CN109613242A - 一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于体外检测技术领域，具体涉及一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒及其制备方法。本发明所提供的肌酸激酶同工酶检测试剂盒，包括：磁分离试剂和酶标记抗体；磁分离试剂包括：表面上结合有第一抗CK‑MB单克隆抗体和第二抗CK‑MB单克隆抗体的磁微粒；酶标记抗体包括：酶标记的第三抗CK‑MB单克隆抗体；和/或，酶标记的第四抗CK‑MB单克隆抗体；其中，第一、第二、第三和第四抗CK‑MB单克隆抗体分别特异于肌酸激酶同工酶的不同表位。本发明磁分离试剂中的磁微粒的表面上结合有特异于肌酸激酶同工酶的不同表位的第一抗CK‑MB单克隆抗体和第二抗CK‑MB单克隆抗体，可实现多位点识别待测样品中的CK‑MB抗原，增强磁珠抗体与抗原的结合，可避免漏检的情况，灵敏度高，适用人群广泛。

Description

一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于体外检测技术领域，具体涉及一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

心血管疾病是危害我国人民健康和生命的重大致死性疾病，根据卫生部统计，在我国城市中，每十万人中就有二百三十五人死于心脑血管疾病，占各类疾病引起的死亡的首位，且每年以2％的速度递增。急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)是指因持久而严重的心肌缺血所致的部分心肌急性坏死，是造成心血管病人死亡的主要原因。在临床上常表现为胸痛、急性循环功能障碍以及反映心肌损伤、缺血和坏死等一系列特征性的心电图改变。临床表现常有持久的胸骨后剧烈疼痛、急性循环功能障碍、心律失常、心功能衰竭、发热、白细胞计数和血清心肌损伤标记酶的升高以及心肌急性损伤与坏死的心电图进行性演变。中国的急性心肌梗死发病率近年来呈明显上升趋势，每年新发至少50万，现患至少200万。

肌酸激酶(CK)主要存在于脊椎动物中，也存在于动物的心脏、骨骼肌以及脑等组织的细胞质和线粒体中。CK在人体中存在较广泛，在血中半衰期约为6-8小时。CK用于催化肌酸和ATP或磷酸肌酸和ADP之间磷酸转移的可逆反应，以维持细胞内ATP的生理浓度。CK催化作用是可逆的，即在pH9.0时可催化肌酸和ATP生成磷酸肌酸和ADP，为正反应；也可在pH6.7时催化磷酸肌酸和ADP生成肌酸和ATP，为逆反应。其中，在中性条件下，逆反应是正反应的2-6倍，即以生成ATP为主，以保证组织细胞所需的能量来自ATP。正反应有利于线粒体内氧化磷酸化生成的ATP，以磷酸肌酸的形式进入细胞液，供应细胞生理活动的需要。因此，肌酸激酶是一个与细胞内能量转运、肌肉收缩和ATP的再生有直接关系的重要激酶。

CK是一个二聚体，以3种同工酶的形式存在：2个B单体(CK-BB)，2个M单体(CK-MM)，MB的单体混合体(CK-MB)。这3种同工酶分子量相同，催化相同的化学反应，但其分子结构和来源不同：CK-BB来源于横纹肌，CK-MM来源于大脑和消化道，而CK-MB来源于心肌。心肌中CK-MB占CK总量的15％～25％，所以在心肌损伤，特别是急性心肌梗死(AMI)时，测定CK-MB对AMI的诊断有极大的临床意义。有关实验表明，在症状发生后12～48d时采样分析，CK-MB质量的临床灵敏度和临床特异性分别为96.8％和89.6％，这就使它在众多心肌标志物中脱颖而出，成为对AMI临床诊断起重要作用的一个指标。在实际临床诊断中，可通过结合cTnI、Myo等心肌特异标志物的检测结果来进一步提高临床诊断的准确性。

CK-MB的常规测定方法主要为免疫抑制法，测定CK-MB的活力。正常血清中CK同工酶主要为CK-MM、CK-MB和极少量的CK-BB，由于CK-BB的含量极微，可忽略不计，因此此方法假设血清中只有CK-MM和CK-MB，在试剂中加入抗CK-M亚单位的多克隆抗体,从而抑制CK-MM和CK-MB中M亚单位活性,测得结果相当于CK-MB中B亚单位活性,将结果乘以2即相当于CK-MB活力。此方法迅速，简介，省时，有较高的敏感性。然而，该法的影响因素和缺陷众多：

