CN109527270A - 水蛭特异性营养诱导液及天然水蛭素的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及水蛭特异性营养诱导液及天然水蛭素的提取方法。该水蛭特异性营养诱导液包括氯化钠、复合氨基酸、葡萄糖、反式‑4,5‑环氧基‑2‑癸烯醛和无菌水。本发明采用活体诱导喂饱菲牛蛭的方法，避免了水蛭大规模的采杀，使水蛭得到重复利用。采用喂食特异性营养诱导液代替全牛血和其它适口性差的诱导物质，既能诱导水蛭充分吸食，又减少了大量血液等杂蛋白混入，有利于后续天然水蛭素分离和纯化。

Description

水蛭特异性营养诱导液及天然水蛭素的提取方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及水蛭特异性营养诱导液及天然水蛭素的提取方法。

背景技术

水蛭俗称蚂蟥、马鳖等，在动物分类学上隶属于环节动物门、蛭纲的种类。目前世界上估计约有500种，在我国有100种左右，业已发现89种。水蛭根据其食性可以分为吸血和不吸血两大类。目前国际上将吸食哺乳动物或者其它脊椎动物血液的吸血水蛭统称为医用水蛭。

菲牛蛭(Poecilobdella manillensis Lesson)俗称金边蚂蟥，隶属于环节动物门、蛭纲、无吻蛭目、医蛭科、牛蛭属。在吸血类水蛭中，菲牛蛭是一个体型较大的种类，在我国主要分布于我国华南的广西、广东、福建、海南和香港等地低于海拔500m的广大地区。通常生活在稻田、水沟、江河或池塘里，主要以吸吮人和脊椎动物(如牛、青蛙等)的血液为生。

1884年威尔士国家医学院海克拉夫特首先发现吸血水蛭咽部具有水溶性抗凝血物质。1904年雅各比将这种物质命名为“水蛭素”(Hirudin)。1955年德国马克沃德特首次从吸血水蛭体内分离提取出较纯的水蛭素。科学研究表明，菲牛蛭体内含有丰富的抗凝血酶活性物质即天然水蛭素，它是迄今为止世界上所发现作用最强的天然抗凝血酶物质，对人类心脑血管疾病尤其是脑血栓等疾病具有较好的疗效。

近一个世纪以来，各国学者对吸血水蛭的唾液腺分泌物进行广泛而又深入研究。现代医学科学和药理学研究表明，吸血水蛭在吸吮血液过程中能够分泌大量的唾液，其唾液中含有许多生物活性成分，主要包括：(1)含有直接作用于凝血系统的成分，如水蛭素等。(2)含有类似于吗啡类的生物镇痛及消炎成分。(3)含有抑制各种细菌生长的抗生素物质(如金黄色葡萄球菌等)。(4)含有能促使伤口愈合并减少疤痕形成的成分，如水蛭透明质酸酶类物质等。各国科学家还在吸血水蛭唾液腺分泌物中发现了许多与吸食哺乳动物血液相关联的生物活性物质，如麻醉剂(Anaesthetic)、血管扩张剂(Vasodilator)、裂纤酶(Hementin)、前列腺素(Prostaglandins)以及安替斯塔辛(Antistasin)、博待啉(Bdellins)和伊格啉(Eglins)等其它蛋白酶抑制剂。天然水蛭素是迄今为止世界上所发现作用最强的抗凝血酶物质，其在治疗某些血液性疾病方面优于肝素和其它凝血酶抑制剂，能够更有效地抑制凝血酶诱发的弥散性血管内凝血和静脉血栓形成，在治疗诸如败血休克、动脉粥样硬化、脑血管梗塞、心血管病、眼科以及遗传性疾病等缺少抗凝血酶Ⅲ的病例方面显示出巨大的优越性，从而引起各国医药工作者的广泛重视。因此，各国生物学科研工作者对水蛭素的纯化产生极大兴趣，也尝试了很多分离纯化的方法。目前，现有国内有关天然水蛭素分离提取方法如下：

