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CN1094972C - 人类来源的乳酸杆菌菌株、它们的组合物及其应用 - Google Patents

人类来源的乳酸杆菌菌株、它们的组合物及其应用 Download PDF

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CN1094972C
CN1094972C CN95193239A CN95193239A CN1094972C CN 1094972 C CN1094972 C CN 1094972C CN 95193239 A CN95193239 A CN 95193239A CN 95193239 A CN95193239 A CN 95193239A CN 1094972 C CN1094972 C CN 1094972C
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bacterial
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Abstract

本发明涉及乳酸杆菌菌株及含有它们的药物组合物。

Description

人类来源的乳酸杆菌菌株、它们的组合物及其应用
技术领域：
    本发明涉及乳酸杆菌菌株和含有它们的药物组合物。
    更具体地说，本发明涉及三种新的人源非嗜酸性乳酸杆菌菌株
(鉴定编号为CNCM I-1390、CNCM I-1391和CNCM I-
1392，1994年1月13日保藏于the CNCM Collection of the
Institut Pasteur)和一种新的人源嗜酸性乳酸杆菌(命名为CNCM
I-1447，根据布达佩斯条约于1994年7月13日保藏于同一研究
所)。
背景技术：乳酸细菌的治疗用途具有悠久和确定的历史，其可以追朔到本
世纪的初期以及指明使用发酵乳对消费者健康状况的有利影响的
各种研究(参考文献1-5)。
自从那时起，乳酸细菌已广泛应用于制药工业，它们构成治疗
病原菌引起的肠内疾病的各种制剂的活性成分并用作抗生素治疗
中的辅药(参考文献6-9)。
    过去的几十年中，科学家们从整体上加深了对乳酸细菌的认
识，特别是对乳酸杆菌的认识，获得了惊人的大量信息。
    不过，目前市场上的产品似乎并没有考虑到近期科研成果(参
考文献10-11)。
    应该特别指出的是，许多研究已表明：
    -乳酸杆菌在肠内微生物菌丛的调节中起到独特的作用，不仅
产生乳酸还产生特殊的抗细菌物质(参考文献12-16)；
    -考虑到“宿主特异性”要求，这些细菌必须来自肠内环境，
细菌再植入这种环境中(例如，为了应用于人类，这些细菌必须分
离自人肠内系统，等等)以保证移生(参考文献17)；
    -乳酸杆菌与数种代谢活动有关，这些代谢活动与保持良好健
康状态、防止多种病理状态特别相关；特别值得一提的是亚硝胺降解、细菌毒素中和以及防癌活性(参考文献18)；
-粘附到肠上皮上的能力是肠内细菌的一个极为有利的特点(已经知道，多种病原菌在失去粘附粘膜的能力时就丧失其致病力)；因此，对乳酸杆菌而言，为了提供一种阻碍病原菌移生的屏障，其移生在上皮上的可能性也是特别重要的(参考文献10，19)
-对分离自肠的菌株的分类已作过重大修正；这种生态系统中新细菌种的存在以及每种中特殊生物型的分化已被确认(参考文献20)；
-在确定乳酸细菌菌株的可利用性中，这些菌株的“技术”性质(首先是对低温防腐处理的抵抗性)尤为重要；事实上，目前用于probiotic的目的乳酸杆菌菌株一般只对冻干条件稍有抗性(参考文献21)。冻干之后必须保持粘附性质(并不是总能达到的要求)。
特别是，在试图分离出具有很高肠粘膜细胞粘附能力的乳酸杆菌的过程中，描述了“同源”分离方法，例如，从健康个体的粪便中分离。
例如，US 4839281、EP-A-199535和US 5032399描述了分离自成人、特点为强粘附性质的嗜酸性乳酸杆菌菌株，粘附性质为与参考菌株相比，以粘附到人肠粘膜的一个细胞上的细菌细胞数量来量化。不过，对这一菌株的确切分类是有疑问的，在美国专利局对该申请进行实质审查时，作者自己声称，根据实验数据，所描述的乳酸杆菌属于非嗜酸性菌种(美国专利4839281，卷宗，答复1987年10月30日的审查意见，第7页，最后一段)。EP 577904和US4,946,791中公开了能粘附肠细胞的其它乳酸杆菌菌株。
Reniero等(参考文献27)报道了从两个婴儿的粪便中分离出干酪乳酸杆菌(Lactobacillus casei)的两个菌株。同样的菌株能在粪便中存在数日，这使作者把粘附性质归因于这些菌株。没有提到其它象上述那样的生物学或技术上的性质，而这些性质是本发明所要求的乳酸杆菌菌株的独特性质。
    实际上，发现菌株CNCM I-1390、CNCMI-1391、CNCM
I-1392和CNCM I-1447(除了对肠内和颊细胞的粘附力之外，
常优于参考菌株)，还具有下列特点：
    -抑制人肠内病原菌生长的能力；
    -在各种条件(需氧和厌氧生活)、不同pH值下生长的能力；
这些性质赋予了适应经过胃肠道过程中所要求的生理和病理条件的能力；
    -产生大量乳酸；
    -对胆汁抗性高；
    -对冻干的抗性，不会丧失粘附能力。
    这些菌株属于乳酸杆菌属且以一系列特点为特征，这使它们对
数种病理状态的预防和治疗特别受人关注。
发明内容：本发明提供药物、兽药或营养组合物，其含有菌株CNCM I-
1390、CNCM I-1391、CNCM I-1392和CNCM I-1447中
的至少一种，优选为冻干形式，与适当载体混合。这些组合物可以
口服施用或者与象乳、酸奶或乳制品这样的食品混合施用，以治疗
或预防需要施用乳酸杆菌的胃肠道病理状态，例如，象肠道微生物
异常(dismicrobism)、各种原因的腹泻、溃疡性结肠炎以及有
关病理状态的情形。本发明的组合物也可以在抗生素治疗时施用，
以保护非致病性肠道细菌菌丛。
    本发明的菌株的另一个重要特征是，它们是从健康新生儿和断
奶后的婴儿的粪便中分离出来的。实际上人们已知，哺乳动物在出
生时胃肠道是无菌的；但通常由母体的阴道和肛周菌丛迅速移生。
有益微生物的这条自然迁移途径是剖腹产的婴儿所缺乏的；实际
