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CN109761970B - 一种蛋白靶向降解嵌合分子、制备方法及应用 - Google Patents

一种蛋白靶向降解嵌合分子、制备方法及应用 Download PDF

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CN109761970B CN201910076670.4A CN201910076670A CN109761970B CN 109761970 B CN109761970 B CN 109761970B CN 201910076670 A CN201910076670 A CN 201910076670A CN 109761970 B CN109761970 B CN 109761970B
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陆朦辰
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Abstract

本发明公开了一种蛋白靶向降解嵌合分子、制备方法及应用。本发明提供的蛋白靶向降解嵌合分子可不同程度地抑制BCR‑ABL和/或CRBN阳性的白血病K562细胞中BCR‑ABL和/或CRBN蛋白的表达，因而可以用于制备治疗BCR‑ABL和/或CRBN阳性的白血病的药物，其中，n＝3的蛋白靶向降解嵌合分子具有优异的光致异构化活性，可以用于制备光照调控降解BCR‑ABL和/或CRBN蛋白的试剂或药物；本发明还提供了一种合成该系列蛋白靶向降解嵌合分子的方法。

Description

一种蛋白靶向降解嵌合分子、制备方法及应用
技术领域
本发明属于化学领域，具体涉及一种蛋白靶向降解嵌合分子、制备方法及应用。
背景技术
蛋白靶向降解嵌合(PROTAC)是一项新兴技术，该技术能够利用泛素-蛋白酶体系统，通过招募特定蛋白的E3泛素连接酶诱导某一蛋白的泛素化降解，进而调节该蛋白的浓度。相比于传统的小分子抑制剂，PROTAC技术能够更有效的作用于那些非成药性蛋白。
临床研究表明，BCR-ABL融合蛋白普遍存在于慢性粒细胞白血病(CML)病例中。同时， ABL和BCR-ABL蛋白也是最早用于PROTAC研究的靶标之一。2016年，CREWS课题组率先利用PROTAC策略成功下调了K562白血病细胞中BCR-ABL融合蛋白的表达水平，他们设计的PROTAC小分子能够在低浓度下同时降解BCR-ABL和ABL蛋白。
然而，相关研究表明，ABL参与生长因子与细胞因子应答，同时与细胞粘附，DNA损伤，氧化应激等多条信号通路有关。ABL被激活以刺激细胞增殖或分化，存活或死亡，撤回或迁移，ABL基因的敲除会导致细胞周期功能异常。
但是，如何调控PROTAC分子才能避免ABL蛋白的过度降解呢？这就亟需解决一个技术难题，即如何调控PROTAC分子介导的目标蛋白降解过程。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种可调节的PROTAC分子，以可逆、迅速、简易地利用PROTAC策略下调K562白血病细胞中BCR-ABL和ABL蛋白的表达水平；同时，本发明还旨在提供一种合成制备该PROTAC分子的可行方法。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
一种蛋白靶向降解嵌合分子，化学结构式如下：
Figure BDA0001959062970000011
其中，n为1～5中任一自然数。
优选地，n＝3。
上述蛋白靶向降解嵌合分子的合成方法，合成路线如下：
Figure BDA0001959062970000021
其中，n为1～5中任一自然数。
上述蛋白靶向降解嵌合分子在制备治疗BCR-ABL和/或CRBN阳性的白血病的药物中的应用。
上述n＝3的蛋白靶向降解嵌合分子在制备光照调控降解BCR-ABL和/或CRBN蛋白的试剂或药物方面的应用。
有益效果：
本发明提供的蛋白靶向降解嵌合分子可不同程度地抑制BCR-ABL和/或CRBN阳性的白血病K562细胞中BCR-ABL和/或CRBN蛋白的表达，因而可以用于制备治疗BCR-ABL和/或CRBN阳性的白血病的药物，其中，n＝3的蛋白靶向降解嵌合分子具有优异的光致异构化活性，可以用于制备光照调控降解BCR-ABL和/或CRBN蛋白的试剂或药物；本发明还提供了一种合成该系列蛋白靶向降解嵌合分子的方法。
附图说明
图1：化合物4C的光致异构化示意图；
图2：化合物2C～6C的化学结构及对BCR-ABL和CRBN阳性K562细胞株中ABL和 BCR-ABL蛋白降解活性的免疫印迹检测图；
图3：A)化合物4C-trans和cis构型的紫外-可见吸收光谱；B)化合物4C在周期实验，经UV-C照射后在λ＝361nm处检测吸光度；C)化合物4C-trans经紫外照射后紫外-可见吸收光谱随时间的变化；D)化合物4C-cis经白光照射后紫外-可见吸收光谱随时间的变化；
图4：A)化合物4C-trans对K562细胞系的抗细胞增殖活性测定；B)化合物4C-trans对A549、HCT116、MCF-7和K562细胞系的细胞活力测定；C)250nM浓度下化合物4C-trans 免疫印迹的时效实验；D)给药24小时后，化合物4C-trans免疫印迹的量效实验；
图5：A)孵育24小时后，化合物4C-trans的免疫印迹-量效实验B)250nM浓度下化合物4C-trans的免疫印迹-时效实验；C)孵育24小时后，化合物4C-cis的免疫印迹-量效实验；D) 250nM浓度下化合物4C-cis的免疫印迹-时效实验；
