CN109879877B - 一种可降解plk1和brd4蛋白的化合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物化学领域，具体涉及一种可以靶向泛素化降解PLK1和BRD4蛋白的化合物，及其药学上可接受的盐和以该化合物为活性成分的药物组合物，以及在制备PLK1和BRD4蛋白抑制和降解剂，及其用于作为治疗剂特别是作为治疗和/或预防癌症中的用途。本发明所述的化合物及其药学上可接受的盐结构如下：其变量如权利要求和说明书所述。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种可以靶向泛素化降解PLK1和BRD4蛋白的化合物，及其药学上可接受的盐和以该化合物为活性成分的药物组合物，以及在制备PLK1蛋白和BRD4蛋白抑制剂及其用于治疗和/或预防肿瘤中的应用。
背景技术
泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin proteasome pathway，UPP)是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内80％以上蛋白质的降解。UPP由泛素、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3、蛋白酶体及其底物(蛋白质)构成。UPP特异性降解蛋白质的过程分两个阶段：(1)蛋白底物泛素化：泛素分子由APP提供能量，被E1激活转移到E2，然后经E3与特异性蛋白底物结合；(2)蛋白底物降解：被泛素化的蛋白分子能够被蛋白酶体识别，并进入蛋白酶体降解成短链的多肽分子。
PROTACs技术是利用一种双功能小分子将目标蛋白和细胞内的E3拉近，从而导致目标蛋白质的降解。PROTACs包含三部分功能结构：(1)可以与蛋白底物相结合的部分；(2)能够与E3相结合的部分；(3)前两部分的连接链。在细胞内PROTACs可以同时与靶蛋白及E3结合，使本来不能与E3结合的靶蛋白泛素化，进而被蛋白酶体识别并降解。
研究证明沙利度胺类药物(沙利度胺、来那度胺和泊马度胺)可以结合到CRBN蛋白上，CRBN能与损伤DNA结合蛋白1(damaged DNA binding protein 1,DDB1)、Cullin-4A(CUL4A)、cullins 1调控子(Roc1)结合起来，形成E3泛素连接酶复合物CRL4。该复合物利用泛素来标记特定的蛋白，随后水解这些蛋白。
本发明在参考文献的基础上，选用沙利度胺类似物作为PROTACs中与E3连接酶进行结合的部位，选用不同连接链将其于同时具有PLK1和BRD4蛋白酶抑制剂活性的结构相连接构建PROTACs，同时化合物针对多靶点可降低其抗肿瘤活性的耐药性。体外PLK1和BRD4蛋白酶抑制活性、体外抗肿瘤活性测试及体外PLK1和BRD4蛋白降解活性表明，该类靶向泛素化降解PLK1和BRD4蛋白的化合物(PROTACs)可将PLK1和BRD4靶向蛋白降解，具有良好的抗肿瘤活性，并表现出优异的PLK1和BRD4抑制作用。
发明内容
本发明目的在于提供一种可以泛素化降解PLK1和BRD4蛋白的化合物。具体为具有邻苯二甲酰亚胺片段的化合物及其制备方法，以及该类化合物作为PLK1和BRD4蛋白抑制和降解剂在预防和/或治疗肿瘤中的应用。
本发明设及通式Ⅰ所示的化合物及其药学上可接受的盐：
其中：
R选自C1-C6烷基或C3-C6环烷基；
X选自NH或CH2；
Y选自CH2或CO羰基；
A选自以下连接链：
除非另外指出，本发明所用的术语C1-C6烷基是指甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、直链或直链的C5烷基、直链或直链的C6烷基；C3-C6环烷基是指环丙基、环丁基、环戊基、环己基或带有支链的环丙基、环丁基、环戊基。
本发明的典型化合物包括，但不限于：
此外，本发明包括药物组合物，该组合物含有通式Ⅰ化合物和药物上可接受的赋形剂。所述药物上可接受的赋形剂是指任何可用于药物领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。本发明的化合物可以与其他活性成分组合使用，只要它们不产生其它不利作用，例如过敏反应。
本发明的药物组合可配置成若干剂型，其中含有药物领域中常用的一些赋形剂，例如，口服制剂(如片剂，胶囊剂，溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或混悬剂，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部制剂(例如软膏或溶液)。