1、以水蛭组织为原料直接提取方法。这些方法主要是将水蛭或者局部组织捣碎成浆状，采用高温蒸煮法、双水相沉淀法、有机溶剂沉淀法等等。此外还采用层析法(如凝胶层析、离子交换层析等)、等电聚焦等方法提取水蛭素。如“医用天然水蛭素的提取方法”(CN92107076)；“一种天然水蛭素的生产方法”(CN 201110237485.6)；“一种以菲牛蛭唾液为原料的水蛭素生产工艺”(CN 92107076)；“动物血水蛭水解法及其水蛭水解血”(CN95105650.6)；“一种天然水蛭素有效成分的提取方法”(CN 200710066096.1)。最近研究发现：水蛭躯体组织中存在有大量的与水蛭素结构类似的“伪水蛭素”(Pseudo-hirudin)组分。“伪水蛭素”无生物活性，它的存在增加水蛭素分离的难度。除此之外，其它杂质(如组织液蛋白、动物血液等)含量过多，因此分离工艺复杂、生产周期长、提取率低、成本过高而在实际中无法采用。

2、使用双酶法提取水蛭素。如“一种富含高活性水蛭素的水蛭全粉的制备方法”(CN 104906142 A)；“一种从天然水蛭中提取高抗凝活性水蛭素方法”(CN201010526681.7)；这些方法提取步骤繁琐、操作条件较为严苛。尤其是涉及高温条件，同时又有机溶剂和复杂酶系参与，容易导致产物活性降低，不利于工艺的放大。

3、诱导水蛭唾液分泌物提取水蛭素。如“从菲牛蛭活体中提取天然水蛭素的方法”(ZL 03113566.8)，采用多种无机酸、氨基酸和无机盐混配的诱导物质喂饱水蛭，然后通过人工挤压方法获取含有唾液的混合液体。该方法获得水蛭素含量低，而且能够造成水蛭大量受伤而死亡。如“用电刺激活体水蛭提取水蛭素的方法”(CN 201010604457.5)，采用电流刺激水蛭，其结果使水蛭收缩成团，促使水蛭表皮细胞分泌大量粘液物质，其中水蛭素含量极少而且几乎没有活性，此外液对水蛭造成伤害。如“水蛭素的提取及含量测定”《黑龙江医药科学》2010年第33卷第04期第87页描述了采用化学物质作为诱导液(不同配比的氯化钠和L-精氨酸混合液)收集水蛭唾液腺分泌物。其缺点是水蛭素活性较低，最高仅为40ATU。如“一种吸血水蛭多次提取天然水蛭素方法”(CN 201210493449.7)，采用以蚯蚓的提取液为主，以多糖类物质为辅制备特异性诱导液，让水蛭喝饱，同样再采取物理挤压方式收集唾液(含多种蛋白和糖类等大分子杂质)，如此反复多次；最后将水蛭处死磨浆，采用电泳法或层析法等常规生化分离水蛭素。该方法同样也存在挤压物理刺激对水蛭造成伤害，另外采用水蛭整体组织中其它杂质(如组织液、动物血液等)含量过多，最后导致提取水蛭素纯度和回收率很低。虽然“一种天然水蛭素的规模化生产方法”(CN104151425A)记录了采用乙酸、柠檬酸、氯化钠和碳酸盐溶液作为诱导物质，同时使用硫酸锌或者硫酸锌与乙醇混合液作为催吐剂，但是水蛭吸食量和催吐效果欠佳，尤其是对水蛭吐出的粗品液体(初级提取液)，仅仅采取过滤除杂和干燥两步简单工艺进行水蛭素的提取，显而易见很难获得高活性和高纯度天然水蛭素。

4、当前对水蛭素提取液采用冷冻干燥技术仍然存在相当程度的活性损失，而且水蛭整体匀浆中残留大量的宿主动物血液等杂质也不利于进一步的分离和纯化。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了水蛭特异性营养诱导液及天然水蛭素的提取方法。本发明采用喂食特异性营养诱导液代替全牛血或者其它适口性差的诱导物质，既能诱导水蛭充分大量地吸食，又避免了多种杂蛋白等大分子物质混入吐出液里，有利于下一步水蛭素分离和纯化。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种水蛭特异性营养诱导液，包括氯化钠、复合氨基酸、葡萄糖、反式-4,5-环氧基-2-癸烯醛和无菌水。