图6为化合物4C-trans处理过的K562细胞分别在黑暗(VIS组)和紫外光照条件(每4 小时照射一次)下，BCR-ABL蛋白浓度随时间的变化；
图7为不同浓度化合物4C-trans对ABL基因表达的影响；
图8为500nM浓度的化合物4C-trans对ABL基因表达影响随时间变化曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。实施例中，提到的室温或代表室温的缩写rt均指常温。
实施例1：PROTAC分子的合成和结构确证
合成路线：
Figure BDA0001959062970000031
(E)-4-((4-羟基苯基)二氮烯基)苯甲酸甲酯(3)
Figure BDA0001959062970000041
将化合物2(11.54g，76.1mmol)溶于水(135ml)中，加入HCl(15.8ml，190mmol)，冰浴下冷却至5℃。向反应液中缓慢滴加预冷的亚硝酸钠(5.03g，79.8mmol)水溶液(35ml)，5℃下搅拌1小时。将苯酚(1)(7.52g，79.9mmol)，K2CO3(15.0g，108.5mmol)的水溶液(120ml)滴加到反应液中(10min滴完)，室温下搅拌3小时。用稀醋酸调节至pH＝4，有大量棕黄色固体析出。抽滤，滤饼依次用水和甲醇洗涤，得到棕色固体3(15.65g，80.3％)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.57(s,1H),8.18–8.09(m,2H),7.96–7.80(m,4H),6.97(d,J＝8.4Hz,2H),3.89(s,3H).
Figure BDA0001959062970000042
将化合物3(2.56g，10mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(20ml)中，加入1-溴-2-氯乙烷(1.03ml， 12mmol)和碳酸钾(4.14g，30mmol)，室温反应20h。向反应液中加入200mL水，大量棕黄色固体析出。抽滤，滤饼用10ml水洗涤3次，干燥后得到橘黄色固体4。
Figure BDA0001959062970000043
(E)-4-((4-(2-氯乙氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸甲酯(4a)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.22–8.06(m,2H),7.98–7.81(m,4H),7.29–7.09(m,2H),4.38(t,J＝11.2Hz,2H),4.08–3.94(m,2H),3.90(s,3H).
Figure BDA0001959062970000044
(E)-4-((4-(3-氯丙氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸甲酯(4b)
1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ8.24–8.12(m,2H),8.01–7.86(m,4H),7.09–6.97(m,2H),4.21(t,J＝5.8Hz,2H),3.95(s,3H),3.77(t,J＝6.2Hz,2H),2.28(p,J＝6.0Hz,2H).
Figure BDA0001959062970000045
(E)-4-((4-(4-氯丁氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸甲酯(4c)
1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ8.17(d,J＝8.3Hz,2H),7.92(dd,J＝11.4,8.5Hz,4H), 7.01(d,J＝8.5Hz,2H),4.09(d,J＝5.2Hz,2H),3.95(s,3H),3.63(d,J＝5.9Hz,2H),2.01(p,J＝ 2.9Hz,4H).
Figure BDA0001959062970000051
(E)-4-((4-((5-氯戊基)氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸甲酯(4d)
1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ8.17(d,J＝8.4Hz,2H),7.99–7.85(m,4H),7.06–6.96(m,2H),4.07(t,J＝6.3Hz,2H),3.95(s,3H),3.59(t,J＝6.6Hz,2H),1.95–1.80(m,4H), 1.66(ddt,J＝14.5,9.7,5.7Hz,2H).
Figure BDA0001959062970000052
(E)-4-((4-((6-氯己基)氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸甲酯(4e)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.15(d,J＝8.0Hz,2H),7.93(d,J＝8.2Hz,4H),7.15(d,J ＝8.4Hz,2H),4.17–4.05(m,2H),3.90(s,3H),3.65(s,2H),1.84-1.66(m,4H),1.56-1.38(m, 4H).
