagctg actaattatt cggtaactga 100

<210> 395

<211> 133

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 395

cgcggctgcc tgtctgctcc ggcagcacca tgtcgctctt ggtcgtcagc atggcgtgtg 60

ttgggttctt cttgctgcag ggggcctggc cacatgaggg agtccacaga aaaccttccc 120

tcctggccca ccc 133

<210> 396

<211> 102

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 396

aacttcatga agatgttctt tgatgcggag ctgtcccaga tgcagacgca tgtctctgac 60

acctcagtgg tcctctccat ggacaacaac cgcaacctgg ac 102

<210> 397

<211> 108

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 397

aaggagctga aagcgcgcaa taccaagaag gagggtgacc tgatagctgc tcaggctcgg 60

ctgaaggacc tggaggctct gctgaactcc aaggaggccg cactgagc 108

<210> 398

<211> 107

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 398

ctcccgagtg attgtcatga caacgaaaga agtggagaga ggaaagagta aatgtgtcaa 60

atactggcct gatgagtatg ctctaaaaga atatggcgtc atgcgtg 107

<210> 399

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 399

ttccatgucg aagaaccgag uc 22

<210> 400

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 400

gcagcuacca ccagcacaut 20

<210> 401

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 401

cgtcaugaag ggtcctucca a 21

<210> 402

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 402

atggctgtcu gatggcatug a 21

<210> 403

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 403

caatcctgca ucccccauag t 21

<210> 404

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 404

tgtctctctt tccucttctg ttccua 26

<210> 405

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 405

gugaacagaa aactuggaac gaaagt 26

<210> 406

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 406

cggtgtgcuc ctcactguaa 20

<210> 407

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 407

ccaugacuca aggcacagac t 21

<210> 408

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 408

tccccacauc actgucgaaa c 21

<210> 409

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 409

tctcaacaua agacagtgac caguct 26

<210> 410

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 410

accagggagg ugtcgttaua gt 22

<210> 411

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 411

ctggccagua cacctguca 19

<210> 412

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 412

tcttggccuc gcatctuaga aag 23

<210> 413

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 413

gcaaacccgg cuactugga 19

<210> 414

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 414

catcatacac cuccacgctg ut 22

<210> 415

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 415

tgtggaatta ucacccatca tcaucc 26

<210> 416

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 416

acaagatcuc ccaagtcctc caua 24

<210> 417

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 417

tgutcctgca ucagcaccaa 20

<210> 418

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 418

gctgaatctg gguttagaca tgttugaa 28

<210> 419

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 419

cagcccugga atcccugat 19

<210> 420

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 420

aaactgggcc accucgatut 20

<210> 421

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 421

gaaatggaua aactcatcgc ucagaaag 28

<210> 422

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 422

ccgcccauca tcagaaguga 20

<210> 423

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 423

cagcttgagt uaaacgaacg tactug 26

<210> 424

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 424

cggcagcgug gtttctgua 19

<210> 425

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 425

ctgagcaucc cucccaacat 20

<210> 426

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 426

ttgttccagc ugtcccugaa g 21

<210> 427

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 427

ggcccaucag tucacacagg 20

<210> 428

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 428

ctgcagtccu ttctccaguc t 21

<210> 429

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 429

cuagagtgcu cgcagcagt 19

<210> 430

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 430

actggcagca ggaugagttu c 21

<210> 431

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 431

gtctaccaca aguactccct gauaaag 27

<210> 432

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 432

accatcagtg tugatatcca actcttug 28

<210> 433

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 433

gcttctcuga aaggctctcc ut 22

<210> 434

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 434

aaauacggcu gcaccgagt 19

<210> 435

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 435

ccaggctaca ugcaggacut 20

<210> 436

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 436

gggtgacacc uggaagttgu a 21

<210> 437

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 437

tggttgtccu cgtcctccut 20

<210> 438

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 438

agtctgaggu ccagtagaag tgut 24

<210> 439

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 439

tggaggtguc ctacagguga aa 22

<210> 440

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 440

ggcaggguag agctgtaacu g 21

<210> 441

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 441

tgcagaacgg cugcctaatu t 21

<210> 442

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 442

caagactctg ttutctaaat caggcaut 28

<210> 443

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 443

gcagaagagg aagauttcug aagagt 26

<210> 444

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 444

tcaagttcca ggugaaatgg caut 24

<210> 445

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 445

cagacagccu agctggacut 20

<210> 446

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 446

cgtgaaggau ggcagcaaag ua 22

<210> 447

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 447

ctcccauccc cagaagggua t 21

<210> 448

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 448

tctgtcugcc aggattctcu ca 22

<210> 449

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 449

accgaguguc ccagacaga 19

<210> 450

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 450

tcaactggat acugcagagg tatuaca 27

<210> 451

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 451

gtccacugac aggctgtugt 20

<210> 452

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 452

atcgttgccc ucgcatcut 19

<210> 453

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 453

gactttgugt ggacacugag aga 23

<210> 454

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 454

atacagagtc ugggcaggtu aaaag 25

<210> 455

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 455

gcgcaagggu ttctggttug 20

<210> 456

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 456

ccagtgccau aaggcatcat ug 22

<210> 457

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 457

gctggacaga gcuacagacc uat 23

<210> 458

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 458

gccgcugcac tttttcugg 19

<210> 459

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 459

ctcagctuag ccagguggaa 20

<210> 460

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 460

gagatgacaa gutccggagu ga 22

<210> 461

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 461

acgtgcagca agaugacauc a 21

<210> 462

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 462

gtccttgacc cautgctccu t 21

<210> 463

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 463

agggtucacc ttggcaucaa t 21

<210> 464

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 464

tgctcugttg aatguccaca ct 22

<210> 465

<211> 29

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 465

cggtatccuc gaattcaaag taucaaagt 29

<210> 466

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 466

gagatgagau aaaacccatc acagtuga 28

<210> 467

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 467

cctgagatca ccuaaaaagc tgcua 25

<210> 468

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 468

tggtttggcu ggtgtcgtut 20

<210> 469

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 469

gtctgtgtgg uttgaagcag aattut 26

<210> 470

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 470

gacagggtcu ggctacagut 20

<210> 471

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 471

accacacgga cugagactga ut 22

<210> 472

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 472

gtccguagga gcccatgug 19

<210> 473

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 473

tgtgccugga ccatagucag a 21

<210> 474

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 474

aacagcauct gctggtugaa ga 22

<210> 475

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 475

ggccagaaga gcugagacau c 21

<210> 476

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 476

ggctgcgaut tgctucaca 19

<210> 477

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 477

agtggaaaga ugaactgcga ugt 23

<210> 478

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 478

agtggaaaga ugaactgcga ugt 23

<210> 479

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 479

tggcggagga ggutaccut 19

<210> 480

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 480

cgatgggcuc agcttucaga 20

<210> 481

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 481

acaaaaccuc guccacggaa t 21

<210> 482

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 482

cagaugagga gguccagcaa a 21

<210> 483

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 483

tgctccucgg gtgatacuga 20

<210> 484

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 484

cugaaagcca gggagtuggt 20

<210> 485

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 485

cutgtttcac tcucacaccc agat 24

<210> 486

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 486

tgtgctguca accctaagtt ugt 23

<210> 487

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 487

caggcgaugt cuagcacagg 20

<210> 488

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 488

ggaugcgcca ggaagttuca 20

<210> 489

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 489

ctctggcuct ccgtcgut 18

<210> 490

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 490

gtgggaagau ggctccatuc t 21

<210> 491

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 491

acacagucct ttgcaugcag at 22

<210> 492

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 492

tcatctcugg aacaaacugg caaa 24

<210> 493

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 493

cttgctgaac ugcaggaagu c 21

<210> 494

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 494

agcgugcaga taaugacaag gaa 23

<210> 495

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 495

gatttgacgg cucctctacu gt 22

<210> 496

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 496

ccuggaacag gcagctguat 20

<210> 497

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 497

ttccagggaa gutcaaggca auag 24

<210> 498

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 498

actactccag uccctccaau gac 23

<210> 499

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 499

gccgacacuc gtagtaucca t 21

<210> 500

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 500

aagtggatga tugcagtgag gut 23

<210> 501

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 501