上，这种剖腹产的婴儿易于移生那些不那么有益的微生物。在早产
儿中也观察到肠道由不那么有益的微生物所移生。在这两种情形
中，通过口服施用本发明的菌株可以大大减少这种危险。另外，与
母乳喂养的婴儿相比，瓶喂婴儿在其肠道中有数量更多的梭状芽孢
杆菌、大肠杆菌和肠球菌。在这种情况下，用本发明的乳酸杆菌处
理也有助于肠内菌丛的再平衡。
所述各菌株可配制成只有本发明各菌株的混合物和/或与具有互补性质即不同内在特性的其它菌株一起形成的混合物。这种制剂的典型例子有：含有至少一种具有高粘附性质的菌株与至少一种能产生大量L-乳酸的菌株的混合物。一种优选但绝非限制性的组合物可以这样制备：将本发明的菌株CNCM I-1394和肠球菌Enterococcus faecium SF 68以适当的量(例如，每种菌株为106～1010个细胞)与常用的添加剂或赋形剂混合。
通常为胶囊、溶液或可饮用悬浮液、袋装粉剂和相似形式的每一单一剂量一般含有每一菌株约为106～1010细胞。
还已经证明，本发明的乳酸杆菌在改善食品营养价值方面非常有用。特别优选的是得自乳或其衍生物的乳制品。
具体实施方式：介绍菌株的分离及其鉴定。
实施例1：菌株的分离和鉴定
菌株分离自出生1～6天的新生儿。还从其它的断奶期婴儿取样。
在诊所里，对受试者的粪便每天取样两次，并在厌氧条件下贮藏于无菌药签中。在LBSTM选择性培养基(Lactobacillus SelectionAgar，Oxoid)中进行乳酸杆菌的选择性初步分离。于37℃在厌氧条件下保温平板48小时(Gas Pack system，BBL)。在MRS液体培养基(de Man-Rogosa-Sharpe broth，Oxoid)中分离出所得菌落，进行第一系列再分离以获得纯培养物(在选择性琼脂培养基上涂片并分离单菌落之后)。这些步骤反映了Sharpe提出的方法(参考文献22)。对各菌株进行分离和纯化之后，对它们做进一步鉴定以便仅选择出那些属于乳酸杆菌属的菌株。接着检验下列特征：形态学(用相差显微镜进行光学检测)、对革兰氏染色的反应(所有乳酸杆菌都是阳性的)、过氧化氢酶的存在(所有乳酸杆菌都是阴性的)、温育24小时后检测每种菌株的培养基中存在的两种乳酸立体异构体(用Boehringer kit进行酶法检测)。根据这些检测，可能把这些分离物归入乳酸杆菌属。接着，对各菌株进行冻干并于4℃贮藏。
对所有这些鉴定为乳酸杆菌的菌株在碱提取后再进行质粒外形的分析(参考文献23)。这种分析可以鉴定分离出的菌株(参考文献24)。还检验了可溶性脂质蛋白的外形(参考文献25)和抗生素抗性模式(参考文献26)。
然后，用象糖质发酵模式(API CH 50 galleries system，Biomerieux)这样的标准表型检测法对所有分离物的有代表性的菌株进行分类学分析。
本发明菌株的分类和特征列于下面各图表中：
图表1  -         菌种鉴定：CNCM I-13901.    来源    ：         人
  年龄               断奶期       性别：               女
  分娩类型           自然                  营养类型：    母乳喂养2.    属                 乳酸杆菌属3.    形态学             杆菌              短
                     链                有
                     聚集体            无
                     荚膜的存在        无4.    乳酸的产生                  L        3.84g/L
                              D        0.15g/L5.    糖类发酵
  甘油           -         赤醇              -    D-阿拉伯糖    -
  L-阿拉伯糖     -         D-木糖            -    L-木糖        -
  核糖醇         +         β-甲基-木糖苷    -    半乳糖        +
  D-葡萄糖       +         D-果糖            +    D-甘露糖      +
  L-山梨糖       +         鼠李糖            -    七叶苷        +
  水杨苷         +         纤维二糖          +    麦芽糖        +
  乳糖           可变      蜜二糖            -    蔗糖          +海藻糖(Trealose)     +         菊糖              +    松三糖        +
  D-棉子糖       -         淀粉              -    糖原          -
  木糖醇         -         β-龙胆二糖       -    半乳糖醇      -
  肌醇           -         甘露糖醇          +    山梨糖醇      -
  苦杏仁苷       -         熊果苷            +    D-松二糖      +
  D-来苏糖       -         D-塔格糖          +    D-岩藻糖      -
D-阿拉伯糖醇     -         L-阿拉伯糖醇      -    葡糖酸        +
  α-甲基-D-甘露糖苷   -   α-甲基-D-葡糖苷  -
  N-乙酰氨基葡糖       +   2-酮葡糖酸        -
  5-酮葡糖酸           -   L-岩藻糖          -
  核糖                 +6.    质粒           2
 图表2    -          菌种鉴定                ：CNCM I-13911.     来源                             人
