CN109748956A - 一种红色类胡萝卜素蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脱辅基蛋白突变体，是将野生型脱辅基蛋白氨基酸序列(SEQ ID No.1)第288位突变为丙氨酸得到的，脱辅基蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该脱辅基蛋白突变体可与色素基团结合，得到一种红色类胡萝卜素蛋白。本发明还公开了一种制备红色类胡萝卜素蛋白的方法，通过双质粒组合表达模式，以单一诱导的方法，在基因工程菌中表达出红色类胡萝卜素蛋白(OCP(W288A))，流程简捷，耗时短，生产周期仅18h左右；OCP(W288A)产量大，相比于现有技术，产量提高10倍；纯度高，纯度比值2.4，可用于单晶体制备。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种红色类胡萝卜素蛋白的制备方法。
背景技术
藻类和植物可以利用光来进行光合作用。其中蓝细菌和红藻为了能在水中生长，增加捕光效率，其光合作用机体进化出了一种独特的超分子捕光天线复合体，即藻胆体(PBS)。但是在强烈的阳光下暴晒，光合作用系统特别是反应中心又会产生致命的光氧化作用。因此蓝细菌和红藻又进化出一种可调节的光保护作用系统，可避免过量的光对藻胆体造成伤害。这种保护机制称为非光化学淬灭(NPQ)，主要是依靠藻胆体(PBS)和橙色类胡萝卜素蛋白(OCP)之间的相互作用，消耗多余的激发能量。
橙色类胡萝卜素蛋白(OCP)是一种光敏蛋白和光强传感器。在高亮度的蓝光照射下，暗稳态的橙色类胡萝卜素蛋白(OCPO)，会转换成一种红色的激发态(OCPR)，同时触发非光化学淬灭(NPQ)作用，淬灭来自藻胆体的荧光。橙色类胡萝卜素蛋白(OCP)有两个结构域，N端的结构域(NTD)由α-螺旋组成，C端的结构域(CTD)由α-螺旋/β-折叠组成，色素基团与脱辅基蛋白非共价结合。晶体结构表明，橙色类胡萝卜素蛋白(OCP)的光敏化过程，是从暗稳态OCPO转换成激发态OCPR，最终又回到暗稳态OCPO；此过程同时伴随着色素基团位移12埃米。
有两种途径可导致激发态OCPR：一种是使用高浓度的盐进行化学激发，另一种是通过低温进行冷冻激发。暗稳态转换成激发态也可以自然发生，前提是蛋白的聚集形态发生变化，由二聚体变成单体。
橙色类胡萝卜素蛋白(OCP)最初是从极大螺旋藻Spirulina maxima中分离得到，逐渐地很多相似的蛋白也在其他一些蓝细菌中发现。经测定，分离后的橙色类胡萝卜素蛋白(OCP)的吸收光谱特征峰在495nm和467nm。集胞藻Synechocystis PCC6803的天然OCP蛋白是由基因slr1963编码得到，其色素基团为3'-羟基海胆酮，与节螺藻Arthrospiramaxima一样。
由于在体内表达水平较低，从蓝细菌中分离和纯化这些类胡萝卜素蛋白(OCP)需要很长的时间，流程冗长，最终也只有很低的产量。
近些年，出现了基因工程制备生产完整的类胡萝卜素蛋白(OCP)的方法，主要是在大肠杆菌细胞中完成，中间过程包括色素基团的产生和脱辅基蛋白表达，然后组合生成完整的色素蛋白。
一种是三质粒组合表达方案：第一个质粒，pAC-BETA，携带有连续的基因簇(crtB,crtE,crtI,crtY)，通过crtE启动子控制进行组成型表达，用于合成β-胡萝卜素；第二个质粒携带有基因crtO或者crtW，分别用于将胡萝卜素转化成海胆酮(ECN)或者角黄素(CAN)，表达时受阿拉伯糖诱导型启动子araBAD控制；第三个质粒携带有脱辅基蛋白基因ocp及其衍生型，表达时受IPTG诱导的T7启动子控制。三质粒方案需要3种抗性质粒和2种诱导剂(阿拉伯糖和IPTG)。因此制备时基因工程菌筛选难度大，表达制备耗时多。
另一种是双质粒组合表达方案：第一个质粒pACCAR25ΔcrtXZcrtO，携带有基团簇，由来自噬夏孢欧文菌的基因crtB,crtE,crtI,crtY和crtO组成，可以实现海胆酮(ECN)的生物合成。另一个质粒携带有脱辅基蛋白基因ocp，用于合成脱辅基蛋白。双质粒合成方案虽然只需要2种抗性质粒和1种诱导剂(IPTG)，菌株筛选难度相对较低，但是其中的组成型表达质粒pACCAR25ΔcrtXZcrtO拷贝数极低，色素可能产生量不足，导致色素蛋白与脱辅基蛋白比例低下，最终影响到纯化制备效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种类胡萝卜素蛋白的制备方法，具体为一种红色类胡萝卜素蛋白的制备方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种脱辅基蛋白突变体，其特征在于：是将野生型脱辅基蛋白氨基酸序列(SEQ IDNo.1)第288位突变为丙氨酸得到的，脱辅基蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
