CN109490448A

CN109490448A - 一种地高辛标准物质的制备方法

Info

Publication number: CN109490448A
Application number: CN201811284249.4A
Authority: CN
Inventors: 李国兵; 全灿; 刘兰云; 张旭斌; 蔡旺锋
Original assignee: Tianjin University; National Institute of Metrology
Current assignee: Tianjin University; National Institute of Metrology
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2019-03-19
Anticipated expiration: 2038-10-31
Also published as: CN109490448B

Abstract

本发明公开了一种地高辛标准物质的制备方法，包括如下步骤：将地高辛粗品经过活性炭脱色、液液萃取、溶剂结晶，最后制备得到地高辛标准物质。采用本发明的方法可以将影响地高辛产品色泽的微量杂质进行了有效脱除，产品颜色更白；可以将地高辛和洋地黄以及羟基洋地黄毒苷等杂质进行了有效分离，使产品纯度得到了有效地提高；将双羟基洋地黄毒苷等结构类似的杂质从地高辛产品中分离出去，产品纯度达到99.5％以上。采用本发明所述的方法获得的地高辛晶体产品的含量高于99.5％(HPLC法)，可以作为标准物质用于地高辛原药质量监测以及血药浓度监测，制备方法简单。

Description

一种地高辛标准物质的制备方法

技术领域

本发明涉及标准物质的制备方法，特别是涉及一种地高辛标准物质的制备方法。

背景技术

地高辛又名异羟基洋地黄毒苷，是一种用于治疗各种急性和慢性心功能不全以及室上性心动过速、心房颤动和扑动的强心苷药物，其化学名为：3β-O-2,O-二脱氧-β-D-核-己吡喃糖基-(1→4)-O-2,6-二脱氧-β-D-核-己吡喃糖基-(1→4)-2,6-二脱氧-β-D-核-己吡喃糖基氧代-12β,14β-二羟基-5β-心甾-20(22)烯内酯。分子式为：C₄₁H₆₄O₁₄；分子量为780.94。地高辛纯品为白色结晶或结晶性粉末，熔点为248℃(分解)，地高辛不溶于水、乙醇、乙醚，丙酮，微溶于氯仿、稀醇，溶于吡啶、氯仿-乙醇、二氯甲烷-甲醇等有机溶剂。其结构式如式I所示：

地高辛作为一种常用的心脏疾病的强心苷药物，具有作用可靠、吸收和排泄快等优点，但缺点是治疗安全范围小，一般治疗量相当于中毒量的60％，导致治疗过程中易发生中毒反应。因此治疗过程中需要进行地高辛血药浓度检测，确保地高辛浓度在治疗安全范围，防止由于剂量不足导致疗效不佳，同时又防止浓度过高导致中毒。因此检测结果的准确性和可靠性是确保治疗效果的关键，目前国内缺乏可溯源的地高辛高质量标准物质，因此纯化制备地高辛标准物质是确保地高辛检测结果和心脏疾病治疗效果的重要任务。

由于其复杂的结构(式I)，地高辛尚未人工合成，目前仍然是从毛地黄的叶子发酵进行提取而获得。因为官方药典规定在药物制剂中使用高纯度的地高辛，研究人员一直致力于地高辛分离和纯化制备方法的开发。目前从发酵的毛地黄的叶子提取地高辛的一般程序包括几个阶段：A)、用稀乙醇提取总萃取物质；B)、以氯仿或三氯乙烯作为萃取溶剂从稀乙醇提取物提取次级苷馏分；C)、用特定方法从次级苷提取物中分离提纯地高辛。目前文献报道的分离提纯地高辛的方法包括：

(1)制备色谱方法：采用制备色谱技术对地高辛和杂质进行分离纯化，收集符合纯度要求的馏分，但该方法不宜规模制备地高辛；

(2)分级溶解方法：利用溶剂对地高辛和杂质溶解能力的差异，通过多次分级溶解过程，将杂质从地高辛产品中分离出来，但该方法对杂质双羟洋地黄毒苷和地高辛四洋地黄毒糖化物的分离效果有限，导致地高辛产品纯度达不到标准物质纯度要求；