caaatcugaa gcatagttuc caaccat 27

<210> 502

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 502

tgaccctcug cagctccua 19

<210> 503

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 503

gacagtgaug aaggcgaugg a 21

<210> 504

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 504

cgucatcgtc auccccgat 19

<210> 505

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 505

cagccacaaa gaggguatat tggtua 26

<210> 506

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 506

gatcttacac atutgttcca tggcut 26

<210> 507

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 507

gatgtcccau ggcguaggt 19

<210> 508

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 508

cttggaccau tctcaugcca ac 22

<210> 509

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 509

gcacauccta tggguaacca gaa 23

<210> 510

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 510

agagccaaca uttgcttcaa gtuc 24

<210> 511

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 511

ggaagcugag ctggtgaugt 20

<210> 512

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 512

tgcaugtucc aggagcacaa 20

<210> 513

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 513

cttctccttc ugccacttcu ca 22

<210> 514

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 514

atgaggaacu tgaggcaagu ca 22

<210> 515

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 515

ccaggccccc guagatacat aua 23

<210> 516

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 516

cggcgcucat gaguaagaac a 21

<210> 517

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 517

cggacactug aacttcttcc ugat 24

<210> 518

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 518

cuggttgtga gucaccaagg aa 22

<210> 519

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 519

tgcaautgcu ccagccagaa 20

<210> 520

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 520

acagucacag ccattguagc a 21

<210> 521

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 521

ggaaattgaa guggaaggct tguaaa 26

<210> 522

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 522

tgagccugga attgcagcut 20

<210> 523

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 523

tggctgttat ugctccaagg ut 22

<210> 524

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 524

ctctgttcgc ucaggtcctu t 21

<210> 525

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 525

gcctccutcc guaccacat 19

<210> 526

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 526

tcccaagugc aacctctguc 20

<210> 527

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 527

ggtgcagaag cucttgtauc act 23

<210> 528

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 528

cactatggga cugagtaaca ttctcut 27

<210> 529

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 529

ctagctcacu caggcttugg t 21

<210> 530

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 530

ctactgcugc cggauccaaa 20

<210> 531

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 531

tgtccccugg tgguaagca 19

<210> 532

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 532

ggcctttgut cagtttcugc aa 22

<210> 533

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 533

gtccgctccu gttccttgau at 22

<210> 534

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 534

cccctatucc tgtaacgguc aa 22

<210> 535

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 535

gcataccccu gctgaacuga g 21

<210> 536

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 536

cggaagacag uggcatctac ut 22

<210> 537

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 537

gtaaccggca cacuctctuc t 21

<210> 538

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 538

gtggatgacu gagtaccuga acc 23

<210> 539

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 539

ggccaaacug agcagagtcu t 21

<210> 540

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 540

cgaaugguac ccgagcct 18

<210> 541

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 541

gctgccagut cacaatcatc ug 22

<210> 542

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 542

gcgtgtcuct ggacagcua 19

<210> 543

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 543

gggtccaacu gcatccugaa 20

<210> 544

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 544

ccagactaug acagctcttg gaaua 25

<210> 545

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 545

cttggatgac cutcttcagu cgat 24

<210> 546

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 546

gaaccgaaga cgugttugca aat 23

<210> 547

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 547

ggaaggacut gctcccucaa a 21

<210> 548

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 548

ggaagatgga tucatacctg ctgaug 26

<210> 549

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 549

agttcaacat ggutccttcc ttguag 26

<210> 550

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 550

tggcgguctt cagaaucaac at 22

<210> 551

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 551

gcttctgacg guatgtatta agtucct 27

<210> 552

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 552

cacgcaggga gaagugaucc 20

<210> 553

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 553

gcagcgttuc cagaggtgau a 21

<210> 554

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 554

gtcggaguac gggaacauca c 21

<210> 555

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 555

gctgaccgcu gcttctuca 19

<210> 556

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 556

agagctacca ugtcctctug ga 22

<210> 557

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 557

cggaacaccu ggcagtctut 20

<210> 558

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 558

ctgggtctut ggcctgtuca 20

<210> 559

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 559

ggcccacutc cggtatuct 19

<210> 560

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 560

accaagcaag acugugagac c 21

<210> 561

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 561

gtgtttctct cugaagattc ggtaugt 27

<210> 562

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 562

gctgggcutc acggacauag 20

<210> 563

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 563

ttttcccaat guagccagtg uca 23

<210> 564

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 564

gcgcccugaa gacagaaugt 20

<210> 565

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 565

cctgttggtc uatgcgtctg ua 22

<210> 566

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 566

cttctctguc acctggcuca at 22

<210> 567

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 567

gcgaugagcc agcaaucag 19

<210> 568

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 568

ctacgtgaag auccgccatu ct 22

<210> 569

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 569

tggtcccagu cccacagut 19

<210> 570

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 570

ccauctgcat uggacccaac a 21

<210> 571

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 571

gcacuggaat gttcucccca aa 22

<210> 572

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 572

tgaactctcc cuatgtgtgg tcut 24

<210> 573

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 573

ccgacaucag agacacacug g 21

<210> 574

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 574

tgtggacauc acctgctact uc 22

<210> 575

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 575

atgggctccu tggactcauc 20

<210> 576

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 576

gtcgcugacc gtgaacgaua 20

<210> 577

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 577

atggcuccaa gcaatggaau ct 22

<210> 578

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 578

tgccgccuca cucagaaag 19

<210> 579

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 579

acugaagcga caaggtgugt 20

<210> 580

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 580

catctggttc uccctggttc ut 22

<210> 581

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 581

cugagggaaa ggacaagaug aagt 24

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<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 582

tgacaccata gaugaagagg atucca 26

<210> 583

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 583

caacaacacc ucggaggtcu a 21

<210> 584

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 584

ggcacgauga tgaagaggau gat 23

<210> 585

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 585

caattgattg augctcacca gcut 24

<210> 586

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 586

ccuctccttc cugccagaca 20

<210> 587

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 587

gcacaagcag cugauccga 19

<210> 588

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 588

ctctctcatg aucgtcttta gcctut 26

<210> 589

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 589

actgagaccg agucgcctua 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 590

ggctucagga atggcuggat 20

<210> 591

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 591

gacattgccu gccatgcut 19

<210> 592

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 592

tctcctgcua agatggagtg tuca 24

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 593

ccatgagcga cguggctaut 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 594

ctcacgtugg tccacaucct 20

<210> 595

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 595

tgcatuggaa gccgtggut 19

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<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 596

aaaagttccc guggtattca guaaca 26

<210> 597

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 597

tggtggacaa gauggatgat gaug 24

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<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 598

cctccgtgau gatgatcttc ttcut 25

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<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 599

ccaacatcug cctttacatu gacaaac 27

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 600

ggctcagacu ccggttctut 20

<210> 601

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 601

cctgtccugc gtgtugaaag a 21

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<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 602

gggaacuggg cagactcaaa ut 22

<210> 603

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 603

cguctctgtu cagccaagga g 21

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<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 604

tggtctatgt gutcgtatcg catut 25

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<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 605

cccaaccgau atcatttctg atcugt 26

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<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 606

ttgggccagu tttccttguc t 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 607

cccaacuccc aaguggcaaa 20

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<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 608

tgugatcagg tugcaaagga ca 22

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<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 609