进一步地，脱辅基蛋白突变体由SEQ ID No.2所示序列N端序列进行修饰得到，N端序列修饰方法选自以下任一种：
a)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入A；
b)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入GSS；
c)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入GSSSQDC。
进一步地，N端序列修饰方法选自以下任一种：
a)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入A-亲和标记序列；
b)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入GSS-亲和标记序列；
c)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入GSS-亲和标记序列-SQDC。
优选的，亲和标记序列为His6-tag；
优选的，脱辅基蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.5中的任一种所示。
编码上述的脱辅基蛋白突变体的序列。
一种红色类胡萝卜素蛋白，红色类胡萝卜素蛋白由色素基团和上述的脱辅基蛋白突变体组合生成。
一种微生物，含有两种质粒，质粒A携带基因a，基因a用于合成β-胡萝卜素，质粒B携带有基因b和基因c，基因b用于将β-胡萝卜素转化成类胡萝卜素，基因c用于合成上述的脱辅基蛋白突变体；优选的，质粒B为高拷贝数的质粒；更优选的，质粒B为高拷贝数的Duet质粒。
进一步地，基因a为基因crtB、crtE、crtI、crtY组成的基因簇。
进一步地，类胡萝卜素为角黄素或海胆酮。
进一步的，基因b为基因crtW或crtO。
一种红色类胡萝卜素的制备方法，其特征在于：使用上述的微生物表达合成类胡萝卜素。
本发明的有益效果是：本发明可制备得到一种新的类胡萝卜素蛋白——红色类胡萝卜素蛋白。本发明中通过双质粒组合表达模式，以单一诱导的方法，在基因工程菌中表达出红色类胡萝卜素蛋白(OCP(W288A))。该方案流程简捷，耗时短，生产周期仅18h左右；OCP(W288A)产量大，相比于现有技术，产量提高10倍；纯度高，纯度比值2.4，可用于单晶体制备。
附图说明
图1为类胡萝卜素蛋白生物合成途径；
图2为野生型OCP及其突变序列同源对比图；
图3为经Ni2+-亲和层析纯化的OCP的SDS-PAGE结果；
图4为经过尺寸排阻色谱纯化的OCP的产量；
图5为经过尺寸排阻色谱纯化的OCP的SDS-PAGE结果；
图6为OCPO光转化前后的吸收光谱图；
图7为OCP(W288A)的吸收光谱图；
图8为经过尺寸排阻色谱纯化的OCP的吸收光谱图；
图9为OCP对藻胆体荧光淬灭效果。
具体实施方式
下面将结合具体实验进一步阐述本发明，应理解，以下实验仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
本发明中类胡萝卜素蛋白生物合成途径如图1所示，本发明中采用双质粒组合表达，携带有基因crtE，crtB，crtI，crtY的pAC-BETA用于表达β-胡萝卜素，携带基因crtW和基因ocp的pETDuet-ocp-crtW用于合成β-胡萝卜素酮化酶和脱辅基蛋白突变体，β-胡萝卜素酮化酶将β-胡萝卜素转化成角黄素(CAN)，CAN与脱辅基蛋白突变体组合形成类胡萝卜素蛋白。
所有实验操作，均参照《分子克隆》等标准实验手册进行。
1)克隆
质粒pAC-BETA(Addgene plasmid#53272)，携带基因crtE,crtB,crtI,crtY。
基因ocp来自集胞藻Synechocystis sp.PCC6803，可通过酶切位点NcoI和NotI插入pET Duet位点1(Site1)。基因crtW来自鱼腥藻Anabaena sp.PCC7210，可通过酶切位点NdeI和XhoI插入pET Duet位点2(Site2)。最终得到质粒pET Duet-ocp-crtW。基因ocp突变序列可根据设计要求，进行全基因合成，然后通过上述酶切位点接入相应的质粒中。
以上两种质粒pAC-BETA和pET Duet-ocp-crtW，可通过感受态细胞制备的方法，导入大肠杆菌BL21细胞。然后经过抗性筛选，得到所需的基因工程菌株。
(2)表达