用于本发明药物组合物的载体是药物领域中可得到的常见类型，包括：口服制剂用的粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、色素、矫味剂等；可注射制剂用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其配制成肠衣片剂。
通过体外抑酶试验和酶降解试验筛选，我们发现本化合物具有可抑制并降解PLK1和BRD4蛋白酶活力。因此，本发明化合物可用于与PLK1和BRD4蛋白酶活性异常表达相关的疾病中的应用，如各种癌症。
通过体外活性筛选，我们发现本发明化合物具有抗肿瘤活性，因此本发明化合物可以用于制备治疗和/或预防各种癌症的药物，如乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，甲状腺乳头状癌，卵巢癌、黑色素瘤、或各种白血病，特别是急性髓性白血病。
本发明化合物可作为唯一的抗癌药物使用，或者与一种或多种其它抗肿瘤药物联合使用。联合治疗通过将各个治疗组分同时，顺序或隔开给药来实现。
下文中提供的实施例和制备例进一步阐明和举例说明本化合物及其制备方法。应当理解，下述实施例和制备例的范围并不以任何方式限制本发明的范围。
下面的合成路线描述了本发明的通式I化合物的制备，所有的原料都是通过这些路线中描述的方法、通过有机化学领域普通技术人员熟知的方法制备的或者可商购。本发明的全部最终化合物都是通过这些路线中描述的方法或通过与其类似的方法制备的，这些方法是有机化学领域普通技术人员熟知的。这些路线中应用的全部可变因数如下文的定义或如权利要求中的定义。
本发明制备方法操作简单，条件温和，所得化合物均具有PLK1和BRD4蛋白酶抑制和降解活性，抗肿瘤作用显著。
具体实施方式
以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。
实施例1：
4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-N-(2-((2-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺
3-氟酞苷(5.0g,30mmol)，3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(5.0g,30mmol)和醋酸钠(3.7g,45mmol)加入100mL醋酸中。加热回流12h。冷却到室温，将醋酸蒸干。加水100mL，乙酸乙酯萃取100mL×3,将有机相合并蒸干，硅胶柱层析(甲醇：二氯甲烷1:10)得化合物(1a)7.5g,产率90％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:11.14(s,1H),7.93-7.97(m,1H),7.71-7.80(m,2H),5.14-5.18(m,1H),2.85-2.94(m,1H),2.47-2.63(m,1H),2.04-2.09(m,1H).
叔丁基(2-(2-(2-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(1b)
N-Boc-3,6-二氧杂-1,8-辛二胺(0.5g,2.0mmol)，化合物(1a)(0.5g,1.8mmol)和DIPEA 0.7mL加入DMF 10mL中，90℃反应12h。加水100mL，乙酸乙酯萃取100mL×3，将有机相合并蒸干，硅胶柱层析(甲醇:二氯甲烷1:10)得化合物(1b)0.45g,产率50％。LC-MS：505.2(M+1)。
4-((2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-2-(2,6-二氧哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(1c)
化合物(1b)0.4g加入二氯甲烷10mL，三氟醋酸4mL，室温搅拌过夜，将溶剂减压蒸干得化合物(1c)，可无需纯化直接进行下一步反应。
4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-N-(2-((2-((2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺(1)
