CN109706103A - 具有高黏附性植物乳杆菌rs-09及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株具有高黏附性植物乳杆菌RS‑09及其应用，属于微生物领域。该菌株分离自苹果汁，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.17118；具有较强的耐酸耐胆碱盐能力，能够长期保存，对人结肠癌细胞HT‑29粘附能力较高，并且能稳定定植于肠道中，其中盲肠定植率最高；能够显著降低血清中的TNF‑α含量，升高血清中的IL‑10及IL‑4含量，具有免疫调节功能；对肠炎沙门氏菌具有较强的抑菌效果，对菌群失调导致的肠炎性疾病具有防治效果，可应用于功能性食品领域，不仅具有实际生产价值，而且对机体健康具有非常重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株性能优良的具有高黏附性的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）及其应用。
背景技术
乳酸菌是动物胃肠道的益生菌群，代谢可产生有机酸、抗菌肽、双乙酰、细菌素等多种天然抑菌活性物质，具有维持肠道正常菌群平衡，增强免疫力等保健功能。随着人们健康意识的提高，对健康食品的要求也逐步提高。乳酸菌作为功能性食品药品的主力军，被认为是一种具有广阔应用前景的天然饲料添加剂和食品添加剂。
沙门氏菌属于肠杆菌科，是常见的引起肠道疾病的人畜共患病原菌。在中国，22.2%的食物中毒是由沙门氏菌引起的，对公共健康造成严重危害。目前，抗生素干预是沙门氏菌病常规的临床治疗方法，但是抗生素使用会伴随着严重的副作用，如耐药性增强。
沙门氏菌防治，不但可以克服抗生素治疗的缺点，副作用低，而且会对机体产生许多其它方面的有益作用；乳酸菌作为益生菌的重要种类之一，具有无污染、无残留、不产生耐药性等特点，同时还可以提高免疫力，增加动物对疾病的抵抗力；因此，应用乳酸菌代替抗生素防治人类或者动物的肠道疾病已成为当前食品和饲料工业中重要的研究领域 。
乳酸菌能产生抗菌肽、细菌素、类细菌拮抗物质和其他具有抑菌作用的代谢物，如有机酸、过氧化氢等，这些物质协同乳酸菌所产生的乳酸菌素来抑制食品中腐败菌和致病菌的生长；乳酸菌发挥益生效应的先决条件是能够在肠粘膜进行粘附，并能进行定植、繁殖；致病菌通常只有粘附于肠道后才能在局部产生毒素或者侵入到肠组织内致病；因此，乳酸菌首先能占据肠道内的粘附位点，从而对致病菌产生竞争排斥置换等作用；所以，筛选高黏附性乳酸菌对微生态制剂的研发与应用具有重要意义。
发明内容
本发明针对上述现有技术中存在的不足，提供一株具有高黏附性植物乳杆菌RS-09菌株。
本发明从苹果汁发酵液中通过菌种分离筛选，得到新的植物乳杆菌。
本发明的另一个目的是提供一株植物乳杆菌RS-09在制备抑制胃肠道致病菌的药物或者食品中的应用。
本发明的另一个目的是提供一株植物乳杆菌RS-09在制备免疫调节药物或保健食品中的应用。
本发明的另一个目的是提供一株荧光标记植物乳杆菌的方法，跟踪分析植物乳杆菌在肠道内粘附情况及定植率。
所述的植物乳杆菌RS-09能升高血清中的IL-10及IL-4含量，降低血清中的TNF-α含量；白细胞介素10（IL-10）是一种高效的抗炎因子，通过阻断促炎因子、趋化因子等，发挥抗炎症的作用；白细胞介素4（IL-4）的生物作用，包括刺激活化B细胞和T细胞增殖、CD4+T细胞分化成II型辅助T细胞，在调节体液免疫和适应性免疫中起关键作用等；TNF-α是一种炎症因子，在调节免疫、炎症反应、机体防御中起关键作用；因此，植物乳杆菌RS-09具有调节免疫的功能。
为实现上述目的，所述植物乳杆菌RS-09的分离筛选步骤如下：
步骤一，取苹果发酵汁稀释液涂布于乳酸菌选择性培养基MRS培养基，37℃厌氧培养48-72h，挑取平板上单菌落，在MRS固体培养基上划线纯化，得到纯的菌落；
步骤二，经过大量筛选，生理生化及16S鉴定，分离筛选出植物乳杆菌，申请人将其命名为植物乳杆菌RS-09，该菌株纯培养物于2019年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO.17118；
步骤三，纯化后的植物乳杆菌采取冷冻干燥的方式进行-80℃冻存。
所述植物乳杆菌RS-09的生物学特性：该菌株革兰氏阳性，产酸能力强，具有较强的耐酸耐胆碱能力。
所述植物乳杆菌RS-09在肠道各部位具有较强的粘附性及定植率，粘附率高，且能稳定定植。
所述植物乳杆菌RS-09对大肠杆菌、沙门氏菌具有明显抑菌作用。
所述植物乳杆菌RS-09的应用，包括用于制备动物饲料添加剂，用于制备调节畜禽肠道疾病的调节剂，用于制备动物抗生素替代品或者用于制备致病性动物源病菌抑菌剂。
所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）RS-09可在致病性动物源病原菌中应用 。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：1、菌株分离自苹果发酵液中，可食用，也可以在动物饲料添加剂及畜禽养殖中应用，保证了产品的安全性；2、具有较强的产酸能力，能够耐受胃肠环境中低pH和高胆碱盐的浓度，在肠道中存活，调节肠道菌群平衡，发挥优良的益生性能；3、在肠道具有较强的粘附能力，且在48h后稳定定植、繁殖，长期发挥益生作用；4、可以作为动物饲料添加剂使用，绿色、安全、无毒、低耐药性、无副作用，并可以提高动物的免疫能力，增强动物对疾病的抵抗力；5、可以替代抗生素或部分替代抗生素应用于畜禽养殖，以减少抗生素长期滥用引起的细菌耐药性、环境中药物残留和食品安全等方面的问题。
