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CN109633043A - 一种红景天注射液hplc指纹图谱的建立方法及其标准图谱 - Google Patents

一种红景天注射液hplc指纹图谱的建立方法及其标准图谱 Download PDF

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CN109633043A
CN109633043A CN201910147591.8A CN201910147591A CN109633043A CN 109633043 A CN109633043 A CN 109633043A CN 201910147591 A CN201910147591 A CN 201910147591A CN 109633043 A CN109633043 A CN 109633043A
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贺雷
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孟阳
尹婷婷
高晓旭
周建宇
王永亮
崔立萍
张仁波
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Abstract

本发明为一种红景天注射液HPLC指纹图谱的建立方法及其标准图谱，涉及中药指纹图谱分析方法，具体涉及红景天注射液HPLC指纹图谱测定方法，及其所得到的红景天注射液制剂指纹图谱。其步骤如下：(1)供试品溶液的制备。参照物溶液制备。测定方法：取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色图谱。将所得色谱图和对照指纹图谱对照，相似度大于0.90为合格品。对照指纹图谱共有6个共有峰：峰1，没食子酸；峰2，对羟基苯甲酸；峰3，酪醇；峰5（Ｓ），红景天苷；峰6，对香豆酸。通过研究，弥补了现有质量控制技术不足的缺点，使红景天注射液制剂质量控制技术更为完善，也更为科学。