化合物(1d)(0.1g,0.23mmol)加入5mL DMF中，然后加入HBTU(0.17g,0.46mmol)和DIPEA 0.1mL，化合物(1c)(0.1g,0.25mmol)室温反应3h。加50mL水，乙酸乙酯萃取，萃取液先后用饱和食盐水清洗，无水硫酸镁干燥，减压蒸干，硅胶柱层析(甲醇：二氯甲烷1:10)得化合物(1)0.1g,产率50％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：10.98(brs,1H)，8.52(d,J＝8.4Hz,1H)，7.63(s,1H)，7.44-7.47(m,2H)，7.31(d,1H)，7.07(d,1H)，6.84-6.86(m,2H)，6.52-6.55(m,1H)，4.79-4.83(m,1H)，4.45-4.49(m,1H)，4.21-4.23(m,1H)，3.94(s,3H)，3.70-3.75(m,8H)，3.41-3.48(m,2H)，3.31(s,3H)，2.56-2.80(m,3H)，2.10-2.18(m,1H)，1.95-1.99(m,1H)，1.58-1.80(m,11H)，0.87(t,J＝8.0Hz,3H)；LC-MS：812.4(M+1)。
实施例2：
4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-N-(2-((2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺
叔丁基-(2-2-(2-(2-(2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸酯(2b)
N-Boc-1,11-二氨基-3,6,9-三氧杂十一烷(0.58g，2.0mmol)，化合物(1a)(0.5g,1.8mmol)和DIPEA 0.7mL加入DMF 10mL中，90℃反应12h。加水100mL，乙酸乙酯萃取100mL×3,将有机相合并蒸干，硅胶柱层析(甲醇:二氯甲烷1:10)得化合物(2b)0.4g,产率40％。LC-MS：549.2(M+1)。
4-((2-(2-((2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基)-2-(2,6-二氧哌啶-3-基)异吲哚-1,3-二酮(2c)
化合物(2b)0.4g加入二氯甲烷10mL，三氟醋酸4mL，室温搅拌过夜，将溶剂减压蒸干得化合物(2c)，可无需纯化直接进行下一步反应。
4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-N-(2-((2-(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-3-甲氧基苯甲酰胺(2)
化合物(1d)(0.1g,0.23mmol)加入5mL DMF中，然后加入HBTU(0.17g,0.46mmol)和DIPEA 0.1mL，化合物(2c)(0.11g,0.25mmol)室温反应3h。加50mL水，乙酸乙酯萃取，萃取液先后用饱和食盐水清洗，无水硫酸镁干燥，减压蒸干，硅胶柱层析(甲醇：二氯甲烷1：10)得化合物(2)0.1g,产率50％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：11.03(brs,1H)，8.53(d,J＝8.4Hz,1H),7.71(s,1H),7.42-7.51(m,2H),7.33-7.38(m,1H),7.08-7.12(m,1H),6.85(s,1H),6.75(s,1H),6.43(s,1H),4.90(m,1H),4.46-4.48(m,1H),4.30-4.32(m,1H),3.96(s,3H),3.68(m,12H),3.40-3.42(m,2H),3.32(s,3H),2.75-2.87(m,3H),2.12-2.14(m,1H),1.94-1.96(m,1H),1.56-1.78(m,11H),0.88(t,J＝8.0Hz,3H)；LC-MS：856.4(M+1)。
实施例3：
N-(2-(2-(2-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)-4-(((R)-7-乙基-8-异丙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺
N-(2-(2-(2-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)-4-(((R)-7-乙基-8-异丙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺(3)