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<210> 610

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 610

gtagcccuca gccugacat 19

<210> 611

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 611

gcagucgggc attcctuca 19

<210> 612

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 612

gtgtagucag acgagcacuc at 22

<210> 613

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 613

ctgcagcugg ttatccugac a 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 614

aaggtggugg cgatggatut 20

<210> 615

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 615

gcggaccauc ttctggauga 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 616

agccttgguc agtgccatut 20

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<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 617

gaagatguac caggtggagt ucaa 24

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<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 618

gatttttgug gcacagtcuc act 23

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<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 619

agaguttgta ugccgcaaga ca 22

<210> 620

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 620

ggcgagtugg attttggacu ga 22

<210> 621

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 621

gtgtgctugt ggactcucac a 21

<210> 622

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 622

gccagcgaga ugagaaauag ca 22

<210> 623

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 623

aattgtcata guggacatct gcauca 26

<210> 624

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 624

gtggtggccu ctccttgtut 20

<210> 625

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 625

agtttcacug cctggtgtug a 21

<210> 626

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 626

gtacacguga aggtgagcuc at 22

<210> 627

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 627

ggactaacau gttcaatgug ggacaa 26

<210> 628

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 628

gagtggatut cccgtguagc a 21

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<211> 29

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 629

catatcctta cuggagagat ggtagcuat 29

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 630

ggctgtcuct agcacauggt 20

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<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 631

agagtgactu caaatgacag ugcaa 25

<210> 632

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 632

tcaggaagcu ccgcagtuc 19

<210> 633

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 633

caccugcgtg augaggagaa a 21

<210> 634

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 634

gtgggcttau ccaccatctu ct 22

<210> 635

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 635

ctccgugctt cucagacagt 20

<210> 636

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 636

gacctccttu gctggctcta ut 22

<210> 637

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 637

cctcaacaac aaguttgccu cct 23

<210> 638

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 638

agcaatcugg gcctcaaaga ug 22

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<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 639

ccgagcaaaa gucaaatgau gcc 23

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<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 640

