CN109797209A - 一种树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能的特异性生物标志物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体是一种树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能的特异性生物标志物，本发明提供SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA(即lnc‑Dpf3)或其互补或同源RNA序列作为鉴别树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能生物标志物的应用，检测所述RNA序列水平的试剂在制备鉴别树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能的试剂盒中的应用以及相应的试剂盒和方法。本发明为临床及科研鉴别树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能提供了方便而有效的特异性生物标志物和方法，具有广泛的应用前景。

Description

一种树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和 功能的特异性生物标志物

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，具体地说，是一种长链非编码 RNA——lnc-Dpf3作为鉴别树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能的新型特异性生物标志物中的用途和应用方法。

背景技术

哺乳动物基因组可转录多种长非编码RNA(long noncoding RNA， lncRNA)，然而其中仅有少数lncRNA的序列和功能被明确。近年来，lncRNA 在生命生理过程以及疾病进程中的作用不断受到关注，但是关于lncRNA与免疫系统之间的研究并不多，尤其是lncRNA在树突状细胞的报道几乎空白。

树突状细胞是连接天然免疫和适应性免疫的关键桥梁，在激活机体抗病原体免疫应答及维持自身免疫耐受过程中发挥关键性调控作用。树突状细胞的功能调控决定了免疫应答的整体平衡。树突状细胞广泛分布于非淋巴组织及淋巴组织，树突状细胞的体内迁移对于其成熟活化及功能调控至关重要。然而，越来越多的研究表明树突状细胞迁移的紊乱可能导致树突状细胞在炎症部位的过度聚集及活化，导致组织过度炎症，甚至引发自身免疫性疾病的发生。树突状细胞相关趋化因子及趋化因子受体已成为自身免疫性疾病的潜在诊断标识和治疗靶点。

DC迁移受到趋化因子、细胞因子及其他炎症介质的共同调控。分布于外周的未成熟DC通过其表面模式识别受体感知危险信号，摄取病原体后成熟活化，上调趋化因子受体CCR7表达。由淋巴结基质细胞所分泌的CCL19/CCL21 作用于DC表达的CCR7，促进DC向次级淋巴器官的T细胞区迁移，启动并调控T细胞介导的适应性免疫应答。CCL19/CCL21被证明与多种自身免疫性疾病如多发性硬化(multiple sclerosis，MS)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)及炎症性肠病(inflammatory bowel diseases，IBD)等的发生发展密切相关。CCL19/CCL21或其受体CCR7的基因缺失小鼠中实验性自身免疫性脑脊髓炎、抗原诱导的关节炎发病明显减弱，且DC介导的Th1及Th17 细胞活化显著降低。因此CCL19/CCL21依赖的DC迁移及功能活化对于维持免疫应答及免疫调控的动态平衡发挥关键作用。

过去的研究已证实趋化因子CCL19和CCL21在诱导树突状细胞从外周向淋巴结迁移，若要确定由树突状细胞的趋化状态或鉴别趋化性树突状细胞，则需要联合检查数个标志物，如联合检测到MHC^hiCD11c^intCD40^hiCCR7+，然而尚无特异性生物标志物可以鉴别趋化性树突状细胞。

为方便临床和科研应用，本领域中迫切需要研究和开发出针对鉴别树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能的特异性表达生物标志物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴别树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能的生物标志物：lnc-Dpf3及其杂交或同源序列。本发明的另一目的在于提供检测lnc-Dpf3及其杂交或同源序列的试剂在制备鉴别树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能的试剂盒中的应用。本发明的第三个目的在于提供一种鉴别树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能的方法和试剂盒。

本发明从小鼠Dpf3的基因第一个内含子中筛选出了由树突状细胞特异性表达的长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)分子lnc-Dpf3(Noncode database ID:n274819，GenBank No:AK140952.1，SEQ ID NO:1)。该分子在树突状细胞的特异性高表达，能够将树突状细胞更好的与其他免疫细胞，如B细胞、CD4+T细胞、自然杀伤细胞等区分开来。并且，lnc-Dpf3在树突状细胞受趋化因子CCL19和CCL21刺激后表达上调、在树突状细胞由外周组织向淋巴结迁移后表达上调、在趋化性树突状细胞中比非趋化性树突状细胞表达更高。因而，lnc-Dpf3能够鉴别趋化性树突状细胞以及树突状细胞的趋化状态和功能。这在临床和科研中对树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能的鉴定和判断以及相关疾病的诊断中有广泛的应用前景，可用于例如对象中免疫功能判断、免疫治疗方案选择(例如针对临床感染、炎症、自身免疫性疾病以及肿瘤等免疫相关性疾病的治疗方案选择)和/或预后评估(例如免疫功能的预后评估)。在此基础上，完成了本发明。

