CN109652376B

CN109652376B - 一种用于卵巢癌组织3d培养的培养基

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Publication number: CN109652376B
Application number: CN201910013937.5A
Authority: CN
Inventors: 王勇; 郑鸿平; 黄敏
Original assignee: Accurate International Biotechnology Guangzhou Co ltd
Current assignee: Accurate International Biotechnology Guangzhou Co ltd
Priority date: 2019-01-08
Filing date: 2019-01-08
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2039-01-08
Also published as: CN109652376A

Abstract

本发明公开了一种用于卵巢癌组织3D培养的培养基，所述培养基含有以下成份：细胞因子B27、N‑乙酰半胱氨酸、R‑spondin 1、A83‑01、表皮生长因子、谷氨酰胺、N2Supplement、雌激素、孕酮、维生素E。本发明的培养基包括了多种针对于及卵巢癌组织细胞培养所需要的细胞因子，信号通路调控因子，各种细胞因子及调控因子相互直接密切影响，协调配合，使得卵巢癌组织细胞在培养过程中能够更好的表现出其固有的活性特征，实现高度近似于活体卵巢癌组织的综合特性，用此培养基3D培养的卵巢肿瘤细胞，成团聚集，中间缺氧，类似于卵巢肿瘤组织。

Description

一种用于卵巢癌组织3D培养的培养基

技术领域

本发明属于生物医药领域，公开了一种用于卵巢癌组织3D培养的培养基。

背景技术

目前抗肿瘤药物筛选评价的体外方法主要是肿瘤细胞的2D培养系统，体内筛选评价方法主要使用的是动物模型。2D培养时，肿瘤细胞在形态、分化、扩增、对刺激的代谢反应以及基因蛋白质表达等方面均与其在体内的状态存在着很大的不同，对于动物评价体系，接种成功率低，实验周期长，还由于与人类存在着较大的种属差异，也不能完全反映药物在人体内的代谢过程、药效作用和毒副作用。

人源组织类器官培养技术作为近来肿瘤学研究的新手段，体外3D培养条件下使用成熟人体细胞培养人体组织类器官，这种器官几乎保留了来源人体组织相同的遗传学特征，可在体外表现出与体内细胞相似的遗传物质以及结构的稳定性。目前，科学家已成功在体外使用使用成熟肝脏、小肠、消化道组织细胞培养出肝脏类器官及肺组织器官等，并利用这一技术在相关领域开展进行了多种研究。相对于传统细胞培养，这一技术可以为我们提供充足的遗传稳定、均一的体外培养的组织细胞，并将可能对直接研究基因在人体细胞中的作用提供巨大的帮助。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于卵巢癌组织3D培养的培养基。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于卵巢癌组织3D培养的培养基，所述培养基含有以下成份：细胞因子B2750倍稀释、N-乙酰半胱氨酸0.8～1.2mM、R-spondin 1 200～250ng/ml、A83-01 150～250nM、表皮生长因子45～55ng/ml、谷氨酰胺100倍稀释、N2Supplement 100X稀释、雌激素0.5～1μM，孕酮1～10ng/ml，维生素E 1～5mM。

优选的，所述培训基还含有以下成份：Noggin 90～110ng/ml、FGF 10成纤维细胞生长因子40～60ng/ml、烟酰胺5～20mM、Y-27632 5～15μM、Gastrin 0.5～1.5nM、bFGF 0～5ng/ml。

优选的，所述谷氨酰胺为含有L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺稳定形式的二肽。

优选的，所述表皮生长因子为EGF。

优选的，所述成纤维细胞生长因子为FGF 10。

本发明的卵巢癌组织类器官的培养基针对于卵巢癌组织来源细胞的培养生长特点，选用了多种细胞因子成份按照一定的比例进行调和，经过调和的培养基中细胞因子，信号通路调控因子含量适宜，卵巢癌细胞能够有效的在3D环境中形成类器官。本发明的培养基，可以有效的维持组织细胞特异性、干细胞特性、基因分型高度一致，组织形态也高度相似。除了满足科学研究的需要，在临床用药指导方面，目前卵巢癌患者没有合适的靶向药物，活检样本的体外3D培养为患者的药物用药指导提供了很好的一个有益的选择。此外，本发明的培养基可以完成卵巢癌组织的传代培养，达到大规模复制卵巢癌组织类器官的需求，控制培养得到的类器官具有高度的一致性。卵巢癌肿瘤类器官3D培养模式图见图1。