Figure BDA0001959062970000053
将化合物4(5mmol)溶于10ml四氢呋喃中，缓慢加入10ml氢氧化锂(600mg，25mmol)水溶液，室温下搅拌过夜。反应完成后在搅拌下向反应液中加入200mL水，用稀盐酸调节体系至pH＝2，有大量橙色固体析出。抽滤得粗品，滤饼用水洗涤3次，干燥后得到橙色固体5。
Figure BDA0001959062970000054
(E)-4-((4-(2-氯乙氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸(5a)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ13.40–12.80(s,1H),8.32–8.10(m,2H),8.06–7.81(m,4H),7.29–7.09(m,2H),4.38(t,J＝10.8Hz,2H),4.12–3.92(m,2H).
Figure BDA0001959062970000061
(E)-4-((4-(2-氯丙氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸(5b)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.06(d,J＝8.1Hz,2H),7.90(d,J＝8.5Hz,2H),7.78(d,J ＝8.1Hz,2H),7.16(d,J＝8.5Hz,2H),5.76(s,2H),4.21(t,J＝6.1Hz,2H),3.82(t,J＝6.5Hz, 2H),2.22(p,J＝6.4Hz,2H).
Figure BDA0001959062970000062
(E)-4-((4-(2-氯丁氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸(5c)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.0Hz,2H),7.90(d,J＝8.6Hz,2H),7.78(d,J ＝8.1Hz,2H),7.14(d,J＝8.5Hz,2H),4.13(d,J＝5.2Hz,2H),1.97–1.77(m,4H).
Figure BDA0001959062970000063
(E)-4-((4-(2-氯戊氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸(5d)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.09(d,J＝8.0Hz,2H),7.86(dd,J＝25.2,8.2Hz,4H),7.13(d,J＝8.5Hz,2H),4.10(t,J＝6.4Hz,2H),3.68(d,J＝13.2Hz,2H),1.79(dq,J＝12.5,5.6 Hz,4H),1.57(q,J＝7.9Hz,2H).
Figure BDA0001959062970000064
(E)-4-((4-(2-氯己氧基)苯基)二氮烯基)苯甲酸(5e)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝7.9Hz,2H),7.88(d,J＝8.4Hz,2H),7.77(d,J ＝7.9Hz,2H),7.12(d,J＝8.5Hz,2H),4.07(d,J＝6.6Hz,2H),3.64(t,J＝6.7Hz,2H),1.75(s, 4H),1.46(s,4H).
Figure BDA0001959062970000065
将化合物5(2.0mmol)溶于无水四氢呋喃(10ml)中，加入草酰氯(338ul，4.0mmol)，加1滴 N，N-二甲基甲酰胺，室温下搅拌30分钟。减压蒸馏后，将体系溶于无水四氢呋喃(5ml)中，冰浴下逐滴加入来那度胺(518.5mg，2.0mmol)和DIEA(992ul，6.0mmol)的四氢呋喃(20ml)溶液，室温下搅拌过夜。反应完全后，减压蒸馏获得棕色固体，粗品用甲醇重结晶，得到化合物6，为橙色固体。
Figure BDA0001959062970000071
(E)-4-((4-(2-氯乙氧基)苯基)二氮烯基)-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚-4-基)苯甲酰胺(6a)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.96(s,1H),10.48(s,1H),8.18(d,J＝8.2Hz,2H),7.96 (dt,J＝8.9,4.2Hz,4H),7.76(d,J＝7.5Hz,1H),7.65–7.55(m,2H),7.26–7.14(m,2H),5.15 (dd,J＝13.2,5.2Hz,1H),4.47(d,J＝2.6Hz,2H),4.40(t,J＝5.1Hz,2H),4.00(t,J＝5.1Hz,2H), 2.99–2.81(m,1H),2.67–2.54(m,1H),2.45–2.27(m,1H),2.07–1.93(m,1H).
Figure BDA0001959062970000072
(E)-4-((4-(2-氯丙氧基)苯基)二氮烯基)-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚-4-基)苯甲酰胺(6b)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.99(s,1H),10.51(s,1H),8.19(d,J＝8.2Hz,2H),7.97 (dd,J＝8.4,5.8Hz,4H),7.77(d,J＝7.5Hz,1H),7.60(dt,J＝15.2,7.5Hz,2H),7.19(d,J＝8.6 Hz,2H),5.17(dd,J＝13.2,5.0Hz,1H),4.54–4.38(m,2H),4.23(t,J＝6.0Hz,2H),3.83(t,J＝ 6.5Hz,2H),2.99–2.82(m,1H),2.64–2.54(m,1H),2.45–2.34(m,1H),2.23(p,J＝6.5Hz,2H), 2.04–1.97(m,1H).