1)酶易于老化

CK-MB活性的酶易于老化，主要表现为酶构象改变。其引起CK-MB活性检测降低或正常的原因可能是由于过了检测时间，以致血清中酶老化使酶的催化活性降低或丧失，从而导致酶的活化能升高所致。

2)巨CK的干扰

巨CK是巨分子酶，比正常情况下相应的酶有着高分子团，不被抗CK-M抗血清所抑制，表现为血清中“CK-MB”占CK活力50％以上，而CK活力正常或轻度或中度增高。巨CK大部分情况下是酶与一种免疫球蛋白的复合物，称巨CK1，通常免疫球蛋白是IgG和IgA，偶见IgM。当形成复合物时，CK-MB试剂不但不能抑制CK-M，而且因计算时结果乘以2，更加扩大了误差；而巨CK2是一种不正常低聚的线粒体CK，又称CK-Mt，CK-Mt抗原性与CK-M不同，抗M抗体不能抑制CK-Mt，故形成CK-MB的假阳性。

3)CK-BB的干扰

免疫抑制法检测CK-MB活性的方法是假定标本中无CK-BB活性。同工酶CK-BB主要存在于脑组织中，正常情况其在血清中活性很低，部分脑部疾患、前列腺等组织肿瘤出现时，组织中CK-BB释放进入外周血，由于CK-BB活性的升高，必定影响CK-MB测定结果的准确性，造成CK-MB的假阳性。

4)溶血的干扰

测定CK、CK-MB活力尽量不使用溶血标本。众所周知，红细胞中不含CK，但红细胞中含有腺苷酸激酶(AK)，AK能直接参与CK速率法的第二步反应，在没有CK的情况下，AK可直接与葡萄糖-6磷酸反应在腺苷二磷酸作用下经葡萄糖-6磷酸脱氢酶催化使NAD还原成NADH，从而引起340nm处吸光度上升，从上述反应可看出，即便血清中不含CK，溶血标本中的AK也能直接参与2ADP→ATP+AMP的反应，故对CK-MB的测定结果也带来一定影响。

因而，本领域技术人员亟待一种能够快速、高灵敏度的肌酸激酶同工酶CK-MB检测方法。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒，旨在解决现有CK-MB检测方法的干扰因素过多带来的低灵敏度的技术问题。

本发明的另一目的在于提供一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒的制备方法，以提供一种操作简便、快速的方法去制备上述肌酸激酶同工酶检测试剂盒。

为了实现上述发明目的，本发明的一方面，提供了一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒，包括：磁分离试剂和酶标记抗体；

所述磁分离试剂包括：表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒；

所述酶标记抗体包括：酶标记的第三抗CK-MB单克隆抗体；和/或，酶标记的第四抗CK-MB单克隆抗体；

其中，所述第一、第二、第三和第四抗CK-MB单克隆抗体分别特异于肌酸激酶同工酶的不同表位。

与现有技术相比，本发明磁分离试剂中的磁微粒的表面上同时结合有第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体，第一和第二抗CK-MB单克隆抗体特异于肌酸激酶同工酶的不同表位，可实现多位点识别待测样品中的CK-MB抗原，增强磁珠抗体与抗原的结合，提高灵敏度，在实际应用过程中可避免漏检的情况，适用人群广泛。

本发明的另一方面，提供了一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒的制备方法，包括：

a)将磁微粒与第一抗CK-MB单克隆抗体、第二抗CK-MB单克隆抗体反应，制备表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒；

b)将第三抗CK-MB单克隆抗体或第四抗CK-MB单克隆抗体偶联标记酶，制备酶标记的检测抗体；

其中，所述第一抗CK-MB单克隆抗体和所述第二抗CK-MB单克隆抗体与所述磁微粒共价结合。

本发明所提供的制备方法，操作简便，可实施性强。通过上述制备方法，可快速制备得到一种灵敏度高的肌酸激酶同工酶检测试剂盒。

附图说明

图1为本发明测试例中肌酸激酶同工酶检测试剂盒在血清检测中与现有产品的线性相关性拟合图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例说明书中所提到的各组分的质量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间质量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例说明书组合物各组分的含量按比例放大或缩小均在本发明实施例说明书公开的范围之内。具体地，本发明实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等医药领域公知的重量单位。