ggtggtgagu cacgtgugt 19

<210> 641

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 641

gaacgcacug cccucagat 19

<210> 642

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 642

catcaaactc uggtctggaa gaauca 26

<210> 643

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 643

gtgcgucagc agcaatgtut 20

<210> 644

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 644

gcaccacugt ggcatcuga 19

<210> 645

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 645

cgggagggcu tctaucgaga 20

<210> 646

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 646

ccaucctugc agggacact 19

<210> 647

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 647

cctcctccut acctagacaa ugaga 25

<210> 648

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 648

caagcuauag caagccagga ct 22

<210> 649

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 649

atgtcaucac aatggauccc aaaga 25

<210> 650

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 650

acagcaggug atgauggcaa 20

<210> 651

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 651

gtgagttgau catcgaattc uccaaaat 28

<210> 652

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 652

ccaccacguc gtccatguc 19

<210> 653

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 653

cctgagcaag ccuggcaut 19

<210> 654

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 654

atcgagggug gtgtctgcta ua 22

<210> 655

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 655

gagattcucg cccugagcaa 20

<210> 656

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 656

agatcttcuc cttcagtgcu cct 23

<210> 657

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 657

gtgugagagc ccggaagatu t 21

<210> 658

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 658

tctgggcggc aauacgattu t 21

<210> 659

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 659

agtgaggccu tttgctggau t 21

<210> 660

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 660

acagcutgag gctugaagac c 21

<210> 661

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 661

cgccgcucaa gtgaggaut 19

<210> 662

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 662

ggguacccat gagtuagaag aggat 25

<210> 663

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 663

gctggaagau catcgagagc taug 24

<210> 664

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 664

ccuccaccac ctucccaaag 20

<210> 665

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 665

cgccatacua cctgggcaua 20

<210> 666

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 666

tcaaagaaac agcugugagg agaaa 25

<210> 667

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 667

cattcaagaa cucaaggagc ucaga 25

<210> 668

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 668

acttagccau acagggctcc tua 23

<210> 669

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 669

ccaaacugtc ggctucaaag ag 22

<210> 670

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 670

tcctccucag cagttcctuc a 21

<210> 671

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 671

agtaactcct cautcaagac ccuacat 27

<210> 672

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 672

tgagccccaa gaaugaccug 20

<210> 673

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 673

cccttatgug acaatgtgaa cacuca 26

<210> 674

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 674

agcacccutt cggcctut 18

<210> 675

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 675

caaagaagcc ucttcctcct acuc 24

<210> 676

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 676

tguccagcag gcagtacuct 20

<210> 677

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 677

cttaagacgg ugaggtcagc ut 22

<210> 678

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 678

acactgguca ctgctgauga g 21

<210> 679

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 679

ctcaatccca cugcccacua c 21

<210> 680

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 680

aggagactcu gggtgaacau acat 24

<210> 681

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 681

caggacucca ccucagacct 20

<210> 682

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 682

ttttgcgggu ctttgtcttc uct 23

<210> 683

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 683

ccaagtgtcc auacctcaat ttcttuca 28

<210> 684

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 684

ttgugccagc tctucaacag a 21

<210> 685

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 685

ccgaaacacu accagcugca a 21

<210> 686

<211> 29

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 686

tccgctctgt atutcttaaa agtctctuc 29

<210> 687

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 687

tgtguccaag agagctcagu ct 22

<210> 688

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 688

ccattcagcu tgagggucca 20

<210> 689

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 689

ggaagaggca uctcgtttgu act 23

<210> 690

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 690

gcctccatua aatctcgacc auagg 25

<210> 691

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 691

cgatcuccag cccaagatga ut 22

<210> 692

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 692

cgacaguaga ggagggugag g 21

<210> 693

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 693

cacacctgga utcccttccu t 21

<210> 694

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 694

gutttccagu cagagggaca gt 22

<210> 695

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 695

ggaagtggug ctggtuagga 20

<210> 696

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 696

cttagggagu gggagaaguc aaag 24

<210> 697

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 697

cttugacagc gacaagaagu gg 22

<210> 698

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 698

ccctcaguga agcgguaca 19

<210> 699

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 699

cgcaatguca cccatcucct 20

<210> 700

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 700

tttcttttgt ccutgggcct uct 23

<210> 701

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 701

cttccccgau tgccacgua 19

<210> 702

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 702

cgguccagca ggaattuggt 20

<210> 703

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 703

ctcccagcuc tucaccgat 19

<210> 704

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 704

ctcccattuc cctgcacuca 20

<210> 705

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 705

ggaggaaugu cagcaccaga 20

<210> 706

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 706

tcacacatat gautaggcca acugt 25

<210> 707

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 707

tgcggaggaa cuttgugaac a 21

<210> 708

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 708

aggcgaagau ggucagcaat 20

<210> 709

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 709

catggaagcu gttgccaagu t 21

<210> 710

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 710

aaattctugg gcacatatcc tucct 25

<210> 711

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 711

ggtcgacccu tgccacuac 19

<210> 712

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 712

agctgcugct acctuagaag ga 22

<210> 713

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 713

gatcggcauc ctgacaguga 20

<210> 714

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 714

cccttcttgu gggcatcttc ut 22

<210> 715

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 715

gagattcucg cccugagcaa 20

<210> 716

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 716

tggucagggc agcaggua 18

<210> 717

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 717

tgccgagcua aattacacat tgauga 26

<210> 718

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 718

catggucaca gagccaccut 20

<210> 719

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 719

gtggcccugt aggacctuc 19

<210> 720

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 720

cgatgucgca cggtaccug 19

<210> 721

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 721

ggcaccuacc tttuaaccac aga 23

<210> 722

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 722

cttcctgcug agccagtcut 20

<210> 723

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 723

ggattggaat ugaggaagac tgttacua 28

<210> 724

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 724

acgcaguctg gttcauccc 19

<210> 725

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 725

atgacagugc aggaagaucg aaa 23

<210> 726

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 726

ctgggccacc utgtuacaca 20

<210> 727

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 727

ctccagccau acuccacaga at 22

<210> 728

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 728

aacaaagagg ugaggtggaa gaug 24

<210> 729

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 729

tgcctgggcu tcatagcaut 20

<210> 730

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 730

gcagaatggu catgaagaug cc 22

<210> 731

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 731

ccaagcgaau gaagcaucca a 21

<210> 732

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 732

gcctgggucc ttcaaccuc 19

<210> 733

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 733

ggagtggcuc cgcagauac 19

<210> 734

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 734

gtgatcuccg caggguagaa a 21

<210> 735

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 735

ttgagatttg cugatggaag cauaaga 27

<210> 736

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 736

gtgctttagg uctccataga gcut 24

<210> 737

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 737

guggacuccc ggagaggat 19

<210> 738

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 738

gagctaacgu cgatcttgta agtcut 26

<210> 739

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 739

ccgtuacaag cgucaggga 19

<210> 740

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 740

agtcactcag utccccguag t 21

<210> 741

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 741

caggtguctg tctgcugcaa 20

<210> 742

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 742

gacgaagaau cagaagcagc agtaaua 27

<210> 743

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 743

gguggacggc aagaatguga 20

<210> 744

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 744

gcctcattcu ggccaaggua 20

<210> 745

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 745

ggttcagagc uttctggagu ga 22

<210> 746

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 746

cttgcaatac auaacaacct gcucaa 26

<210> 747

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 747

gcaatagaug gctacagtgu caga 24

<210> 748

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 748

agctgctgua cccattctuc ag 22

<210> 749

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 749

ggtggagugc cgcttcuac 19

<210> 750

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 750

gggtgccgua gttggagaua a 21

<210> 751

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 751

aaaagtugtc tgtgugcgca aa 22

<210> 752

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 752

ccccagcaag gutctttcug t 21

<210> 753

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 753

ggagtgcugt tccgagugg 19

<210> 754

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 754

tcgauacacu ggaagccaaa act 23

<210> 755

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 755

caccacuggc atctcuggaa 20

<210> 756

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 756

agatcgtatg agugcattcc catug 25

<210> 757

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 757

cccccagauc cagaccttcu t 21

<210> 758

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 758

gctctugcct tctgcucaca 20

<210> 759

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 759

agcgaactca uctttgccag ua 22

<210> 760

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 760

cutcagctcu gacaccgaca t 21

<210> 761

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 761

gcggccagga uggttctua 19

<210> 762

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 762

gttuagcacg aagctcuccg at 22

<210> 763

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 763

accccaaucg gaagccuaac 20

<210> 764

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 764

agaugagcat uggcagcga 19

<210> 765

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 765

ttggctgtga uattgtgtgc uaca 24

<210> 766

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 766

tttgtcacag tugttacttg gguaca 26

<210> 767

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 767

gcctcuacca cttctaugac cagat 25

<210> 768

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 768

cataagccuc cctggtctct uc 22

<210> 769

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 769

cccggaagug cctaagtcut 20

<210> 770

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 770

cggcacucct ccatgtugat 20

<210> 771

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 771

catgttugcg cagcuggt 18

<210> 772

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 772

gctccttcgu gtcctctttg uag 23

<210> 773

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 773