附图说明
图1为本发明的植物乳杆菌RS-09革兰氏染色光学显微镜照片示意图。
图2为本发明的植物乳杆菌RS-09扫描电镜照片示意图。
图3为本发明的植物乳杆菌RS-09细胞的粘附能力示意图。
图4为本发明的植物乳杆菌RS-09细胞的阴性对照图。
图5为本发明的植物乳杆菌RS-09细胞的沙门氏菌阳性对照图。
图6为本发明的植物乳杆菌RS-09对沙门氏菌的排斥实验图。
图7为本发明的植物乳杆菌RS-09对沙门氏菌的竞争实验图。
图8为本发明的植物乳杆菌RS-09对沙门氏菌的置换实验图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）RS-09的分离筛选步骤如下：
步骤一，取苹果发酵汁稀释液涂布于乳酸菌选择性培养基MRS培养基，37℃厌氧培养48-72h，挑取平板上单菌落，在MRS固体培养基上划线纯化，得到纯的菌落；
步骤二，经过大量筛选，生理生化及16S鉴定，分离筛选出植物乳杆菌，申请人将其命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）RS-09，该菌株纯培养物于2019年01月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.17118；
步骤三，纯化后的植物乳杆菌采取冷冻干燥的方式进行-80℃冻存。
分离得到的所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）RS-09具有如下生物学特性：
该菌株革兰氏阳性，产酸能力强，具有较强的耐酸耐胆碱能力，在pH2.5条件下，37℃孵育2h，活菌数高达8.23×108CFU/mL；在0.3%胆盐浓度条件下，37℃孵育2h，活菌数高达9.68×108CFU/mL。
所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）RS-09菌株在肠道各部位具有较强的粘附性及定植率，用cFDA-SE荧光标记植物乳杆菌，喂服小鼠后，在不同时间点检测植物乳杆菌定植情况及肠道分布情况，在48h，盲肠部分粘附率最高，并能稳定定植。
所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）RS-09菌株对大肠杆菌、沙门氏菌具有明显抑菌作用。
所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）RS-09的应用，包括用于制备动物饲料添加剂，用于制备调节畜禽肠道疾病的调节剂，用于制备动物抗生素替代品或者用于制备致病性动物源病菌抑菌剂。
所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）RS-09可在致病性动物源病原菌中应用 。
实施例1
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）RS-09的分离、纯化与鉴定
植物乳杆菌菌株分离纯化：将苹果汁发酵液混匀，取发酵液5mL，10倍系列稀释至10-6，每个稀释浓度取200μL涂布于含1% CaCO3乳酸菌选择性培养基MRS培养基上，37℃厌氧罐中培养48h，挑取平板上单菌落，在MRS固体培养基上划线纯化，37℃厌氧罐中培养48h，得到纯的菌落；对纯化后菌落进行革兰氏染色鉴定；菌株在含CaCO3的MRS培养基上菌落直径1-2mm、白色、凸起、有溶钙圈；该菌株革兰氏阳性，圆端直杆状；菌体革兰氏染色特性如图1所示。扫描电镜鉴定图片如图2所示。
植物乳杆菌菌株筛选鉴定：对获得的菌株RS-09利用微生物鉴定系统（梅里埃，VITEK 2）和16S rDNA测序进行鉴定；微生物系统鉴定结果如表1所示；利用已发表的16S通用引物（27F和1492R，引物序列为27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）对菌株RS-09的16S rDNA基因序列进行扩增和测序，PCR扩增产物送华大基因有限公司测序，菌株RS-09的16S rDNA的核苷酸序列为序列表中的序列1；经过16S rDNA基因比对，与Genebank中的Lactobacillus plantarum菌株比对相似率达100%；结合微生物系统鉴定，RS-09为一株植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌RS-09；植物乳杆菌RS-09的16S rDNA如序列表所示。
表1 植物乳杆菌RS-09微生物系统鉴定结果
| 菌株 | dGAL | LeuA | ELLM | PheA | ProA | PyrA | dCEL | TyrA | APPA | OPS |
| RS-09 | + | + | - | + | - | - | + | - | - | - |