化合物(3d)(0.09g,0.23mmol)加入5mL DMF中，然后加入HBTU(0.17g,0.46mmol)和DIPEA 0.1mL，化合物(1c)(0.1g,0.25mmol)室温反应3h。加50mL水，乙酸乙酯萃取，萃取液先后用饱和食盐水清洗，无水硫酸镁干燥，减压蒸干，硅胶柱层析(甲醇：二氯甲烷1：10)得化合物(1)0.09g,产率50％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：11.03(brs,1H)，8.57(d,J＝8.4Hz,1H),7.74(s,1H),7.65(s,1H),7.46-7.50(m,2H),7.25-7.27(m,1H),7.10(d,J＝7.2Hz,1H),6.92(d,J＝8.8Hz,1H),6.75(s,1H),5.04-5.12(m,1H),4.69-4.72(m,1H),4.27-4.33(m,1H),3.90(s,3H),3.72(t,J＝5.2Hz,2H),3.65(m,4H),3.56(t,J＝5.2Hz,2H),3.47(t,J＝5.2Hz,2H),3.32(s,3H),3.30-3.32(m,2H),2.73-2.89(m,3H),2.10-2.14(m,1H),1.81-1.97(m,2H),1.35-1.40(m,6H),0.86(t,J＝8.4Hz,3H)；LC-MS：786.3(M+1)。
实施例4
4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-N-(6-(2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)己基)-3-甲氧基苯甲酰胺
4-溴-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚-1,3-二酮(4a)
4-溴苯酐(2.3g,10.0mmol),3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(1.8g,11mmol),醋酸钠(1.0g,12mmol)加入醋酸50mL,回流反应12h。冷却到室温，将醋酸减压蒸干，加水100mL，乙酸乙酯萃取100mL×3,将有机相合并蒸干，硅胶柱层析(甲醇：二氯甲烷1:10)得化合物(4a)2.7g，产率80％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:11.15(s,1H),8.06(d,J＝8.0Hz,1H),7.94(d,J＝7.2Hz,1H),7.78(t,J＝7.6Hz,1H),5.18-5.20(m,1H),2.87-2.96(m,1H),2.48-2.65(m,2H),2.05-2.10(m,1H)。
叔丁基(6-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)己-5-炔-1-基)氨基甲酸酯(4b)
化合物(4a)(0.7g,2.0mmol)，己-5-炔-1-基氨基甲酸叔丁酯(0.8g,4.0mmol)，CuI(76mg,0.4mmol)，Pd(PPh3)2Cl2(140mg,0.2mmol)加入DMF 10mL。氮气保护下加入三乙胺5.0mL。70℃反应3h，冷却过滤，加水100mL,乙酸乙酯萃取100mL×3,将有机相合并蒸干，硅胶柱层析(乙酸乙酯)得化合物(4b)0.5g,产率56％；LC-MS：454.2(M+1)。
4-(6-氨基己基)-2-(2,6-二氧六氢吡啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(4d)
10％Pd/C(50mg)，化合物(4b)(0.5g,1.1mmol)，加入乙醇10mL，室温常压通氢气反应12h，过滤蒸干，加入二氯甲烷10mL，三氟醋酸4.0mL，室温搅拌过夜，减压蒸干得化合物(4d)直接用于下一步反应。
4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-N-(6-(2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)己基)-3-甲氧基苯甲酰胺(4)
化合物(1d)(0.1g,0.23mmol)加入5mL DMF中，然后加入HBTU(0.17g,0.46mmol)和DIPEA 0.1mL，化合物(4d)(0.09g,0.25mmol)室温反应3h。加50mL水，乙酸乙酯萃取，萃取液先后用饱和食盐水清洗，无水硫酸镁干燥，减压蒸干，硅胶柱层析(甲醇：二氯甲烷1：10)得化合物(1)0.07g，产率40％；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：11.10(brs,1H),8.58(d,J＝8.4Hz,1H)，7.66-7.78(m,3H),7.56-7.59(m,2H),7.43(d,J＝8.0Hz,1H)，7.24-7.27(m,1H)，5.94(s,1H),5.12(m,1H),4.33-4.37(m,1H)，4.24-4.26(m,1H)，3.94(s,3H),3.23-3.28(m,5H),3.05(t,J＝8.0Hz,2H),2.83-2.85(m,1H),2.50-2.60(m,2H),2.00-2.04(m,2H),1.85-1.89(m,2H)，1.47-1.70(m,11H),1.26-1.34(m,4H),0.88(t,J＝7.2Hz,3H)；LC-MS：765.3(M+1)。