cgtgtacttu accaacgagc ugaa 24

<210> 774

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 774

cggagtugcc acttgactug 20

<210> 775

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 775

gtgcuccacc acctacaacu t 21

<210> 776

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 776

tcagtggugc agctgtcaua g 21

<210> 777

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 777

gtgaccauga gcagtttgcu aaa 23

<210> 778

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 778

ggtcagaccg augtccatua ca 22

<210> 779

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 779

agagagaagc gagguttcca ut 22

<210> 780

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 780

tctccttggu gctcctcugt 20

<210> 781

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 781

ctgtaactgc tcuaggtgct tcatuat 27

<210> 782

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 782

aggccacagc acuttctuct 20

<210> 783

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 783

agtaccucca gaacagattu gagagt 26

<210> 784

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 784

tcagcaggcu ggcattugt 19

<210> 785

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 785

cgttgcactg guataaaatc ttacugg 27

<210> 786

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 786

cctcatacug agtggcattu gaacaa 26

<210> 787

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 787

agcgaccccu tcucagact 19

<210> 788

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 788

cgatgaggac gaucgcuagg a 21

<210> 789

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 789

gagcatccag utggagtuga ca 22

<210> 790

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 790

cctccccutt cttcccguct 20

<210> 791

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 791

cctagucaag cactgguacc aa 22

<210> 792

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 792

tccaagaccg uccgaaaucc 20

<210> 793

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 793

tgtggcaugg tttgcatugg 20

<210> 794

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 794

cttctctcca gagugtaact ttatgugt 28

<210> 795

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 795

gccagacccu cuggagaag 19

<210> 796

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 796

tggagcucac aggguaggaa 20

<210> 797

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 797

ccactcacac cugcagcua 19

<210> 798

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 798

gtcugagcgc gcaaacut 18

<210> 799

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 799

gcgaguaugg agcagaaacg a 21

<210> 800

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 800

aattccaaau gagctcucca acca 24

<210> 801

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 801

ggtgtccutg ggtgcugat 19

<210> 802

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 802

aatagccctg guaggtaact cugt 24

<210> 803

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 803

aatgatgttc cccauatcca gtgug 25

<210> 804

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 804

agagaaggcu cccctguga 19

<210> 805

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 805

ctggtggutc cattugcaaa gg 22

<210> 806

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 806

ctgatgaagc agcugagaga ugat 24

<210> 807

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 807

cagggaaggc cuccuacaaa g 21

<210> 808

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 808

tctcuggacc cactctguca 20

<210> 809

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 809

gaatcccagc ugacucgct 19

<210> 810

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 810

ccacatggcc auatattgga augga 25

<210> 811

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 811

acctctcatg cuctgctctc ut 22

<210> 812

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 812

accatcuagc cccaaggagu t 21

<210> 813

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 813

ctttgatgtg cutcctgcct ut 22

<210> 814

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 814

cgcugcagga ctgugaaac 19

<210> 815

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 815

cgctcaggaa ucatgggcua t 21

<210> 816

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 816

gccagaccgu ctccttctut 20

<210> 817

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 817

aagtgcttac autacagcga cuct 24

<210> 818

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 818

gcutctcatg guggagcaca t 21

<210> 819

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 819

acacagccua aagucagcac a 21

<210> 820

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 820

cggaauggaa cgccuggaa 19

<210> 821

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 821

gccaaccaau gtgctatuca aact 24

<210> 822

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 822

acctggcagc guagggua 18

<210> 823

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 823

agctccaagu cctcacacag aua 23

<210> 824

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 824

ggacuccccg gttcatugt 19

<210> 825

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 825

gccctugcac atgccuact 19

<210> 826

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 826

gtggcacaaa gcugatgacu t 21

<210> 827

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 827

ccucacagga caccagctuc 20

<210> 828

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 828

agctgggccu gggagauat 19

<210> 829

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 829

gtggcgaccu cactuacga 19

<210> 830

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 830

aggagggcac uggcagttau a 21

<210> 831

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 831

cccagaccuc actgcucaga 20

<210> 832

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 832

aggatccutc caggguacga at 22

<210> 833

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 833

ccaatuggaa cctgggauca agt 23

<210> 834

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 834

ccatgtgauc tgacacccug aa 22

<210> 835

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 835

ccacctccug catagagggu a 21

<210> 836

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 836

cgcataacuc acaggaacca gataut 26

<210> 837

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 837

acacacatgc cuttgagtgg ut 22

<210> 838

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 838

caucatggug cacagcaaag t 21

<210> 839

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 839

ggcccaagac uccaaccatt tua 23

<210> 840

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 840

tgagugagcg gcuaggagaa 20

<210> 841

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 841

acaggagcca ugcaagaagu t 21

<210> 842

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 842

gcccattgut catagggtug agt 23

<210> 843

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 843

agcttttcug tggctgguga at 22

<210> 844

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 844

ccatccagug ggactatggg auaa 24

<210> 845

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 845

ccagcaccca ugagttguga 20

<210> 846

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 846

ccgcaacuct ugggcgat 18

<210> 847

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 847

cgaguacgug ccacaccaa 19

<210> 848

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 848

cattgaattc utcctggaug ccaaa 25

<210> 849

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 849

gccgggaaua cagtcgctut 20

<210> 850

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 850

agtgtcccuc cctcctucag 20

<210> 851

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 851

tgctccagtt uttcagaaga aguga 25

<210> 852

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 852

tccgggcaca cutacattug t 21

<210> 853

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 853

cctacagcug cagtctucca 20

<210> 854

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 854

aacgttgtug ggctcucct 19

<210> 855

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 855

aacaatccua aaggaagauc cagcaa 26

<210> 856

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 856

gggagtgcac ugctgtcua 19

<210> 857

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 857

ccguggagca ggugaagaat 20

<210> 858

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 858

tctatagagu cgccaccctg aug 23

<210> 859

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 859

ggctgcugca ttacataatc uggat 25

<210> 860

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 860

agcactggtu ggtcttcatc ut 22

<210> 861

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 861

gugccagaca aacctcucca 20

<210> 862

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 862

ttatgcagag cagugttctu cca 23

<210> 863

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 863

tcacactttc augagttcct ccatut 26

<210> 864

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 864

gacatcagca uggtcatctg taaagua 27

<210> 865

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 865

ccacgtcggu gaccatctut 20

<210> 866

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 866

ggagcaaagc ugctgggaua 20

<210> 867

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 867

tgggtggucc tgcaaaaucc 20

<210> 868

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 868

acatattgat tuggagccag ttctuca 27

<210> 869

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 869

caacctgacc cugctggaua 20

<210> 870

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 870

gaggaugggu acaccacaca 20

<210> 871

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 871

cacugagagg aagcgcauga 20

<210> 872

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 872

cagacgucuc ccggacaa 18

<210> 873

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 873

gacuatcugc gccagggaaa 20

<210> 874

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 874

ggcctucagt gtgttcucca a 21

<210> 875

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 875

gcccttgaga uttgaggccu t 21

<210> 876

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 876

acatcctccu gaagagtggt ttug 24

<210> 877

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 877

cgctgctgug cccatcuat 19

<210> 878

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 878

gcaagugaag agcagcaggu a 21

<210> 879

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 879

ggacaaagaa uctaccgugc aagt 24

<210> 880

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 880

tcucatgucc agcaaagcag aa 22

<210> 881

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 881

cgacagaagu ggaagtgcug aaaa 24

<210> 882

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 882

ctggatguga gctgtuaaaa ggga 24

<210> 883

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 883

gccacctuca aggaaaccag ut 22

<210> 884

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 884

cttgagtcua gatttagggc ugaaagt 27

<210> 885

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 885

gtggagaagc ucattgcuac ga 22

<210> 886

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 886

gtatgtgccc ugctcctucc 20

<210> 887

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 887

gcacccugag gaatgcatgu at 22

<210> 888

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 888

gccucaggaa ggcccttuc 19

<210> 889

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 889

gagtgactau gggcgguga 19

<210> 890

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 890

agaugatgct acuggcaaca gaac 24

<210> 891

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 891

ggaaacctct ucagcatttg cut 23

<210> 892

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 892

ggcauttcag ctguggaagg at 22

<210> 893

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 893

cggtcttcau gcagagacug a 21

<210> 894

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 894

gtgaaataua gatgttcccu ccaggaat 28

<210> 895

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 895

ccagagcagg cagaugaaau acc 23

<210> 896

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 896

agctccacag caucgatguc 20

<210> 897

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 897

cgtctgcuga ggctcaagtu a 21

<210> 898

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 898

gcacaacucc ggtgacauca a 21

<210> 899

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 899

tgaugcccaa agauggcaag a 21

<210> 900

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 900

cgctcttcuc tacgaccucc a 21

<210> 901

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 901

ttctcgguct ggaggaugga 20

<210> 902

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 902

cagctccaga guctctagac ugt 23

<210> 903

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 903

aggactgccu gccccaua 18

<210> 904

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 904

acattcctcg augtcccctu ct 22

<210> 905

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 905

ccttugggca aggaccugag 20

<210> 906

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 906