本发明的第一方面，提供选自下组的RNA序列在制备鉴别树突状细胞和/ 或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能的试剂或试剂盒中的应用：

(a)SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA；

(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；

(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的RNA序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳动物中的同源序列。

本发明的第二方面，提供检测选自下组的RNA序列水平的试剂在制备鉴别树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能的试剂盒中的应用：

(a)SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA；

(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；

(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的RNA序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳动物中的同源序列。

在本发明的优选实施方式中，所述RNA序列是SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA。

在本发明的一些实施方式中，所述树突状细胞和/或其分化而成的趋化性树突状细胞来源于哺乳动物，优选小鼠、人、大鼠、犬、猴、猩猩、猪、马、牛或羊，更优选小鼠。

在本发明的一些实施方式中，所述趋化状态选自：细胞表面MHCII、 CD11c、CD40、CCR7的表达；所述功能选自：树突状细胞在趋化因子CCL19 和CCL21刺激后发生迁移(体外)、在病原体或炎症刺激下由外周组织向次级淋巴结迁移(体内)。lnc-Dpf3的表达量与树突状细胞趋化状态正相关。当 lnc-Dpf3表达量升高时，代表树突状细胞成功发生趋化或成为趋化性树突状细胞。

在本发明的一些实施方式中，所述RNA序列的水平用于免疫功能判断、免疫治疗方案选择和/或预后评估。

在本发明的一些实施方式中，若待鉴别细胞中所述RNA序列的水平高于非树突状细胞，则表明该所测细胞是树突状细胞；若待鉴别细胞为树突状细胞，该所测细胞中所述RNA序列的水平较处理前升高，则表明该所测细胞发生趋化或往趋化性树突状细胞方向转化；若采用候选试剂或体系处理树突状细胞后，所测细胞中的所述RNA序列水平与处理前相比升高，则表明所述候选试剂或体系能诱导树突状细胞发生趋化或往趋化性树突状细胞方向转化。

在本发明的一些实施方式中，所述非树突状细胞为选自下组中的一种或两种以上：B细胞、CD4⁺T细胞、自然杀伤细胞。

在本发明的一些实施方式中，所述鉴别通过选自下组中的一种或两种以上方法进行：qRT-PCR、RNA印迹法、原位杂交、生物芯片技术、流式细胞术、二代测序RNA-seq，优选qRT-PCR。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂为选自下组中的一种或两种以上：针对所述RNA序列的探针或引物、或其他以此序列为指示的检测方法。

在本发明的一些实施方式中，所述引物是qRT-PCR检测用的定量引物，优选SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示的引物。

在本发明的一些实施方式中，所述探针是RNA Flow Cytometry检测用的探针，优选SEQ ID NO:6～SEQ ID NO:61所示的探针组合。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包含：其它鉴别树突状细胞细胞和/或趋化性树突状细胞的试剂，例如MHCII、CD11c、CD40、CCR7检测试剂。

本发明的第三方面，提供一种用于鉴别树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能的试剂盒，其包含：

i)检测选自下组的RNA序列水平的试剂：

(a)SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA；

(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；

(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的RNA序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳动物中的同源序列；

ii)容纳i)所述试剂的容器。

在本发明的一些实施方式中，所述鉴别通过选自下组中的一种或两种以上方法进行：qRT-PCR、RNA印迹法、原位杂交、生物芯片技术、流式细胞术、二代测序RNA-seq，优选qRT-PCR。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂为选自下组中的一种或两种以上：针对所述RNA序列的探针或引物、或其他以此序列为指示的检测方法。

在本发明的一些实施方式中，所述引物是qRT-PCR检测用的定量引物，优选SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示的引物。

在本发明的一些实施方式中，所述探针是RNA Flow Cytometry检测用的探针，优选SEQ ID NO:6～SEQ ID NO:61所示的探针组合。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包含：其它鉴别树突状细胞和 /或趋化性树突状细胞的试剂，例如MHC II、CD11c、CD40、CCR7检测试剂。

本发明的第四方面，提供一种鉴别树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/ 或其趋化状态和功能方法、或鉴别能诱导产生树突状细胞和/或趋化性树突状细胞的试剂或体系的方法，所述方法包括检测待鉴别细胞中选自下组的RNA 序列的水平的步骤：

(a)SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA；

(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；

(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的RNA序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳动物中的同源序列。

在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括：

将待鉴别细胞中所述RNA序列的水平与非树突状细胞中所述RNA序列的水平比较，或将处理前的待鉴别细胞中所述RNA序列的水平与不同时间段或处理阶段的待鉴别细胞中的所述RNA序列水平比较；