Figure BDA0001959062970000073
(E)-4-((4-(2-氯丁氧基)苯基)二氮烯基)-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚-4-基)苯甲酰胺(6c)
1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.01(s,1H),10.53(s,1H),8.15(dd,J＝18.7,8.2Hz,2H),7.94(dd,J＝11.3,8.3Hz,4H),7.77(d,J＝7.4Hz,1H),7.60(dt,J＝14.9,7.4Hz,2H),7.16 (dd,J＝9.2,2.8Hz,2H),5.17(dd,J＝13.5,4.9Hz,1H),4.47(s,2H),4.15(s,2H),3.73(d,J＝6.5 Hz,2H),2.99–2.85(m,1H),2.66–2.55(m,1H),2.48–2.33(m,1H),2.07–1.98(m,1H),1.96– 1.79(m,4H).
Figure BDA0001959062970000081
(E)-4-((4-(2-氯戊氧基)苯基)二氮烯基)-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚-4-基)苯甲酰胺(6d)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ10.90(s,1H),10.42(s,1H),8.09(d,J＝8.2Hz,2H),7.87 (t,J＝7.9Hz,4H),7.67(d,J＝7.5Hz,1H),7.51(dt,J＝15.1,7.5Hz,2H),7.07(d,J＝8.5Hz,2H), 5.07(dd,J＝13.1,5.2Hz,1H),4.43–4.33(m,2H),4.03(t,J＝6.3Hz,2H),3.59(t,J＝6.5Hz, 2H),2.90–2.80(m,1H),2.62–2.48(m,1H),2.46–2.32(m,1H),1.99–1.87(m,1H),1.70(d,J ＝9.7Hz,4H),1.47(t,J＝7.8Hz,2H).
Figure BDA0001959062970000082
(E)-4-((4-(2-氯己氧基)苯基)二氮烯基)-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚-4-基)苯甲酰胺(6e)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.00(s,1H),10.52(s,1H),8.18(d,J＝8.3Hz,2H),7.95 (t,J＝8.2Hz,4H),7.76(d,J＝7.4Hz,1H),7.60(dt,J＝15.0,7.4Hz,2H),7.15(d,J＝8.6Hz,2H), 5.16(dd,J＝13.1,5.1Hz,1H),4.54–4.40(m,2H),4.10(t,J＝6.5Hz,2H),3.65(t,J＝6.6Hz, 2H),2.96–2.84(m,1H),2.68–2.52(m,1H),2.46–2.33(m,1H),2.04–1.98(m,1H),1.88– 1.62(m,4H),1.47(d,J＝7.1Hz,4H).
Figure BDA0001959062970000083
N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-(2-甲基-6-(哌嗪-1-基)嘧啶-4-基氨基)噻唑-5-甲酰胺(8)
将2-(6-氯-2-甲基嘧啶-4-基氨基)-N-(2-氯-6-甲基苯基)噻唑-5-甲酰胺，7(1.00g，2.54mmol)，哌嗪(2.19g，25.4mmol)、N，N-二异丙基乙胺(0.84mL，5.07mmol)溶于无水1,4-二氧六环(30ml) 中，回流12小时。减压蒸馏所得的油状物依次用水/甲醇、甲醇/醚洗涤，得灰白色固体，粗品用乙醚重结晶得到化合物8(0.82g，73％)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.88(s,1H),8.21(s,1H),7.40(d,J＝7.3Hz,1H),7.26(d, J＝8.2Hz,2H),6.02(s,1H),3.44(s,4H),2.74(s,4H),2.40(d,J＝3.0Hz,3H),2.23(d,J＝2.9Hz, 3H).