| 菌株 | dGLU | dMNE | dMAL | SAC | ARB | NAG | BGLUi | URE | BGURi | AARAF |
| RS-09 | + | + | + | + | + | + | （+） | - | - | - |
| 菌株 | BGALi | AARA | AGALi | BMAN | ARG | PVATE | MTE | ESC | BdFUC | dXYL |
| RS-09 | + | - | - | - | - | - | + | + | - | - |
| 菌株 | BNAGi | AMANi | AIFUC | PHOS | IARA | dRIB2 | GRAM | MORPH | AERO | |
| RS-09 | - | - | - | - | - | + | + | - | - |
注：“+”代表阳性反应；“-”代表阴性反应。
实施例2
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）RS-09粘附能力测定
取无菌6孔板，每孔放置无菌盖玻片，将传代一次浓度为1×105个/mL的人结肠癌细胞系HT-29接种至6孔板，5% CO2，37℃环境条件下培养过夜，至单层细胞，弃去培养液，用DMEM溶液轻轻洗涤三次，每孔加入200μL的用DMEM溶液悬浮（不含抗生素）的植物乳杆菌菌悬液（5×107CFU/孔）和1800μL DMEM培养液，重复三个孔，置37℃、5%CO2 培养箱中培养2h后，弃上清，无菌PBS清洗三次，每孔加入400μL0.25%胰酶消化5min，然后加入400μL的含10% 胎牛血清的DMEM溶液终止消化；取细胞玻片，进行革兰氏染色，显微镜下随机选取20个视野，对视野中的细胞上粘附的细菌总数和细胞数进行计数，并测定粘附指数，实验结果如图3所示，RS-09对人结肠癌细胞系HT-29粘附指数为4.97，具有一定的细胞粘附能力。
实施例3
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）RS-09肠道内定植情况的动态分布
cFDA-SE标记植物乳杆菌RS-09：取2×108CFU/mL的RS-09菌液200ml，在4℃下，4000rpm离心10min，用冷的PBS（pH7.2）洗涤2遍，重悬于20mL终浓度为20μmol/L cFDA-SE的溶液中，37℃避光孵育20min，PBS洗涤3遍，去除未结合的cFDA-SE分子，PBS重悬至终浓度为2×109CFU/mL。
植物乳杆菌RS-09小鼠体内肠道不同部分定植情况动态分布：选取4～5周龄SPF级别的BALB/c小鼠54只，灌服cFDA-SE标记的植物乳杆菌悬液（2×109CFU/mL），每只小鼠500μL；在灌服后5个不同时间点（2h/12h/24h/48h/96h）取小鼠肠道，每个时间点3只小鼠；及时将十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠各肠段放置于冰上，无菌操作，用3ml PBS反复冲洗各肠段内容物于15mL离心管中，用400目尼龙网过滤，去除组织和颗粒物；取过滤后的菌液离心，4℃，5000rpm，离心10min，弃上清，无菌PBS洗三次，取1mL无菌PBS重悬，流式细胞仪在488nm激发光下进行检测，各肠段荧光标记的RS-09阳性率代表RS-09在肠道内定植情况。
植物乳杆菌RS-09体内标记模型建立成功，实验结果如表2所示，结果表明植物乳杆菌RS-09在肠道内具有较高的定植率，并能在48h后稳定定植并进行繁殖。
表2 流式细胞仪检测RS-09在小鼠肠道不同部位阳性率
| 2h | 12h | 24h | 48h | 96h | |
| 十二指肠 | 11.30% | 31.80% | 6.53% | 3.98% | 10.50% |
| 空肠 | 54.50% | 49.50% | 26.50% | 23.40% | 54.50% |
| 回肠 | 77.40% | 46.30% | 36.40% | 19.20% | 40.60% |
| 盲肠 | 65.40% | 81.00% | 54.80% | 38.40% | 69.40% |
| 结肠 | 66.20% | 69.10% | 64.40% | 33.10% | 75.30% |
| 直肠 | 46.50% | 71.20% | 44.50% | 30.30% | 71.50% |
实施例4
植物乳杆菌RS-09对肠炎沙门氏菌粘附抑制作用
取无菌24孔板，将传代一次浓度为1×105个/mL的人结肠癌细胞系HT-29接种至24孔板，5% CO2，37℃环境条件下培养过夜，至单层细胞；设置三个处理，通过荧光标记法，采用竞争、排斥和置换试验来研究植物乳杆菌RS-09对沙门氏菌的粘附抑制作用。
竞争试验：HT-29细胞与植物乳杆菌RS-09（未标记）、沙门氏菌（GFP标记）在5%CO2，37℃环境条件下共孵育1h，弃上清，PBS洗涤三次，每孔加入200μL 0.25%胰酶消化5min，然后加入400μL的含10% 胎牛血清的DMEM溶液终止消化。