鉴于上述专利存在的问题，本发明提供了一种特异性营养诱导液，在水蛭吸食过程中其唾液腺不断地产生水蛭素。分泌的水蛭素随着水蛭吸食诱导液一起进入其体内嗉囊里。在不伤害水蛭的情况下，使用催吐剂让水蛭再吐出来，收集含有水蛭素的吐出液即为初级提取液。这种初级提取液里除了水蛭素以外基本上没有其它生物大分子等杂质成分，使得后续的分离纯化工作变得简单、快速而且有效。将收集的初级提取液进行硫酸铵分级盐析、冷冻干燥成冻干粉，能够大幅度提高水蛭素提取纯度和回收率。同时在冷冻干燥过程中加入水蛭素保护剂和表面活性剂，不但可以减少水蛭素活性损失，而且还有利于长期保存。

作为优选，水蛭特异性营养诱导液中各原料的浓度为：

氯化钠100～200mmol/L，复合氨基酸5～15mmol/L，葡萄糖0.5～1.5mmol/L，反式-4,5-环氧基-2-癸烯醛0.02～0.05mg/ml，加无菌水至终浓度。

优选地，水蛭特异性营养诱导液中各原料的浓度为：

氯化钠150mmol/L，复合氨基酸10mmol/L，葡萄糖1mmol/L，反式-4,5-环氧基-2-癸烯醛0.03mg/ml，加无菌水至终浓度。

优选地，水蛭特异性营养诱导液中各原料的浓度为：

氯化钠150mmol/L，复合氨基酸10mmol/L，葡萄糖1mmol/L，反式-4,5-环氧基-2-癸烯醛0.02mg/ml，加无菌水至终浓度。

优选地，水蛭特异性营养诱导液中各原料的浓度为：

氯化钠100mmol/L，复合氨基酸15mmol/L，葡萄糖0.5mmol/L，反式-4,5-环氧基-2-癸烯醛0.04mg/ml，加无菌水至终浓度。

优选地，水蛭特异性营养诱导液中各原料的浓度为：

氯化钠200mmol/L，复合氨基酸5mmol/L，葡萄糖1.5mmol/L，反式-4,5-环氧基-2-癸烯醛0.05mg/ml，加无菌水至终浓度。

本发明还提供了一种水蛭素的提取方法，包括如下步骤：

步骤1：采用上述水蛭特异性营养诱导液喂食水蛭；

步骤2：将喂饱的水蛭置于催吐剂中，使其吐出体内液体，移除水蛭，得到初级提取液；

步骤3：采用硫酸铵对初级提取液进行硫酸铵分级沉淀除杂，离心，透析除盐，浓缩，冷冻干燥，得到提取物即天然水蛭素。

作为优选，步骤1中水蛭为禁食20～40天的水蛭。

优选地，水蛭为禁食28～32天的水蛭。

作为优选，水蛭为包括菲牛蛭、日本医蛭或棒纹医蛭等所有吸血水蛭。

优选地，水蛭为菲牛蛭。

作为优选，步骤1中水蛭特异性营养诱导液为预热至36～38℃的水蛭特异性营养诱导液。

优选地，水蛭特异性营养诱导液为预热至37℃的水蛭特异性营养诱导液。

作为优选，水蛭特异性营养诱导液的喂食量为5～7mL/g·bw。

优选地，水蛭特异性营养诱导液的喂食量为5mL/g·bw。

作为优选，催吐剂为质量百分含量6％～10％的乙醇。

作为优选，以g/mL计，水蛭与催吐剂比例为1:(1～2)。

作为优选，将喂饱的水蛭置于催吐剂中15～20min。

优选地，催吐剂为质量百分含量8％的乙醇。

优选地，以g/mL计，水蛭与催吐剂比例为1:1。

优选地，将喂饱的水蛭置于催吐剂中20min。

作为优选，硫酸铵为30％～80％饱和度的硫酸铵。

作为优选，离心的温度为3～5℃，离心的转速为7000～9000rpm，离心时间为18～22min。