Figure BDA0001959062970000091
向中间体6(0.11mmol)的丙酮(10ml)溶液中加入碘化钠(83mg，0.55mmol)，回流24小时，减压蒸馏得橘黄色固体。将固体溶于DMF(20ml)中，并依次加入化合物8(43mg，0.10mmol) 和DIEA(96μL，0.57mmol)，80℃下搅拌16小时。将反应液冷却至室温，加入200mL水，有大量橙黄色固体析出，抽滤后粗品经TLC纯化(MeOH/DCM，1/50至1/25)，得到化合物9，橙色固体。
Figure BDA0001959062970000092
(E)-N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-((6-(4-(2-(4-((4-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-oxoisoindolin-4-基) 氨甲酰基)苯基)二氮烯基)苯氧基)乙基)哌嗪-1-基)-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)噻唑-5-甲酰胺(9a)
1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.47(s,1H),10.99(s,1H),10.51(s,1H),9.87(s,1H),8.26–8.13(m,3H),8.06–7.85(m,4H),7.75(d,J＝7.4Hz,1H),7.68–7.46(m,2H),7.38(d,J＝ 7.4Hz,1H),7.32–7.15(m,4H),6.05(s,1H),5.15(dd,J＝13.2,5.2Hz,1H),4.43(d,J＝16.4Hz, 2H),4.25(d,J＝5.1Hz,2H),3.59–3.46(m,4H),2.99–2.88(m,1H),2.77–2.67(m,1H),2.63– 2.53(m,4H),2.40(s,3H),2.36–2.30(m,1H),2.22(s,3H),2.06–1.91(m,1H).MS(ESI):calcd for C48H45ClN12O6S,952.30；m/z:[M]+＝953.3036
Figure BDA0001959062970000093
(E)-N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-((6-(4-(3-(4-((4-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-oxoisoindolin-4-基) 氨甲酰基)苯基)二氮烯基)苯氧基)丙基)哌嗪-1-基)-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)噻唑-5-甲酰胺(9b)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)11.47(s,1H),10.99(s,1H),10.51(s,1H),9.87(s,1H),8.25 –8.11(m,3H),7.95(dd,J＝8.5,5.9Hz,4H),7.75(d,J＝7.4Hz,1H),7.60(dd,J＝13.7,7.4Hz, 2H),7.38(dd,J＝7.3,2.1Hz,1H),7.31–7.12(m,4H),6.04(s,1H),5.15(dd,J＝13.2,5.2Hz, 1H),4.46(s,2H),4.23–4.12(m,2H),3.59–3.46(m,4H),2.96–2.85(m,1H),2.63–2.60(m, 1H),2.57–2.49(m,4H),2.39(s,3H),2.32–2.25(m,1H),2.22(s,3H),2.07–1.88(m,3H). MS(ESI):calcd for C49H47ClN12O6S,966.32；m/z[M]+:967.3325
Figure BDA0001959062970000101
(E)-N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-((6-(4-(4-(4-((4-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-oxoisoindolin-4-基) 氨甲酰基)苯基)二氮烯基)苯氧基)丁基)哌嗪-1-基)-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)噻唑-5-甲酰胺(9c)
1HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.41(s,1H),10.96(s,1H),10.44(d,J＝15.3Hz,1H),9.83 (s,1H),8.30–8.09(m,3H),7.95(t,J＝7.4Hz,4H),7.80(dd,J＝18.2,7.5Hz,1H),7.58(h,J＝ 8.5,7.9Hz,3H),7.38(d,J＝7.4Hz,1H),7.25(d,J＝8.2Hz,2H),7.16(d,J＝8.8Hz,2H),6.05(d, J＝6.7Hz,1H),5.15(dd,J＝13.6,5.2Hz,1H),4.50(d,J＝17.5Hz,2H),4.13(d,J＝6.6Hz,2H), 3.55–3.49(m,4H),3.05–2.79(m,1H),2.66–2.54(m,1H),2.44(s,3H),2.43–2.33(m,4H), 2.32–2.26(m,1H),2.25–2.19(s,3H),2.10–1.95(m,1H),1.89–1.71(m,2H),1.63(t,J＝7.9 Hz,2H).MS(ESI):calcd for C50H49ClN12O6S,980.33；m/z:[M]+＝981.33728