一方面，本发明实施例提供了一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒，包括：磁分离试剂和酶标记抗体；

磁分离试剂包括：表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒；

酶标记抗体包括：酶标记的第三抗CK-MB单克隆抗体；和/或，酶标记的第四抗CK-MB单克隆抗体；

其中，第一、第二、第三和第四抗CK-MB单克隆抗体分别特异于肌酸激酶同工酶的不同表位。

在上述技术方案中，表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒在提高检测灵敏度上起着非常重要的作用，第一和第二抗CK-MB单克隆抗体特异于肌酸激酶同工酶的不同表位，它们同时结合在磁微粒的表面，在磁微粒抗体与抗原结合的过程中，可实现多位点识别待测样品中的CK-MB抗原，增强磁珠抗体与抗原的结合，进而提高检测效率，避免漏检的情况，灵敏度高，适用人群广泛。

作为优选，在磁分离试剂中，第一抗CK-MB单克隆抗体、第二抗CK-MB单克隆抗体和磁微粒的质量比为(1～2):(2～4):20。当第一抗CK-MB单克隆抗体、第二抗CK-MB单克隆抗体和磁微粒的质量比为(1～2):(2～4):20时，使得包被的两种抗体能够均匀分布于磁微粒表面，增强检测灵敏度。

作为优选，在酶标记抗体中，第三抗CK-MB单克隆抗体和标记酶的质量比为1:(1～5)；或，第四抗CK-MB单克隆抗体和所述标记酶的质量比为1:(1～10)。如此，可使得第三、第四CK-MB单克隆抗体的效价相似，不在比例范围时，不同酶标抗体的效价差别较大，试剂灵敏度下降。在酶标记抗体中，标记酶与第三CK-MB单克隆抗体的质量比大于5，标记酶过量，导致原料浪费；当标记酶与第三CK-MB单克隆抗体的质量比小于1时，标记酶量不充足，导致抗体的标记率低，影响试剂灵敏度。第四CK-MB单克隆抗体同理。在本发明实施例中，第四CK-MB单克隆抗体需要比第三抗体更高的检测灵敏度，一般的，偶联第四CK-MB单克隆抗体的标记酶应为偶联第三CK-MB单克隆抗体的标记酶的1～2倍。

作为优选，第一抗CK-MB单克隆抗体、第二抗CK-MB单克隆抗体和第三抗CK-MB单克隆抗体的质量比为1:(1～2):(2～4)；或

第一抗CK-MB单克隆抗体、第二抗CK-MB单克隆抗体和第四抗CK-MB单克隆抗体的质量比为1:(1～2):(2～4)。

第一、第二抗CK-MB单克隆抗体偶联磁微粒，用于捕获反应体系中的抗原，通过磁分离技术将捕获的抗原富集起来，一般其使用量会少于酶标抗体的使用量，可以达到最佳性价比例。磁微粒应优先标记亲和力和效价较高的抗体，提升捕获效率。第三、第四抗CK-MB单克隆抗体酶标抗体，为提升试剂的灵敏度，需要对捕获的抗原完成几乎100％的识别，需要酶标抗体远远过量，以牺牲成本来获取试剂的灵敏性。在本发明实施例中，酶标抗体的量为第一、第二抗CK-MB单克隆抗体的1～2倍比较适宜。

作为优选，第一、第二抗CK-MB单克隆抗体特异于肌酸激酶同工酶的M亚基，第三和第四抗CK-MB单克隆抗体特异于肌酸激酶同工酶的B亚基，可保证CK-MB复合物检测的特异性，提高试剂的灵敏度。

作为优选，在述酶标记抗体中，标记酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

作为优选，磁微粒的粒径为0.5～3.5μm。

当磁微粒的粒径大于3.5μm时，磁微粒比表面积减少，试剂灵敏度变小，达不到超敏效果；当磁微粒的粒径小于0.5μm时，影响磁分离效果。

本发明实施例中，上述肌酸激酶同工酶检测试剂盒还包括：化学发光底物。在本发明实施例中，但凡能被本发明实施例的酶标记物催化发光的化学发光底物均适用于本发明。

作为优选，化学发光底物包括二氧杂环乙烷、二氧杂环乙烷类似物、鲁米诺和鲁米诺衍生物中的至少一种。

作为优选，磁分离试剂还包括：试剂R1；

所述试剂R1的配方为Tris 5～8份，氯化钠6～10份，牛血清白蛋白4～6份，吐温0.8～1.2份，水补足至1000份，盐酸调节pH至7.3～7.5，所述份数为重量份。Tris提供最佳pH反应环境，而能保持pH保持稳定，不产生波动；氯化钠提供盐离子浓度，保持生命大分子自然构象；牛血清白蛋白，提供蛋白保护剂；吐温，较少非特异性吸附，提高磁珠分散度。