其中，若待鉴别细胞中所述RNA序列的水平高于非树突状细胞，则表明该所测细胞是树突状细胞；

若待鉴别细胞为树突状细胞，该所测细胞中所述RNA序列的水平较处理前升高，则表明该所测细胞发生趋化或往趋化性树突状细胞方向转化；

若采用候选试剂或体系处理树突状细胞后，所测细胞中的所述RNA序列水平与处理前相比升高，则表明所述候选试剂或体系能诱导树突状细胞发生趋化或往趋化性树突状细胞方向转化。

lnc-Dpf3的表达量与树突状细胞趋化状态正相关。当lnc-Dpf3表达量升高时，代表树突状细胞成功发生趋化或称为趋化性树突状细胞。

本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，术语“表达”在描述lnc-Dpf3是指其RNA水平。

Lnc-Dpf3及其杂交和同源序列

如本文所用，术语“lnc-Dpf3”是指(a)由树突状细胞特异性表达的长链非编码RNA分子(lncRNA)，其序列如SEQ ID NO:1所示；(b)在严格条件下与 (a)限定的序列杂交的序列；(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的 RNA序列；和(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳动物中的同源序列。

在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％ (v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

本发明的RNA全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。

试剂盒

本发明中还提供了用于鉴别树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能试剂盒，其中包含(i)检测本发明分子标志物lnc-Dpf3的一种或多种试剂；和(ii)容纳所述试剂的容器。

用于本发明中的检测方法可采用本领域中常用的RNA检测方法，只要该方法可检测出lnc-Dpf3的水平或水平变化，这些方法包括但不限于：qRT-PCR、 RNA印迹法、原位杂交、生物芯片技术、流式细胞术等检测方法，本领域技术人员可根据需要进行选择。

可根据多种检测原理和方法，按照需要在试剂盒中配备检测lnc-Dpf3水平的试剂或试剂组。在本发明中，“试剂组”是指包含了检测所需的多种试剂的试剂组合。

此外，本发明的试剂盒还可根据需要包括：容器、对照物(包括阳性或阴性对照)、使用说明书、缓冲剂等，本领域技术人员可根据具体情况对其进行选择。

本发明优点在于：

1、确定了一种能鉴别树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能的特异性分子标志物——lnc-Dpf3；

2、为临床和科研中涉及树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能的应用和研究提供了简便而有效的工具和方法，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1：lnc-Dpf3在各类免疫细胞中的表达量的qRT-PCR检测。图中所示结果为平均值±标准差(n＝3)。

图2：lnc-Dpf3在树突状细胞在趋化因子CCL19和CCL21刺激不同时间点的表达量的qRT-PCR检测。图中所示结果为平均值±标准差(n＝3)。

图3：lnc-Dpf3在淋巴结趋化性树突状细胞和非趋化性树突状细胞的流式细胞术检测。图中所示结果为平均值±标准差(n＝3)。

图4：lnc-Dpf3在树突状细胞由外周向淋巴结迁移过程中的流式细胞术检测。图中所示结果为平均值±标准差(n＝3)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA 的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.树突状细胞的培养过程

将小鼠骨髓细胞培养在37℃的细胞培养箱中[RPMI-1640(PAA)细胞培养液，其中含10％(v/v)FCS(PAA)，100ng/mL小鼠GM-CSF，10ng/mL 小鼠IL-4细胞因子(R&D Systems，Minneapolis,MN)]六天，加入LPS(100 ng/ml，sigma)刺激24小时后，诱导成熟树突状细胞，再进行抗CD11c磁珠 (Miltenyi Biotech)分选，得到纯化的树突状细胞。

实施例2：lnc-Dpf3定量实时PCR(qRT-PCR)检测

根据文献记载，CCL19和CCL21能够作用于树突状细胞表面CCR7，诱导其发生趋化性迁移(Ohl,L.,Mohaupt,M.,Czeloth,N.,Hintzen,G.,Kiafard,Z., Zwirner,J.,Blankenstein,T.,Henning,G.,andR.(2004).CCR7governs skin dendriticcell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity 21,279-288.)。