ccccacaacu tgaagatgtu ccat 24

<210> 907

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 907

ggttgtgauc ggcatctugg t 21

<210> 908

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 908

ccccugcagg atgtuggaaa t 21

<210> 909

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 909

ccgctgtgua ggaaagaagc uaaa 24

<210> 910

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 910

acaaggttcu ggcgtgguc 19

<210> 911

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 911

gaucccgcac acccgaua 18

<210> 912

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 912

aatagttcag cugcttcatg tucct 25

<210> 913

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 913

gccccatugt tcccggut 18

<210> 914

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 914

ggcacugccc acaaguca 18

<210> 915

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 915

tctcggccac cuttgaugag 20

<210> 916

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 916

atttgagctc agaugttctt cacugt 26

<210> 917

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 917

gcctgtgtcu ccttgtgatg ut 22

<210> 918

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 918

gcctgtgtcu ccttgtgatg ut 22

<210> 919

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 919

gcagcactuc aggaggtuac at 22

<210> 920

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 920

tggttgcugt ctcagtugct 20

<210> 921

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 921

ccagggugcc aggatcatua c 21

<210> 922

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 922

tccaaagcuc caaaggttuc ct 22

<210> 923

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 923

cugtgattcu gcccacggaa 20

<210> 924

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 924

ccaatgtgag ucctcagcca auc 23

<210> 925

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 925

gacagacuga agaaacaucc aaggt 25

<210> 926

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 926

tttccaggca ccgutccuc 19

<210> 927

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 927

gacaagccug tagcccaugt 20

<210> 928

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 928

atgagguaca ggccctcuga t 21

<210> 929

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 929

ctctuggcag ccttccugat 20

<210> 930

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 930

tccactctca aucactctca gtuct 25

<210> 931

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 931

gaggccagca guaaaacaac auc 23

<210> 932

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 932

acagaaggtg acutgggcat agataua 27

<210> 933

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 933

ccccgcggga cucatattut 20

<210> 934

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 934

gacacagcgg ugctgaaaua c 21

<210> 935

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 935

gagauggcac gggacacuac 20

<210> 936

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 936

ggttgtggug gtctgacagu t 21

<210> 937

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 937

gtccagggca aggucttuga 20

<210> 938

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 938

cattgtagtt tguagctcgt gtgtug 26

<210> 939

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 939

ggaagaaggc ccuacagtat ugag 24

<210> 940

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 940

cccacagacc utggattctu ca 22

<210> 941

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 941

ccagaccccu cgaagttctt ut 22

<210> 942

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 942

cttgtcccuc tccagcacut 20

<210> 943

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 943

ttcgtcugca cagucaccaa 20

<210> 944

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 944

cagccacagc aguagcaaug 20

<210> 945

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 945

gggagaggcu cuaccaggaa 20

<210> 946

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 946

gtgggtccac ugagtcattg ua 22

<210> 947

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 947

ttctacctcu agatctgttt ggtucagt 28

<210> 948

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 948

aacgagatgu ggacagcaug t 21

<210> 949

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 949

gtgguccacc ccaacuaaag a 21

<210> 950

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 950

acagacttcc utttggccau acaa 24

<210> 951

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 951

tcgccatuga ccgctacaut 20

<210> 952

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 952

agttgtucca acctagcaug gg 22

<210> 953

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 953

cgccuccacc aacucagat 19

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 954

ggtcguccag gtacccttug 20

<210> 955

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 955

tgtggcctau gcagtcaacu c 21

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<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 956

gtgaacugca tctgguagag aaca 24

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<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 957

ttgcaaagaa ggaagauggt tgttuc 26

<210> 958

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 958

atactggcug cacaggtugt 20

<210> 959

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 959

gtgaccguga tgctggugat 20

<210> 960

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 960

cggtuataga tgtatcuggc cacac 25

<210> 961

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 961

ctgctcagtg ugatccttgc aua 23

<210> 962

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 962

catugcgaca ggcacacuc 19

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<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 963

ctgcuggcac aaggcaaug 19

<210> 964

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 964

tcatgcuggg cttcgaguag 20

<210> 965

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 965

cgtcagcggc uttctccua 19

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<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 966

ttgauccacc tgcuccaaaa act 23

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 967

cgggagguca ccctacacut 20

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<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 968

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<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 969

ctacagaccc aguttcccca ut 22

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<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 970

aagggcucag agtggttgtu t 21

<210> 971

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 971

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 972

caccaauggc aaaaggcugt 20

<210> 973

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 973

gaaagccaca cccugaatcu ca 22

<210> 974

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

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tccttccuct ttctccucca ca 22

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<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 975

gaaccagcgg utaccaugga 20

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<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 976

gtagatggug ggcaggaaga ut 22

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<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 977

gattccagcc aggauacaga tctuaaa 27

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<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 978

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<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

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<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 980

aaaatcccag auatgcugga aaacct 26

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 981

gccaggugac aggaacctut 20

<210> 982

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 982

tcacgaggau ttcccgguag t 21

<210> 983

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 983

cccggcagau tccacagaau t 21

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<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 984

caggtcgcug acatatttcu gga 23

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<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 985

gcagatucca caaaagttca tagtugac 28

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<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 986

agcttcaggu cgctgatgta ttuc 24

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<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 987

agccaaugac tttgtgguga cat 23

<210> 988

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 988

tgcaggagug tcagcttugt 20

<210> 989

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 989

gacacuctgg actucagcca 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 991

ccugccacgc caataacuca 20

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<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 992

aggtcaggtu cacagagtcc ut 22

<210> 993

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 993

tccagaaucg aaggccauca ag 22

<210> 994

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 994

tguagggaag tgaugggaga gg 22

<210> 995

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 995

cgagcuatag aagaaucacc agca 24

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<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 996

tcttcggagu ttgggtttgc ut 22

<210> 997

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 997

gcaauccaga cagtaattcu gcaaac 26

<210> 998

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 998

aaagtgggaa gauacgattc aagucc 26

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<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 999

cacugccccg tcttauggaa a 21

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<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1000

aggttggagu cgttctcaua gaact 25

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<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1001

cctctactac ctuatggacc tgtctua 27

<210> 1002

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1002

ggcatcacag ucttttccac aaaug 25

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<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1003

ggcttcatag cautcgccta cuc 23

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<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1004

ggatgaaucc aatggtcaug aggat 25

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<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1005

cuccaagacu ggcaagaaag ga 22

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<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1006

gcatcttggg utcaggctuc a 21

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<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1007

gtttatggag cagguggaag atcuat 26

<210> 1008

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1008

tcgtgcaauc tgcguacca 19

<210> 1009

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1009

cgagguggag cacatgtuca 20

<210> 1010

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1010

gguccccaga acggatctut 20

<210> 1011

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1011

ggctgtcucg aacgtguga 19

<210> 1012

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1012

aaccatcaaa cagaaauacc aggtcuac 28

<210> 1013

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1013

atgtcaaaug acagcaaagc acug 24

<210> 1014

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1014

caacttgtcc uccttgtgaa augg 24

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<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1015

ctgctgucag gtctccaaug a 21

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<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1016

gccagugaca ugcaaagaaa ct 22

<210> 1017

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1017

ctgaagacgu gguaccagac a 21

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<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1018

gcttcaagac cuctcaaggc tut 23

<210> 1019

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1019

ctgaactgca gauccttggu gaa 23

<210> 1020

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1020

caccaacgcu gcctttaaug a 21

<210> 1021

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1021

gaaagcaaag gcucagcagu t 21

<210> 1022

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1022

tgtagttggu cacttcacau aaggaaat 28

<210> 1023

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1023

gtggctcucc ttgtcatttu cc 22

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<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1024

gggaggaacc aggcuttaaa gut 23

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<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1025

ccttggtgat uctaatagtc cttgugt 27

<210> 1026

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<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1026