作为优选，表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒与所述试剂R1混合，其工作浓度为10～50μg/mL。如此，可使得磁微粒上的抗体包被率最高。当磁微粒的浓度过高，容易降低抗体的包被浓度低；当磁微粒的浓度过低，大量游离抗体无法包被到磁微粒表面，造成原料浪费。

另一方面，本发明实施例还提供了上文所述的肌酸激酶同工酶检测试剂盒的制备方法，包括：

a)将磁微粒与第一抗CK-MB单克隆抗体、第二抗CK-MB单克隆抗体反应，制备表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒；

b)将第三抗CK-MB单克隆抗体或第四抗CK-MB单克隆抗体偶联标记酶，制备酶标记的检测抗体；

其中，第二抗CK-MB单克隆抗体与磁微粒的结合活性优于第一抗CK-MB单克隆抗体与磁微粒的结合活性；

第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体与磁微粒共价结合。

在本发明实施例中，对第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体与磁微粒的反应顺序不作具体限制。也就是，在本发明实施例中，可以为：第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体同时与磁微粒混合反应，制备表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒；也可以为：将第一抗CK-MB单克隆抗体先与磁微粒混合反应，制备表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒，然后加入第二抗CK-MB单克隆抗体继续反应，进而制备表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒。

作为进一步优选的实施方式，本发明实施例肌酸激酶同工酶检测试剂盒的制备方法，包括：

a)将磁微粒与第一抗CK-MB单克隆抗体反应，制备表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒；将表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒与第二抗CK-MB单克隆抗体反应，制备表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒；

b)将第三抗CK-MB单克隆抗体或第四抗CK-MB单克隆抗体偶联标记酶，制备酶标记的检测抗体；

其中，第二抗CK-MB单克隆抗体与磁微粒的结合活性优于第一抗CK-MB单克隆抗体与磁微粒的结合活性；

第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体与磁微粒共价结合。

在上述技术方案中，通过先将第一抗CK-MB单克隆抗体与磁微粒反应，再加入第二抗CK-MB单克隆抗体进行反应，使得第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体能同时包被到磁微粒的表面，避免由于抗体间的活性、构象差异导致其在磁微粒表面的不均匀分布，稳定性高，操作简便。

具体的，在步骤a)中，将磁微粒与第一抗CK-MB单克隆抗体反应，主要目的在于先将第一抗CK-MB单克隆抗体包被在磁微粒的表面，该包被为化学包被。

将磁微粒与第一抗CK-MB单克隆抗体反应，该步骤的具体实施过程包括：

S11、提供磁微粒，离心，加入MES缓冲液进行平衡处理，得到经过平衡处理的磁微粒；

S12、将经过平衡处理的磁微粒置于交联试剂中，对磁微粒的表面活性基团进行活化，得到活化后的磁微粒；

S13、将活化后的磁微粒与第一抗CK-MB单克隆抗体置于MES缓冲液中，室温避光混匀反应；待反应结束后，固液分离，洗涤，加入封闭液进行封闭，洗涤，得到表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒；

S14、将表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体置于试剂R1中进行储存。

进一步的，将表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒与第二抗CK-MB单克隆抗体反应，主要目的在于先将第二抗CK-MB单克隆抗体包被在表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒的表面，该包被为化学包被。

将表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒与第二抗CK-MB单克隆抗体反应，该步骤的具体实施过程包括：

S21、取表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒，离心，加入MES缓冲液进行平衡处理，得到经过平衡处理的表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒；

S22、将经过平衡处理的表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒置于交联试剂中，对其表面活性基团进行活化，得到活化后的表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒；

S23、将活化后的表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒与第二抗CK-MB单克隆抗体置于MES缓冲液中，室温避光混匀反应；待反应结束后，固液分离，洗涤，加入封闭液进行封闭，得到表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒。

