CN109528688A - 新型耐温纳米载药系统 - Google Patents

Abstract

本发明属于纳米载药领域，具体涉及一种新型耐温纳米载药系统，包括来源于牛奶的脂质微泡。本发明的一种耐温纳米载药系统，以源自饲养处于泌乳期奶牛的牛奶提取的尺寸在150nm左右的脂质微泡为载体，联合包裹在所述脂质微泡内的化疗药，使化疗药物更多的作用肿瘤细胞，同时降低化疗药物对机体的毒副作用。

Description

新型耐温纳米载药系统

技术领域

本发明属于纳米载药领域，具体涉及一种新型耐温纳米载药系统。

背景技术

纳米载药系统由于具有EPR效应，能够提高肿瘤靶向性，增强化疗药物疗效并降低毒副作用而被广泛用于肿瘤治疗。已经报道的可对化疗药物进行包裹进行靶向给药的纳米材料包括：聚乙二醇-脑磷脂共聚物(PEG-PE)、聚乳醛乙醇酸共聚物(PLGA)等，已证实可以用于包裹化疗药物，并且可以将化疗药物输送到肿瘤部位，提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。抗肿瘤纳米载药系统通过静脉注射到达靶部位时需经过体内多重生理屏障，为突破这些生理屏障，理想的纳米载药系统须具备血液中长循环、肿瘤部位有效富集、肿瘤深部穿透、被肿瘤细胞有效摄取及胞内响应性释放药物的能力等。由于纳米材料是外源性物质，其本身对生物机体存在一定的毒副作用，同时临床使用的纳米材料的粒径规格也导致该材料携带的化疗药物对机体的毒副作用。尽管目前有很多策略用来改善纳米药物抗肿瘤治疗效果，但这些策略大多不能满足所有条件来克服体内的多重生理屏障。此外，很多的纳米材料的生产及工艺要求高，成本大，不利于临床推广应用。

生物来源的纳米材料作为载药系统能克服传统的合成纳米材料作为载药系统的不足。已有研究证实，生物膜结构形成的囊泡作为载体能将药物输送到生物体病灶部位，并且具有靶向性。由于细胞来源的囊泡粒径较大(400-1000nm)，在体外不稳定，而且对热不耐受；同时，有些用肿瘤细胞来源的囊泡作为药物载体，存在对生物体内诱发形成肿瘤的风险；细胞来源的囊泡在制备中要求较高，成本大，不能够一次大量获得。

因此，如何找到一种能大量获得，又具有耐高温特性，同时也具有生物活性的纳米载体，已成为医学治疗中急需解决的难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型耐温纳米载药系统。

本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种新型耐温纳米载药系统，包括来源于牛奶的脂质微泡。

所述的脂质微泡的平均粒径为150nm,且粒径范围为100-200nm。

所述的牛奶牛初乳或者其他不同泌乳期分泌的牛奶。

所述的脂质微泡可以采用下述步骤制备：将所述的牛奶以13000-20000g的离心力离心分离去除脂肪球、酪蛋白及碎片，取上清液以20000g的离心力离心0.5-2小时，收集获得的沉淀即为脂质微泡。

所述的脂质微泡也可以采用下述步骤制备：使用滤膜过滤，滤膜孔径为10微米；将过滤后得到的上清液以20000g的离心力离心0.5-2小时，收集获得的沉淀即为脂质微泡。

离心分离条件为常温或者0-10度低温条件。常温指30度以下。

所述的脂质微泡耐受不超过42度的热灌注治疗6小时以内。

还包括治疗药；所述的脂质微泡和化疗药在室温混合孵育0.5-2小时。

可以应用于治疗卵巢癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌或直肠癌。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明的一种耐温纳米载药系统，以源自饲养处于泌乳期奶牛的牛奶提取的尺寸在150nm左右的脂质微泡为载体，联合包裹在所述脂质微泡内的化疗药，使化疗药物更多的作用肿瘤细胞，同时降低化疗药物对机体的毒副作用。

2、本发明的脂质微泡载体施用到肿瘤细胞时，能靶向更多的肿瘤细胞，同时由于其较小的纳米尺寸，能提高作为有效成分的化疗药物在肿瘤的释放，增强肿瘤细胞对包裹化疗药的摄取，在治疗中可以降低给药剂量，在减少化疗药对人体的伤害的同时，几乎可以避免外来载体对身体的危害。

