CN109535097A - 一类检测二氢硫辛酸琥珀酰转移酶的分子探针及其制备方法和用途 - Google Patents
一类检测二氢硫辛酸琥珀酰转移酶的分子探针及其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一类检测二氢硫辛酸琥珀酰转移酶的分子探针及其制备方法和用途。所述探针如下述式I所示，其在低浓度下可有效检测活细胞中的二氢硫辛酸琥珀酰转移酶。所述探针不仅对细胞中二氢硫辛酸琥珀酰转移酶具有良好的选择性，而且对其表现出较高的反应活性，并且能对活细胞标记后的目的蛋白进行有效纯化。
Description
技术领域
本发明涉及的是化学生物学领域，具体涉及一类在活细胞中检测二氢硫辛酸琥珀酰转移酶的分子探针及其制备方法和应用。
背景技术
二氢硫辛酸琥珀酰转移酶(DLST)作为α-酮戊二酸脱氢酶复合体(α-ketoglutarate dehydrogenase complex)的核心组成部分，在催化α-酮戊二酸转换成琥珀酰辅酶A过程中发挥着关键作用，是三羧酸循环(TCA)的重要组成部分[1-3]。研究表明DLST蛋白与多种疾病的发生密切相关，如阿尔茨海默病[4-6]、白血病[7]、心血管疾病[8]等，然而由于缺乏有效的工具小分子，对DLST的功能研究受到了极大的限制。因此，开发一种能够用于在活细胞中检测DLST的分子探针对于DLST的功能研究具有重要意义。
基于活性的蛋白质组分析(Activity-based protein profiling，ABPP)技术是一种强大的化学蛋白质组学研究工具，它利用活性位点导向的化学小分子探针直接在复杂的生物体系中监测酶的功能状态[9-11]。ABPP的核心是设计一个可以在活细胞或复杂的蛋白质组内与某类酶活性中心氨基酸残基发生共价反应的“活性分子探针”(Activity-based探针，ABP)，由于ABP对蛋白的化学修饰发生在其催化活性中心，因此我们可以通过探针标记水平的高低即可在复杂的蛋白质组即时读取某类蛋白酶的活性功能状态[12]，这一技术原理对于DLST分子探针的设计具有重要的借鉴意义。
上述引用文献如下所示：
[1]Yang,L.；Shi,Q.；Ho,D.J.；Starkov,A.A.；Wille,E.J.；Xu,H.；Chen,H.L.；Zhang,S.；Stack,C.M.；Calingasan,N.Y.；Gibson,G.E.；Beal,M.F.Mice deficient indihydrolipoyl succinyl transferase show increased vulnerability tomitochondrial toxins.Neurobiol.Dis.,2009,36,320-330.
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[3]Guo,H.；Madzak,C.；Du,G.；Zhou,J.Mutagenesis of conserved active siteresidues of dihydrolipoamide succinyltransferase enhances the accumulation ofα-ketoglutarate in Yarrowia lipolytica.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2016,100,649-659.
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[8]Heggermont,W.A.；Papageorgiou,A.P.；Quaegebeur,A.；Deckx,S.；Carai,P.；Verhesen,W.；Eelen,G.；Schoors,S.；van Leeuwen,R.；Alekseev,S.；Elzenaar,I.；Vinckier,S.；Pokreisz,P.；Walravens,A.S.；Gijsbers,R.；Haute,C.V.D.；Nickel,A.；Schroen,B.；van Bilsen,M.；Janssens,S.；Maack,C.；Pinto,Y.；Carmeliet,P.；Heymans,S.Inhibition of MicroRNA-146a and Overexpression of Its Target DihydrolipoylSuccinyltransferase Protect Against Pressure Overload-Induced CardiacHypertrophy and Dysfunction.Circulation,2017,136,747–761.
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发明内容
本发明的目的之一在于提供一种基于检测标记二氢硫辛酸琥珀酰转移酶的化合物；
本发明的另一目的是提供制备上述化合物的中间体化合物；
本发明的另一目的是提供制备上述化合物的制备方法；
本发明还有一目的是提供含有上述化合物的组合物；
本发明还有一目的是提供上述化合物的用途。
为达到上述目的，本申请采用下述技术方案：
一种化合物化合物或其立体异构体、或其盐或其溶剂化物，其以下述式I所示：
其中R1选自任意取代的亚烷基、亚氨基、任意取代或未取代的亚烯基、任意取代或未取代的亚炔基、任意取代或未取代的亚环烷基、任意取代或未取代的亚芳基或任意取代或未取代的亚杂芳基；优选地，选自任意取代或未取代的C1-6亚烷基、任意取代或未取代的C1-6亚芳基；更优选地，选自亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚仲丁基、亚戊基、亚邻苯基、亚间苯基、亚对苯基、亚邻噻吩基、亚间噻吩基、亚邻呋喃基、亚间呋喃基、亚邻吡啶基、亚间吡啶基、亚对吡啶基、亚萘基、亚蒽基、
R2选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基；优选地，选自C1-6烷基或C1-6芳基；更优选地，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、戊基或苯基。
最优选地，式I化合物选自下述化合物：
探针1：2-(甲磺酰基)-5-(4-氟-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；
探针2：2-(乙磺酰基)-5-(4-氟-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；