优选地，离心的温度为4℃，离心的转速为8000rpm，离心时间为20min。

作为优选，步骤3后还包括：

将水蛭素提取物溶于生理盐水，加入冻干保护剂、表面活性剂，冷冻干燥，得到水蛭素提取物冻干粉。

作为优选，冻干保护剂为甘露醇和海藻糖的混合物。

作为优选，表面活性剂为吐温-80。

作为优选，甘露醇的质量百分浓度为1％～4％，海藻糖的质量百分浓度为1％～4％，吐温-80的质量百分浓度为0.1％～1.5％。

优选地，甘露醇的质量百分浓度为3％，海藻糖的质量百分浓度为3％，吐温-80的质量百分浓度为1％。

作为优选，冷冻干燥的温度为-40℃～-72℃，冷冻干燥的时间为40小时以上。

优选地，冷冻干燥的温度为-55℃，冷冻干燥的时间为48小时。

本发明提供了水蛭特异性营养诱导液及天然水蛭素的提取方法。该水蛭特异性营养诱导液包括氯化钠、复合氨基酸、葡萄糖、反式-4,5-环氧基-2-癸烯醛和无菌水。本发明具有以下有益效果：

1、采用活体诱导喂饱菲牛蛭的方法，避免了水蛭大规模的采杀，使水蛭得到重复利用。采用喂食特异性营养诱导液代替全牛血或者其它适口性差的诱导物，既能诱导水蛭充分吸食，又减少了大量血液等杂蛋白混入水蛭嗉囊里，有利于下一步针对催吐后的吐出液(初级提取液)中的水蛭素分离提取。

2、本发明采用硫酸铵分级沉淀进行除杂和浓缩，不仅能够快速除去杂蛋白又能有效地收集水蛭素等活性物质，同时采用此法进行浓缩，不会使水蛭素变性，操作简单，工艺无毒。

3、本发明采用添加保护剂海藻糖、甘露醇和表面活性剂吐温-80进行冷冻干燥，有效保护了水蛭素的活性，降低了活性损失。

具体实施方式

本发明公开了水蛭特异性营养诱导液及水蛭素的提取方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

针对现有水蛭素提取技术的缺陷与不足，本发明主要使用以无机盐和氨基酸和反式-4,5-环氧基-2-癸烯醛为主要成分的水蛭特异性营养诱导液，通过活体诱导方法可以快速获得水蛭唾液分泌的水蛭素，它既不杀死水蛭，又可以通过继续饲养水蛭以便多次提取，有效地提高生物资源利用率。

本发明要解决的技术问题一个是在现有技术中水蛭活性物质制备方法效率低，且不易除去血红蛋白和血红素等生物大分子杂质问题。通过喂食特异性营养诱导液之后，再对水蛭进行催吐，这样就会减少了其它杂质和蛋白混入，初级提取液(吐出液)中的杂质比以往方法减少了70％，以解决现有水蛭素分离提取存在复杂技术环节，明显地降低生产成本，显著提高水蛭素的纯度和回收率。

本发明要解决的技术问题另一个是以往技术中对水蛭活性物质冷冻干燥过程中会造成较高的活性损失。在本次发明中加入水蛭素的保护剂和表面活性剂，与以往冷冻干燥(活性损失率在35-40％)方法相比，其活性损失降低到9％，显著的降低了水蛭素的活性损失，能够为实现天然水蛭素的工厂化大规模生产提供新方法。

本发明的水蛭活体诱导、高效提取天然水蛭素生产方法，包括以下步骤：

(1)喂食特异性营养诱导液：将禁食饥饿一个月左右成体菲牛蛭，用无菌水冲洗干净。用肠衣灌装预热至37℃特异性营养诱导液饲喂1.5-2h。所述的特异性营养诱导液是以无机盐、氨基酸和反式-4,5-环氧基-2-癸烯醛为主要原料，分别按照一定比例配置而成的特异性营养液。