取实施例1中利用CD11c磁珠分选得到的树突状细胞或接受CCL19(50 ng/ml)和CCL21(50ng/ml)(R&D)刺激各个时间点的树突状细胞，采用TRIzol (Invitrogen公司)提取其中的RNA样品。qRT-PCR使用SYBR RT-PCR试剂盒(Takara公司，SYBR Green Realtime PCRMaster Mix Code：QPK-201)，并在LightCycler(Roche公司)实时定量PCR仪上进行操作。

lnc-Dpf3的qRT-PCR检测用的定量引物为：

5'-GTGCCACCTACTGTACACCT-3'(上游，SEQ ID NO:2)；

5'-TGGGCACTCAGGTGCAGTAT-3'(下游，SEQ ID NO:3)。

反转录反应参数：42℃20分钟，99℃5分钟。

qRT-PCR反应参数：95℃15秒，57℃10秒，68℃2秒读板，72℃30 秒，40循环。

RNA的相对定量使用2-ΔΔCt法计算(以U6为内参)。

U6qRT-PCR检测用的定量引物为：

5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'(上游，SEQ ID NO:4)；

5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'(下游，SEQ ID NO:5)。

测试结果如图1和图2所示。

图1中的数据显示：lnc-Dpf3仅在树突状细胞中高表达，而在其它免疫细胞中不表达或表达量很低。

B细胞是采用抗CD19磁珠(Miltenyi Biotech)从小鼠脾脏细胞中分离而出；CD4⁺T细胞是采用抗CD4磁珠(Miltenyi Biotech)从小鼠脾脏细胞中分离而出；自然杀伤细胞是采用抗DX5磁珠(Miltenyi Biotech)从小鼠脾脏细胞中分离而出。

图2中的数据显示：lnc-Dpf3在树突状细胞受CCL19和CCL21刺激12 小时-72小时过程中表达量持续上调，在刺激后96小时达到最高峰，为未刺激树突状细胞中表达量的三倍。

实施例3：FITC皮肤刺激后，引流淋巴结中趋化性树突状细胞的lnc-Dpf3 表达量的流式细胞术检测

涂抹100微升5mg/ml FITC(Invitrogen公司，溶于50:50(v/v)丙酮-邻苯二甲酸二丁酯(Sigma Aldrich公司))于小鼠去毛的右侧背部皮肤，不同时间点取右侧腹股沟淋巴结，FITC+细胞即为趋化性树突状细胞，FITC-细胞即为非趋化性树突状细胞。以流式细胞术检测FITC涂抹后不同时间点趋化性树突状细胞中lnc-Dpf3表达量。

所用细胞流式抗体标记按照其标准操作流程进行。流式细胞检测用的是 FACSLSRII流式细胞仪，软件为FACSDiva(BD Biosciences)。具体步骤可参见本实验室之前发表的论文(Liu,J.等Rhbdd3controls autoimmunity by suppressing the production ofIL-6by dendritic cells via K27-linked ubiquitination of the regulatorNEMO.Nature Immunology.2014；15:612-622.)。lnc-Dpf3的 RNA流式细胞术(RNA FlowCytometry)标记和检测，以lnc-Dpf3特异性探针标记(LE探针为label extender探针用于信号放大，BL探针为blocker探针，用于防止非特异性信号放大)，采用RNAAssay Kit(Thermo Fisher 公司)按照其标准操作流程进行。

lnc-Dpf3的RNA Flow Cytometry检测用的探针为：

LE探针tcatagatggtctctctatcacttcct(5'-3')(SEQ ID NO:6)

LE探针aataggttcctgttgagtgaccag(5'-3')(SEQ ID NO:7)

LE探针ttaactgtaactcagtcaaacgtactaag(5'-3')(SEQ ID NO:8)

LE探针ggtcacagatggctatagagatgc(5'-3')(SEQ ID NO:9)

LE探针gccagagaagcttgtctttgtgat(5'-3')(SEQ ID NO:10)

LE探针gcgctgctgtccctgttg(5'-3')(SEQ ID NO:11)

LE探针ccgttgatgcccataggtga(5'-3')(SEQ ID NO:12)

LE探针cccatcagatcaccctctaactaa(5'-3')(SEQ ID NO:13)

LE探针gctgttttggctaaactgatgtg(5'-3')(SEQ ID NO:14)

LE探针ggtggagtggaaaagctacttct(5'-3')(SEQ ID NO:15)

BL探针aggctggggaggtcatgg(5'-3')(SEQ ID NO:16)

BL探针acaaatcaagccaaaagcctg(5'-3')(SEQ ID NO:17)

LE探针aggacaaaattcatgtctgggtc(5'-3')(SEQ ID NO:18)

LE探针cgcctgattatatttgatacctaatttac(5'-3')(SEQ ID NO:19)

BL探针gggggttgaacaactgtttcc(5'-3')(SEQ ID NO:20)

LE探针gcatcagtgacaagcctgttatg(5'-3')(SEQ ID NO:21)

LE探针caagcctgacgagtcaatggt(5'-3')(SEQ ID NO:22)

LE探针ctgtgtgtaataatactgcctggc(5'-3')(SEQ ID NO:23)

LE探针ggaggagtcatactcagctatggtct(5'-3')(SEQ ID NO:24)