探针3：2-(甲磺酰基)-5-(3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；
探针4：2-(乙磺酰基)-5-(3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；
探针5：2-(甲磺酰基)-5-(2,4-二氯-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；
探针6：2-(乙磺酰基)-5-(2,4-二氯-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑。
一种制备式I化合物的化合物，如下述式6所示：
其中R1和R2如上所述。
一种制备式6化合物的化合物，如下述式5所示：
其中R1和R2如上所述。
一种制备式5化合物的化合物，如下述式4所示：
其中R1和R2如上所述。
一种制备式4化合物的化合物，如下述式4所示：
其中R1如上所述。
式I所述化合物的制备方法，包括下述步骤：
优选地包括以式6化合物制备式I化合物的反应步骤；
进一步优选地包括以式5化合物制备式6化合物的反应步骤；
再进一步优选地包括以式4化合物制备式5化合物的反应步骤；
再进一步优选地包括以式3化合物制备式4化合物的反应步骤；
最优选地，所述制备方法包括：(1)以式3化合物制备式4化合物；(2)再以式4化合物制备式5化合物；(3)再以式5化合物制备式6化合物；(4)再以式6化合物制备式I化合物的反应步骤。
其中，优选地，步骤(1)中，式3化合物在KOH和硫酸二甲(乙)酯存在下制备式4化合物；优选地，步骤(2)中，式4化合物在NBS和AIBN存在下制备式5化合物；优选地，步骤(3)中，式5化合物在炔丙醇和NaH存在下制备式6化合物；优选地，步骤(4)中，式6化合物在mCPBA存在下制备式I化合物。
一种组合物，其含有上述化合物，以及农业上可用的助剂或杀菌剂、杀虫剂或除草剂；或药学上可用的助剂。本领域技术人员知晓的是，所述化合物与杀菌剂、杀虫剂或除草剂混和时，形成农业上可用的复配制剂。
当所述组合物含有农业上可用的助剂时，所述组合物的剂型选自乳油(EC)、粉剂(DP)、可湿性粉剂(WP)、颗粒剂(GR)、水剂(AS)、悬浮剂(SC)、超低容量喷雾剂(ULV)、可溶性粉剂(SP)、微胶囊剂(MC)、烟剂(FU)、水乳剂(EW)、水分散性粒剂(WG)。
当所述组合物含有药学上可用的助剂时，所述组合物的剂型选自素片、薄膜包衣片、糖衣片、肠衣片、分散片、胶囊、颗粒剂、口服溶液或口服混悬液。
所述的化合物可用于防治农业病虫害方面的用途，优选地，所述农业病虫害为植物细菌性或真菌性病害；更优选地，所述农业病虫害为植物叶枯病和植物溃疡病；最优选地，所述农业病虫害为水稻白叶枯病、黄瓜白叶枯病、烟草青枯病、魔芋白叶枯病、柑桔溃疡病、烟草青枯病、葡萄溃疡病、番茄溃疡病、猕猴桃溃疡病、苹果溃疡病、黄瓜灰霉病、辣椒枯萎病、油菜菌核病、小麦赤霉病、马铃薯晚疫病、蓝莓根腐。
所述的化合物可用于制备治疗或预防阿尔茨海默病或白血病药物；优选地，在制备预防阿尔茨海默病或白血病中药物中，所述化合物被制备成在活细胞中标记检测二氢硫辛酸琥珀酰转移酶的试剂或对活细胞标记后的目标蛋白的纯化试剂。
进一步优选地，本发明化合物的制备方法包括下述具体步骤：
(1)以含甲基取代的苯甲酸和甲醇为原料，在浓硫酸催化下回流反应4-6h，反应完后减压蒸馏除掉甲醇，经柱层析提纯后得到不同的甲酸甲酯1。
(2)以甲酸甲酯为原料，加入80％水合肼后回流反应。待体系冷却后，有白色固体析出，水洗后烘干得到不同的甲酰肼2。
(3)以上述制备的甲酰肼、CS2及KOH为原料，乙醇为溶剂回流反应36-48h，反应完后减压蒸馏除掉乙醇，调节pH至4左右后得到不同的硫醇3。
(4)以上述制备的硫醇、KOH为原料，向其中加入硫酸二甲(乙)酯，常温搅拌2h，粗产物经柱层析提纯得到相应的硫醚4。
(5)以上述制备的硫醚、NBS为原料，以CCl4为溶剂，在AIBN催化下回流反应，反应完后减压蒸馏除掉CCl4，粗产物经柱层析提纯得到不同的苄溴取代硫醚5。
(6)以上述苄溴取代硫醚、炔丙醇为原料，以DMF为溶剂，冰浴下向体系中加入1.2倍当量的NaH反应2h。用饱和氯化铵和乙酸乙酯萃取，粗产物经柱层析提纯得到不同的丙炔基取代硫醚6。
(7)以上述丙炔基取代硫醚为原料，以二氯甲烷作溶剂，冰浴下向体系中加入mCPBA进行氧化反应。减压蒸馏除掉二氯甲烷，粗产物经柱层析提纯得到相应的探针1-6。
其中：
柱层析提纯采用200-300目硅胶，柱层析所用有机溶剂为石油醚与乙酸乙酯混合溶液。
本发明所述的一类在活细胞中检测二氢硫辛酸琥珀酰转移酶的分子探针对水稻白叶枯病菌和柑橘溃疡病菌具有良好的抑菌活性，探针1-6对水稻白叶枯病菌的IC50分别为：3.58、7.95、5.51、13.94、3.99、6.80μM，探针1-4对柑橘溃疡病菌的IC50分别为17.53、7.06、15.60、12.63μM。
本发明的目的还在于提供所述探针的用途，将探针1-6应用于活细胞内二氢硫辛酸琥珀酰转移酶的检测。实验流程如图1，具体实施步骤如下：
(1)分别向990μL细胞悬浮液加入10μL探针1-6，使其终浓度为5μM，25℃孵育2h。
(2)离心后弃上清，用PBS(pH 7.2)洗涤3次，然后100μL PBS重悬细胞。
(3)分别在冰浴条件下超声破碎细胞，4℃下离心30min，12000rpm。
(4)将上清蛋白稀释至1μg/μL，然后取45μL。
(5)分别向上清中1μL生物素-N3、1μL抗坏血酸钠、3μL BTTAA/CuSO4混合溶液，37℃下混合2h。
(6)分别加入50μL 2×loading buffer，95℃下煮沸10min。
(7)将上述样品分别取20μL进行SDS-PAGE。
(8)将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上，条件：200mA电流下转膜50min。
(9)用含0.05％tween-20的PBS溶液(0.05％PBST)洗膜3次，每次10min，然后用5％脱脂奶粉封闭2h。
(10)用0.05％PBST洗膜3次，每次10min，然后加入HRP标记的Streptavidin在冰浴下孵育2h。
(11)用0.05％PBST洗膜3次，每次10min，加入ECL发光试剂，然后利用化学发光成像系统进行成像分析。
本发明的有益效果：
本发明所述的探针1-6是首次报道的能用于活细胞内检测DLST蛋白的分子探针，不仅在低浓度下能对细胞中的DLST进行有效检测，而且对细胞内的DLST具有较高的选择性，并且探针1和探针2能对活细胞标记后的目的蛋白(DLST)进行有效纯化。探针1-6对于DLST蛋白的功能研究具有重要意义。