排斥试验：HT-29细胞与植物乳杆菌RS-09（未标记）37℃环境条件下共孵育1h，弃上清，PBS洗涤1次，加入沙门氏菌（GFP标记）在5% CO2，37℃环境条件下共孵育1h，弃上清，PBS洗涤三次，每孔加入200μL 0.25%胰酶消化5min，然后加入400μL的含10% 胎牛血清的DMEM溶液终止消化。
置换试验：HT-29细胞与沙门氏菌（GFP标记）37℃环境条件下共孵育1h，弃上清，PBS洗涤1次，加入植物乳杆菌RS-09（未标记）在5% CO2，37℃环境条件下共孵育1h，弃上清，PBS洗涤三次，每孔加入200μL 0.25%胰酶消化5min，然后加入400μL的含10% 胎牛血清的DMEM溶液终止消化。
以上处理结束后，收集液体，离心弃上清，0.5mL PBS重悬，流式细胞仪检测阳性率，结果如图4-图8所示，结果表明加入植物乳杆菌RS-09后，沙门氏菌阳性率降低，植物乳杆菌RS-09可以通过排斥、竞争或置换，抑制沙门氏菌粘附肠上皮细胞。
实施例5
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）RS-09对小鼠免疫功能的调节
选取4～5周龄BALB/C小鼠作为动物模型，分为两组，每组5只小鼠；空白对照组：从试验开始至结束喂服500μL无菌PBS；植物乳杆菌组：灌服500μL菌悬液（5×109CFU/mL），连续灌服10天；10天后，眼球取血，每只小鼠取血至1.5ml EP管中，室温放置30min血清析出后，3000rpm，4℃离心20min，取血清分装，冻存于-80℃，进行后续ELISA实验。
采用上海依科赛生物制品有限公司ELISA试剂盒进行TNF-α、IL-4及IL-10的检测，结果如表3所示；通过结果可以看出，植物乳杆菌RS-09可以降低炎症因子TNF-α因子表达，升高抗炎因子IL-4及IL-10的表达，对动物具有免疫调节的功能。
表3 ELISA试剂盒检测血清中免疫因子
| IL-10（pg/mL） | IL-4（pg/mL） | TNF-α（pg/mL） | |
| 空白对照组 | 121.24 | 1.75 | 281.61 |
| 植物乳杆菌 | 135.52 | 17.43 | 114.24 |
实施例6
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）RS-09对小鼠免疫功能的调节
选取4～5周龄BALB/C小鼠作为动物模型，分为两组，每组5只小鼠；空白对照组：从试验开始至结束喂服500μL无菌PBS；植物乳杆菌组：灌服500μL菌悬液（5×1010CFU/mL），连续灌服10天；10天后，眼球取血，每只小鼠取血至1.5ml EP管中，室温放置30min血清析出后，3000rpm，4℃离心20min，取血清分装，冻存于-80℃，进行后续ELISA实验。
采用上海依科赛生物制品有限公司ELISA试剂盒进行TNF-α、IL-4及IL-10的检测，结果如表4所示；通过结果可以看出，植物乳杆菌RS-09可以降低炎症因子TNF-α因子表达，升高抗炎因子IL-4及IL-10的表达，对动物具有免疫调节的功能。
表4 ELISA试剂盒检测血清中免疫因子
| IL-10（pg/mL） | IL-4（pg/mL） | TNF-α（pg/mL） | |
| 空白对照组 | 114.5 | 2.75 | 261.58 |
| 植物乳杆菌 | 148.71 | 15.69 | 107.61 |
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 鲁东大学
<120> 具有高黏附性植物乳杆菌RS-09及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1386
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400> 2
tgttacaaac tctcatggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg 60
cggcatgctg atccgcgatt actagcgatt ccgacttcat gtaggcgagt tgcagcctac 120
aatccgaact gagaatggct ttaagagatt agcttactct cgcgagttcg caactcgttg 180
taccatccat tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca 240
tccccacctt cctccggttt gtcaccggca gtctcaccag agtgcccaac ttaatgctgg 300
caactgataa taagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc 360
tgacgacaac catgcaccac ctgtatccat gtccccgaag ggaacgtcta atctcttaga 420
tttgcatagt atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgta gcttcgaatt aaaccacatg 480