LE探针cctaggggagaattcccaaga(5'-3')(SEQ ID NO:25)

LE探针cctcggaggtatgcaaggct(5'-3')(SEQ ID NO:26)

BL探针aagcttccttcttactggctagc(5'-3')(SEQ ID NO:27)

LE探针caggctagacctgggctgg(5'-3')(SEQ ID NO:28)

LE探针ccttgattacaggacatgaagaatt(5'-3')(SEQ ID NO:29)

BL探针atcaccaaagacaccaatggg(5'-3')(SEQ ID NO:30)

BL探针gtagcactagactttattacctaattacct(5'-3')(SEQ ID NO:31)

LE探针tgctattagctctgcaccagaacta(5'-3')(SEQ ID NO:32)

LE探针ccagaacactacaggaagttgtcac(5'-3')(SEQ ID NO:33)

BL探针ggaggtccctgaggccc(5'-3')(SEQ ID NO:34)

LE探针actgcctcaccacttggtcag(5'-3')(SEQ ID NO:35)

LE探针ccgtaccaggggtgggat(5'-3')(SEQ ID NO:36)

LE探针agagccataggttattaaagaaatagtc(5'-3')(SEQ ID NO:37)

LE探针atgaggtagataaagatgctccca(5'-3')(SEQ ID NO:38)

BL探针ttgcttttcatttttatgtgtttca(5'-3')(SEQ ID NO:39)

BL探针aggatattatcagaaaaaaaaaaaagtag(5'-3')(SEQ ID NO:40)

LE探针aaataaactaagtgaaaatgtataaccct(5'-3')(SEQ ID NO:41)

LE探针gcaacttttgggtggagaaaag(5'-3')(SEQ ID NO:42)

BL探针agcccaggacacttggaaaa(5'-3')(SEQ ID NO:43)

BL探针ccctttataataaaactaaaatataaaagatat(5'-3')(SEQ ID NO:44)

LE探针ttcggtaaaaatggctttatatca(5'-3')(SEQ ID NO:45)

LE探针cagtagcctcaaagtataatgtgtgc(5'-3')(SEQ ID NO:46)

BL探针aggccgtatgggggtgg(5'-3')(SEQ ID NO:47)

LE探针ttatgggagggagagaaagagag(5'-3')(SEQ ID NO:48)

LE探针tcaaataaaaagaaaacaaagtgca(5'-3')(SEQ ID NO:49)

BL探针ggattgggctgtgggtatattg(5'-3')(SEQ ID NO:50)

BL探针ccccctggtactgtgaataaaaag(5'-3')(SEQ ID NO:51)

LE探针atattcaaagccttggattcga(5'-3')(SEQ ID NO:52)

LE探针ctcatacagctcttatctacccagc(5'-3')(SEQ ID NO:53)

LE探针aagtaggattacaggttgggattatag(5'-3')(SEQ ID NO:54)

LE探针catatccacacttgaaataccttattta(5'-3')(SEQ ID NO:55)

BL探针tatcaagagaggtgaaattaaataaatta(5'-3')(SEQ ID NO:56)

BL探针ggtaagaattgaaaatcatctaaattcc(5'-3')(SEQ ID NO:57)

LE探针gcatattcgatttttcccattga(5'-3')(SEQ ID NO:58)

LE探针gcacacgtgacttatggggaaa(5'-3')(SEQ ID NO:59)

LE探针cctgatgactatacatgctaaaaatgg(5'-3')(SEQ ID NO:60)

LE探针catacaaacttcagaaataactgagaagt(5'-3')(SEQ ID NO:61)

测试结果如图3和图4所示。

图3中的数据显示：FITC涂抹后，趋化性树突状细胞的lnc-Dpf3表达量比非趋化性树突状细胞明显升高。

图4中的数据显示：FITC涂抹后，趋化性树突状细胞中lnc-Dpf3表达量在48-72小时持续升高。

以上结果表明：

lnc-Dpf3可以作为鉴别树突状细胞及其趋化状态的特异性生物标记物，其表达水平可用于区别趋化性树突状细胞和非趋化性树突状细胞，及用于鉴别树突状细胞的趋化状态和功能。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