附图说明
图1；探针1-6对活细胞的标记流程
图2；探针1-6对Xoo细胞的活体标记
图3；探针1对Xoo的活体浓度依赖性标记
图4；探针1对Xoo细胞中DLST的纯化
图5；探针1-4对Xac细胞的活体标记
图6；探针2对Xac的活体浓度依赖性标记
图7；探针2对Xac细胞中DLST的纯化
图8；探针1对重组表达DLST的浓度依赖性标记
实施例
下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例所述方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例中用到的所有原料和溶剂均为市售相应纯度的产品。
实施例1：探针1-6的制备
(1)取0.20mol不同取代的苯甲酸于250mL圆底烧瓶中，向其中加入20倍当量的甲醇和4mL 98％浓硫酸，然后回流反应4-6h。减压蒸馏除掉甲醇后用硅胶拌样，通过柱层析提纯得到化合物1，收率96-99％。
(2)取0.15mol化合物1于100mL圆底烧瓶中，向其中加入2.5倍当量的80％水合肼，回流反应2h。待体系冷却后，有白色固体析出，水洗后烘干得到化合物2，收率77-91％。
(3)取0.15mol化合物2于250mL圆底烧瓶中，向其中加入2倍当量的KOH和100mL乙醇，搅拌溶解后滴加2倍当量CS2，常温搅拌8h后回流反应24-36h。减压蒸馏除掉乙醇后在冰浴下用5％稀盐酸调节pH至4-5，抽滤后得到粗产物3。
(4)取0.10mol粗产物3于100mL圆底烧瓶，向其中加入含0.20mol KOH的50mL水溶液，缓慢滴加2倍当量硫酸二甲(乙)酯，室温搅拌2h。将体系抽滤后得到黄色固体，取少量乙酸乙酯溶解后硅胶拌样，柱层析提纯后得到化合物4，两步收率36-53％。
(5)取0.03mol化合物4于100mL圆底烧瓶中，向其中50mL干燥CCl4，然后加入1.2倍当量的NBS和0.1倍当量AIBN，回流反应48h。将反应体系抽滤除掉不溶物后减压蒸馏除掉CCl4，取少量CH2Cl2溶解固体后硅胶拌样，经柱层析提纯得到化合物5，收率43-77％。
(6)取5mmol化合物5和1.1倍当量炔丙醇于100mL圆底烧瓶中，向其中加入20mL无水DMF，冰浴下搅拌溶解，然后加入1.2倍当量NaH反应2h。向体系中加入饱和20mL氯化铵溶液和60mL乙酸乙酯萃取，水相用50mL乙酸乙酯萃取2次后合并有机相，减压蒸馏除掉溶剂后用硅胶拌样，经柱层析提纯后得到化合物6，收率43-66％。
(7)取5mmol化合物6溶解于15mL干燥CH2Cl2，冰浴下搅拌溶解，然后向体系中加入3倍当量的mCPBA反应2h。将反应体系抽滤除掉固体不溶物，减压蒸馏除掉部分CH2Cl2，剩下的体系用硅胶拌样，经柱层析提纯后得到目标产物探针1-6，收率40-70％。
探针1-6的结构表征如下：
探针1：2-(甲磺酰基)-5-(4-氟-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；1HNMR(500MHz,CDCl3)δ8.26(dd,J＝6.6,2.2Hz,1H),8.10(ddd,J＝8.5,4.8,2.3Hz,1H),7.25(t,J＝8.9Hz,1H),4.74(s,2H),4.30(d,J＝2.4Hz,2H),3.53(s,3H),2.52(t,J＝2.4Hz,1H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ165.89,164.48,162.43,162.23,129.89,129.57,127.10,118.53,116.95,78.98,75.54,64.53,58.24,43.08.HRMS(ESI)calculated forC13H11FN2O4S[M+H]+m/z 311.0496,found 311.0493.
探针2：2-(乙磺酰基)-5-(4-氟-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；1HNMR(500MHz,CDCl3)δ8.26(dd,J＝6.6,2.3Hz,1H),8.10(ddd,J＝8.5,4.8,2.3Hz,1H),7.25(t,J＝8.9Hz,1H),4.75(s,2H),4.31(d,J＝2.4Hz,2H),3.62(q,J＝7.4Hz,2H),2.52(t,J＝2.4Hz,1H),1.55(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ165.90,164.46,162.42,161.42,129.90,129.56,127.08,118.59,116.92,78.98,75.50,64.50,58.23,50.16,6.92.HRMS(ESI)calculated for C14H13FN2O4S[M+H]+m/z 325.0653,found 325.0648.
探针3：2-(甲磺酰基)-5-(4-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.12(d,J＝8.4Hz,2H),7.55(d,J＝8.5Hz,2H),4.70(s,2H),4.26(d,J＝2.4Hz,2H),3.53(s,3H),2.51(t,J＝2.4Hz,1H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ166.57,162.17,143.50,128.49,127.96,121.44,79.21,75.28,70.78,57.88,43.08.HRMS(ESI)calculatedfor C13H12N2O4S[M+H]+m/z 293.0591,found 293.0587.
探针4：2-(乙磺酰基)-5-(4-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.11(d,J＝8.3Hz,2H),7.55(d,J＝8.1Hz,2H),4.70(s,2H),4.25(d,J＝2.3Hz,2H),3.61(q,J＝7.4Hz,2H),2.50(t,J＝2.4Hz,1H),1.54(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ166.59,161.37,143.47,128.47,127.94,121.53,79.22,75.25,70.79,57.87,50.17,6.91.HRMS(ESI)calculated for C14H14N2O4S[M+H]+m/z 307.0747,found307.0744.