Description

一种红景天注射液HPLC指纹图谱的建立方法及其标准图谱
技术领域
本发明涉及中药指纹图谱分析方法，具体涉及红景天注射液HPLC指纹图谱测定方法，及其所得到的红景天注射液制剂指纹图谱。
背景技术
在现有技术中，心脑血管疾病是近年来严重危害人类健康的常见疾病。由于人类生活质量的提高，心脑血管疾病呈上升趋势。治疗心脑血管疾病，中药虽然单靶点作用强度弱于西药，但多途径、多靶点、动态整体治疗、毒副作用小的优势则远胜于西药，尤其是疗效确切的中成药的综合治疗效果要优于西药。
中药注射剂为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，但现行的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等方法都不足以解决这一问题。
大株红景天注射液是由大株红景天单味中药组成，是通化玉圣药业有限公司生产独家产品。功能与主治：活血化瘀。冠心病稳定型劳累性心绞痛。症见：胸部刺痛，绞痛，固定不移，痛引肩背及臂内侧，胸闷，心悸不宁，唇舌紫暗，脉细涩。用法用量：静脉滴注。一次10ml加入250ml氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液中，一日一次，10天为一疗程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种红景天注射液HPLC指纹图谱测定方法及其所得到的红景天注射液制剂指纹图谱。本发明通过对红景天注射液HPLC指纹图谱的研究，为红景天注射液的质量控制提供一种新的方法，弥补了现有质量控制技术不足的缺点，使红景天注射液制剂质量控制技术更为完善，也更为科学。
本发明技术方案是：
一种红景天注射液的指纹图谱的HPLC检测方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密量取本品0.5ml，于10ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；参照物溶液具体为，取红景天苷对照品，精密称定，加水制成每1ml含红景天苷0.05mg的溶液，作为参照物溶液。
(2)测定方法：取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色图谱。其中色谱条件为：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.07%磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，柱温30℃，检测波长为278nm，流速为0.8ml/min，理论板数按红景天苷峰计算，应不低于30000。
(3) 将所得色谱图和对照指纹图谱对照，相似度大于0.90为合格品，相似度评价采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价。
（4）对照指纹图谱共有6个共有峰（见图2）：峰1，没食子酸；峰2，对羟基苯甲酸；峰3， 酪醇；峰5（Ｓ）， 红景天苷；峰6， 对香豆酸。
上述方案中，
步骤(1)中所述对照品溶液的浓度均为50μg/mL。
步骤(2)中所述色谱柱为：Agilent XDB-C18色谱柱，柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为5μm。
步骤(2)中所述分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl,注入液相色谱仪，测定，记录60分钟内的色谱峰。
优选，红景天注射液的指纹图谱的HPLC检测方法，其特征在于步骤如下：
(1)参比对照品溶液的制备：
参照物溶液具体为，取红景天苷对照品，精密称定，加水制成每1ml含红景天苷0.05mg的溶液，作为参照物溶液。
(2)供试品溶液的制备：精密量取本品0.5ml，于10ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
(3)分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，记录60min的色谱图，即得。
其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂， Agilent XDB-C18色谱柱，柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为5μm，以0.07%磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，柱温30℃，检测波长为278nm，流速为0.8ml/min，理论板数按红景天苷峰计算，应不低于30000。
（4）采用计算机将所得多批次合格的红景天注射液的色谱图拟合为一个标准对照指纹图谱。
本发明优点是：
1、本发明涉及红景天注射液的HPLC指纹图谱的构建方法，包括供试品溶液的制备，对照品溶液的制备，色谱条件限定，分别精密吸取供试品溶液，各20μl注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得HPLC指纹图谱。
2、本发明的积极效果是：从指纹图谱的相似度判断批量之间的质量一致性，还可追根溯源，寻找工艺操作中的问题。
3、能有效的反映成品批与批之间的质量，有利于全面监控产品的质量，避免了质量控制的单一性和片面性，并具有方便、快捷、稳定、精密、重现性好等特点。
4、供试品制作简便，色谱条件容易实现。
5、本发明方法所得红景天注射液指纹图谱的峰多，峰形好，易于鉴别，相似性高，准确可靠。
6、能够定量比对，全图谱匹配，6点校正进行相似度评价。
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。
附图说明
图1是22批红景天注射液指纹图谱（R为对照指纹图谱）。
图2是红景天注射液对照指纹图谱。
图3是实施例1红景天注射液测定的指纹图谱与标准对照图谱比较图。
图4是实施例2红景天注射液测定的指纹图谱与标准对照图谱比较图。
图5是实施例3红景天注射液测定的指纹图谱与标准对照图谱比较图。
具体实施方式
为此，本发明提供一种红景天注射液液相色谱标准指纹图谱的建立以及使用该指纹图谱对生产和销售中的红景天注射液进行测定的方法。
大株红景天注射液HPLC检测方法，所述方法包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：
参照物溶液具体为：取红景天苷对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含红景天苷0.05mg的溶液，作为参照物溶液。对照品溶液的浓度均为50μg/mL。
(2)供试品溶液的制备：制备供试品溶液具体为：精密量取本品0.5ml，于10ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
(3)分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，记录60min的色谱图，即得。
其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，（Agilent XDB-C18色谱柱，柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为5μm），以0.07%磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温30℃；检测波长为278nm，流速为0.8ml/min；理论板数按红景天苷峰计算，应不低于30000。见表1。
（4）采用计算机将所得多批次合格的红景天注射液的色谱图拟合为一个标准对照指纹图谱。
（5）将所得色谱图和标准指纹图谱对照，相似度大于0.90为合格品，相似度评价采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》进行评价。
本发明的技术方案是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1.仪器与试剂
1.1仪器
十万分之一电子天平(METTLER TOLEDO)、岛津LC-20A高效液相色谱仪（二元高压梯度泵）、安捷伦Agilent XDB-C18(4.6×15cm,4.6um)色谱柱。
1.2试剂
红景天苷对照品、甲醇、乙腈。
2.液相色谱系统条件：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，（Agilent XDB-C18色谱柱，柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为5μm），以0.07%磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温30℃；检测波长为278nm，流速为0.8ml/min；理论板数按红景天苷峰计算，应不低于30000。见表1。
3.供试品溶液制备
供试品溶液的制备：制备供试品溶液具体为：精密量取本品0.5ml，于10ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
4.参照物溶液制备
取红景天苷对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含红景天苷0.05mg的溶液，作为参照物溶液。
方法学考察
5.1精密度实验
按所定标准制备方法操作制备供试品溶液，取同一供试品溶液，连续进样6次，按所定标准的色谱条件测定，选择6个共有峰进行比较，选择第5个共有峰红景天苷为标准峰（S），结果（见表2.1，2.2）表明各共有峰相对保留时间RSD≤0.157%，各共有峰相对峰面积RSD≤1.903%，表明该方法精密度良好。