(3)液液萃取方法：利用互不相溶的溶剂体系对地高辛和杂质溶解能力差异实现纯化地高辛的目的，但由于地高辛产品中的杂质种类多，性质各异，液液萃取结果会导致产品中部分杂质的含量下降，相应会有部分杂质的含量会增加。因此该方法只能针对特定杂质的分离有效，不具备普适性。

无论是对地高辛原药的质量进行监控还是病人治疗过程中地高辛血药浓度进行监测，均是采用高效液相色谱方法，为了确保检测结果准确可靠，检测过程必须使用地高辛标准物质。同时，为了确保分析测试结果具有科学的溯源性和测量的不确定度，分析测试机构必须采用地高辛标准物质对采用的分析测试方法进行确认。此外地高辛标准物质对实施实验室间量值对比以及实验室的质量管理体系的建立也是必不可少的。

标准物质通常要求高纯度，组成均匀且化学稳定。为了满足国内药品质量检测和给病人准确施药的要求，对地高辛标准物质的需求日益迫切。目前国内还没有研究机构能够提供地高辛标准物质，而进口国外的地高辛标准物质存在费用昂贵、到货周期长且检测结果缺乏溯源性等问题，因此迫切需要开发高纯度地高辛的纯化制备技术。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供能够获得纯度高达99.5％以上的一种地高辛标准物质的制备方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种地高辛标准物质的制备方法，包括如下步骤：

(1)按2g:100～400mL的比例，将地高辛粗品溶解于溶剂一中，加入活性炭，脱色30～120min，过滤得到滤液，滤液蒸发得到地高辛晶体粗产品；所述活性炭为地高辛粗品重量的3％～10％；

(2)将步骤(1)得到地高辛晶体粗产品溶解到100-250mL稀释剂中，再加入与稀释剂互不相溶的萃取剂，在800～2000rpm，搅拌5～30min，澄清分相后将萃取相倾出，保留萃余相，所述稀释剂与萃取剂的体积比为(0.5～5):1；

(3)向萃余相中再加入萃取剂，在800～2000rpm，搅拌5～30min，澄清分相后将萃取相排出，保留萃余相，本步骤的萃取剂与步骤(2)获得的萃余相的体积比为1:(0.5～5)；

(4)重复步骤(3)2-5次；

(5)将步骤(4)得到的萃余相蒸发，降温结晶，降至常温后过滤得到地高辛晶体产品，再用稀释剂洗涤2-5次，真空干燥后得到地高辛初产品；

(6)将步骤(5)得到地高辛初产品超声溶解于100～400mL溶剂二中，在500～1200rpm条件下，滴加去离子水，至晶体完全析出，抽滤、干燥得到地高辛标准物质。

步骤(2)中稀释剂与萃取剂的体积比优选为(1～2):1。

步骤(4)优选为：重复步骤(3)4次。

步骤(6)优选为：将步骤(5)得到地高辛初产品溶解于溶剂二中，在1000rpm条件下，滴加去离子水100-300mL，去离子水的滴加时间为90～150min，至晶体完全析出，抽滤、干燥得到地高辛标准物质。

去离子水量加入量最好为120mL，去离子水的滴加时间为100-120min。

步骤(1)中，所述溶剂一选自甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、体积比为(0.2～4):1的甲醇-水混合溶剂、体积比为(0.2～4):1的乙醇-水混合溶剂、体积比为(0.2～4):1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂、体积比为(0.2～4):1的二氯甲烷-乙醇混合溶剂、体积比为(0.2～4):1的三氯甲烷-甲醇混合溶剂或体积比为(0.2～4):1的三氯甲烷-乙醇混合溶剂。

稀释剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯中的至少一种。

萃取剂选自体积比为(0.5～2:1)的水-甲醇混合溶剂、体积比为(0.5～2:1)的水-乙醇混合溶剂、体积比为(0.5～2:1)的水-丙酮混合溶剂或体积比为(0.5～2:1)的水-DMSO混合溶剂。