本发明的有益效果是：

本发明的培养基包括了多种针对于人卵巢癌组织细胞培养所需要的细胞因子，信号通路调控因子，各种细胞因子及调控因子相互直接密切影响，协调配合，使得卵巢癌组织细胞在培养过程中能够更好的表现出其固有的活性特征，实现高度近似于活体卵巢癌组织的综合特性。用此培养基3D培养的卵巢肿瘤细胞，成团聚集，中间缺氧，类似于卵巢肿瘤组织。

附图说明

图1为卵巢癌肿瘤类器官3D培养模式图；

图2为新鲜卵巢癌组织通过胶原酶消化后第10天3D类器官培养的效果图；

图3为新鲜卵巢癌组织通过胶原酶消化后第2、6、14天3D类器官培养的效果图；

图4为关键成份重要性研究，14天3D卵巢癌类器官培养的效果图。

注：图3中从左至右的3张图片，依次为第2、6、14天的效果图；图4中从左至右的4张图片，依次为无N2Supplement，无维生素E，无雌激素，无孕酮、及本发明正常培养基(实施例1的培养基)的效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例所用产品购置信息如下，但并不局限于同产家。

B27:购自GIBCO公司，即B27补充剂，可维持原代大鼠、小鼠和人PSC来源及胚胎来源的神经元，使人PSC来源和胚胎来源的神经干细胞(NSC)分化成神经元。

N-acetylcysteine:购自SIGMA公司，即：N-乙酰半胱氨酸。

EGF:购自R&D公司，即：表皮生长因子。

Noggin，购自Peprotech公司，即：细胞生长蛋白成分。

A83-01，购买自Tocris Bioscience。

FGF10:购自Peprotech公司，即：成纤维细胞生长因子。

Nicotinamide：购自SIGMA公司，即：烟酰胺。

Y-27632：购自Abmole Bioscience，即：ROCK特异性通路阻断剂。

Glutamax，即：谷氨酰胺，购自GIBCO公司。

N-2Supplement(100X):货号：17502001，购自Life Technologies。

bFGF，购自Peprotech公司。

Gastrin，购自美国Sigma公司，即：人胃泌素。

维生素E:购自SIGMA雌激素，购自SIGMA，E8875-1G。

孕酮:购自SIGMA公司。

实施例1

一种用于卵巢癌组织3D培养的培养基，其配方如下：细胞因子B27 50倍稀释；N-acetylcysteine 1mM；EGF 50ng/ml；Noggin 100ng/ml；R-spondin 1 250ng/ml；A83-01200n M；FGF 10 50ng/ml；烟酰胺10mM；Y-27632(即：ROCK特异性通路阻断剂)10μM；glutamax100倍稀释；N2Supplement 100倍稀释；b FGF 1ng/ml，Gastrin 1nM；维生素E3mM；雌激素0.5μM；孕酮5ng/ml。

实施例2

一种用于卵巢癌组织3D培养的培养基，其配方如下：细胞因子B27 50倍稀释；N-acetylcysteine 1.2mM；EGF 45ng/ml；Noggin 90ng/ml；R-spondin 1 220ng/ml；A83-01150n M；FGF 10 60ng/ml；烟酰胺20mM；Y-27632(即：ROCK特异性通路阻断剂)15μM；glutamax100倍稀释；N2Supplement 100倍稀释；b FGF 5ng/ml；Gastrin 0.5nM；维生素E5mM；雌激素1μM；孕酮1ng/ml。

实施例3

一种用于卵巢癌组织3D培养的培养基，其配方如下：细胞因子B27 50倍稀释；N-acetylcysteine 0.8mM；EGF 55ng/ml；Noggin 110ng/ml；R-spondin 1 200ng/ml；A83-01250n M；FGF10 40ng/ml；烟酰胺5mM；Y-27632(即：ROCK特异性通路阻断剂)5μM；glutamax100倍稀释；N2Supplement 100倍稀释；b FGF 3ng/ml；Gastrin 1.5nM；维生素E 1mM；雌激素0.8μM；孕酮10ng/ml。

实施例4

一种用于卵巢癌组织3D培养的培养基，其配方如下：细胞因子B27 50倍稀释；N-acetylcysteine 0.9mM；EGF 48ng/ml；Noggin 95ng/ml；R-spondin 1 230ng/ml；A83-01230n M；FGF 10 45ng/ml；烟酰胺10mM；Y-27632(即：ROCK特异性通路阻断剂)10μM；glutamax100倍稀释；N2Supplement 100倍稀释；Gastrin 1nM；维生素E 3mM；雌激素0.8μM；孕酮8ng/ml。