探针5：2-(甲磺酰基)-5-(2,4-二氯-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.93(d,J＝8.5Hz,1H),7.54(d,J＝8.5Hz,1H),4.97(s,2H),4.30(d,J＝2.4Hz,2H),3.54(s,3H),2.52(t,J＝2.4Hz,1H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ164.55,162.69,141.97,136.88,135.66,132.18,129.01,121.33,79.12,75.33,66.34,58.53,43.07.HRMS(ESI)calculated for C13H10N2O4SCl2[M+H]+m/z 360.9811,found360.9807.
探针6：2-(乙磺酰基)-5-(2,4-二氯-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.93(d,J＝8.5Hz,1H),7.54(d,J＝8.5Hz,1H),4.97(s,2H),4.30(d,J＝2.4Hz,2H),3.62(q,J＝7.5Hz,2H),2.52(t,J＝2.4Hz,1H),1.56(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ164.60,161.94,141.92,136.84,135.64,132.18,129.00,121.42,79.12,75.30,66.33,58.51,50.25,6.94.HRMS(ESI)calculated forC14H12N2O4SCl2[M+H]+m/z 374.9968,found 374.9966.
式6结构表征如下：
6-1：2-(甲硫基)-5-(4-氟-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.09(dd,J＝6.8,2.2Hz,1H),7.96(ddd,J＝8.5,4.9,2.3Hz,1H),7.17(t,J＝9.1Hz,1H),4.72(s,2H),4.27(d,J＝2.4Hz,2H),2.78(s,3H),2.51(t,J＝2.4Hz,1H).13CNMR(125MHz,CDCl3)δ165.27,165.04,163.56,161.54,128.74,128.42,126.10,120.14,116.53,79.13,75.36,64.72,58.05,14.76.HRMS(ESI)calculated for C13H11FN2O2S[M+H]+m/z 279.0598,found 279.0600.
6-2：2-(乙硫基)-5-(4-氟-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.09(dd,J＝6.7,2.2Hz,1H),7.96(ddd,J＝8.6,4.9,2.3Hz,1H),7.17(t,J＝9.0Hz,1H),4.71(s,2H),4.27(d,J＝2.4Hz,2H),3.31(q,J＝7.4Hz,2H),2.50(t,J＝2.4Hz,1H),1.51(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ164.91,164.58,163.57,161.55,128.77,128.35,126.09,120.19,116.52,79.14,75.33,64.75,58.03,27.15,14.82.HRMS(ESI)calculated for C14H13FN2O2S[M+H]+m/z 293.0755,found293.0757.
6-3：2-(甲硫基)-5-(4-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.98(d,J＝8.3Hz,2H),7.48(d,J＝8.0Hz,2H),4.66(s,2H),4.22(d,J＝2.4Hz,2H),2.77(s,3H),2.49(t,J＝2.4Hz,1H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ165.74,165.15,141.37,128.40,126.85,123.16,79.36,75.15,70.97,57.66,14.75.HRMS(ESI)calculated forC13H12N2O2S[M+H]+m/z 261.0692,found 261.0692.
6-4：2-(乙硫基)-5-(4-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.99(d,J＝6.7Hz,2H),7.48(d,J＝7.4Hz,2H),4.67(s,2H),4.22(t,J＝2.1Hz,2H),3.32(q,J＝7.4Hz,2H),2.49(dd,J＝4.4,2.2Hz,1H),1.51(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ165.60,164.46,141.34,128.40,126.85,123.21,79.36,75.13,70.98,57.65,27.14,14.84.HRMS(ESI)calculated for C14H14N2O2S[M+H]+m/z 275.0849,found275.0849.
6-5：2-(甲硫基)-5-(2,4-二氯-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.82(d,J＝8.5Hz,1H),7.46(d,J＝8.5Hz,1H),4.95(s,2H),4.28(d,J＝2.4Hz,2H),2.78(s,3H),2.50(t,J＝2.4Hz,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ166.12,163.65,140.21,135.99,134.97,131.51,128.59,122.91,79.20,75.08,66.39,58.34,14.64.HRMS(ESI)calculated for C13H10N2O2SCl2[M+H]+m/z 328.9913,found 328.9915.
6-6：2-(乙硫基)-5-(2,4-二氯-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.82(d,J＝8.5Hz,1H),7.46(d,J＝8.5Hz,1H),4.95(s,2H),4.28(d,J＝2.4Hz,2H),3.32(q,J＝7.4Hz,2H),2.50(t,J＝2.4Hz,1H),1.52(t,J＝7.4Hz,3H).13CNMR(100MHz,CDCl3)δ165.47,163.51,140.17,135.95,134.96,131.51,128.59,122.94,79.21,75.08,66.40,58.34,27.09,14.78.HRMS(ESI)calculated for C14H12N2O2SCl2[M+H]+m/z 343.0069,found 343.0072.
式5结构表征如下：
5-1：2-(甲硫基)-5-(3-(溴甲基)-4-氟)苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(500MHz,DMSO-D6)δ8.21(d,J＝7.0Hz,1H),8.03–7.96(m,1H),7.48(t,J＝9.2Hz,1H),4.80(s,2H),2.77(s,3H).13C NMR(125MHz,DMSO-D6)δ165.42,164.50,163.71,161.69,130.28,129.76,127.53,120.50,117.83,26.40,14.88.HRMS(ESI)calculated for C10H8FN2OSBr[M+H]+m/z302.9598,found 302.9600.
5-2：2-(乙硫基)-5-(3-(溴甲基)-4-氟)苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.07(dd,J＝7.0,2.2Hz,1H),7.97(ddd,J＝8.6,4.8,2.3Hz,1H),7.20(t,J＝9.0Hz,1H),4.54(s,2H),3.33(q,J＝7.4Hz,2H),1.52(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ164.77,164.47,163.51,161.47,129.93,129.06,126.58,120.59,116.91,27.18,24.51,14.79.HRMS(ESI)calculated for C11H10FN2OSBr[M+H]+m/z 316.9754,found316.9759.