溶剂二选自体积比为(0.5～2):1的二氯甲烷-甲醇溶液、体积比为(0.5～2):1的二氯甲烷-乙醇混合溶剂、体积比为(0.5～2):1的三氯甲烷-甲醇混合溶剂、体积比为(0.5～2):1的三氯甲烷-乙醇混合溶剂、体积比为(2～5):1的甲醇-水混合溶剂或体积比为(2～5):1的乙醇-水混合溶剂。

本发明的优点：

采用本发明的方法可以将影响地高辛产品色泽的微量杂质进行了有效脱除，产品颜色更白；可以将地高辛和洋地黄以及羟基洋地黄毒苷等杂质进行了有效分离，使产品纯度得到了有效地提高；将双羟基洋地黄毒苷等结构类似的杂质从地高辛产品中分离出去，产品纯度达到99.5％以上。采用本发明所述的方法获得的地高辛晶体产品的含量高于99.5％(HPLC法)，可以作为标准物质用于地高辛原药质量监测以及血药浓度监测，制备方法简单。

附图说明

图1为实施例1制备出的地高辛标准物质候选物中地高辛的多级质谱图；

图2为实施例1制备出的地高辛标准物质候选物的液相色谱定值谱图。

具体实施方式：

地高辛粗品是依据现有技术已知的各种方法制备得到或者采用市售的地高辛原料药。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。需要指出的是，以下是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以权利要求书记载的内容为准。

实施例1

一种地高辛标准物质的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取2g市售的地高辛粗品(原料)加入到250ml的圆底烧瓶中，加入150mL三氯甲烷，装上回流冷凝管，采用电加热套加热沸腾使固体全部溶解，然后将溶液温度下降至55℃时，加入0.1g的活性炭，然后在沸点下回流脱色45min，用保温漏斗热过滤掉活性炭，所得滤体旋转蒸发，得到地高辛白色晶体粗产品1.9g；

经过液相色谱检测，地高辛含量为97.9％，双羟基洋地黄毒苷含量为1.0％，洋地黄含量为0.3％，羟基洋地黄毒苷含量为0.3％，异地高辛含量为0.3％，其他杂质为不明组分。

(2)将步骤(1)获得的1.9g地高辛晶体粗产品溶解到150ml稀释剂中，稀释剂为体积比为1:1的二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶剂，超声溶解后转移到500ml三口圆底烧瓶中，装上电机搅拌，往烧瓶中再加入150ml萃取剂，萃取剂为体积比为1:1的甲醇-水混合溶剂；进行液液萃取，控制搅拌转速为1500rpm，搅拌5min，澄清分相后将萃取相排出，保留萃余相；

(3)向步骤(2)获得的萃余相中再加入与所述萃余相体积相同的萃取剂，萃取剂为体积比为1:1的甲醇-水混合溶剂；在1500rpm，搅拌5min，澄清分相后将萃取相排出，保留萃余相；

(4)重复步骤(3)4次；

(5)将步骤(4)得到的萃余相蒸发至原有体积的1/3，降温结晶，待温度降至常温后继续保持30min，过滤得到地高辛晶体产品，再用稀释剂洗涤3次，每次稀释剂用量为10ml，稀释剂为体积比为1:1的二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶剂，真空干燥后得到地高辛初产品1.1g；

经过液相色谱检测，地高辛含量为99.1％，双羟基洋地黄毒苷含量为0.6％，洋地黄毒苷含量为0.05％，羟基洋地黄毒苷含量为0.1％，异地高辛含量为0.1％，其他杂质为不明组分；

(6)将步骤(5)得到地高辛初产品1.1g放入200mL溶剂二中，溶剂二为体积比1:1二氯甲烷-乙醇混合溶剂，超声溶解10min，在1000rpm条件下，滴加去离子水120mL，滴加时间为100min，至晶体完全析出，抽滤，滤饼用二氯甲烷洗涤3次(每次体积用量为10ml)、干燥得到地高辛标准物质0.9g。