实施例5

一种用于卵巢癌组织3D培养的培养基，其配方如下：细胞因子B27 50X稀释、N-acetylysteine 1mM、R-spondin 1 250ng/ml、A83-01 250nM、EGF 45ng/ml、谷氨酰胺100X稀释、N2Supplement 100X稀释、雌激素1μM，孕酮8ng/ml，维生素E 5mM。

实施例6

人卵巢癌组织类器官培养：

取小鼠卵巢癌组织冰上剪碎，加入10ml胶原酶重悬，转移至37℃、220rpm摇床消化20min.用100μm细胞筛网过滤细胞，滤液加入10ml DMEM/F12终止消化，离心(4℃，200g，5min)，去除上清。

取5ml红细胞裂解液重悬细胞5min。然后离心(4℃，200g，5min)，去除上清，加入10ml DMEM/F12重悬，离心(4℃，200g，5min)，去除上清。细胞计数，混合matrigel，20000细胞每40ul，滴于48孔孔正中，放置培养皿至37℃，5％CO₂中10min，凝固Marteigel。每孔加入150ul实施例1制备的条件培养基，37℃，5％CO₂。

细胞培养箱培养。每间隔3-4天更换一次培养基，使用实施例1制备的条件培养基。

收集类器官，滴入事先准备好的OCT包埋剂中，-80℃冰冻后切片(染色常规)，鉴定细胞来源。免疫组化染色，Q-PCR检测组织中的细胞来源卵巢组织相关基因的表达。

卵巢癌肿瘤类器官3D培养模式图见图1。使用实施例1培养基3D培养卵巢癌，新鲜卵巢癌组织通过胶原酶消化后第10天3D类器官培养的效果图见图2；新鲜卵巢癌组织通过胶原酶消化后第2、6、14天3D类器官培养的效果图见图3，可见卵巢癌细胞成团聚集，类似于卵巢肿瘤组织。

对比例1

对比其他的普通培养基

采用现有的普通的培养基(DMEM+10％FBS)3D条件下培养的分散的卵巢组织细胞，37℃，5％CO₂细胞培养箱培养。每间隔2-3天更换一次培养基，结果卵巢组织细胞在培养过程中细胞附着在培养皿底部，与一般细胞培养结果类似，无法形成有结构的、多细胞成份的类器官。

对比例2

对比N2Supplement的条件培养基(其它成份及用量同实施例1)

采用N2Supplement的条件培养基，37℃，5％CO₂细胞培养箱培养，卵巢组织类器官形成缓慢，Q-PCR检测卵巢组织相关基因表达发现其中内分泌相关基因水平低于来源的卵巢组织，且传代次数有限(10代之后生长缓慢)，效果如图4从左至右第1张图片。

对比例3

对比无维生素E的条件培养基(其它成份及用量同实施例1)

采用无维生素E的条件培养基，37℃，5％CO₂细胞培养箱培养，卵巢组织类器官形成缓慢，卵巢癌类器官生长缓慢，且传代次数有限(10代之后生长缓慢)，效果如图4从左至右第2张图片。

对比例4

对比雌激素的条件培养基(其它成份及用量同实施例1)

采用无雌激素的条件培养基，37℃，5％CO₂细胞培养箱培养，卵巢癌组织类器官形成缓慢，卵巢癌类器官生长缓慢，且传代次数有限(10代之后生长缓慢)，冻存后复苏后难生存。效果如图4从左至右第3张图片。

对比例5

对比无孕酮的条件培养基(其它成份及用量同实施例1)

采用无孕酮的条件培养基，37℃，5％CO₂细胞培养箱培养，效果如图4所示从左至右第4张图片，卵巢癌类器官几乎不生长。

由图4可知，N2Supplement、维生素E、雌激素、孕酮具有协同作用，可用于卵巢癌组织3D培养。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于卵巢癌组织3D培养的培养基，所述培养基含有以下成份：细胞因子B27 50倍稀释、N-乙酰半胱氨酸0.8～1.2mM、R-spondin 1 200～250ng/ml、A83-01 150～250nM、表皮生长因子45～55ng/ml、谷氨酰胺100倍稀释、N2 Supplement 100倍稀释、雌激素0.5～1μM、孕酮1～10ng/ml、维生素E 1～5mM、Noggin 90～110ng/ml、FGF 10成纤维细胞生长因子40～60ng/ml、烟酰胺5～20mM、Y-27632 5～15μM、Gastrin 0.5～1.5nM、bFGF 0～5ng/ml。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述谷氨酰胺为含有L-谷氨酰胺、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺稳定形式的二肽。