Figure BDA0001959062970000102
(E)-N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-((6-(4-(5-(4-((4-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-oxoisoindolin-4-基) 氨甲酰基)苯基)二氮烯基)苯氧基)戊基)哌嗪-1-基)-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)噻唑-5-甲酰胺(9d)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.46(s,1H),10.99(s,1H),10.51(s,1H),9.86(s,1H),8.25 –8.12(m,3H),7.95(t,J＝7.7Hz,4H),7.75(d,J＝7.4Hz,1H),7.60(dd,J＝13.6,7.2Hz,2H), 7.38(d,J＝7.4Hz,1H),7.25(d,J＝7.9Hz,2H),7.15(d,J＝8.6Hz,2H),6.03(s,1H),5.15(dd,J ＝12.2,5.2Hz,1H),4.50–4.37(m,2H),4.09(d,J＝6.7Hz,2H),3.60–3.41(m,4H),2.98–2.82 (m,1H),2.64–2.53(m,1H),2.42(s,3H),2.41–2.34(m,4H),2.33–2.27(m,1H),2.22(s,3H), 2.01–1.94(m,1H),1.85–1.70(m,2H),1.57–1.43(s,4H).MS(ESI):calcd for C51H51ClN12O6S 994.35；m/z:[M]+＝995.3535
Figure BDA0001959062970000103
(E)-N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-((6-(4-(6-(4-((4-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-oxoisoindolin-4- 基)氨甲酰基)苯基)二氮烯基)苯氧基)己基)哌嗪-1-基)-2-甲基嘧啶-4-基)氨基)噻唑-5-甲酰胺(9e)
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.39(s,1H),10.92(s,1H),10.41(s,1H),9.80(s,1H),8.25 –8.02(m,3H),7.90(t,J＝8.1Hz,4H),7.73(p,J＝10.2,8.7Hz,1H),7.54(dt,J＝15.6,7.8Hz, 2H),7.34(d,J＝7.3Hz,1H),7.20(d,J＝8.3Hz,2H),7.09(d,J＝8.6Hz,2H),6.00(s,1H),5.11 (dd,J＝13.1,5.2Hz,1H),4.50–4.34(m,2H),4.04(t,J＝6.4Hz,2H),3.46(d,J＝6.7Hz,4H), 2.96–2.78(m,1H),2.61–2.53(m,1H),2.41–2.31(m,4H),2.26(s,3H),2.21–2.11(m,4H), 2.01–1.87(m,1H),1.79–1.64(m,2H),1.42(q,J＝7.1Hz,4H),1.34(d,J＝9.6Hz,2H).MS (ESI):calcd for C52H53ClN12O6S1008.36；m/z:[M]+＝1009.36956
实施例2：效果实施例
最初，研究人员合成了2C化合物(图2中的 A)，这是连接链最短(n＝1)的小分子，并使用BCR-ABL和CRBN阳性的K562细胞株，通过免疫印迹测试化合物在细胞中对ABL和BCR-ABL蛋白的降解情况。给药36小时后，WB结果显示化合物2C能够剂量依赖性地下调BCR-ABL蛋白的水平，在100nM浓度下的ABL蛋白和BCR-ABL融合蛋白水平的显着降低 (图2中的 B)。随后，研究人员尝试延长连接链(提高n值)。结果表明，随着接头延伸直至4 个碳原子时，化合物的降解活性持续提高，但链长进一步延伸后活性逐渐降低。在这些 PROTAC分子中，化合物4C降解BCR-ABL融合蛋白显示出最佳活性(图2中的 C)。图2中的 D为 3C化合物对K562细胞株中ABL和BCR-ABL蛋白降解作用的量效关系；图2中的 E为4C化合物对K562细胞株中ABL和BCR-ABL蛋白降解作用的量效关系；图2中的 F为5C化合物对K562 细胞株中ABL和BCR-ABL蛋白降解作用的量效关系；图2中的 G为6C化合物对K562细胞株中 ABL和BCR-ABL蛋白降解作用的量效关系。
上述试验表明，蛋白靶向降解嵌合分子2C、3C、4C、5C、6C均可不同程度地抑制BCR-ABL 和/或CRBN阳性的白血病K562细胞中BCR-ABL和/或CRBN蛋白的表达，因而可以用于制备治疗BCR-ABL和/或CRBN阳性的白血病的药物。
实施例3：效果实施例