实施例5:
4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-N-(5-(2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)戊基)-3-甲氧基苯甲酰胺
叔丁基(5-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)戊-4-炔-1-基)氨基甲酸酯(5a)
化合物(4a)(0.7g,2.0mmol)，戊-4-炔-1-基氨基甲酸叔丁酯(0.73g,4.0mmol)，CuI(76mg,0.4mmol)，Pd(PPh3)2Cl2(140mg,0.2mmol)加入DMF 10mL。氮气保护加入三乙胺5.0mL。70℃反应3h，冷却过滤，加水100mL，乙酸乙酯萃取100mL×3，将有机相合并蒸干，硅胶柱层析(乙酸乙酯)得化合物(5a)0.5g,产率56％；LC-MS：440.2(M+1)。
4-(5-氨基戊基)-2-(2,6-二氧六氢吡啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(5c)
10％Pd/C(50mg),化合物(5a)(0.5g,1.1mmol)，加入乙醇10mL，室温常压通氢气反应12h，过滤蒸干，加入二氯甲烷10mL，三氟醋酸4.0mL,室温搅拌过夜,减压蒸干得化合物(5c)直接用于下一步反应。
4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-N-(5-(2-(2，6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)戊基)-3-甲氧基苯甲酰胺(5)
化合物(1d)(0.1g,0.23mmol)加入5mL DMF中，然后加入HBTU(0.17g,0.46mmol)和DIPEA 0.1mL，化合物(5c)(0.086g,0.25mmol)室温反应3h。加50mL水，乙酸乙酯萃取，萃取液先后用饱和食盐水清洗，无水硫酸镁干燥，减压蒸干，硅胶柱层析(甲醇：二氯甲烷1:10)得化合物(5)0.086g,产率50％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：11.09(s,1H),8.54(d,J＝8.4Hz,1H),7.65-7.78(m,3H),7.57(s,1H),7.54(s,1H),7.40(d,J＝8.0Hz,1H),7.24-7.26(m,1H),5.93(s,1H),5.12-5.14(m,1H),4.32-4.36(m,1H)，4.24-4.26(m,1H)，3.94(s,3H),3.24-3.29(m,5H),3.06(t,J＝8.0Hz,2H),2.83-2.91(m,1H),2.56-2.60(m,2H),2.01-2.05(m,2H),1.82-1.86(m,2H),1.60-1.80(m,9H),1.52-1.56(m,2H),1.35-1.42(m,2H),0.87(t,J＝8.0Hz,3H)；LC-MS：751.3(M+1)。
实施例6:
N-(6-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)己基)-4-(((R)-7-8-异丙基乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺
N-(6-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)己基)-4-(((R)-7-8-异丙基乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺(6)
化合物(3d)(0.09g,0.23mmol)加入5mL DMF中，然后加入HBTU(0.17g,0.46mmol)和DIPEA 0.1mL，化合物(4d)(0.089g,0.25mmol)室温反应3h。加50mL水，乙酸乙酯萃取，萃取液先后用饱和食盐水清洗，无水硫酸镁干燥，减压蒸干，硅胶柱层析(甲醇：二氯甲烷1:10)得化合物(5)0.1g,产率60％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：11.01(brs,1H),8.57(d,J＝8.4Hz,1H),7.69-7.79(m,4H),7.56(s,1H),7.44(s,1H),7.24-7.26(m,1H),5.96(s,1H),5.14(dd,J＝13.2Hz,J＝5.2Hz,1H),4.72-4.76(m,1H),4.26-4.30(m,1H),3.93(s,3H),3.34(s,3H),3.24-3.28(m,2H),3.06(t,J＝8.0Hz,2H),2.83-2.93(m,1H),2.50-2.62(m,2H),2.03-2.06(m,1H),1.83-1.97(m,2H,)1.60-1.66(m,2H),1.26-1.54(m,12H),0.86(t,J＝8.0Hz,3H)；LC-MS：739.3(M+1)。