S24、取表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒加入试剂R1进行储存，得到磁分离试剂。

在上述技术方案中，本发明通过先将第一抗CK-MB单克隆抗体与磁微粒反应，再加入第二抗CK-MB单克隆抗体进行反应，使得第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体能同时包被到磁微粒的表面，避免由于抗体间的活性、构象差异导致其在磁微粒表面的不均匀分布，稳定性高，操作简便。

作为优选，试剂R1的制备包括：取Tris 5～8份和氯化钠6～10份溶解在部分纯水中，盐酸调节pH至7.3～7.5后加入牛血清白蛋白4～6份和吐温0.8～1.2份，水补足至1000份。

作为优选，MES缓冲液的制备包括：取20～22g MES加约800mL纯水使之溶解，过后用NaOH调pH至5.0，定容至1L。如此，为磁微粒的包被提供一个缓冲环境，适宜的pH环境能促进反应速率，且MES缓冲液在该pH范围内(pH4.5～5.5)可以提供强大的缓冲能力，即反应体系中非强碱性物质大量加入，不会改变此pH范围。适宜的离子强度可保持生物大分子的自然折叠构象，抗体分子一般在阳离子为50mM浓度下保持构象，离子浓度过高会使分子发生皱缩，过低会使分子过于舒展，都不利于发生抗体和配体的免疫结合反应。

作为优选，交联试剂为含9～11mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的MES缓冲液。如此，提高提升交联反应效率，缩短实验时间，提高磁微粒与抗体的反应度。

作为优选，用于洗涤的清洗液的制备包括：称取Tris 2.8～3.2g、NaCl 8～10g加约800mL纯水使之溶解，过后用HCl调pH至7.2后，加入0.5g Tween-20混匀后，定容至1L。

作为优选，用于封闭的封闭液的制备包括：称取Tris 5～7g和NaCl 5～10g加入80ml纯水使之溶解，过后用HCl调pH至6～8后，加入4.5～5.5g BSA、0.8～1.2g Tween-20混匀后，定容至1000mL。

作为本发明实施例的优选实施方案，在步骤a)中，第一抗CK-MB单克隆抗体、第二抗CK-MB单克隆抗体和磁微粒的质量比为(1～2):(2～4):20。

在步骤b)中，将第三抗CK-MB单克隆抗体或第四抗CK-MB单克隆抗体偶联标记酶，其目的在于制备酶标记物，使得第三抗CK-MB单克隆抗体或第四抗CK-MB单克隆抗体被标记酶标记。

将第三抗CK-MB单克隆抗体偶联标记酶，这一步骤的具体实施过程包括：

S31、提供经过透析处理的第三抗CK-MB单克隆抗体和标记酶，将第三抗CK-MB单克隆抗体、标记酶和第一酶标记试剂混合，室温避光反应；

S32、待反应结束后，加入第二酶标记试剂继续反应，脱盐纯化，得到酶标记的第三抗CK-MB单克隆抗体。

在一实施例中，第三抗CK-MB单克隆抗体和标记酶的质量比优选为1:(1～5)。

作为本发明实施例的优选实施方式，第一抗CK-MB单克隆抗体、第二抗CK-MB单克隆抗体和第三抗CK-MB单克隆抗体的质量比为1:(1～2):(2～4)。

在另一实施例中，为了保证抗体和酶之间的最佳偶联状态，进行透析处理，置换抗体和酶的缓冲体系。该透析处理的具体过程包括：将第三抗CK-MB单克隆抗体和标记酶分别加入两个透析袋中，在PBS缓冲液(0.1mol/L，pH7.4)中透析1～4h。

在又一实施例中，第一酶标记试剂为质量百分浓度为0.1％的戊二醛溶液，第二酶标记试剂为乙醇胺。

作为优选，标记酶选为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

值得注意的是，将第四抗CK-MB单克隆抗体偶联标记酶，这一步骤的具体实施过程和将第三抗CK-MB单克隆抗体偶联标记酶的过程相同，其区别仅在于：将第三抗CK-MB单克隆抗体替换为第四抗CK-MB单克隆抗体。

在步骤S32中，脱盐纯化主要用于纯化反应得到的酶标记物，提高酶标记物的纯度。具体的，这一步骤的实施过程包括：

以20mM PBS为流动相，流速0.5mL/min，TSK3000的HPLC预装柱。首先，将第三抗CK-MB单克隆抗体、标记酶和酶标记的第三抗CK-MB单克隆抗体分别上样，记录他们的出峰时间；之后，将步骤S32的反应产物上样，收集与酶标记的第三抗CK-MB单克隆抗体出峰时间对应的组分，超滤浓缩后于4℃保存。