序列表

<110> 中国人民解放军第二军医大学

<120> 一种树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能的特异性生物标志物

<130> /

<160> 61

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4076

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

ggggagggag gaagcaagag aggattctta atcctgggag caggaatgag tgcagaaaat 60

gccctgggaa cttaagattc ccccggttca tgtcagcgca cagcagccca tatataaccc 120

tgggcaagct taatcctcgc ttccccggct tatctcagcc tcacattcgt gggctcacca 180

gcccggagtc tctttggatg ttggccaggc ctgctgggaa tggtaagagc tgagacaggg 240

acagaaactc acgtccttgc atgttggaat gaggcctcct tcctctccca ctttcctggc 300

ctttagattt tcctcctggc attggcacgt aggcttcctg gcctcacatc tctaatcttt 360

tgaagaaggg agactctgat ctcaggtttg caggaggctg tgtcagcgat gcagatgatt 420

cgaggtgagc agaggcagaa tggtagtagt tgtactttct cttttggttg tttggtgacg 480

gggtttcaca atccctaact caggctggcc ttgaactctt tatgtagctt gggctgggtc 540

tgagcttggc aaccctcctg ctgccgcttt tggactcggt tccaaatcct gacatttcag 600

gcttatgcca acaaggctgg cttaggtgtc actttgaaat cccggctgca gtcttgtgag 660

tttaaaacct tccccgagtt tctcttttcc tagctaactt ggatttttat gaggaatggg 720

aaggtctcat gagagcaaac gattctggga agctgacaga ggccatgttg gggatcttgg 780

gcttgtactg gatgtgtggg caggcaggtg gcgcctctat ccttctcctc tctcgccttt 840

tctctgggtt gggtttacag ctatgacccg ccctcccctg acccctaggt ttccccttta 900

gaacagctgt aaaggtcaca gcttgctttt gaagatacgt ggtatttcta gaatggcttc 960

cattctttgg acaagaagct gagttgtacc taaccttaac tcccttcctc ttcctctcac 1020

attctttctg ccccttcctc tgccatgttc cctgaccgtg gaggaagtga tagagagacc 1080

atctatgact ggtcactcaa caggaaccta ttcttagtac gtttgactga gttacagtta 1140

agcatctcta tagccatctg tgaccatcac aaagacaagc ttctctggcc aacagggaca 1200

gcagcgctca cctatgggca tcaacggtta gttagagggt gatctgatgg gcacatcagt 1260

ttagccaaaa cagcagaagt agcttttcca ctccacccca tgacctcccc agcctcaggc 1320

ttttggcttg atttgtgacc cagacatgaa ttttgtcctg taaattaggt atcaaatata 1380

atcaggcggg aaacagttgt tcaacccccc ataacaggct tgtcactgat gcaccattga 1440

ctcgtcaggc ttggccaggc agtattatta cacacagaga ccatagctga gtatgactcc 1500

tcctcttggg aattctcccc taggagcctt gcatacctcc gagggctagc cagtaagaag 1560

gaagcttcca gcccaggtct agcctgaatt cttcatgtcc tgtaatcaag gcccattggt 1620

gtctttggtg ataggtaatt aggtaataaa gtctagtgct actagttctg gtgcagagct 1680

aatagcagtg acaacttcct gtagtgttct gggggcctca gggacctccc tgaccaagtg 1740

gtgaggcagt atcccacccc tggtacggga ctatttcttt aataacctat ggctcttggg 1800

agcatcttta tctacctcat tgaaacacat aaaaatgaaa agcaacacaa cacacttttt 1860

tattagtatt tcaaatatca gattccttta tggcaccccc cctccccacc agcttccccc 1920

ttcctcttgt ctccttgtcc agagttgtgt gacttctttt ctactttttt tttttttctg 1980

ataatatcct agggttatac attttcactt agtttatttc ttttctccac ccaaaagttg 2040

cttttccaag tgtcctgggc tatatctttt atattttagt tttattataa agggtgatat 2100

aaagccattt ttaccgaagc acacattata ctttgaggct actgccaccc ccatacggcc 2160

tctctctttc tctccctccc ataatgcact ttgttttctt tttatttgac aatataccca 2220

cagcccaatc cctttttatt cacagtacca gggggtcgaa tccaaggctt tgaatatgct 2280

gggtagataa gagctgtatg agctataatc ccaacctgta atcctacttt aaataaggta 2340

tttcaagtgt ggatatgtaa tttatttaat ttcacctctc ttgataggaa tttagatgat 2400