5-3：2-(甲硫基)-5-(4-(溴甲基))苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.98(d,J＝8.4Hz,2H),7.51(d,J＝8.3Hz,2H),4.51(s,2H),2.78(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ165.42,165.39,141.40,129.82,127.15,123.63,32.39,14.75.HRMS(ESI)calculated for C10H9N2OSBr[M+H]+m/z 284.9692,found 284.9695.
5-4：2-(乙硫基)-5-(4-(溴甲基))苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.98(d,J＝8.4Hz,2H),7.51(d,J＝8.3Hz,2H),4.51(s,2H),3.32(q,J＝7.4Hz,2H),1.52(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ165.28,164.71,141.38,129.81,127.15,123.68,32.39,27.15,14.83.HRMS(ESI)calculated for C11H11N2OSBr[M+H]+m/z298.9848,found 298.9851.
5-5：2-(甲硫基)-5-(2,4-二氯-3-(溴甲基))苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.82(d,J＝8.5Hz,1H),7.48(d,J＝8.5Hz,1H),4.83(s,2H),2.79(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ166.34,163.48,139.03,135.85,134.79,131.26,128.83,123.15,27.35,14.76.HRMS(ESI)calculated for C10H7N2OSCl2Br[M+H]+m/z 352.8912,found 352.8914.
5-6：2-(乙硫基)-5-(2,4-二氯-3-(溴甲基))苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.84(d,J＝8.6Hz,1H),7.48(d,J＝8.5Hz,1H),4.84(s,2H),3.34(q,J＝7.4Hz,2H),1.54(t,J＝6.8Hz,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ165.69,163.33,138.99,135.83,134.76,131.26,128.83,123.18,27.37,27.19,14.86.HRMS(ESI)calculated forC11H9N2OSCl2Br[M+H]+m/z 366.9069,found 366.9071.
式4结构表征如下：
4-1：2-(甲硫基)-5-(3-甲基-4-氟)苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(500MHz,DMSO-D6)δ7.91(d,J＝7.1Hz,1H),7.85–7.78(m,1H),7.35(t,J＝9.1Hz,1H),2.76(s,3H),2.31(s,3H).13C NMR(125MHz,DMSO-D6)δ165.12,164.91,164.15,162.16,130.37,126.82,126.59,119.92,116.83,14.84,14.51.HRMS(ESI)calculated for C10H9FN2OS[M+H]+m/z225.0492,found 225.0493.
4-2：2-(乙硫基)-5-(3-甲基-4-氟)苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87(d,J＝7.2Hz,1H),7.84–7.77(m,1H),7.11(t,J＝8.9Hz,1H),3.31(q,J＝7.4Hz,2H),2.34(s,3H),1.51(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ165.09,164.56,164.25,162.06,130.12,126.27,126.09,119.69,116.04,27.07,14.74,14.53.HRMS(ESI)calculated for C11H11FN2OS[M+H]+m/z 239.0649,found 239.0647.
4-3：2-(甲硫基)-5-(4-甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.88(d,J＝8.2Hz,2H),7.28(d,J＝8.5Hz,2H),2.77(s,3H),2.41(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ166.07,164.74,142.24,129.82,126.69,120.97,21.74,14.75.HRMS(ESI)calculated for C10H10N2OS[M+H]+m/z 207.0587,found 207.0588.
4-4：2-(乙硫基)-5-(4-甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.88(d,J＝8.2Hz,2H),7.28(d,J＝8.0Hz,2H),3.30(q,J＝7.4Hz,2H),2.41(s,3H),1.50(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ165.86,163.95,142.13,129.73,126.62,120.95,27.05,21.64,14.78.HRMS(ESI)calculated for C11H12N2OS[M+H]+m/z 221.0743,found221.0744.
4-5：2-(甲硫基)-5-(2,4-二氯-3-甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.66(d,J＝8.5Hz,1H),7.41(d,J＝8.5Hz,1H),2.78(s,3H),2.56(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ165.97,164.10,138.75,136.70,134.40,128.80,127.98,122.31,18.15,14.73.HRMS(ESI)calculated for C10H8N2OSCl2[M+H]+m/z 274.9807,found 274.9807.
4-6：2-(乙硫基)-5-(2,4-二氯-3-甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.67(d,J＝8.5Hz,1H),7.41(d,J＝8.5Hz,1H),3.32(q,J＝7.4Hz,2H),2.56(s,3H),1.52(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ165.31,163.95,138.72,136.68,134.37,128.80,127.98,122.35,27.15,18.14,14.87.HRMS(ESI)calculated forC11H10N2OSCl2[M+H]+m/z 288.9964,found 288.9965.
式3结构表征如下：
3-1：2-巯基-5-(3-甲基-4-氟)苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(500MHz,DMSO-D6)1HNMR(500MHz,DMSO-D6)δ14.74(s,1H),7.84(d,J＝6.8Hz,1H),7.79–7.68(m,1H),7.35(t,J＝9.1Hz,1H),2.31(s,3H).δ177.39,163.82,161.83,159.88,129.64,126.19,118.82,116.22,14.01.
3-2：2-巯基-5-(4-甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.14(s,1H),7.82(d,J＝8.3Hz,2H),7.31(d,J＝8.0Hz,2H),2.43(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.24,161.98,143.53,130.11,126.66,119.74,21.91.
3-3：2-巯基-5-(2,4-二氯-3-甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.41(s,1H),7.32(d,J＝8.3Hz,1H),7.26(d,J＝8.3Hz,1H),2.49(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ167.83,137.70,135.96,132.99,132.47,127.99,127.22,17.93.