实施例7:
4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-N-(6-(2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1-氧异二氢亚吲哚-4-基)己基)-3-甲氧基苯甲酰胺
NBS(17g,96mmol)，BPO(2.0g,8.0mmol),2-甲基-3-溴苯甲酸甲酯(18g,80mmol)加入150mL苯中，加热回流6h,冷却减压蒸干，硅胶柱层析(乙酸乙酯：石油醚1:20)得到化合物(7a)22g，产率90％。
3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(14.5g,88mmol)，三乙胺(13mL,96mmol)，化合物(7a)(22g,72mmol)加入乙腈150mL中，80℃反应12h,冷却到室温，减压蒸干。加水100mL,乙酸乙酯萃取100mL×3,将有机相合并蒸干，硅胶柱层析(甲醇：二氯甲烷1:10)得化合物(7b)17g,产率73％；1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ:11.00(s,1H),7.87(d,J＝7.6Hz,1H),7.78(d,J＝7.6Hz,1H),7.51(t,J＝8.0Hz,1H),5.16(dd,J＝13.2Hz,J＝5.2Hz,1H),4.42(d,J＝17.6Hz,1H),4.27(d,J＝17.6Hz,1H),2.87-2.96(m,1H),2.42-2.62(m,2H),2.00-2.08(m,1H)。叔丁基(6-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-3-氧异二氢亚吲哚-4-基)己-5-炔-1-基)氨基甲酸酯(7c)
化合物(7b)(0.65g,2.0mmol)，己-5-炔-1-基氨基甲酸叔丁酯(0.8g,4.0mmol),CuI(76mg,0.4mmol),Pd(PPh3)2Cl2(140mg,0.2mmol)加入DMF 10mL。氮气保护加入三乙胺5.0mL。70℃反应3h，冷却过滤，加水100mL,乙酸乙酯萃取100mL×3,将有机相合并蒸干，硅胶柱层析(乙酸乙酯)得化合物(7c)0.5g,产率57％；LC-MS：440.2(M+1)。
3-(7-(6-氨基己基)-1-氧代异丁醇-2-基)哌啶-2,6-二酮(7e)
10％Pd/C(50mg),化合物(7c)(0.5g,1.1mmol),加入乙醇10mL，室温常压通氢气反应12h，过滤蒸干，加入二氯甲烷10mL,三氟醋酸4.0mL,室温搅拌过夜,减压蒸干得化合物(7e)直接用于下一步反应。
4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-N-(6-(2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1-氧异二氢亚吲哚-4-基)己基)-3-甲氧基苯甲酰胺(7)
化合物(1d)(0.1g,0.23mmol)加入5mL DMF中，然后加入HBTU(0.17g,0.46mmol)和DIPEA 0.1mL，化合物(7e)(0.086g,0.25mmol)室温反应3h。加50mL水，乙酸乙酯萃取，萃取液先后用饱和食盐水清洗，无水硫酸镁干燥，减压蒸干，硅胶柱层析(甲醇：二氯甲烷1：10)得化合物(1)0.08g,产率46％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：10.98(brs,1H),8.58(d,J＝8.4Hz,1H),7.64(s,1H),7.20-7.60(m,6H),5.96(s,1H),5.12(dd,J＝13.2Hz,J＝4.8Hz,1H),4.48(d,J＝17.2Hz,1H),4.30-4.38(m,2H)，4.23-4.27(m,1H)，3.94(s,3H)，3.24-3.30(m,5H),2.87-2.94(m,1H),2.45-2.72(m,4H),2.01-2.05(m,2H),1.85-1.90(m,2H)，1.60-1.80(m,9H),1.48-1.52(m,2H),1.26-1.38(m,4H),0.88(t,J＝7.2Hz,3H)；LC-MS：(M+1)751.3。