经过液相色谱检测，地高辛含量为99.52％，双羟基洋地黄毒苷含量为0.35％，洋地黄含量为0.03％，羟基洋地黄毒苷含量为0.05％，不明组分杂质含量为0.05％，洋地黄毒苷和异地高辛含量未被检测出。

将实施例1所得的地高辛产品分别用LCMS-IT-TOF质谱仪和Agilent 1200高效液相色谱仪进行结构鉴定和定值分析(见图1和图2)。从图中可以看出，采用实施例1的制备纯化方法获得了高纯地高辛。

对比例1

(没有经过活性炭吸附脱色步骤)

一种艾氏剂标准物质的制备方法，包括以下步骤：

a.液液萃取：称取2g市售的地高辛粗品(原料)加入到150mL稀释剂二氯甲烷-乙酸乙酯(体积比为1:1)中，超声溶解后转移到500ml三口圆底烧瓶中，装上电机搅拌，往烧瓶中再加入150ml萃取剂甲醇-水溶液(体积比为1:1)进行液液萃取，控制搅拌转速为1500rpm，搅拌5min后澄清分相。分相后将萃取相倾出，加入150ml新鲜萃取剂甲醇-水溶液(体积比为1:1)继续液液萃取过程。上述过程重复4次。将所得稀释剂相旋转蒸发至原有体积的1/3，降温结晶析出晶体，待温度降至常温后继续保持30min，抽滤得到晶体粗产品，产品用二氯甲烷-乙酸乙酯(体积比为1:1)混合溶剂洗涤3次(每次体积用量为10ml)，干燥得到地高辛晶体产品得到产品1.15g。经过液相色谱检测，地高辛含量为98.9％，双羟基洋地黄毒苷含量为0.8％，洋地黄含量为0.05％，羟基洋地黄毒苷含量为0.05％，其他杂质为不明组分，产品为浅灰发暗晶体。

b.溶析结晶：将步骤a所得的1.15g地高辛粗产品加入到100ml二氯甲烷-乙醇溶液(体积比1:1)中，超声溶解10min。待地高辛全部溶解后转移到500ml烧杯中，装上电机搅拌，控制搅拌转速为1000rpm，往溶液中滴加去离子水共120ml，滴加时间为100min，将含有地高辛晶体悬浮液过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤3次(每次体积用量为10ml)，将所得晶体进行真空干燥，获得浅灰发暗晶体产品0.96g。经过液相色谱检测，地高辛含量为99.38％，双羟基洋地黄毒苷含量为0.35％，洋地黄含量为0.04％，羟基洋地黄毒苷含量为0.04％，其他杂质为不明组分。

对比例2

(没有经过液液萃取步骤)

将实施例1步骤(a)所得的2g地高辛粗产品加入到200ml二氯甲烷-乙醇溶液(体积比1:1)中，超声溶解10min。待地高辛全部溶解后转移到500ml烧杯中，装上电机搅拌，控制搅拌转速为1000rpm，往溶液中滴加去离子水共240ml，滴加时间为100min，将含有地高辛晶体悬浮液过滤，滤饼用二氯甲烷洗涤3次(每次体积用量为20ml)，将所得晶体进行真空干燥，获得白色晶体产品1.8g。经过液相色谱检测，地高辛含量为99.2％，双羟基洋地黄毒苷含量为0.35％，洋地黄含量为0.15％，羟基洋地黄毒苷含量为0.22％，其他杂质为不明组分。

实施例2-6

起始原料均为2g市售的地高辛粗品，制备步骤与实施例1相同，具体参数见表1。

表1

实验证明，用二氯甲烷、体积比为0.2:1的甲醇-水混合溶剂、体积比为4:1的甲醇-水混合溶剂、体积比为0.2:1的乙醇-水混合溶剂、体积比为4:1的乙醇-水混合溶剂、体积比为0.2:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂、体积比为4:1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂、体积比为0.2:1的二氯甲烷-乙醇混合溶剂、体积比为4:1的二氯甲烷-乙醇混合溶剂、体积比为0.2:1的三氯甲烷-甲醇混合溶剂、体积比为4:1的三氯甲烷-甲醇混合溶剂、体积比为0.2:1的三氯甲烷-乙醇混合溶剂或体积比为4:1的三氯甲烷-乙醇混合溶剂替代实施例1的三氯甲烷，其它同实施例1，制备出的高纯地高辛的纯度与实施例1相近。