实施例2：探针1-6半抑制浓度(IC50)测试
将探针1-6配成5个相应浓度的含毒液体培养基，取5mL于试管中，用酶标仪测定含药无菌液体培养基OD600值，加入40μL含有水稻白叶枯病菌或柑橘溃疡病菌NB液体培养基(每升培养基中含牛肉胨3g，蛋白胨5g，酵母粉1g，葡萄糖10g，pH 7.0-7.2)，然后在28℃、180rpm条件下摇床培养36-48h，用酶标仪测定各个浓度菌液的OD600值。
校正OD值＝含菌培养基OD值-无菌培养基OD值
防效％＝(校正后对照培养基菌液OD值-校正含毒培养基OD值)/校正后对照培养基菌液OD值×100
将抑制率数据转换成机率值(y)、药剂浓度(μg/mL)转换成对数值(x)，在Excel数据处理软件中进行回归分析，得到毒力回归方程(y＝ax+b)和相关系数(R)，计算药剂对病原菌EC50值，结果见表1和表2。按上述方法，探针1-6的抑菌活性见表1和表2
表1探针1-6对水稻白叶枯病菌的IC50值
从表1活性测试结果可知探针1-6对水稻白叶枯病菌均表现出较高的抑菌活性，其IC50分别为3.58±0.03、7.95±0.09、5.51±0.03、13.94±0.03、3.99±0.08、6.80±0.16μM，与对照药剂甲磺酰菌唑(3.51±0.04μM)相当。
表2探针1-4对柑橘溃疡病菌的IC50值
从表2活性测试结果可知探针1-4对柑橘溃疡病菌均表现出较高的抑菌活性，其IC50分别为17.53±0.10、7.06±0.25、15.60±0.14、12.63±0.33μM，与对照药剂甲磺酰菌唑(8.59±0.16μM)相当。
表3探针对烟草青枯病菌的IC50值
从表3活性测试结果可知探针2(224.59±14.55μM)对烟草青枯病菌的活性与甲磺酰菌唑(65.06±6.98μM)相比下降约4倍，探针3(84.67±6.77μM)对烟草青枯病菌活性与甲磺酰菌唑(65.06±6.98μM)相当。
实施例3：探针1-6在活细胞中对DLST的标记实验
1、探针1-6对水稻白叶枯病菌(Xoo)的活体标记
分别取2mL OD600＝0.6的Xoo菌液，离心后弃上清，然后用0.99mL PBS(pH＝7.2)重悬细胞。分别加入10μL探针1-6，使其终浓度均为5μM，对照组加入10μL DMSO，25℃孵育2h。离心后弃上清，PBS洗涤3次后加入100μL PBS重悬细胞，冰浴下超声破碎细胞。离心后将蛋白稀释至1μg/μL，分别取45μL上清，然后分别加入biotin-N3、抗坏血酸钠及BTTAA/CuSO4混合溶液进行click反应。再分别向样品中加入50μL 2×loading buffer，在95℃下煮沸10min。分别取20μL样品进行SDS-PAGE，然后在200mA恒流下转膜50min，PBST洗膜后用5％脱脂奶粉封闭2h。将膜用PBST清洗后加入HRP标记的链霉亲和素(HRP-Streptavidin)孵育2h，再次用PBST洗膜后，加入化学发光试剂，通过化学发光成像系统进行成像分析(如图2)。从图2中可以看出探针1-6在5μM浓度下均可有效标记细胞中的DLST蛋白，而对照组实验中未能标记DLST。
2、探针1对Xoo细胞的浓度依赖性标记实验
分别取2mL OD600＝0.6的Xoo菌液，离心后弃上清，然后用0.99mL PBS(pH＝7.2)重悬细胞。分别加入10μL不同浓度的探针1，使其终浓度分别为0.5、1、2.5、5、10μM，对照组加入10μL DMSO，分别在25℃下孵育2h。离心后弃上清，PBS洗涤3次后加入100μL PBS重悬细胞，冰浴下超声破碎细胞。离心后将蛋白稀释至1μg/μL，分别取45μL上清，然后分别加入biotin-N3、抗坏血酸钠及BTTAA/CuSO4混合溶液进行click反应，分别向样品中加入50μL 2×loading buffer，在95℃下煮沸10min。分别取20μL样品进行SDS-PAGE，然后在200mA恒流下转膜50min，PBST洗膜后用5％脱脂奶粉封闭2h。将膜用PBST清洗后加入HRP标记的链霉亲和素(HRP-Streptavidin)孵育2h，再次用PBST洗膜后，加入化学发光试剂，通过化学发光成像系统进行成像分析(如图3)。从图3中可以看出探针1在0.5-10μM浓度下，对DLST具有浓度依赖性的标记效果，并且对DLST具有较高的选择性。
3、探针1对Xoo细胞中DLST的纯化实验
分别取20mL OD600＝0.6的Xoo菌液，离心后弃上清，然后用0.99mL PBS(pH＝7.2)重悬细胞。实验组加入10μL探针1，使其终浓度为100μM，对照组加入10μL DMSO，分别在25℃下孵育2h。离心后弃上清，PBS洗涤3次后加入1000μL PBS重悬细胞，冰浴下超声破碎细胞。离心后将实验组与空白组的蛋白稀释至相同浓度，分别取950μL上清，然后分别加入biotin-N3、抗坏血酸钠及BTTAA/CuSO4混合溶液，使其终体积为1000μL，然后37℃下混合2h。分别向体系中加入5倍体积的预冷丙酮，-80℃冷冻2h后离心，弃上清，将沉淀用甲醇洗涤3次，挥干将溶剂后将蛋白沉淀用1mL 0.2％SDS/PBS溶解，然后分别加入1mL链霉亲和素磁珠(streptavidin bead，Promega)，室温下混合2h。分别将样品置于磁力架上，弃上清，将磁珠分别用6M尿素、1％SDS/PBS、PBS洗涤3次，然后分别加入30μL PBS和30μL 2×loadingbuffer，在95℃下煮沸10min。分别取40μL样品进行SDS-PAGE，然后进行考马斯亮蓝染色(如图4)，从图4中可以看出探针1能有效对Xoo细胞中的DLST蛋白进行富集纯化，对照组则无法对DLST进行有效纯化。
4、探针1-4对柑橘溃疡病菌(Xac)的活体标记
分别取2mL OD600＝0.6的Xac菌液，离心后弃上清，然后用0.99mL PBS(pH＝7.2)重悬细胞。分别加入10μL探针1-4，使其终浓度均为50μM，对照组加入10μL DMSO，25℃孵育2h。离心后弃上清，PBS洗涤3次后加入100μL PBS重悬细胞，冰浴下超声破碎细胞。离心后将蛋白稀释至1μg/μL，分别取45μL上清，然后分别加入biotin-N3、抗坏血酸钠及BTTAA/CuSO4混合溶液进行click反应，分别向样品中加入50μL 2×loading buffer，在95℃下煮沸10min。分别取20μL样品进行SDS-PAGE，然后在200mA恒流下转膜50min，PBST洗膜后用5％脱脂奶粉封闭2h。将膜用PBST清洗后加入HRP标记的链霉亲和素(HRP-Streptavidin)孵育2h，再次用PBST洗膜后，加入化学发光试剂，通过化学发光成像系统进行成像分析(如图5)。从图5中可以看出探针1-4在50μM浓度下均可有效标记Xac细胞中的DLST蛋白，而对照组实验中未能标记DLST。