   年龄                             断奶期             性别：          女
   分娩类型                         剖腹产
                                                             营养类型：瓶喂2.     属                               乳酸杆菌属3.     形态学                           杆菌                    短
                                    链                      有
                                    聚集体                  无
                                    荚膜的存在              无4.     乳酸的产生                                L            3.14g/L
                                             D            0.20g/L5.     糖类发酵
   甘油                  -             赤醇              -      D-阿拉伯糖    -
   L-阿拉伯糖            -             D-木糖            -      L-木糖        -
   核糖醇                +             β-甲基-木糖苷    -      半乳糖        +
   D-葡萄糖              +             D-果糖            +      D-甘露糖      +
   L-山梨糖              +             鼠李糖            -      七叶苷        +
   水杨苷                +             纤维二糖          +      麦芽糖        +
   乳糖                  +             蜜二糖            -      蔗糖          +海藻糖(Trealose)             +             菊糖              +      松三糖        +
   D-棉子糖              -             淀粉              -      糖原          -
   木糖醇                -             β-龙胆二糖       +      半乳糖醇      -
   肌醇                  -             甘露糖醇          +      山梨糖醇      -
   苦杏仁苷              +             熊果苷            +      D-松二糖      +
   D-来苏糖              -             D-塔格糖          +      D-岩藻糖      -
 D-阿拉伯糖醇            -             L-阿拉伯糖醇      -      葡糖酸        +
   α-甲基-D-甘露糖苷           -      α-甲基-D-葡糖苷  -
   N-乙酰氨基葡糖               +      2-酮葡糖酸        -
   5-酮葡糖酸                   -      L-岩藻糖          -
   核糖                         +6.           质粒：  5图表3   -              菌种鉴定                    CNCM I-13921.      来源                          人
    年龄                          断奶期               性别            女
    分娩类型                      自然                      营养类型：母乳喂养2.      属                            乳酸杆菌属3.      形态学                        杆菌                       短
                                  链                         有
                                  聚集体                     无
                                  荚膜的存在                 无4.      糖类发酵
       甘油            -               赤醇                  -      D-阿拉伯糖    -
        L-阿拉伯糖     -               D-木糖                -      L-木糖        -
        核糖醇         +               β-甲基-木糖苷        -      半乳糖        +
        D-葡萄糖       +               D-果糖                +      D-甘露糖      +
        L-山梨糖       +               鼠李糖                -      七叶苷        +
        水杨苷         +               纤维二糖              +      麦芽糖        +