实验证明，用0.5:1的水-甲醇混合溶剂、体积比为2:1的水-乙醇混合溶剂、体积比为0.5:1的水-乙醇混合溶剂、体积比为0.5:1的水-丙酮混合溶剂、体积比为0.5:1的水-DMSO混合溶剂或体积比为2:1的水-DMSO混合溶剂替代代实施例1的体积比为1:1的甲醇-水混合溶剂，其它同实施例1，制备出的高纯地高辛的纯度与实施例1相近。

实验证明，用体积比为0.5:1的二氯甲烷-甲醇溶液、用体积比为2:1的二氯甲烷-甲醇溶液、体积比为0.5:1的二氯甲烷-乙醇混合溶剂、体积比为2:1的二氯甲烷-乙醇混合溶剂、体积比为0.5:1的三氯甲烷-甲醇混合溶剂、体积比为2:1的三氯甲烷-甲醇混合溶剂、体积比为0.5:1的三氯甲烷-乙醇混合溶剂、体积比为2:1的三氯甲烷-乙醇混合溶剂、体积比为2:1的甲醇-水混合溶剂、体积比为5:1的甲醇-水混合溶剂、体积比为2:1的乙醇-水混合溶剂或体积比为5:1的乙醇-水混合溶剂替代实施例1的体积比1:1二氯甲烷-乙醇混合溶剂，其它同实施例1，制备出的高纯地高辛的纯度与实施例1相近。

实施例2-6中所得地高辛纯品采用LCMS-IT-TOF质谱仪和Agilent 1200高效液相色谱仪进行结构鉴定和定值分析，表明采用实施例2-6的制备纯化方法获得了高纯地高辛。

上述实施例仅仅是本发明中的一些实例，但并不作为对本发明中的限定。

Claims

1.一种地高辛标准物质的制备方法，其特征是包括如下步骤：

(4)重复步骤(3)2-5次；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中稀释剂与萃取剂的体积比为(1～2):1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(4)为：重复步骤(3)4次。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(6)为：将步骤(5)得到地高辛初产品溶解于溶剂二中，在1000rpm条件下，滴加去离子水100-300mL，去离子水的滴加时间为90～150min，至晶体完全析出，抽滤、干燥得到地高辛标准物质。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述去离子水量加入量为120mL，去离子水的滴加时间为100-120min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述溶剂一选自甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、体积比为(0.2～4):1的甲醇-水混合溶剂、体积比为(0.2～4):1的乙醇-水混合溶剂、体积比为(0.2～4):1的二氯甲烷-甲醇混合溶剂、体积比为(0.2～4):1的二氯甲烷-乙醇混合溶剂、体积比为(0.2～4):1的三氯甲烷-甲醇混合溶剂或体积比为(0.2～4):1的三氯甲烷-乙醇混合溶剂。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述稀释剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯中的至少一种。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述萃取剂选自体积比为(0.5～2:1)的水-甲醇混合溶剂、体积比为(0.5～2:1)的水-乙醇混合溶剂、体积比为(0.5～2:1)的水-丙酮混合溶剂或体积比为(0.5～2:1)的水-DMSO混合溶剂。

9.根据权利要求1、4或5所述的方法，其特征在于所述溶剂二选自体积比为(0.5～2):1的二氯甲烷-甲醇溶液、体积比为(0.5～2):1的二氯甲烷-乙醇混合溶剂、体积比为(0.5～2):1的三氯甲烷-甲醇混合溶剂、体积比为(0.5～2):1的三氯甲烷-乙醇混合溶剂、体积比为(2～5):1的甲醇-水混合溶剂或体积比为(2～5):1的乙醇-水混合溶剂。