5、探针2对Xac细胞的浓度依赖性标记实验
分别取2mL OD600＝0.6的Xac菌液，离心后弃上清，然后用0.99mL PBS(pH＝7.2)重悬细胞。分别加入10μL不同浓度的探针2，使其终浓度分别为12.5、25、50、75、100μM，对照组加入10μL DMSO，分别在25℃下孵育2h。离心后弃上清，PBS洗涤3次后加入100μL PBS重悬细胞，冰浴下超声破碎细胞。离心后将蛋白稀释至1μg/μL，分别取45μL上清，然后分别加入biotin-N3、抗坏血酸钠及BTTAA/CuSO4混合溶液进行click反应，分别向样品中加入50μL 2×loading buffer，在95℃下煮沸10min。分别取20μL样品进行SDS-PAGE，然后在200mA恒流下转膜50min，PBST洗膜后用5％脱脂奶粉封闭2h。将膜用PBST清洗后加入HRP标记的链霉亲和素(HRP-Streptavidin)孵育2h，再次用PBST洗膜后，加入化学发光试剂，通过化学发光成像系统进行成像分析(如图6)。从图6中可以看出探针2在12.5-100μM浓度下，对DLST具有浓度依赖性的标记效果，并且对DLST具有较高的选择性。
6、探针2对Xac细胞中DLST的纯化实验
分别取20mL OD600＝0.6的Xac菌液，离心后弃上清，然后用0.99mL PBS(pH＝7.2)重悬细胞。实验组加入10μL探针2，使其终浓度为200μM，对照组加入10μL DMSO，分别在25℃下孵育2h。离心后弃上清，PBS洗涤3次后加入1000μL PBS重悬细胞，冰浴下超声破碎细胞。离心后将实验组与空白组的蛋白稀释至相同浓度，分别取950μL上清，然后分别加入biotin-N3、抗坏血酸钠及BTTAA/CuSO4混合溶液，使其终体积为1000μL，然后37℃下混合2h。分别向体系中加入5倍体积的预冷丙酮，-80℃冷冻2h后离心，弃上清，将沉淀用甲醇洗涤3次，挥干将溶剂后将蛋白沉淀用1mL 0.2％SDS/PBS溶解，然后分别加入1mL链霉亲和素磁珠(Streptavidin bead)，室温下混合2h。分别将样品置于磁力架上，弃上清，将磁珠分别用6M尿素、1％SDS/PBS、PBS洗涤3次，然后分别加入30μL PBS和30μL 2×loading buffer，在95℃下煮沸10min。分别取40μL样品进行SDS-PAGE，然后进行考马斯亮蓝染色(如图7)，从图7中可以看出探针2能有效对Xac细胞中的DLST蛋白进行富集纯化，对照组则无法对DLST进行有效纯化。
实施例4：探针1对重组表达DLST的浓度依赖性标记实验
分别取100ng重组水稻白叶枯病菌DLST(in 44μL PBS)，然后分别加入1μL不同浓度的探针1，使其终浓度分别为0.5、1、2.5、5、10μM，对照组加入1μL DMSO，分别在25℃下孵育2h。然后分别向体系中加入biotin-N3、抗坏血酸钠及BTTAA/CuSO4混合溶液，在37℃下混合2h。再分别向体系中加入50μL 2×loading buffer，在95℃下煮沸10min。分别取40μL样品进行SDS-PAGE，然后在200mA恒流下转膜50min，PBST洗膜后用5％脱脂奶粉封闭2h。将膜用PBST清洗后加入HRP标记的链霉亲和素(HRP-Streptavidin)孵育2h，再次用PBST洗膜后，加入化学发光试剂，通过化学发光成像系统进行成像分析(如图8)。从图8中可以看出探针1在0.5-10μM浓度下，对重组表达DLST具有浓度依赖性的作用方式。
以上所述仅为本发明的优选实施例，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。对于本领域的技术人员，在不脱离本发明原理的前提下仍然可以继续做出改进，这些改进也应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.一种化合物或其立体异构体、或其盐或其溶剂化物，其特征在于以下述式I所示：
其中R1选自任意取代的亚烷基、亚氨基、任意取代或未取代的亚烯基、任意取代或未取代的亚炔基、任意取代或未取代的亚环烷基、任意取代或未取代的亚芳基或任意取代或未取代的亚杂芳基；优选地，选自任意取代或未取代的C1-6亚烷基、任意取代或未取代的C1-6亚芳基；更优选地，选自亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚仲丁基、亚戊基、亚邻苯基、亚间苯基、亚对苯基、亚邻噻吩基、亚间噻吩基、亚邻呋喃基、亚间呋喃基、亚邻吡啶基、亚间吡啶基、亚对吡啶基、亚萘基、亚蒽基、亚卤代苯基；最优选地，选自
R2选自氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基；优选地，选自C1-6烷基或C1-6芳基；更优选地，选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、戊基或苯基。
2.根据权利要求1所述的化合物或其立体异构体、或其盐或其溶剂化物，其特征在于选自下述化合物：
探针1：2-(甲磺酰基)-5-(4-氟-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；
探针2：2-(乙磺酰基)-5-(4-氟-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；
探针3：2-(甲磺酰基)-5-(3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；
探针4：2-(乙磺酰基)-5-(3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；
探针5：2-(甲磺酰基)-5-(2,4-二氯-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；
探针6：2-(乙磺酰基)-5-(2,4-二氯-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑。