5.2 重现性实验
取同一批红景天注射液，按所定标准制备方法操作制备6份供试液，按所定标准色谱条件测定，结果（见表2.3，2.4）表明各共有峰相对保留时间RSD≤0.172%，各共有峰相对峰面积RSD≤0.315%。表明该方法重现性较好。
5.3稳定性实验
按所定标准制备方法操作制备供试液，取同一供试品溶液，分别于0，2，6，10，12，24h按所定标准色谱条件测定，结果（见表2.5，2.6）各共有峰相对保留时间RSD≤0.826%，各共有峰相对峰面积RSD≤1.631%。表明供试品溶液在24h内稳定性良好。
上述方法学考察结果表明，本研究所建立的色谱指纹图谱精密度、重现性和稳定性好，可以用红景天注射液指纹图谱进行分析。
6.对照指纹图谱的建立及多批产品指纹图谱相似度的分析
6.1 对照指纹图谱的建立
按照所定标准方法，分析了22批大株红景天注射液的色谱指纹图谱，并将22批红景天注射液色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版本），确定的6个共有峰进行校正，生成红景天注射液对照指纹图谱。见图1、图2。
6.2 多批次红景天注射液色谱指纹图谱的相似度分析
取27批红景天注射液，按上述建立的指纹图谱测定方法进行检测，并将所得指纹图谱和红景天注射液对照指纹图谱进行全图谱匹配，6点校正，计算各样品指纹图谱与对照图谱的相似度。27批注射液相似度均大于等于0.90（表2.7），结果表明不同批次红景天注射液相似度较高，指纹图谱相似性良好说明工艺稳定。
6.3相似度标准的制定
有效化学成分群的中药注射液质量稳定，主要取决于红景天注射液中所含主要化学成分组成和比例的稳定，这方面的稳定取决于产品生产的原料药材质量、生产工艺（包括提取、醇沉、活性炭处理、超滤等）重现性，以及过程控制（药材、中间体、灌装前后分析控制）三个方面。根据本研究对多批次红景天注射液指纹图谱相似度分析结果（见表2.7），同时考虑到大生产和采集药材来源的可能变化，本研究拟定相似度标准为大于等于0.90。
见图1： 22批红景天注射液指纹图谱（R为对照指纹图谱）。
见图2 红景天注射液对照指纹图谱，其中峰1. 没食子酸；峰2. 对羟基苯甲酸；峰3. 酪醇；峰5（Ｓ）. 红景天苷；峰6. 对香豆酸。
7.数据分析
按中国药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》2012年版进行计算，获得每个批次相似度值。样品相似度在0.910～0.972。
实施例
对红景天注射液进行指纹图谱测定，具体步骤如下：
步骤(1)参比对照品溶液的制备：
参照物溶液具体为，取红景天苷对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含红景天苷0.05mg的溶液，作为参照物溶液。
步骤(2)供试品溶液的制备：制备供试品溶液具体为：精密量取本品0.5ml，于10ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
步骤(3)分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20ml，注入高效液相色谱仪，记录60min的色谱图，即得。
其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，（Agilent XDB-C18色谱柱，柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为5μm），以0.07%磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温30℃；检测波长为278nm，流速为0.8ml/min；理论板数按红景天苷峰计算，应不低于30000。
对照指纹图谱见图2,峰1. 没食子酸；峰2. 对羟基苯甲酸；峰3. 酪醇；峰5（Ｓ）. 红景天苷；峰6. 对香豆酸。 按中国药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》2012年版进行计算，比较对照指纹图谱和上述测定的指纹图谱的相似度，相似度在大于0.90为合格。实施例1 对红景天注射液1001190105批次进行指纹图谱测定，具体步骤如下： 步骤(1)参比对照品溶液的制备： 参照物溶液具体为，取红景天苷对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含红景天苷0.05mg的溶液，作为参照物溶液。 步骤(2)供试品溶液的制备：制备供试品溶液具体为：精密量取本品0.5ml，于10ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。 步骤(3)分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20ml，注入高效液相色谱仪，记录60min的色谱图，即得。 其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，（Agilent XDB-C18色谱柱，柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为5μm），以0.07%磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温30℃；检测波长为278nm，流速为0.8ml/min；理论板数按红景天苷峰计算，应不低于30000。
对照指纹图谱见图2，峰1. 没食子酸；峰2. 对羟基苯甲酸；峰3. 酪醇；峰5（Ｓ）. 红景天苷；峰6. 对香豆酸。按中国药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》2012年版进行计算，比较对照指纹图谱和上述测定的指纹图谱的相似度，相似度在大于0.90为合格。相似度计算结果见表3－1。
试验结果：1001190105批次红景天注射液测定的指纹图谱与标准对照图谱比较（见图3），相似度为0.950，符合不低于0.90的要求。
实施例2
对红景天注射液1001190106批次进行指纹图谱测定，具体步骤如下：
步骤(1)参比对照品溶液的制备：
参照物溶液具体为，取红景天苷对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含红景天苷0.05mg的溶液，作为参照物溶液。
步骤(2)供试品溶液的制备：制备供试品溶液具体为：精密量取本品0.5ml，于10ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
步骤(3)分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20ml，注入高效液相色谱仪，记录60min的色谱图，即得。
其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，（Agilent XDB-C18色谱柱，柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为5μm），以0.07%磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温30℃；检测波长为278nm，流速为0.8ml/min；理论板数按红景天苷峰计算，应不低于30000。
对照指纹图谱见图2，峰1. 没食子酸；峰2. 对羟基苯甲酸；峰3. 酪醇；峰5（Ｓ）. 红景天苷；峰6. 对香豆酸。
按中国药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》2012年版进行计算，比较对照指纹图谱和上述测定的指纹图谱的相似度，相似度在大于0.90为合格。相似度计算结果见表3－2。
试验结果：1001190106批次红景天注射液测定的指纹图谱与标准对照图谱比较（见图4），相似度为0.934，符合不低于0.90的要求。 实施例3 对红景天注射液1001190107批次进行指纹图谱测定，具体步骤如下： 步骤(1)参比对照品溶液的制备： 参照物溶液具体为，取红景天苷对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含红景天苷0.05mg的溶液，作为参照物溶液。 步骤(2)供试品溶液的制备：制备供试品溶液具体为：精密量取本品0.5ml，于10ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。 步骤(3)分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20ml，注入高效液相色谱仪，记录60min的色谱图，即得。 其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，（Agilent XDB-C18色谱柱，柱长为150mm，内径为4.6mm, 粒径为5μm），以0.07%磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温30℃；检测波长为278nm，流速为0.8ml/min；理论板数按红景天苷峰计算，应不低于30000。
对照指纹图谱见图2：峰1. 没食子酸；峰2. 对羟基苯甲酸；峰3. 酪醇；峰5（Ｓ）. 红景天苷；峰6. 对香豆酸。
按中国药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》2012年版进行计算，比较对照指纹图谱和上述测定的指纹图谱的相似度，相似度在大于0.90为合格。相似度计算结果见表3－3。
试验结果：1001190107批次红景天注射液测定的指纹图谱与标准对照图谱比较（见图5），相似度为0.966，符合不低于0.0.90的要求。