cgacgggaug gcatcacua 19

<210> 1027

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1027

gcgcgugctt ttgtttgug 19

<210> 1028

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1028

cagatggata uatgccacgc ugat 24

<210> 1029

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1029

catggcaacc cugggacut 19

<210> 1030

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1030

aattcugggc gggacttcuc 20

<210> 1031

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1031

ccuagacacc uggaacagag aga 23

<210> 1032

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1032

tcacaggccu cactcguaca 20

<210> 1033

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1033

aatgtctcau ggagaagcag ugaaa 25

<210> 1034

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1034

caucaggaac aacccaaucc aaag 24

<210> 1035

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1035

gcacagacug acagaaugaa cct 23

<210> 1036

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1036

gccatcguag gcatactgtt cauac 25

<210> 1037

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1037

ggacttugag gcgggtgtut 20

<210> 1038

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1038

tcaatagctt gtugaactgc atgatgua 28

<210> 1039

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1039

tgccaaguca gcaattctgu ga 22

<210> 1040

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1040

tcucaggtaa guaacaggcc aaga 24

<210> 1041

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1041

ctgaacaacu gctgcgugat 20

<210> 1042

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1042

gactcaaaca ggacugtgaa ctuct 25

<210> 1043

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1043

ggaattctcc aucaccgtgg ua 22

<210> 1044

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1044

tctgagaaut ggcgcuggaa a 21

<210> 1045

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1045

acctgaaaac ccacacucga aut 23

<210> 1046

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1046

gggugccaca gattucacag 20

<210> 1047

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1047

gagaggauca tggcggaugg 20

<210> 1048

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1048

acactttctt ctuccacaat atgcagut 28

<210> 1049

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1049

ctcgctguca tcctcatugc t 21

<210> 1050

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1050

gcactugcca ctggtguaga 20

<210> 1051

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1051

ctaaacatcu gcctgatctc auagagt 27

<210> 1052

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1052

cccacacaua tgccatggug at 22

<210> 1053

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1053

ccacctgcug cagtcuaca 19

<210> 1054

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1054

ttcatugcca caaagttgau gcaa 24

<210> 1055

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1055

cctcacgcuc cgtttcuct 19

<210> 1056

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1056

agttcacatc cuccttcttc ttctuct 27

<210> 1057

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1057

agtacaggau gctugccaaa aga 23

<210> 1058

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1058

ggagaaaauc aagtcgtgcu gaat 24

<210> 1059

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1059

gctcugacgg cgttacugat 20

<210> 1060

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1060

tcctcccggu tgtagatgta tcuc 24

<210> 1061

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1061

tcaagagcgu gccctactuc 20

<210> 1062

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1062

gattgagcau ccaccaagaa cttut 25

<210> 1063

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1063

ccaggaggag ggauaatggt tcaua 25

<210> 1064

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1064

aguggccggg ttcuagagt 19

<210> 1065

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1065

tcaaagagcu ggugcgaaaa ga 22

<210> 1066

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1066

gcctcgccau cagcaugat 19

<210> 1067

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1067

ccugtgtggu agagcacact 20

<210> 1068

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1068

ccagcugauc acaccaagag a 21

<210> 1069

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1069

cggaguatug ggaccaggag 20

<210> 1070

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1070

ccacgucgca gccatacatu a 21

<210> 1071

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1071

augcatatuc ggacccacac at 22

<210> 1072

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1072

cctgtctgca aaugctctgt ug 22

<210> 1073

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1073

ggcagtgcuc ccaaaaugaa 20

<210> 1074

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1074

tcgcattcgu tcctttcacu ga 22

<210> 1075

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1075

tcaccuccaa gacagtgctu t 21

<210> 1076

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1076

tcagcucagg accttcauac aca 23

<210> 1077

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1077

cgagctuctg cgtcugact 19

<210> 1078

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1078

agatcttcuc cttggtgcuc ct 22

<210> 1079

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1079

ccttcttcaa gaucagttac cucacc 26

<210> 1080

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1080

acagtctcug tgagctcuga cat 23

<210> 1081

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1081

ccugccccca atttgucagt 20

<210> 1082

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1082

gctttgggua gaatccugag aca 23

<210> 1083

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1083

gatgaacgca aacutcgtac ttuct 25

<210> 1084

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1084

ggtcaagaca cccugctuca 20

<210> 1085

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1085

cgtcgtgtcu caagatctag cut 23

<210> 1086

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1086

tgagtcatcu gcggtactgu ct 22

<210> 1087

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1087

gccatttaug gcctccaucc a 21

<210> 1088

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1088

gagagagagu gtgcgccuaa a 21

<210> 1089

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1089

acuaaccaac ccacugggag aa 22

<210> 1090

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1090

tcaatgatgc ugggaccttg ug 22

<210> 1091

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1091

gcgggacguc guagagaaa 19

<210> 1092

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1092

cctctcagga ugaggactug ga 22

<210> 1093

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1093

caggtucccc tcacagucaa t 21

<210> 1094

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1094

catgtagugg cacctgcuga a 21

<210> 1095

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1095

gggagacgut cagcuaccc 19

<210> 1096

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1096

gggcaacuca gagatagctt tcut 24

<210> 1097

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1097

cacggacaaa guccctugga 20

<210> 1098

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1098

ccaaaggccc uctcgtucac 20

<210> 1099

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1099

caggcggagg caucctuac 19

<210> 1100

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1100

aggaactgtg ucattggtgt agattuc 27

<210> 1101

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1101

actggccttg guttaattgt gacut 25

<210> 1102

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1102

cucaguccaa ccacagcga 19

<210> 1103

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1103

caggcacucc tuggagcaa 19

<210> 1104

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1104

gcactggagu ggcagauagt 20

<210> 1105

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1105

gcgacttuac ccttcgacua ga 22

<210> 1106

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1106

gggauccagg ugacccaaag 20

<210> 1107

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1107

gcccugcacg tggtguaa 18

<210> 1108

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1108

caactccagg cutgtagctg uc 22

<210> 1109

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1109

gaccgatgau caggatatct acaaggua 28

<210> 1110

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1110

acctcacagg ucagggtugt 20

<210> 1111

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1111

gtcctgtctc ucctcatgct agua 24

<210> 1112

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1112

ctgctggtcu catagtaatc uaccac 26

<210> 1113

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1113

caggcuccaa ccuccagc 18

<210> 1114

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1114

agcuggagtg tuaggagggc 20

<210> 1115

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1115

agcccccaut cctgtugac 19

<210> 1116

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1116

gatatcgcug ccgccugt 18

<210> 1117

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1117

gggctgaacc auacactccu t 21

<210> 1118

<211> 33

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1118

aatcaactga gtaauatgaa gtattgacug aca 33

<210> 1119