(2)催吐收集初级提取液：将喂饱菲牛蛭放入盛有催吐剂容器中浸泡15-20min，使其吐出体内液体；取出水蛭移至盛有无菌水中反复浸泡清洗干净；将水蛭放入矿质水中继续饲养，以备下一次提取天然水蛭素之用；同时收集容器内的液体即为天然水蛭素的初级提取液(内含诱导液、唾液腺分泌物、催吐剂和其它粘液混合物)。

(3)用硫酸铵分级沉淀对初级提取液进行除杂，透析除盐、浓缩，离心,收集沉淀即为水蛭素提取物。

(4)将提取物溶于生理盐水并加入保护剂(甘露醇、海藻糖)和表面活性剂(吐温-80)，-80℃过夜预冻，然后冷冻干燥48h，即得到水蛭素冻干粉，室温干燥保存。

作为优选，所述步骤(1)中喂食菲牛蛭的特异性营养诱导液采用无机盐和氨基酸的混合溶液。特异性营养诱导液配方是：150mmol/L Nacl，10mmol/L复合氨基酸，1mmol/L葡萄糖，0.03％反式-4,5-环氧基-2-癸烯醛。

作为优选，所述步骤(2)中催吐剂采用8％乙醇；水蛭与催吐剂比例为1:1(m/v)。

作为优选，所述步骤(3)中硫酸铵分级沉淀采用硫酸铵饱和度为30％-80％。

作为优选，所述步骤(3)中离心采用4℃，8000rpm，20min。

作为优选，所述步骤(4)中加入保护剂和表面活性剂，保护剂具体比例为3％甘露醇和3％海藻糖，表面活性剂具体比例为1％吐温-80。使天然水蛭素在冷冻干燥过程中得到极大保护，与以往冷冻干燥相比，其活性损失降低到9％。

本发明特色在于：

1、通过活体诱导方法可以快速获得水蛭唾液分泌的水蛭素，它既不杀死水蛭，可以通过继续饲养水蛭多次提取，有效地提高生物资源利用率。

2、水蛭素分离纯化工艺简单，减少了其它杂质和蛋白混入，其杂质比常规提取方法减少了70％的杂蛋白，回收率提高90％，明显地降低生产成本，显著提高水蛭素的纯度和比活力。

3、在冷冻干燥过程中通过加入保护剂和表面活性剂，使水蛭素的活性损失率从以往的35％降低到现在的9％，为提取天然水蛭素提供了便捷高效的途径，使天然水蛭素的规模化、工厂化生产变为现实。

本发明提供的水蛭特异性营养诱导液及水蛭素的提取方法中所用原料均可由市场购得。其中，反式-4,5-环氧基-2-癸烯醛购自Santacruze公司，编号：CAS 134454-31-2；复合氨基酸购自源叶公司，品牌为源叶。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

将禁食饥饿一个月左右成体菲牛蛭30g，用无菌水冲洗干净。用肠衣灌装预热至37℃含150mmol/L NaCl、10mmol/L复合氨基酸、1mmol/L葡萄糖的和0.03％反式-4,5-环氧基-2-癸烯醛的特异性营养诱导液300mL，饲喂2h。将喂饱菲牛蛭放入盛有8％乙醇中浸泡15min，使其吐出体内液体；取出水蛭移至盛有无菌水中反复浸泡清洗干净；将水蛭放入矿质水中继续饲养，以备下一次提取天然水蛭素之用；同时收集容器内的吐出液体即为初级提取液(内含特异性营养诱导液、唾液腺分泌物、催吐剂和其它粘液混合物)。用30％-80％饱和度硫酸铵对提取液进行分级沉淀除杂，8000rpm离心20min，透析除盐，浓缩，收集沉淀，将沉淀溶于20ml生理盐水，则为提取液，进行抗凝血活性测定和蛋白质含量测定。