改造后的大肠杆菌使用Terrific Broth medium(24gL-1酵母提取物,12gL-1胰蛋白胨,0.71molL-1K2HPO4,0.17molL-1KH2PO4,0.4％v/v甘油)进行培养，同时加入抗生素ampicillin(终浓度50mgmL-1)和chloramphenicol(终浓度40mgmL-1)。
培养温度37℃，时长3-4h直到OD600＝0.6～0.8。然后加入终浓度为0.2mM的IPTG，在16℃条件下诱导培养表达。16～18h后，离心收集细胞，离心力12,000×g，时间3min，离心温度4℃。收集时用纯水清洗两遍，可储存于-20℃。
(3)分离与纯化
收集好的细胞用冰预冷的裂解缓冲液((20mMTris,300mMNaCl,10％甘油，pH 8.0)重悬，弱光下采用法式破碎。破碎后的样品12,000×g离心，取上清悬浮液进行层析，层析柱为Ni-ProBond resin(Invitrogen)。清洗杂质时，裂解缓冲液含20mM imidazole。收集样品时，裂解缓冲液含300mM imidazole。然后用缓冲液(20mMTris·HCl，50mMNaCl，pH 8.0)透析12h。
进一步的纯化，可采用分子筛层析柱进行色谱层析。
类胡萝卜素蛋白主要表达方法及产品性质对比结构如下表所示：
a)pAC-BETA质粒携带基因crtE,crtB,crtI,crtY；pCDF(或者pET30)质粒携带基因ocp；pBAD质粒携带基因crtW或者crtO；pETDeuT质粒携带基因ocp和crtW。
b)A：N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入A；GSS：在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入GSS；GSSHHHHHHSQDC：N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入GSSHHHHHHSQDC；HHHHHH为亲和标记序列His6-tag；OCPs与野生型OCP的氨基酸序列变化如图2所示；
c)可见光与紫外吸收比值，OCP采用A476/A280，OCP(W288A)采用A520/A280。
d)Ni:样品通过Ni2+-亲和层析纯化；
SEC:样品通过Ni2+-亲和层析纯化后，再通过分子筛纯化柱色谱纯化。
e)产量计算统一采用Ni2+-亲和层析后获取的蛋白量数据。
通过Ni2+-亲和层析纯化得到的OCPs的SDS-PAGE结果如图3所示，图中从左至右依次为Marker，OCP(A)，OCP(GSS)，OCP(GSS-SQDC)，OCP(A/W288A)，OCP(GSS/W288A)和OCP(GSS-SQDC/W288A)。
经过尺寸排阻色谱纯化的OCPs的产量如图4所示，SDS-PAGE结果如图5所示。图4、5中M：Marker，1：OCP(A/W288A)，2：OCP(GSS/W288A)，3：OCP(GSS-SQDC/W288A)，4：OCP(A)，5：OCP(GSS)和6：OCP(GSS-SQDC)。
(4)可逆光转化与光谱分析
为了实现OCP蛋白从暗稳态到激发态的转化，纯化后的样品，需要在4℃条件下，用白光照射5min，强度5000mmol photons m-1s-1，卤素光源(5100)。色素蛋白的光谱分析采用的设备是型号为UV-9000S(Shanghai Metash Instruments Co.,Ltd)的紫外可见光谱仪。
光转化前后的吸收光谱图如图6所示，其中样品经过Ni2+-亲和层析纯化，检测的缓冲液环境为20mM Tris，300mM NaCl，10％甘油。黑色线为OCPs蛋白在橙色暗稳态下的吸收光谱，红色线为OCPs蛋白在红色激发态下的吸收光谱。
OCP(W288A)的吸收光谱图如图7所示，样品经过Ni2+-亲和层析纯化；检测的缓冲液环境为20mM Tris，300mM NaCl，10％甘油。
经过尺寸排阻色谱进一步纯化的OCPs的吸收光谱图如图8所示。检测的缓冲液环境为20mM Tris，50mM NaCl，室温检测。
(5)藻胆体荧光淬灭
OCP蛋白用白光照射5min，从暗稳态转化到激发态后，与纯化的集胞藻藻胆体共同混匀孵育，缓冲液环境为0.8M phosphate。淬灭实验过程中，需要使OCP蛋白保持在激发态OCPR，因此OCP蛋白实验组须要受到蓝绿光持续照射；而OCP(W288A)蛋白因光谱性质表现类似OCPR，可在暗光条件下完成实验。所有实验组的OCP蛋白(0.48μM)与藻胆体(0.012μM)摩尔比统一为40。
荧光淬灭检测采用的设备是型号为F320的荧光分光光度计(TianJinGangDongSciand Tech Development Company,China)。OCP蛋白浓度是根据其摩尔吸收系数换算得到，OCPO结合色素CAN后在495nm处的摩尔吸收系数ε＝63,000M-1cm-1，OCP(W288A)结合色素CAN后在540nm处的摩尔吸收系数ε＝38,000M-1cm-1。