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1119

cccccugcca gtauagcct 19

<210> 1120

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1120

gtgatcugcc tcgtggugt 19

<210> 1121

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1121

gaagtguggc cagaagugga 20

<210> 1122

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1122

tcgtttggct ggaucataga ttaacaut 28

<210> 1123

<211> 17

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1123

catccugggc caggcuc 17

<210> 1124

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1124

ggctucaggg ctgaauggat 20

<210> 1125

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1125

tgcgtgaucc acaucaacag g 21

<210> 1126

<211> 17

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1126

gucccgggau gccgcac 17

<210> 1127

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1127

ataacaggcc ucagccaaau cat 23

<210> 1128

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1128

gguaaagtcu gagcaggaca gg 22

<210> 1129

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1129

aatataacag gccucagcca aaucat 26

<210> 1130

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1130

agctgactgu gctgtgctut 20

<210> 1131

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1131

gtccccaaua taacaggccu cag 23

<210> 1132

<211> 17

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1132

acagagcacc cgcuguc 17

<210> 1133

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1133

ccccaataua acaggccuca gc 22

<210> 1134

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1134

aggaugagag aaccccugga g 21

<210> 1135

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1135

tatgagtugg cgaggaagau cg 22

<210> 1136

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1136

ggatccugac gttgagtugc t 21

<210> 1137

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1137

tatgagtugg cgaggaagau cg 22

<210> 1138

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1138

ggatccugac gttgagtugc t 21

<210> 1139

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1139

tatgagtugg cgaggaagau cg 22

<210> 1140

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1140

ggatccugac gttgagtugc t 21

<210> 1141

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1141

tatgagtugg cgaggaagau cg 22

<210> 1142

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1142

ggatccugac gttgagtugc t 21

<210> 1143

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1143

tatgagtugg cgaggaagau cg 22

<210> 1144

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1144

ggatccugac gttgagtugc t 21

<210> 1145

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1145

catggatgcu gatgaggguc aa 22

<210> 1146

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1146

gactctgtca cucttggagc tut 23

<210> 1147

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1147

gaataccaat accaauccca aaagguc 27

<210> 1148

<211> 17

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1148

ccaaguggcg gcactut 17

<210> 1149

<211> 30

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1149

aatccatctg tucagaaatt ctacaauggt 30

<210> 1150

<211> 26

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1150

aaaaacuttc actuaagacc caggga 26

<210> 1151

<211> 32

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1151

tttggagaag ugatttgaat ctttcuagga at 32

<210> 1152

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1152

tcaautaaaa agcugaagag gaaaccac 28

<210> 1153

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1153

agggaacagc acutctucaa gg 22

<210> 1154

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1154

gctagcutgg ctgauaacaa caca 24

<210> 1155

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1155

ccugtcugca cagacagca 19

<210> 1156

<211> 17

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1156

caggcgaccu ggguggg 17

<210> 1157

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1157

ggctcttucc gtgactcucc 20

<210> 1158

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1158

gaacaugcag gtgtcuggg 19

<210> 1159

<211> 24

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1159

atgatgactc ugatcagggu agca 24

<210> 1160

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1160

gagagcaaga ggucaagagc ug 22

<210> 1161

<211> 17

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1161

tgccggacgg gutccuc 17

<210> 1162

<211> 17

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1162

tgugcaggcu gcagagc 17

<210> 1163

<211> 17

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1163

cgctgtccuc cgcgcug 17

<210> 1164

<211> 19

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1164

cugcagacga gcacugagc 19

<210> 1165

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1165

cggttagggu cattatccaa atcatucc 28

<210> 1166

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1166

aggaagagug ggaaaagaug aaagc 25

<210> 1167

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1167

acggtguccc ccaacuct 18

<210> 1168

<211> 17

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1168

gggagcugcc ccaugct 17

<210> 1169

<211> 18

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1169

gttccggcgu caagguga 18

<210> 1170

<211> 30

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1170

atctaatata aaaccagcut gcgttgttuc 30

<210> 1171

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1171

aggaatgacg uaggacccta ugaat 25

<210> 1172

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1172

gttgagattu acccctgcau ggt 23

<210> 1173

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1173

cgttttcucc atagtcauag gaagagc 27

<210> 1174

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1174

cugcaggttu ccaaccacaa g 21

<210> 1175

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1175

ccaacataag ucacaatggc accua 25

<210> 1176

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1176

ccagautccc cuccaggagt 20

<210> 1177

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1177

catuccaaaa gccacacuca aagat 25

<210> 1178

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1178

ggtacccagg uggagagaau ga 22

<210> 1179

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1179

ctgacgaaat uccacaaaac ctcut 25

<210> 1180

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1180

gggactggug gttgtgaugg 20

<210> 1181

<211> 23

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1181

gagcagagau acacgtgcca uat 23

<210> 1182

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1182

agcuccaagg acagcuagga 20

<210> 1183

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1183

ggctcttaug aatcccatcc ugaaa 25

<210> 1184

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1184

agagaagagg ugagagaaga aacattug 28

<210> 1185

<211> 28

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1185

tttaaagaug accagagcau ccaaaaga 28

<210> 1186

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1186

tgctttgcgu tggacatuca ag 22

<210> 1187

<211> 17

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1187

gctgagcuga gcucggt 17

<210> 1188

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1188

cugattucac caggcgacct 20

<210> 1189

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1189

ggttgatgca cugatggatg agaut 25

<210> 1190

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1190

cctcagcgau gatgctaucc ag 22

<210> 1191

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1191

agcaaagtgc gugaggagtu t 21

<210> 1192

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1192

cgcutctcac ugagagcagt 20

<210> 1193

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1193

gcggauggtg tuccaagaaa a 21

<210> 1194

<211> 22

<212> DNA

<213> 合成序列

<400> 1194

gcgctttctu tgacgttccu aa 22

Claims (20)

1.用于单个流多重测定样品中的免疫应答的组合物，所述组合物由多组引物对试剂组成，所述引物对试剂针对多个靶序列以测量样品中靶标的表达水平，其中靶基因选自由以下功能组成的组：检查点途径、T细胞相关信号传导途径、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)标志物、肿瘤标志物和持家基因。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中靶基因选自：免疫检查点途径和靶标；T细胞和B细胞信号传导基因、淋巴细胞亚群标志物、干扰素信号传导基因、细胞因子信号传导基因；肿瘤标志物、肿瘤抗原和增殖标志物；和持家基因。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述靶基因选自表1的基因。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述靶基因由表1的基因组成。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多个靶序列包含选自表1的扩增子序列。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多个靶序列包括表1的每个扩增子序列。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多种引物对试剂选自表2的引物对。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多种引物对试剂由表2的每个引物对组成。

9.一种多重测定法，其包括权利要求1-8中任一项所述的组合物。

10.一种测试试剂盒，其包含权利要求1-8中任一项所述的组合物。

11.一种用于确定生物样品中的免疫应答活性的方法，包括：

多重扩增来自生物样品的多种靶表达序列，其中扩增包括使至少一部分样品与权利要求1的组合物和聚合酶在扩增条件下接触，从而产生扩增的靶表达序列；

检测所述多个靶序列中的每一个的表达水平；其中与对照样品相比，一种或多种免疫应答标志物的表达水平的变化决定了样品中免疫应答活性的变化。

12.根据权利要求11所述的方法，其中靶基因选自：免疫检查点途径和靶标；T细胞和B细胞信号传导基因、淋巴细胞亚群标志物、干扰素信号传导基因、细胞因子信号传导基因；肿瘤标志物、肿瘤抗原和增殖标志物；和持家基因。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述靶基因选自表1的基因。

14.根据权利要求11所述的方法，其中所述靶基因由表1的基因组成。

15.根据权利要求11所述的方法，其中所述多个靶序列包含选自表1的扩增子序列。

16.根据权利要求11所述的方法，其中所述多个靶序列包括表1中的每个扩增子序列。

17.根据权利要求11所述的方法，其中所述多种引物对试剂选自表2的引物对。

18.根据权利要求11所述的方法，其中所述多种引物对试剂由表2的每个引物对组成。

19.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物样品包括肿瘤和/或肿瘤周围的组织。

20.根据权利要求11所述的方法，其中所述生物样品和所述对照样品来自同一个体。