研究发现，化合物4C具有良好的光致异构化活性。化合物4C经200-275nM紫外光(UV-C)照射后，在345-425nm间trans-偶氮苯基团的特征吸收峰消失，这表明化合物由trans 构型转变为cis构型(图3中的 A)。随后，我们通过紫外-可见吸收光谱探究了化合物4C的光动力学特征。结果显示：在361nm是化合物4C-trans中偶氮基团的最大吸收(λmax)。经紫外照射后，361nm处的峰逐渐降低，这表明该化合物逐渐由trans构型转为cis构型。361nm处的吸光度-时间的曲线图表明：经紫外照射1小时，化合物基本完全转化为cis构型(图3中的 B)。cis构型的化合物4C经白光照射，逐渐转化为trans构型(图3中的 C)。此外，由于化合物4C是T型光开关，cis构型在黑暗条件下经自发热弛豫转化为trans构型，在25℃时T1/2约为10 小时。随后，我们测试了光敏开关的可逆性，结果表明：化合物4C在经紫外和白光轮流照射5次后依然相对稳定。
研究人员进一步评价了化合物4C的细胞活性。在抗K562细胞增殖活性测试中，化合物 4C的半数抑制浓度(IC50)为68nM(图4中的 A)；在细胞活力测试中，化合物4C的半数有效浓度(EC50)为28nM(图4中的 B)；此外，化合物4C基本不影响非BCR-ABL依赖的肿瘤细胞系，如A549，HCT116，HEK293T和MCF-7乳腺癌(图4中的 B)。由此可见，化合物4C对 BCR-ABL依赖的K562细胞系有着良好的选择性。
其中，抗K562细胞增殖活性测试的操作方法如下：
在96孔板中配制100μL的K562细胞悬液及10μL不同浓度的待测化合物。将培养板放在培养箱孵育48小时(37℃，5％CO2)。向每孔加入10μL CCK-8溶液。将培养板在培养箱内孵育1-4小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
细胞毒性活力(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100，其中：
A(加药)：具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度
A(空白)：具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度
A(0加药)：具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度
其中，K562细胞活力测试的操作方法如下：
将50uL的K562，MCF-7，HCT116和A549的细胞悬液加入96孔板上孵育12小时，将10uL化合物加入孔中，孵育48小时后。按CellTiter-
Figure BDA0001959062970000121
发光细胞活力测定试剂盒(Promega) 操作。使用GraphPadPrism 6中的非线性回归分析数据。
为测试化合物4C对K562细胞中c-ABL和BCR-ABL蛋白的降解效果，研究人员进行了免疫印迹实验。时效实验显示：经250nM化合物4C孵育4小时后ABL明显降低，10小时后BCR-ABL和c-ABL蛋白均显着降解，32小时后ABL和BCR-ABL的达到最大降解，48 小时后，K562细胞出现明显凋亡。为了排除化合物4C影响ABL基因产生假阳性的可能，研究人员在K562细胞中使用RT-qPCR研究了ABL基因的表达。结果如图7、图8所示。量效实验显示：与对照组相比，经不同浓度的化合物4C处理36小时后的K562细胞中，ABL基因的mRNA水平没有显着变化；时效实验显示，K562细胞经500nM的化合物4C孵育48小时中未观察到ABL基因的mRNA水平有显着降低。
免疫印迹实验的操作方法如下：
A.溶液和试剂
使用反渗透去离子水(RODI)或同等级别的水制备溶液。
1*PBS：加入50ml 20*PBS至950ml dH2O并混合。
1*TBS：加入100ml 10*TBS至900ml dH2O并混合。
1*电泳缓冲液：添加100ml 10*电泳缓冲液至900ml dH2O中并混合。
1*转移缓冲液：将100ml 10*转移缓冲液添加至100ml甲醇+800ml dH2O中，并混合。
1*TBST：将100ml 10X TBST添加至900ml dH2O中并混合。
封闭缓冲液：含5％w/v脱脂奶粉的1*TBST；
洗涤缓冲液：1*BST。
一抗稀释缓冲液：含5％脱脂奶粉的1*TBST；要制备20ml，添加1.0g脱脂奶粉至20ml 1*TBST，然后充分混匀。
HRP偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linkedAntibody(#7074)。
检测试剂：SignalFireTMECLReagent(#6883)。
B.蛋白质印迹
制备样品：
给药后的K562细胞孵育24小时处理。
从培养物中吸出培养基；用1*PBS洗涤细胞；吸出。
加入弱效RIPA裂解液(100μl)来裂解细胞，裂解40min。
13000rpm、4℃、15min离心，取80μl上清液并加入20μl上样缓冲液，并在100℃下加热8分钟；放在冰上冷却。
上样10μL到10％的SDS-PAGE凝胶上。湿法转至PVDF膜上。
C.膜封闭和抗体孵育
I.膜封闭
将膜置于25ml封闭缓冲液中，在室温下封闭1小时。
用15ml TBST洗涤三次，每次5分钟。
II.一抗孵育
将膜和一抗(按照产品说明书中建议的适当稀释度和稀释液)置于10ml一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。
用15ml TBST洗涤三次，每次5分钟。
使用10ml封闭缓冲液稀释Anti-rabbit IgG,HRP-linkedAntibody(#7074，按1:2000的比例)和anti-biotin,HRP-linkedAntibody(#7075，按1:1000-1:3000的比例)用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育1小时。