3.一种制备权利要求1中式I化合物的化合物，其特征在于如下述式6所示：
其中R1和R2如权利要求1所述；优选地，式6化合物为：
6-1：2-(甲硫基)-5-(4-氟-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；
6-2：2-(乙硫基)-5-(4-氟-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；
6-3：2-(甲硫基)-5-(4-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；
6-4：2-(乙硫基)-5-(4-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；
6-5：2-(甲硫基)-5-(2,4-二氯-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；
6-6：2-(乙硫基)-5-(2,4-二氯-3-(丙炔基氧基)甲基)苯基-1,3,4-噁二唑。
4.一种制备式6化合物的化合物，其特征在于如下述式5所示：
其中R1和R2如权利要求1所述，优选地，式5化合物为：
5-1：2-(甲硫基)-5-(3-(溴甲基)-4-氟)苯基-1,3,4-噁二唑；
5-2：2-(乙硫基)-5-(3-(溴甲基)-4-氟)苯基-1,3,4-噁二唑；
5-3：2-(甲硫基)-5-(4-(溴甲基))苯基-1,3,4-噁二唑；
5-4：2-(乙硫基)-5-(4-(溴甲基))苯基-1,3,4-噁二唑；
5-5：2-(甲硫基)-5-(2,4-二氯-3-(溴甲基))苯基-1,3,4-噁二唑；
5-6：2-(乙硫基)-5-(2,4-二氯-3-(溴甲基))苯基-1,3,4-噁二唑。
5.一种制备式5化合物的化合物，其特征在于如下述式4所示：
其中R1和R2如权利要求1所述；优选地，式4化合物为：
4-1：2-(甲硫基)-5-(3-甲基-4-氟)苯基-1,3,4-噁二唑；
4-2：2-(乙硫基)-5-(3-甲基-4-氟)苯基-1,3,4-噁二唑；
4-3：2-(甲硫基)-5-(4-甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；
4-4：2-(乙硫基)-5-(4-甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；
4-5：2-(甲硫基)-5-(2,4-二氯-3-甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；
4-6：2-(乙硫基)-5-(2,4-二氯-3-甲基)苯基-1,3,4-噁二唑。
6.一种制备式4化合物的化合物，其特征在于如下述式3所示：
其中R1如权利要求1所述；优选地，式3化合物为：
3-1：2-巯基-5-(3-甲基-4-氟)苯基-1,3,4-噁二唑；
3-2：2-巯基-5-(4-甲基)苯基-1,3,4-噁二唑；
3-3：2-巯基-5-(2,4-二氯-3-甲基)苯基-1,3,4-噁二唑。
7.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于包括下述步骤：
优选地包括以式6化合物制备式I化合物的反应步骤；
进一步优选地包括以式5化合物制备式6化合物的反应步骤；
再进一步优选地包括以式4化合物制备式5化合物的反应步骤；
再进一步优选地包括以式3化合物制备式4化合物的反应步骤；
最优选地，所述制备方法包括：(1)以式3化合物制备式4化合物；(2)再以式4化合物制备式5化合物；(3)再以式5化合物制备式6化合物；(4)再以式6化合物制备式I化合物的反应步骤。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：优选地，步骤(1)中，式3化合物在KOH和硫酸二甲(乙)酯存在下制备式4化合物；
优选地，步骤(2)中，式4化合物在NBS和AIBN存在下制备式5化合物；优选地，步骤(3)中，式5化合物在炔丙醇和NaH存在下制备式6化合物；优选地，步骤(4)中，式6化合物在mCPBA存在下制备式I化合物。
9.一种组合物，其特征在于含有权利要求1或2所述的化合物，以及农业上可用的助剂或杀菌剂、杀虫剂或除草剂；或药学上可用的助剂；当所述组合物含有农业上可用的助剂时，所述组合物的剂型选自乳油(EC)、粉剂(DP)、可湿性粉剂(WP)、颗粒剂(GR)、水剂(AS)、悬浮剂(SC)、超低容量喷雾剂(ULV)、可溶性粉剂(SP)、微胶囊剂(MC)、烟剂(FU)、水乳剂(EW)、水分散性粒剂(WG)；当所述组合物含有药学上可用的助剂时，所述组合物的剂型选自素片、薄膜包衣片、糖衣片、肠衣片、分散片、胶囊、颗粒剂、口服溶液或口服混悬液。
10.权利要求1或2所述的化合物在防治农业病虫害方面的用途，优选地，所述农业病虫害为植物细菌性或真菌性病害；更优选地，所述农业病虫害为植物叶枯病和植物溃疡病；最优选地，所述农业病虫害为水稻白叶枯病、烟草青枯病、黄瓜白叶枯病、魔芋白叶枯病、柑桔溃疡病、葡萄溃疡病、番茄溃疡病、猕猴桃溃疡病、苹果溃疡病、黄瓜灰霉病、辣椒枯萎病、油菜菌核病、小麦赤霉病、马铃薯晚疫病、蓝莓根腐。
11.权利要求1或2所述的化合物在制备治疗或预防阿尔茨海默病或白血病药物方面的用途；优选地，在制备预防阿尔茨海默病、白血病或心血管疾病药物中，所述化合物被制备成在活细胞中标记检测二氢硫辛酸琥珀酰转移酶的试剂或对活细胞标记后的目标蛋白的纯化试剂。
12.一种防治农业病虫害的方法，其特征在于：使权利要求1或2所述的式I化合物，或权利要求9的组合物作用于有害物或其生活环境；优选地，所述农业病虫害为植物细菌性或真菌性病害；更优选地，所述农业病虫害为水稻白叶枯病、黄瓜白叶枯病、魔芋白叶枯病、柑桔溃疡病、烟草青枯病、葡萄溃疡病、番茄溃疡病、猕猴桃溃疡病、苹果溃疡病。
13.用于保护植物免受农业病虫害侵害的方法，其包括其中使植物与权利要求1或2所述的式I的化合物或与权利要求9的组合物接触的方法步骤。
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| CN102499247A (zh) * | 2011-10-17 | 2012-06-20 | 贵州大学 | 一类防治作物细菌病害的噁二唑砜类化合物 |
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