ctccaccgct tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt tcagccttgc ggccgtactc 540
cccaggcgga atgcttaatg cgttagctgc agcactgaag ggcggaaacc ctccaacact 600
tagcattcat cgtttacggt atggactacc agggtatcta atcctgtttg ctacccatac 660
tttcgagcct cagcgtcagt tacagaccag acagccgcct tcgccactgg tgttcttcca 720
tatatctacg catttcaccg ctacacatgg agttccactg tcctcttctg cactcaagtt 780
tcccagtttc cgatgcactt cttcggttga gccgaaggct ttcacatcag acttaaaaaa 840
ccgcctgcgc tcgctttacg cccaataaat ccggacaacg cttgccacct acgtattacc 900
gcggctgctg gcacgtagtt agccgtggct ttctggttaa ataccgtcaa tacctgaaca 960
gttactctca gatatgttct tctttaacaa cagagtttta cgagccgaaa cccttcttca 1020
ctcacgcggc gttgctccat cagactttcg tccattgtgg aagattccct actgctgcct 1080
cccgtaggag tttgggccgt gtctcagtcc caatgtggcc gattaccctc tcaggtcggc 1140
tacgtatcat tgccatggtg agccgttacc ccaccatcta gctaatacgc cgcgggacca 1200
tccaaaagtg atagccgaag ccatctttca agctcggacc atgcggtcca agttgttatg 1260
cggtattagc atctgtttcc aggtgttatc ccccgcttct gggcaggttt cccacgtgtt 1320
actcaccagt tcgccactca ctcaaatgta aatcatgatg caagcaccaa tcaataccag 1380
agttcg 1386
Claims (11)
1. 一种植物乳杆菌株，其特征在于，该菌株是从苹果汁发酵液中通过菌种分离筛选而得，命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）RS-09，该菌株已于2019年1月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.17118。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌株，其特征在于，所述菌株的分离筛选步骤如下：
步骤一，取苹果发酵汁稀释液涂布于乳酸菌选择性培养基MRS培养基，37℃厌氧培养48-72h，挑取平板上单菌落，在MRS固体培养基上划线纯化，得到纯的菌落；
步骤二，经过大量筛选，生理生化及16S鉴定，分离筛选出植物乳杆菌；
步骤三，纯化后的植物乳杆菌采取冷冻干燥的方式进行-80℃冻存。
3.根据权利要求1所述的植物乳杆菌株，其特征在于，所述菌株能升高血清中的IL-10及IL-4含量，降低血清中的TNF-α含量，减少肠道沙门氏菌定植数量。
4.一种菌剂，其特征在于，活性成分中含有权利要求3所述的植物乳杆菌株。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述植物乳杆菌株的浓度为108CFU/g以上。
6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于，所述植物乳杆菌株的浓度为109-1010CFU/g。
7.根据权利要求4-6中任意一项所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂制成药物，药物的剂型选自片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂或者冷干制剂中的至少一种。
8.根据权利要求4-6中任意一项所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂制成药物，药物采用冷冻干燥工艺制备。
9.一种组合物，其特征在于，成分中含有权利要求3所述的植物乳杆菌株。
10.一种如权利要求9所述的组合物在制备抑制胃肠道致病菌的药物或食品中的应用。
11.一种如权利要求9所述的组合物在制备免疫调节药物或保健食品中的应用。
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2019
- 2019-03-19 CN CN201910205945.XA patent/CN109706103B/zh active Active
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