实施例8:
4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-N-(5-(2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1-氧异二氢亚吲哚-4-基)戊基)-3-甲氧基苯甲酰胺
叔丁基(5-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-3-氧异二氢亚吲哚-4-基)戊-4-炔-1-基)氨基甲酸酯(8a)
化合物(7b)(0.65g,2.0mmol)，戊-4-炔-1-基氨基甲酸叔丁酯(0.73g,4.0mmol)，CuI(76mg,0.4mmol)，Pd(PPh3)2Cl2(140mg,0.2mmol)加入DMF 10mL。氮气保护加入三乙胺5.0mL。70℃反应3h，冷却过滤，加水100mL,乙酸乙酯萃取100mL×3，将有机相合并蒸干，硅胶柱层析(乙酸乙酯)得化合物(8a)0.5g，产率59％；LC-MS：426.2(M+1)。
3-(7-(5-戊基)-1-氧异二氢亚吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮(8c)
10％Pd/C(50mg),化合物(8a)(0.5g,1.1mmol)，加入乙醇10mL，室温常压通氢气反应12h，过滤蒸干，加入二氯甲烷10mL,三氟醋酸4.0mL,室温搅拌过夜,减压蒸干得化合物(8c)直接用于下一步反应。
4-(((R)-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-N-(5-(2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1-氧异二氢亚吲哚-4-基)戊基)-3-甲氧基苯甲酰胺(8)
化合物(1d)(0.1g,0.23mmol)加入5mL DMF中，然后加入HBTU(0.17g,0.46mmol)和DIPEA 0.1mL，化合物(8c)(0.082g,0.25mmol)室温反应3h。加50mL水，乙酸乙酯萃取，萃取液先后用饱和食盐水清洗，无水硫酸镁干燥，减压蒸干，硅胶柱层析(甲醇：二氯甲烷1:10)得化合物(1)0.085g,产率50％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：11.02(brs,1H),8.58(d,J＝8.4Hz,1H),7.65(s,1H),7.57-7.60(m,3H),7.40-7.48(m,2H),7.24-7.27(m,1H)，5.96(s,1H),5.12(dd,J＝13.2Hz，J＝5.2Hz,1H),4.48(d,J＝17.2Hz,1H),4.33-4.37(m,2H)，4.24-4.26(m,1H)，3.92(s,3H),3.26-3.32(m,5H),2.87-2.96(m,1H),2.44-2.70(m,4H),2.01-2.06(m,2H),1.60-1.90(m,11H),1.54-1.58(m,2H),1.24-1.38(m,2H),0.88(t,J＝7.2Hz,3H)；LC-MS：(M+1)737.3。
实施例9:
N-(6-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧异二氢亚吲哚-4-基)己基)-4-(((R)-7-乙基-8-异丙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺
N-(6-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧异二氢亚吲哚-4-基)己基)-4-(((R)-7-乙基-8-异丙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酰胺(9)
化合物(3d)(0.09g,0.23mmol)加入5mL DMF中，然后加入HBTU(0.17g,0.46mmol)和DIPEA 0.1mL，化合物(7c)(0.086g,0.25mmol)室温反应3h。加入50mL水，乙酸乙酯萃取，萃取液先后用饱和食盐水清洗，无水硫酸镁干燥，减压蒸干，硅胶柱层析(甲醇：二氯甲烷1:10)得化合物(9)0.09g，产率54％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ：10.98(brs,1H),8.57(d,J＝8.2Hz,1H),7.78(s,1H),7.67(s,1H),7.20-7.60(m,5H),5.98(s,1H),5.13(dd,J＝13.2Hz,J＝4.8Hz,1H),4.72-4.76(m,1H),4.48(d,J＝17.2Hz,1H),4.28-4.34(m,2H),3.92(s,3H),3.34(s,3H),3.24-3.30(m,2H),2.87-2.94(m,1H),2.45-2.72(m,4H),1.82-2.04(m,3H),1.62-1.66(m,2H),1.48-1.52(m,2H),1.26-1.40(m,10H),0.88(t,J＝8.0Hz,3H)；LC-MS：725.3(M+1)。