OCP蛋白对藻胆体荧光淬灭效果图如图9所示。其中被激发的藻胆体(终浓度0.012μM)，分别加入各种OCPs蛋白进行荧光淬灭，淬灭时长5min。荧光检测波长位于663nm，加入OCP系列蛋白淬灭的实验组检测时需要蓝绿光持续照射激发，而加入OCP(W288A)系列蛋白淬灭的实验组须在黑暗环境下检测。OCP及OCP(W288A)突变体系列蛋白均采用本技术表达制备，并通过Ni2+-亲和层析纯化。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州天宝颂原生物科技开发有限公司
<120> 一种红色类胡萝卜素蛋白的制备方法
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
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Claims (9)
1.一种脱辅基蛋白突变体，其特征在于：是将野生型脱辅基蛋白氨基酸序列(SEQ IDNo.1)第288位突变为丙氨酸得到的，脱辅基蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.根据权利要求1所述的脱辅基蛋白突变体，其特征在于：脱辅基蛋白突变体由SEQ IDNo.2所示序列N端序列进行修饰得到，N端序列修饰方法选自以下任一种：
a)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入A；
b)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入GSS；
c)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入GSSSQDC。
3.根据权利要求2所述的脱辅基蛋白突变体，其特征在于：N端序列修饰方法选自以下任一种：
a)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入A-亲和标记序列；
b)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入GSS-亲和标记序列；
c)在N端起始氨基酸甲硫氨酸后插入GSS-亲和标记序列-SQDC；
优选的，亲和标记序列为His6-tag；
优选的，脱辅基蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.5中的任一种所示。
4.编码权利要求1～3任一项所述的脱辅基蛋白突变体的序列。
5.一种红色类胡萝卜素蛋白，其特征在于：红色类胡萝卜素蛋白由色素基团和权利要求1～3任一项所述的脱辅基蛋白突变体组合生成。
6.一种微生物，含有两种质粒，其特征在于：质粒A携带基因a，基因a用于合成β-胡萝卜素，质粒B携带有基因b和基因c，基因b用于将β-胡萝卜素转化成类胡萝卜素，基因c用于合成权利要求1～3任一项所述的脱辅基蛋白突变体；优选的，质粒B为高拷贝数的质粒；更优选的，质粒B为高拷贝数的Duet质粒。
7.根据权利要求6所述的微生物，其特征在于：基因a为基因crtB、crtE、crtI、crtY组成的基因簇。
8.根据权利要求6所述的微生物，其特征在于：类胡萝卜素为角黄素或海胆酮；进一步的，基因b为基因crtW或crtO。
9.一种红色类胡萝卜素的制备方法，其特征在于：使用权利要求6～8任一项所述的微生物表达合成类胡萝卜素。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111500551A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-07 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | Ggpps定向单点突变蛋白ggpps-218 |
| CN111534497A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-14 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | Ggpps定向单点突变蛋白ggpps-161 |
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| CN111593032A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-28 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 酶口袋和酶分子表面的定向五位点突变蛋白ggpps |