为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例肌酸激酶同工酶检测试剂盒及其制备方法的进步性能显著地体现，以下通过实施例对本发明的实施进行举例说明。

以下实施例中所采用的磁微粒选为Merck公司的EM1-100140，第一和第二抗CK-MB单克隆抗体分别选为Medix公司的MAB7501和MAB7502，第三和第四抗CK-MB单克隆抗体分别选为Biospecific公司的A27060和A27080。

实施例1

本实施例提供了一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其制备方法包括：

1、试剂准备

MES缓冲液的制备：取21.32g MES加约800mL纯水使之溶解，过后用NaOH调pH至5.0，定容至1L。

交联试剂的制备：取适量EDC加入MES缓冲液中，调节EDC的浓度为10mg/mL。

封闭液的制备：称取Tris 6.05g、NaCl 9.0g，加入80ml纯水使之溶解，过后用HCl调pH至7.2后，加入5.0g BSA、1.0g Tween-20混匀，定容至1000mL。

清洗液的制备：称取Tris 3.025g、NaCl 9g，加约800mL纯水使之溶解，过后用HCl调pH至7.2后，加入0.5g Tween-20混匀后，定容至1L。

试剂R1的制备：取Tris 6.5g、氯化钠9.0g，加80mL纯水使之溶解，之后加盐酸调节pH至7.2，再加入5.0gBSA和1.0g吐温，再加入纯水补足至1L。

2、磁分离试剂的制备

1)0.3g磁微粒EM1-100140(粒径0.93μm)，离心，加入MES缓冲液重悬，磁分离，如此重复3次，得到经过平衡处理的磁微粒。

2)将步骤1)中经过平衡处理的磁微粒置于1mL的交联试剂中，混匀，室温避光反应30min，磁分离后去上清，得到活化后的磁微粒；其中，本实施例的交联试剂为含10mg/mLEDC的MES缓冲液。

3)将活化后的磁微粒与1.5mg第一抗CK-MB单克隆抗体置于MES缓冲液中，室温避光混匀反应3h；待反应结束后，磁分离后去上清，加入清洗液重复洗涤3次，之后加入5mL封闭液于室温避光混匀反应过夜，再加入清洗液重复洗涤3次，得到表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒。

4)取步骤3)的表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒，离心，加入MES缓冲液重悬，磁分离，如此重复3次，得到经过平衡处理的表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒。

5)将步骤4)的经过平衡处理的表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒置于交联试剂中，混匀，室温避光反应30min，磁分离后去上清，得到活化后的表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒；其中，本实施例的交联试剂为含10mg/mL EDC的MES缓冲液。

6)将步骤5)活化后的表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒与1.5mg第二抗CK-MB单克隆抗体置于MES缓冲液中，室温避光混匀反应3h；待反应结束后，固液分离，洗涤，加入封闭液于室温避光混匀反应过夜，得到表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒。

7)取表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒加入试剂R1进行储存，得到磁分离试剂。

3、酶标记抗体的制备

1)将2mg第三抗CK-MB单克隆抗体和2mg碱性磷酸酶分别加入两个透析袋中，在PBS缓冲液(0.1mol/L，pH7.4)中透析2h，得到经过透析处理的第三抗CK-MB单克隆抗体和标记酶。

2)取经过透析处理的第三抗CK-MB单克隆抗体和标记酶混合，缓慢加入0.2mL0.1wt％戊二醛，室温避光反应2h；之后，缓慢加入0.1mL乙醇胺继续反应2h，脱盐纯化，得到酶标记的第三抗CK-MB单克隆抗体。

4、化学发光底物选为二氧杂环乙烷或其类似物。

对比例

本对比例提供了一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其制备方法包括：

1、试剂准备

与实施例1的步骤1相同，此处不再一一赘述。

2、磁分离试剂的制备

1)取0.3g磁微粒EM1-100140(粒径0.93μm)，离心，加入MES缓冲液重悬，磁分离，如此重复3次，得到经过平衡处理的磁微粒。

2)将步骤1)中经过平衡处理的磁微粒置于1mL的交联试剂中，混匀，室温避光反应30min，磁分离后去上清，得到活化后的磁微粒；其中，本实施例的交联试剂为含10mg/mLEDC的MES缓冲液。