用15mlTBST洗涤三次，每次5分钟。
继续进行检测(D部分)。
D.蛋白质检测
使用说明：
在TBST中清洗与膜结合的HRP(Antibody Conjugate)三次，持续5分钟。
将显色液与膜一起孵育1分钟，倒掉多余溶液(膜将保持湿润)并曝光。
RT-qPCR实验的操作方法如下：
根据NCBI数据库中的相关基因信息，选择编码序列，委托金斯瑞生物科技有限公司设计合成引物，序列如下：
Figure BDA0001959062970000141
收集于1.5mL离心管中的的K 562细胞重悬液短暂离心，吸去培养上清后加入适量Trizol 试剂并反复吹打以裂解细胞，室温静置5min；向上述裂解液中加入0.2倍体积的氯仿，涡旋 15s后，于室温静置3min；12000rpm、4℃离心15min，从离心机中小心取出离心管，吸取上层水相转移至新的离心管中；加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置10min；12000rpm、4℃离心15min此时试管底部出现白色的RNA沉淀；小心弃去上清，加入1mL的75％乙醇(0.1％， DEPC水配制)，上下颠倒均匀；10min；12000rpm、4℃离心15min，为了RNA沉淀尽快在空气中干燥加入可500μL无水乙醇除水；待白色状核酸刚好消失时，加入适量的0.1％DEPC 水重悬，混匀后，用分光光度计检测所提取RNA样品的纯度和浓度，RNA溶液的A260/A280 的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
按下表配置cDNA，轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。混合液在加入逆转录酶 MMLV之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5ul， 37℃水浴60分钟。取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。
取0.2ml薄壁PCR管,分别编号。向各管中加入2×qPCR TaqMix12.5ul,10uM各基因正反向引物混合物0.5ul,对应的cDNA各1ul。一管中不加模板用作阴性对照。各管补加水至25ul。混匀,置于SLAN荧光定量PCR仪中。95℃5min预变性后,95℃15s→65℃35s(荧光检测),40 cycles。
Figure BDA0001959062970000142
Figure BDA0001959062970000151
接下来，我们测试了化合物4C的不同构型对ABL和BCR-ABL蛋白降解活性的差异。免疫印迹的结果表明：trans构型的4C化合物在25nM浓度下能够轻微降解BCR-ABL融合蛋白，500nM浓度下超过80％的BCR-ABL和几乎所有ABL蛋白被降解(图5中的 A)。在相同条件下，cis构型的4C化合物在250nM浓度下对BCR-ABL蛋白没有明显降解(图5中的 C)。时效实验显示：trans构型的化合物4C在250nM浓度下，4小时后观察到BCR-ABL略微减少， 10小时后BCR-ABL融合蛋白明显减少，32小时后超过90％BCR-ABL融合蛋白被降解(图 5中的 B)；相同条件下的cis构型化合物4C在孵育32小时后没有观察到BCR-ABL的显着减少 (图5中的D)。以上结果均证明化合物4C的trans和cis构型在降解活性上有很大差异，仅有trans 构型能有效降解BCR-ABL蛋白。免疫印迹实验的操作方法同前述。
为模拟光控过程，研究人员用化合物4C-trans处理K562细胞24小时，然后将这些细胞移至新鲜培养基中并分成2组：一组置于暗室中(VIS组)，另一组分别在孵育0、4、8、12、16、24后小时经紫外照射，以此模拟光致异构化过程(UV组)。结果显示：黑暗组中，BCR-ABL融合蛋白维持在低水平，ABL几乎消失(图6-VIS组 )，而在UV组中，ABL和BCR-ABL水平随时间推移而增加(图6-UV组 )。这些结果均证明：经紫外照射变构后的4C化合物失去了降解活性，通过紫外照射，我们可以随时终止PROTAC降解过程。
模拟光控的具体操作方法如下：
将终浓度100nM化合物4C-trans加入K562细胞中，37℃孵育24小时；洗去培养基并用 1*PBS洗涤2次，后将细胞转移至新鲜的1640培养基中(10％FBS，1*谷氨酰胺)培养，并分成两组：一组置于暗室中，另一组每4小时用UV-C灯照射30min；分别在转移并孵育0、 4、8、16、24小时后收集细胞，细胞后处理与免疫印迹相同。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (5)

1.一种蛋白靶向降解嵌合分子，其特征在于，化学结构式如下：
Figure FDA0001959062960000011
其中，n为1～5任一自然数。
2.根据权利要求1所述的蛋白靶向降解嵌合分子，其特征在于：n＝3。
3.权利要求1所述蛋白靶向降解嵌合分子的合成方法，其特征在于，合成路线如下：
Figure FDA0001959062960000012
其中，n为1～5中任一自然数。
4.权利要求1所述的蛋白靶向降解嵌合分子在制备治疗BCR-ABL和/或CRBN阳性的白血病的药物中的应用。
5.权利要求2所述的蛋白靶向降解嵌合分子在制备光照调控降解BCR-ABL和/或CRBN蛋白的试剂或药物方面的应用。
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