Claims (5)

1.一种红景天注射液的指纹图谱的HPLC检测方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：精密量取本品0.5ml，于10ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；参照物溶液具体为，取红景天苷对照品，精密称定，加水制成每1ml含红景天苷0.05mg的溶液，作为参照物溶液；
(2)测定方法：取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，得到色图谱；其中色谱条件为：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.07%磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，柱温30℃，检测波长为278nm，流速为0.8ml/min，理论板数按红景天苷峰计算，应不低于30000；
将所得色谱图和对照指纹图谱对照，相似度大于0.90为合格品，相似度评价采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价；
对照指纹图谱共有6个共有峰：峰1，没食子酸；峰2，对羟基苯甲酸；峰3， 酪醇；峰5（Ｓ），红景天苷；峰6，对香豆酸。
2.根据权利要求1所述的红景天注射液的指纹图谱的HPLC检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述对照品溶液的浓度均为50μg/mL。
3.根据权利要求1所述的红景天注射液的指纹图谱的HPLC检测方法，其特征在于：步骤(2)中所述色谱柱为：Agilent XDB-C18色谱柱，柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为5μm。
4.根据权利要求1所述的红景天注射液的指纹图谱的HPLC检测方法，其特征在于：步骤(2)中所述分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl,注入液相色谱仪，测定，记录60分钟内的色谱峰。
5.根据权利要求1所述的红景天注射液的指纹图谱的HPLC检测方法，其特征在于步骤如下：
(1)参比对照品溶液的制备：
参照物溶液具体为，取红景天苷对照品，精密称定，加水制成每1ml含红景天苷0.05mg的溶液，作为参照物溶液；
(2)供试品溶液的制备：精密量取本品0.5ml，于10ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
(3)分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，记录60min的色谱图，即得；
其中色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂， Agilent XDB-C18色谱柱，柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为5μm，以0.07%磷酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，柱温30℃，检测波长为278nm，流速为0.8ml/min，理论板数按红景天苷峰计算，应不低于30000；
（4）采用计算机将所得多批次合格的红景天注射液的色谱图拟合为一个标准对照指纹图谱。
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