实施例2

将禁食饥饿一个月左右成体菲牛蛭30g，用无菌水冲洗干净。用肠衣灌装预热至37℃含150mmol/L NaCl、10mmol/L复合氨基酸、1mmol/L葡萄糖的和0.03％反式-4,5-环氧基-2-癸烯醛的特异性营养诱导液300mL，饲喂2h。将喂饱菲牛蛭放入盛有8％乙醇中浸泡20min，使其吐出体内液体；取出水蛭移至盛有无菌水中反复浸泡清洗干净；将水蛭放入矿质水中继续饲养，以备下一次提取天然水蛭素之用；同时收集容器内的液体即为即为初级提取液(内含特异性营养诱导液、唾液腺分泌物、催吐剂和其它粘液混合物)。用30％-80％饱和度硫酸铵对提取液进行分级沉淀除杂，8000rpm离心20min，透析除盐，浓缩，收集沉淀，将沉淀溶于20ml生理盐水，则为提取液，进行抗凝血活性测定和蛋白质含量测定。

实施例3

将禁食饥饿一个月左右成体菲牛蛭30g，用无菌水冲洗干净。用肠衣灌装预热至37℃含100mmol/L NaCl、15mmol/L复合氨基酸、0.5mmol/L葡萄糖的和0.04％反式-4,5-环氧基-2-癸烯醛的特异性营养诱导液300mL，饲喂2h。将喂饱菲牛蛭放入盛有8％乙醇中浸泡20min，使其吐出体内液体；取出水蛭移至盛有无菌水中反复浸泡清洗干净；将水蛭放入矿质水中继续饲养，以备下一次提取天然水蛭素之用；同时收集容器内的液体即为初级提取液(内含特异性营养诱导液、唾液腺分泌物、催吐剂和其它粘液混合物)。用30％-80％饱和度硫酸铵对提取液进行分级沉淀除杂，8000rpm离心20min，透析除盐，浓缩，收集沉淀，将沉淀溶于20ml生理盐水，则为提取液，进行抗凝血活性测定和蛋白质含量测定。

实施例4

将禁食饥饿一个月左右成体菲牛蛭30g，用无菌水冲洗干净。用肠衣灌装预热至37℃含200mmol/L NaCl、5mmol/L复合氨基酸、1.5mmol/L葡萄糖的和0.05％反式-4,5-环氧基-2-癸烯醛的特异性营养诱导液300mL，饲喂2h。将喂饱菲牛蛭放入盛有8％乙醇中浸泡20min，使其吐出体内液体；取出水蛭移至盛有无菌水中反复浸泡清洗干净；将水蛭放入矿质水中继续饲养，以备下一次提取天然水蛭素之用；同时收集容器内的液体即为初级提取液(内含特异性营养诱导液、唾液腺分泌物、催吐剂和其它粘液混合物)。用30％-80％饱和度硫酸铵对提取液进行分级沉淀除杂，8000rpm离心20min，透析除盐，浓缩，收集沉淀，将沉淀溶于20ml生理盐水，则为提取液，进行抗凝血活性测定和蛋白质含量测定。

对比例1

将禁食饥饿一个月左右成体菲牛蛭30g，用无菌水冲洗干净。用肠衣灌装预热至37℃的全牛血300mL，饲喂2h。将喂饱菲牛蛭放入盛有8％乙醇中浸泡20min，使其吐出体内液体；取出水蛭移至盛有无菌水中反复浸泡清洗干净；将水蛭放入矿质水中继续饲养，以备下一次提取天然水蛭素之用；同时收集容器内的液体即为初级提取液(内含牛血、唾液腺分泌物、催吐剂和其它粘液混合物)。用30％-80％饱和度硫酸铵对提取液进行分级沉淀除杂，8000rpm离心20min，透析除盐，浓缩，收集沉淀，将沉淀溶于20ml生理盐水，则为提取液，进行抗凝血活性测定和蛋白质含量测定。