tttcaattct tacctcaatg ggaaaaatcg aatatgcttt ccccataagt cacgtgtgcc 2460

catttttagc atgtatagtc atcaggactt ctcagttatt tctgaagttt gtatgtaata 2520

tgaagtgagt gaattgaaag atatctgtta tgttcttacc ttggacaaat atggatctct 2580

gactgttttc ctgatggttt gttttagatc attttttttt ctttctttct ttctttcttt 2640

ctttctttct ttcttttttt tttttttttt ttttttggtt tttcgagaca gggtttctct 2700

ttatagctct gtctgtcctg gagctcactt tgtagaccag gctggcctcg aactcagaaa 2760

tgcctctgcc tcccaagtgc tgggattaaa ggcgtgcgcc actatgcccg gcagatcatt 2820

tattttttta attgaaaaat aaaaataaaa tttaagtgta taagtatttt gtcttcatgt 2880

atgtctgtat accacatggg tgcctggtga ccatgaggcc caaagagtgg catctgatcc 2940

tctgggacag aaggttgtga gcctctatgt tggtgctggg aattgaacct gtgtcctctc 3000

aaagagcagc cagaactctt aaatgcttag ccatctttcc agccctctaa atgatttctt 3060

gttggtataa atgagtcagt aacaaaagtt gtatgtacat ttctgctaca tgtctctgca 3120

catagaggcc agaaggcaac attaggtgtc ttcttcagtc tttctctact ttgagaaaga 3180

gtctctcact aaactggagc tggctgattt ggctagagta gctgaccagt gagccccagg 3240

gatctacctg cttatctcct cttctccagc tctgggattg caagtgttcc cgatcatatc 3300

tggcttttgc aggggtgctg gagaaaggaa cacaggtctt catgcttgga caggaaatat 3360

tcactgacca ggacattctg ctggtcccta aatatcctct ttggactggc tcgtttttta 3420

aatcattcct tagcacagtt tcctaaaatt ggcttaacta ttctgaaaat tgctgtatta 3480

ttaatttcct gttaatggga taaagtactg tgacgaagat aacttgtaga agagagagtt 3540

tgcatttggg cttatggttc cagagtggtg agcccatcac cacagggagg cacggcagca 3600

agcctccctc atggccacag aagcaggaag ctgagggatc gatcacagct caactgcaag 3660

cataaagcag agagagctgc aaatcacgtg aggctaacga ttgtgaagct cagttccagt 3720

gccacttcct tcagcaaggt cacacttccc aagccttccc aaacagtgcc acctactgta 3780

cacctggtgt tcatgtatct gagcctgtga gggacatgtc tcatttaaat caccacagtc 3840

tttaaggctc tggaccttta ttgctgattc atagtcagaa tataaaattt ccattcttat 3900

actgcacctg agtgcccatc tgtccgcatg ctgctaacat ttttaccaag acagaaacaa 3960

agaggtgctg agatggtatg tgaaacagtg acttattgta ctaattcttt tagttagcta 4020

ttatacttgt ttctttacct cgtgaatttc acatcaccca ttccaaaaaa aaaaaa 4076

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

gtgccaccta ctgtacacct 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

tgggcactca ggtgcagtat 20

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

ctcgcttcgg cagcaca 17

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

aacgcttcac gaatttgcgt 20

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

tcatagatgg tctctctatc acttcct 27

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

aataggttcc tgttgagtga ccag 24

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

ttaactgtaa ctcagtcaaa cgtactaag 29

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

ggtcacagat ggctatagag atgc 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 10

gccagagaag cttgtctttg tgat 24

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 11

gcgctgctgt ccctgttg 18

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 12

ccgttgatgc ccataggtga 20

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 13

cccatcagat caccctctaa ctaa 24

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 14

gctgttttgg ctaaactgat gtg 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 15