3)将活化后的磁微粒与1.5mg第一抗CK-MB单克隆抗体置于MES缓冲液中，室温避光混匀反应3h；待反应结束后，磁分离后去上清，加入清洗液重复洗涤3次，之后加入5mL封闭液于室温避光混匀反应过夜，再加入清洗液重复洗涤3次，得到表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒。

4)取表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒加入试剂R1进行储存，得到磁分离试剂。

3、酶标记抗体的制备

与实施例1的步骤3相同，此处不再一一赘述。

4、化学发光底物与实施例1的相同。

测试例

1、取本发明实施例1制备的肌酸激酶同工酶检测试剂盒作为样品组，取对比例1的CK-MB检测试剂盒作为对照组，采用化学发光法对从医院收集的20份血清样本进行平行检测，并记录数据，表1为检测结果。

最低检测限即分析灵敏度，也称检测低限或检出限，指样本中分析物的最小量，可以在规定的可能性条件下予以检出。如表1结果所示，采用本发明实施例所提供的检测试剂盒，对待测样品中的CK-MB进行检查，并计算其最低检测限。发现，本发明实施例所提供的检测试剂盒的最低检测限低至0.001773，明显优于现有产品。

表1

2、取本发明实施例1制备的肌酸激酶同工酶检测试剂盒作为样品组，取对比例1的CK-MB检测试剂盒作为对照组，采用化学发光法对从医院收集的87份血清样本进行平行检测，并记录数据，表2为检测结果。对表2数据进行线性相关性分析，结果如图1，发现其线性相关性系数为0.994，斜率为1.01，表明本发明检测试剂盒与现有产品的一致性良好。

表2

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，包括：磁分离试剂和酶标记抗体；

所述磁分离试剂包括：表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒；

所述酶标记抗体包括：酶标记的第三抗CK-MB单克隆抗体；和/或，酶标记的第四抗CK-MB单克隆抗体；

其中，所述第一、第二、第三和第四抗CK-MB单克隆抗体分别特异于肌酸激酶同工酶的不同表位。

2.根据权利要求1所述的肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，所述第一抗CK-MB单克隆抗体、所述第二抗CK-MB单克隆抗体和所述第三抗CK-MB单克隆抗体的质量比为1:(1～2):(2～4)；或

所述第一抗CK-MB单克隆抗体、所述第二抗CK-MB单克隆抗体和所述第四抗CK-MB单克隆抗体的质量比为1:(1～2):(2～4)。

3.根据权利要求1至2任一项所述的肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒的粒径为0.5～3.5μm。

4.根据权利要求1至2任一项所述的肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，在所述述酶标记抗体中，标记酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

5.根据权利要求1至3任一项所述的肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，还包括：化学发光底物；

所述化学发光底物包括二氧杂环乙烷、二氧杂环乙烷类似物、鲁米诺和鲁米诺衍生物中的至少一种。

6.根据权利要求1至3任一项所述的肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，所述磁分离试剂还包括：试剂R1；

所述试剂R1的配方为Tris 5～8份，氯化钠6～10份，牛血清白蛋白4～6份，吐温0.8～1.2份，水补足至1000份，盐酸调节pH至7.3～7.5，所述份数为重量份。

7.根据权利要求6所述的肌酸激酶同工酶检测试剂盒，其特征在于，在所述磁分离试剂中，所述表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒与所述试剂R1混合，所述表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒的浓度为10～15μg/mL。

8.一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：

a)将磁微粒与第一抗CK-MB单克隆抗体、第二抗CK-MB单克隆抗体反应，制备表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒；

b)将第三抗CK-MB单克隆抗体或第四抗CK-MB单克隆抗体偶联标记酶，制备酶标记的检测抗体；

其中，所述第一抗CK-MB单克隆抗体和所述第二抗CK-MB单克隆抗体与所述磁微粒共价结合。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在步骤a)中，所述第一抗CK-MB单克隆抗体、所述第二抗CK-MB单克隆抗体和所述磁微粒的质量比为(1～2):(2～4):20。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，在步骤b)中，所述第三抗CK-MB单克隆抗体和标记酶的质量比为1:(1～5)；或，所述第四抗CK-MB单克隆抗体和所述标记酶的质量比为1:(1～10)。