对比例2

将禁食饥饿一个月左右成体菲牛蛭30g，用无菌水冲洗干净。用肠衣灌装预热至37℃含1％盐酸、1％碳酸钠、1％磷酸二氢钾的水溶液300mL(参考CN1273012C实施例3营养液配方)，饲喂2h。将喂饱菲牛蛭放入盛有8％乙醇中浸泡20min，使其吐出体内液体；取出水蛭移至盛有无菌水中反复浸泡清洗干净；将水蛭放入矿质水中继续饲养，以备下一次提取天然水蛭素之用；同时收集容器内的液体即为初级提取液(内含特异性营养诱导液、唾液腺分泌物、催吐剂和其它粘液混合物)。用30％-80％饱和度硫酸铵对提取液进行分级沉淀除杂，8000rpm离心20min，透析除盐，浓缩，收集沉淀，将沉淀溶于20ml生理盐水，则为提取液，进行抗凝血活性测定和蛋白质含量测定。

对比例3

将禁食饥饿一个月左右成体菲牛蛭30g，用无菌水冲洗干净。用肠衣灌装预热至37℃含0.3％磷酸、0.3％赖氨酸、0.3％碳酸钠、0.3％氯化钠、0.3％氯化钾的水溶液300mL(参考CN1273012C实施例5营养液配方)，饲喂2h。将喂饱菲牛蛭放入盛有8％乙醇中浸泡20min，使其吐出体内液体；取出水蛭移至盛有无菌水中反复浸泡清洗干净；将水蛭放入矿质水中继续饲养，以备下一次提取天然水蛭素之用；同时收集容器内的液体即为初级提取液(内含特异性营养诱导液、唾液腺分泌物、催吐剂和其它粘液混合物)。用30％-80％饱和度硫酸铵对提取液进行分级沉淀除杂，8000rpm离心20min，透析除盐，浓缩，收集沉淀，将沉淀溶于20ml生理盐水，则为提取液，进行抗凝血活性测定和蛋白质含量测定。

试验例1

将实施例1-4和对比例1-3制备的水蛭提取液进行活性测试，具体试验过程为：

室温条件下，吸取样品20μL，置1.5mL透明离心管中，编号，作为实验组，设置三个平行样；同时吸取20μL氯化钠溶液作为对照组。各加入含0.5％牛纤维蛋白原的三经甲基氨基烷盐缓冲液200μL，混合均匀，置于37℃恒温水浴锅中5分钟，滴加每1mL中含50个单位的凝血酶溶液，每次1μL，边滴加边搅拌均匀，每隔1min滴加1次，直至凝固，记录消耗凝血酶溶液体积，按下式计算：

C2＝C1*V1/V2

式中：C1：凝血酶的单位浓度，ATU/mL；

V1：消耗凝血酶体积，μL；

C2：样品的单位抗凝活性，ATU/mL；

V2：样品加入量，μL。

将实施例1-4和对比例1-3制备的水蛭提取液用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，具体试验过程为：

(1)标准曲线的制作

取6只试管,分别加入牛血清白蛋白标准溶液

(100ug/ml)0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml,用蒸馏水补足至1ml,分别加人4ml考马斯亮蓝G-250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合均匀。2min后在紫外分光光度计上测定样品在595nm波长处的吸光度值(A_595nm)。然后以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制蛋白浓度-吸光度标准曲线。

(2)蛋白质含量的测定

取一系列试管加入1ml待测样品，分别加人4ml考马斯亮蓝G-250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合均匀。2min后在紫外分光光度计上测定样品在595nm波长处的吸光度值(A_595nm)。吸光度值要在标准曲线的线性范围内，若是超过线性范围则进行倍数稀释，最后代入标准曲线查得对应的蛋白含量，计算出各实施事例所得溶液中蛋白质的总含量。

结果如表1所示：

表1特异性营养诱导液进行活体诱导水蛭提取液抗凝血活性测定结果

注：水蛭吸食量＝水蛭吸食后重量/吸食前的重量。

由表1可见，实施例1-4采用特异性营养诱导液喂食水蛭，水蛭吸食量为其本身的5-6倍，而喂食全牛血或者其它适口性差诱导液的吸食量仅为水蛭本身的3倍。所以，采用特异性营养诱导液可以使水蛭充分吸食，有较好的吸食效果。除此之外，将喂饱菲牛蛭放入盛有8％乙醇中浸泡20min，再进行30％-80％饱和度的硫酸铵分级沉淀得到水蛭素提取液比较分析可见：首先，喂食全牛血的提取液中含有较多的杂蛋白，所以比活力较低，仅为800ATU/g左右(见对比例1)；其次，喂食其它诱导液获得的提取液，杂蛋白相对少一些，水蛭素比活力最高可达2500ATU/g左右(对比例2，3)；最后，喂食特异性诱导液的水蛭素提取液中杂蛋白含量最少，其比活力最高，可达3600ATU/g左右。