ggtggagtgg aaaagctact tct 23

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 16

aggctgggga ggtcatgg 18

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 17

acaaatcaag ccaaaagcct g 21

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 18

aggacaaaat tcatgtctgg gtc 23

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 19

cgcctgatta tatttgatac ctaatttac 29

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 20

gggggttgaa caactgtttc c 21

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 21

gcatcagtga caagcctgtt atg 23

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 22

caagcctgac gagtcaatgg t 21

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 23

ctgtgtgtaa taatactgcc tggc 24

<210> 24

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 24

ggaggagtca tactcagcta tggtct 26

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 25

cctaggggag aattcccaag a 21

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 26

cctcggaggt atgcaaggct 20

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 27

aagcttcctt cttactggct agc 23

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 28

caggctagac ctgggctgg 19

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 29

ccttgattac aggacatgaa gaatt 25

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 30

atcaccaaag acaccaatgg g 21

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 31

gtagcactag actttattac ctaattacct 30

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 32

tgctattagc tctgcaccag aacta 25

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 33

ccagaacact acaggaagtt gtcac 25

<210> 34

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 34

ggaggtccct gaggccc 17

<210> 35

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 35

actgcctcac cacttggtca g 21

<210> 36

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 36

ccgtaccagg ggtgggat 18

<210> 37

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 37

agagccatag gttattaaag aaatagtc 28

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 38

atgaggtaga taaagatgct ccca 24

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 39

ttgcttttca tttttatgtg tttca 25

<210> 40

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 40

aggatattat cagaaaaaaa aaaaagtag 29

<210> 41

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 41

aaataaacta agtgaaaatg tataaccct 29

<210> 42

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 42

gcaacttttg ggtggagaaa ag 22

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 43

agcccaggac acttggaaaa 20

<210> 44

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 44

ccctttataa taaaactaaa atataaaaga tat 33

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 45

ttcggtaaaa atggctttat atca 24

<210> 46

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 46

cagtagcctc aaagtataat gtgtgc 26

<210> 47

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 47

aggccgtatg ggggtgg 17

<210> 48

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 48

ttatgggagg gagagaaaga gag 23

<210> 49

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 49

tcaaataaaa agaaaacaaa gtgca 25

<210> 50

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 50

ggattgggct gtgggtatat tg 22

<210> 51

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 51

ccccctggta ctgtgaataa aaag 24

<210> 52

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 52

atattcaaag ccttggattc ga 22

<210> 53

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 53

ctcatacagc tcttatctac ccagc 25

<210> 54

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 54

aagtaggatt acaggttggg attatag 27

<210> 55

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 55

catatccaca cttgaaatac cttattta 28

<210> 56

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 56

tatcaagaga ggtgaaatta aataaatta 29

<210> 57

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 57

ggtaagaatt gaaaatcatc taaattcc 28

<210> 58

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 58

gcatattcga tttttcccat tga 23

<210> 59

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 59

gcacacgtga cttatgggga aa 22

<210> 60

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 60

cctgatgact atacatgcta aaaatgg 27

<210> 61

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 61

catacaaact tcagaaataa ctgagaagt 29

Claims (10)

1.选自下组的RNA序列在制备鉴别树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能的试剂或试剂盒中的应用：

(a)SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA；

(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；

(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的RNA序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳动物中的同源序列。

2.检测选自下组的RNA序列水平的试剂在制备鉴别树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能的试剂盒中的应用：

(a)SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA；

(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；

(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的RNA序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳动物中的同源序列。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述RNA序列是SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述树突状细胞和/或其分化而成的趋化性树突状细胞来源于哺乳动物。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述趋化状态选自：细胞表面MHCII、CD11c、CD40、CCR7的表达；所述功能选自：树突状细胞在趋化因子CCL19和CCL21刺激后发生迁移(体外)、在病原体或炎症刺激下由外周组织向次级淋巴结迁移(体内)。

6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，若待鉴别细胞中所述RNA序列的水平高于非树突状细胞，则表明该待鉴别细胞是树突状细胞；若待鉴别细胞中所述RNA序列的水平高于非趋化性树突状细胞，则表明该待鉴别细胞是趋化性树突状细胞；

若待鉴别细胞为树突状细胞，且处理后所述RNA序列水平升高，则表明该树突状细胞正向趋化性树突状细胞转化，且表明所述处理能诱导树突状细胞发生趋化或向趋化性树突状细胞的转化。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂为选自下组中的一种或两种以上：针对所述RNA序列的探针或引物、或其他以此序列为指示的检测方法。

8.一种用于鉴别树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能的试剂盒，其特征在于，包含：

i)检测选自下组的RNA序列水平的试剂：

(a)SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA；

(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；

(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的RNA序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳动物中的同源序列；

ii)容纳i)所述试剂的容器。

9.一种鉴别树突状细胞和/或趋化性树突状细胞和/或其趋化状态和功能方法、或鉴别能诱导产生树突状细胞和/或趋化性树突状细胞的试剂或体系的方法，所述方法包括检测待鉴别细胞中选自下组的RNA序列的水平的步骤：

(a)SEQ ID NO:1所示的长非编码RNA；

(b)在严格条件下与(a)限定的序列杂交的序列；

(c)与(a)或(b)中序列具有90％以上序列相同性的RNA序列；和

(d)(a)或(b)中序列在非小鼠哺乳动物中的同源序列。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

将待鉴别细胞中所述RNA序列的水平与非树突状细胞中所述RNA序列的水平比较，或将处理前的待鉴别细胞中所述RNA序列的水平与不同时间段或处理阶段的待鉴别细胞中的所述RNA序列水平比较；

其中，若待鉴别细胞中所述RNA序列的水平高于非树突状细胞，则表明该所测细胞是树突状细胞；

若待鉴别细胞为树突状细胞，该所测细胞中所述RNA序列的水平较处理前升高，则表明该所测细胞发生趋化或往趋化性树突状细胞方向转化；

若采用候选试剂或体系处理树突状细胞后，所测细胞中的所述RNA序列水平与处理前相比升高，则表明所述候选试剂或体系能诱导树突状细胞发生趋化或往趋化性树突状细胞方向转化。