3、牛奶的获得非常容易，提取方法成熟，根据本发明记载的方案可从牛奶中获得大量的脂质微泡用于制备本发明的药物制剂，成本非常小，操作简单。

附图说明

图1为牛奶提取的脂质微泡的SEM图。

图2为本发明的脂质微泡的表征图，包括粒径分布和表面电位。

图3为本发明的脂质微泡在42度条件下不同时间的表征，包括粒径和表面电位。

图4显示了电镜下观察到的脂质微泡在42度条件下孵育6小时后的图。

图5本发明的耐温纳米载药系统对肿瘤细胞具有杀伤作用。

图6本发明的耐温纳米载药系统抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的存活时间。

图7本发明的耐温纳米载药系统对机体的毒副作用。

具体实施方式

为了使本技术领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和最佳实施例对本发明作进一步的详细说明。

所述实施例中使用的牛奶、肿瘤细胞、药物及实验动物：H22小鼠肝癌细胞系均可从美国ATCC公司或中国典型物保藏中心CCTCC购买。BALB/C小鼠均购自武汉大学医学实验动物中心，周龄在5-6周，体重18克；牛奶来自牧场饲养的奶牛产的新鲜的初乳。

实施例1：牛奶中脂质微泡的制备：将牛奶分装到离心管中，通过离心收集上述脂质微泡，包括：先以13000g的离心力，在4度的条件下，离心30分钟，去除脂肪球、酪蛋白及碎片，将获得的上清液在20000g离心1小时，收集获得的沉淀即为脂质微泡。

实施例2：牛奶中脂质微泡的制备：将牛奶聚丙烯滤膜过滤，滤膜孔径为10微米。将过滤后得到的上清液以20000g的离心力离心1小时，收集获得的沉淀即为脂质微泡。离心条件可以为0.5-2小时之间,得到的脂质微泡基本相似。

实施例1-2制备得到的脂质微泡效果相似，效果说明:

1、将收集到的脂质微泡用0.9％(g/ml)生理盐水重悬后在透射电镜下观察，从图1可以看出，脂质微泡的粒径范围是在150纳米左右，且均一度较高，成泡状。

2、将收集到的脂质微泡用0.9％(g/ml)生理盐水重悬后，将重悬后的脂质微泡在42℃水浴中孵育6小时后再透射电镜下观察。从图4可以看出，脂质微泡的粒径范围是在150纳米左右，且均一度较高，成泡状。证实本发明的牛奶提取的脂质微泡在42℃环境下6小时后，脂质微泡的生物结构没有破坏，也没有发生聚集。适用于临床的热灌注治疗

3、将收集到的脂质微泡用0.9％(g/ml)生理盐水重悬后用激光粒度仪检测粒度及电位。，从图2中可以看出，牛奶提取的脂质微泡的粒径平均粒径150纳米左右，而且粒径分布很窄，说明材料比较均一(图2A)；表面电位在-10mV(图2B)。

4、收集到的脂质微泡用0.9％(g/ml)生理盐水重悬后在42℃水浴中分别孵育1,2,4,6小时。用激光粒度仪检测不同孵育时间后脂质微泡的粒度及电位。结果显示，牛奶提取的脂质微泡在42℃的环境中，进过不同时间的孵育，其粒径(图3A,3C,3E,3G)和电位(图3B,3D,3F,3H)没有显著改变，且其粒径分布较窄，说明脂质微泡在高温的环境下没有发生团聚。证实本发明的牛奶提取的脂质微泡能耐受42℃的温度，适用临床的热灌注治疗。

实施例3：耐温纳米载药系统对肿瘤细胞具有杀伤作用。

1、实验材料和试剂：H22小鼠肝癌细胞系,化疗药阿霉素商购获得,牛奶为商购。

2、实验步骤：

1)脂质微泡的制备。制备方法同实施例1。

2)将制备的脂质微泡和阿霉素溶液(1mg/ml)在室温条件下孵育1小时，然后20000g离心1小时，沉淀即为包裹阿霉素的载药脂质微泡。

3)在RPMI medium1640细胞培养液中培养H22肝癌肿瘤细胞，将肿瘤细胞种在96孔板种，1×10⁴个/孔。

将获得的载药脂质微泡以阿霉素的当量，分别以0.5,2,4ug/ml阿霉素的量与肿瘤细胞孵育，孵育24小时，作为实验组；将添加游离阿霉素的肿瘤细胞作为对照组。24小时后通过MTT观察细胞的存活情况。

3、实验结果：由图5所示，本发明的载药脂质微泡对肿瘤细胞有杀伤作用。与化疗药物直接杀伤肿瘤细胞的对照组相比，载药脂质微泡的实验组肿瘤细胞的凋亡率更高，说明本发明的载药脂质微泡能杀伤更多的肿瘤细胞。

实施例4：本发明的耐温纳米载药系统抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的存活时间。

1、实验材料和试剂:使用的H22小鼠肝癌细胞同实施例3,化疗药阿霉素商购获得,牛奶为商购，BALB/C小鼠购自武汉大学医学动物中心。

2、实验步骤:

1)脂质微泡的制备。制备方法同实施例1。

2)载药脂质微泡的制备同实施例3。

3)在RPMI medium1640细胞培养液中培养H22肝癌肿瘤细胞。

4)小鼠肝癌H22腹水模型的建立：从上述培养的细胞中取1×10⁵H22小鼠肝癌细胞腹腔接种到BALB/C小鼠，共注射小鼠56只，获得患H22肝癌细胞腹水的BALB/C小鼠，随机分为等数量的4组。

5)将所制备的包裹化疗药的脂质微泡以4mg(阿霉素当量)/kg的给药量、200μl的剂量分别腹腔注射BALB/C小鼠作为实验组，将脂质微泡以25mg蛋白/kg的给药量、200μl的剂量分别腹腔静脉注射BALB/C小鼠作为对照组1；同时对另外BALB/C小鼠分别注射相同剂量的阿霉素和0.9％(g/ml)的生理盐水，分别作为对照组2,3。每天一次，连续7天，第8天起正常饲养。

3、实验结果:将实验组和对照组中的BALB/C小鼠都分为等数量的两组，实验组中的第一组BALB/C小鼠和对照组中第一组BALB/C小鼠分别于第10天处死，测量腹水体积(图6中的6A)，实验组中的第,二组BALB/C小鼠和对照组中第二组BALB/C小鼠分别用于观察存活时间。结果表明，相比于对照组，实验组中载药脂质微泡显著抑制BALB/C小鼠的肝癌细胞的生长，并延长BALB/C小鼠的存活时间(图6中6B)。

实施例7：包裹化疗药的微颗对机体的毒副作用。

1、实验材料和试剂:使用的H22小鼠肝癌细胞同实施例1,化疗药阿霉素,牛奶为商购,BALB/C小鼠购自武汉大学医学动物中心。

2、实验步骤:

1)脂质微泡的制备。制备方法同实施例1。

2)载药脂质微泡的制备同实施例3。

3)在RPMI medium1640细胞培养液中培养H22肝癌肿瘤细胞。

4)小鼠肝癌H22腹水模型的建立：同实施例4。

5)将获得患H22肝癌细胞腹水的BALB/C小鼠，随机分为等数量的4组。将所制备的包裹化疗药的脂质微泡以4mg(阿霉素当量)/kg的给药量、200μl的剂量分别腹腔注射BALB/C小鼠作为实验组，将脂质微泡以25mg蛋白/kg的给药量、200μl的剂量分别腹腔静脉注射BALB/C小鼠作为对照组1；同时对另外BALB/C小鼠分别注射相同剂量的阿霉素和0.9％(g/ml)的生理盐水，分别作为对照组2,3。每天一次，连续7天，第8天起正常饲养。

6)第10天，分别对实验组，对照组小鼠取静脉血，检测血清中关于心脏，肾脏和肝脏毒性指标。

3、实验结果:由图7可以看出，相比于对照组小鼠，注射包裹化疗药的脂质微泡组的小鼠的所有相关毒性指标都要显著低于对照组。可见，用牛奶提取的脂质微泡包裹化疗药得到的药物制剂对机体基本没有毒副作用。

以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (9)

1.一种新型耐温纳米载药系统，其特征在于，包括来源于牛奶的脂质微泡。

2.根据权利要求1所述的新型耐温纳米载药系统，其特征在于，所述的脂质微泡的平均粒径为150nm。

3.根据权利要求1所述的新型耐温纳米载药系统，其特征在于，所述的牛奶牛初乳或者其他不同泌乳期分泌的牛奶。

4.根据权利要求1所述的新型耐温纳米载药系统，其特征在于，所述的脂质微泡采用下述步骤制备：将所述的牛奶以13000-20000g的离心力离心分离去除脂肪球、酪蛋白及碎片，取上清液以20000g的离心力离心0.5-2小时，收集获得的沉淀即为脂质微泡。

5.根据权利要求1所述的新型耐温纳米载药系统，其特征在于，所述的脂质微泡采用下述步骤制备：使用滤膜过滤，滤膜孔径为10微米；将过滤后得到的上清液以20000g的离心力离心0.5-2小时，收集获得的沉淀即为脂质微泡。

6.根据权利要求4-5所述的新型耐温纳米载药系统，其特征在于，离心分离条件为常温或者0-10度低温条件。

7.根据权利要求1所述的新型耐温纳米载药系统，其特征在于，所述的脂质微泡耐受不超过42度的热灌注治疗6小时以内。

8.根据权利要求1所述的新型耐温纳米载药系统，其特征在于，还包括治疗药；所述的脂质微泡和化疗药在室温混合孵育0.5-2小时。

9.根据权利要求8所述的新型耐温纳米载药系统，其特征在于，可以应用于治疗卵巢癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌或直肠癌。