对优选化合物PLK1和BRD4蛋白酶抑制活性，蛋白降解能力以及细胞增殖抑制能力进行了测定，并与本课题组已发表专利CN 201610991723.1中筛选得到化合物A作为对照。
实施例10：PLK1蛋白抑制活性测定
用ELSIA方法测定化合物对PLK1蛋白的抑制活性，96孔微孔板中依次加入PLK1纯化蛋白，2.5μL DMSO稀释的不同浓度抑制剂，150mM底物、10mMATP、90μL反应缓冲液，，同时设立空白和本底对照组，室温孵育30min。洗板，加入100μL PPT-07,室温孵育30min。洗板，每孔中加入100μL抗兔的辣根连接的二抗，室温下孵育30min。洗板，每孔中加入100μL显色剂，室温下孵育15min。每孔加入100μL反应终止液，以激发光450nm，测定各孔荧光计数，计算抑制率IC50
实施例11：BRD4蛋白抑制活性测定方法
采用时间分辨荧光(TR-FRET)法通过BRD4(BD-1)TR-FRET Assay Kit(CaymanChemical，USA)测定化合物对BRD4蛋白的抑制活性。将10μL DMSO溶解的不同浓度的抑制剂加入384微孔板中，加入5μL含10nM BRD4的蛋白反应缓冲液。室温孵育15分钟。随后每孔加入5μL Ac-H4肽和TR-FRET检测试剂[Anti-6His-XL665和Streptavidin-Eu]混合液，黑暗中室温孵育1h。测量在330-350nm下激发后在620nm和665nm处的荧光发射。将在665nm和622nm处的发射的比率作为所形成的BRD4/Ac-H4复合物的量的指示，计算化合物对BRD4蛋白的抑制活性IC50。
实施例12：MTT法测定肿瘤细胞增殖抑制活性方法的建立以及化合物活性测定
将处于细胞对数生长期的要进行实验的肿瘤细胞(A549、MV4-11)按一定的细胞量接种于培养板内，培育24h，加入不同浓度抑制剂，细胞在37℃、5％CO2条件下继续培养48h，每孔加入20μL MTT溶液继续培养4h，用DMSO溶解结晶，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其OD值计算IC50。
实施例13：Western-blot测定PLK1和BRD4蛋白降解方法
将药物干预过的HeLa或MV4-11细胞收集，用预冷的PBS洗涤2次，PMSF与RIPA裂解液以1：100的比例混合，冰上裂解细胞20min，4℃，12000r/min×20min离心，取上清，即细胞总蛋白，用BCA法定量检测蛋白量，用5×蛋白上样缓冲液稀释蛋白后100℃变性5min。蛋白在SDS-PAGE电泳分离，转膜，封闭2h，一抗4℃孵育过夜。TBST洗膜，二抗1:1000孵育2h，化学发光后X胶片显影，用Image J软件分析每个条带的灰度值，计算蛋白降解50％时抑制剂浓度DC50。
Claims (7)
1.如通式Ⅰ所示的化合物及其药学上可接受的盐：
其中：
R选自C1-C6烷基或C3-C6环烷基；
X选自NH或CH2；
Y选自CH2或CO羰基；
A选自以下连接链：
2.根据权利要求1所述的化合物及其药学上可接受的盐：选自，
3.一种药物组合物，其特征在于：包含权利要求1-2中任意一项的化合物及其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的赋形剂。
4.权利要求1-2中任意一项的化合物及其药学上可接受的盐和权利要求3所述药物组合物在制备与PLK1蛋白和BRD4蛋白活性异常表达相关的疾病药物中的应用。
5.权利要求1-2中任意一项的化合物及其药学上可接受的盐和权利要求3所述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.权利要求1-2中任意一项的化合物及其药学上可接受的盐和权利要求3所述药物组合物在制备治疗和/或预防乳腺癌，结肠癌，前列腺癌，胰腺癌，非小细胞肺癌，甲状腺乳头状癌，卵巢癌、黑色素瘤或各种白血病中的应用。
7.如权利要求6所述的权利要求1-2中任意一项的化合物及其药学上可接受的盐和权利要求3所述药物组合物的应用，其中所述各种白血病为急性髓性白血病。
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