| CN114502718A (zh) * | 2019-10-04 | 2022-05-13 | 科纳根公司 | α-紫罗酮和β-紫罗酮的生物合成 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030175854A1 (en) * | 2002-02-28 | 2003-09-18 | Kayser Kevin J. | System and method for gene expression in thermus strains |
| CN105368763A (zh) * | 2014-08-07 | 2016-03-02 | 中央研究院 | 突变型蓝绿藻及提升蓝绿藻的光合生长及生质生产的方法 |
-
2019
- 2019-01-15 CN CN201910034945.8A patent/CN109748956A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030175854A1 (en) * | 2002-02-28 | 2003-09-18 | Kayser Kevin J. | System and method for gene expression in thermus strains |
| CN105368763A (zh) * | 2014-08-07 | 2016-03-02 | 中央研究院 | 突变型蓝绿藻及提升蓝绿藻的光合生长及生质生产的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NIKOLAI N. SLUCHANKO等: "The purple Trp288Ala mutant of Synechocystis OCP persistently quenches phycobilisome fluorescence and tightly interacts with FRP", 《BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA》 * |
| XIAO-DAN LI等: "Optimization of expression of orange carotenoid protein in Escherichia coli", 《PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114502718A (zh) * | 2019-10-04 | 2022-05-13 | 科纳根公司 | α-紫罗酮和β-紫罗酮的生物合成 |
| CN111500551A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-07 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | Ggpps定向单点突变蛋白ggpps-218 |
| CN111534497A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-14 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | Ggpps定向单点突变蛋白ggpps-161 |
| CN111549009A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-18 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 定向三点突变蛋白ggpps-154-161-218 |
| CN111593032A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-08-28 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 酶口袋和酶分子表面的定向五位点突变蛋白ggpps |
| CN111534497B (zh) * | 2020-05-26 | 2022-10-28 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | Ggpps定向单点突变蛋白ggpps-161 |
| CN111593032B (zh) * | 2020-05-26 | 2022-10-28 | 中国烟草总公司郑州烟草研究院 | 酶口袋和酶分子表面的定向五位点突变蛋白ggpps |
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