实施例5

将实施例2得到的水蛭提取液，分为5组，进行不同处理：

处理1：按照实施例2方式获得水蛭提取液；

处理2：在实施例2的基础上加入保护剂1％的甘露醇、1％的海藻糖和表面活性剂0.1％的吐温-80，进行-80℃过夜预冻，然后冷冻干燥48h，得到冻干粉。

处理3：在实施例2的基础上加入保护剂2％的甘露醇、2％的海藻糖和表面活性剂0.5％的吐温-80，进行-80℃过夜预冻，然后冷冻干燥48h，得到冻干粉。

处理4：在实施例2的基础上加入保护剂3％的甘露醇、3％的海藻糖和表面活性剂1.0％的吐温-80，进行-80℃过夜预冻，然后冷冻干燥48h，得到冻干粉。

处理5：在实施例2的基础上加入保护剂4％的甘露醇、4％的海藻糖和表面活性剂1.5％的吐温-80，进行-80℃过夜预冻，然后冷冻干燥48h，得到冻干粉。

将实施例2的基础上处理的冻干粉进行活性测试，如表2所示。

表2处理1-5的水蛭素干粉抗凝血活性测定结果

注：水蛭素干粉活性损失率＝(冷冻干燥前总活性-冷冻干燥后总活性)/冷冻干燥前总活性×100％

由表2可见，处理4加入保护剂3％甘露醇、3％海藻糖和表面活性剂1％吐温-80进行冷冻干燥，可以使活性损失从35％左右降低到9％左右。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种水蛭特异性营养诱导液，其特征在于，包括氯化钠、复合氨基酸、葡萄糖、反式-4,5-环氧基-2-癸烯醛和无菌水。

2.根据权利要求1所述的水蛭特异性营养诱导液，其特征在于，所述水蛭特异性营养诱导液中各原料的浓度为：

氯化钠100～200mmol/L，复合氨基酸5～15mmol/L，葡萄糖0.5～1.5mmol/L，反式-4,5-环氧基-2-癸烯醛0.02～0.05mg/ml，加无菌水至终浓度。

3.根据权利要求1或2所述的水蛭特异性营养诱导液，其特征在于，所述水蛭特异性营养诱导液中各原料的浓度为：

氯化钠150mmol/L，复合氨基酸10mmol/L，葡萄糖1mmol/L，反式-4,5-环氧基-2-癸烯醛0.03mg/mL，加无菌水至终浓度。

4.一种天然水蛭素的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：采用权利要求1至3中任一项所述水蛭特异性营养诱导液喂食水蛭；

步骤2：将喂饱的水蛭置于催吐剂中，使其吐出体内液体，移除水蛭，得到初级提取液；

步骤3：采用硫酸铵对所述初级提取液进行硫酸铵分级沉淀除杂，离心，透析除盐，浓缩，冷冻干燥，得到天然水蛭素。

5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，步骤1中所述水蛭为禁食20～40天的水蛭。

6.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，步骤1中所述水蛭特异性营养诱导液为预热至36～38℃的水蛭特异性营养诱导液。

7.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述水蛭特异性营养诱导液的喂食量为5～7mL/g·bw。

8.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述催吐剂为质量百分含量6％～10％的乙醇；以g/mL计，水蛭与催吐剂比例为1:(1～2)(w/v)；所述将喂饱的水蛭置于催吐剂中15～20min。

9.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述水蛭为吸血水蛭。

10.根据权利要求4至9中任一项所述的提取方法，其特征在于，步骤3后还包括：

将水蛭素提取物溶于生理盐水，加入冻干保护剂、表面活性剂，冷冻干燥，得到水蛭素提取物冻干粉。