        乳糖           +               蜜二糖                -      蔗糖          +
 海藻糖(Trealose)      +               菊糖                  +      松三糖        +
        D-棉子糖       -               淀粉                  -      糖原          -
        木糖醇         -               β-龙胆二糖           +      半乳糖醇      -
        肌醇           -               甘露糖醇              +      山梨糖醇      -
        苦杏仁苷       -               熊果苷                +      D-松二糖      +
        D-来苏糖       -               D-塔格糖              +      D-岩藻糖      -
      D-阿拉伯糖醇     -               L-阿拉伯糖醇          -      葡糖酸        +
        α-甲基-D-甘露糖苷     -       α-甲基-D-葡糖苷      -
        N-乙酰氨基萄糖         +       2-酮葡糖酸            -
        5-酮葡糖酸             -       L-岩藻糖              -
        核糖                   +5.          质粒    2图表4    -            菌种鉴定           CNCM I-14471.      来源                人
    年龄                新生儿              性别：            男
    分娩类型            自然                        营养类型：母乳喂养2.      属                  乳酸杆菌属
    种                  嗜酸3.      形态学              杆菌                短
                        链                  有
                        聚集体              无
                        荚膜的存在          无4.      乳酸的产生                          L   3.53g/L
                                        D   3.12g/L5.      糖类发酵
    甘油                -            赤醇              -
                                                            D-阿拉伯糖     -
    L-阿拉伯糖          -            D-木糖            -    L-木糖         -
    核糖醇              -            β-甲基-木糖苷    -    半乳糖         +
    D-葡萄糖            +            D-果糖            +    D-甘露糖       +
    L-山梨糖            -            鼠李糖            -    七叶苷         +
    水杨苷              +            纤维二糖          +    麦芽糖         +
    乳糖                -            蜜二糖            -    蔗糖           +海藻糖(Trealose)            +            菊糖              +    松三糖         +
    D-棉子糖            -            淀粉              +    糖原           -
    木糖醇              -            β-龙胆二糖       +    半乳糖醇       -
    肌醇                -            甘露糖醇          +    山梨糖醇       +
    苦杏仁苷            +            熊果苷            +    D-松二糖       +
    D-来苏糖            -            D-塔格糖          +    D-岩藻糖       -
    D-阿拉伯糖醇        -            L-阿拉伯糖醇      -    葡糖酸         +
    α-甲基-D-甘露糖苷        -      α-甲基-D-葡糖苷  -
    N-乙酰氨基葡糖            +      2-酮葡糖酸        -
    5-酮葡糖酸                -      L-岩藻糖          -
    核糖                      -6.            质粒：1实施例2
将本发明的各菌株与参照菌株相比较，以评估它们粘附各类细胞的持久力、在各种pH值下生长的持久力、在不同胆汁浓度下生长的持久力、以及在各种温育条件下生长的持久力、影响肠内病原菌生长的能力。在每一分析之前，将冻干的菌株样品再水化并于MRS培养基中温育。
参考菌株如下：
嗜酸性乳酸杆菌ATCC 53103
嗜酸性乳酸杆菌ATCC 4357
德氏乳酸杆菌ATCC 7994
肠炎沙门氏菌ATCC IMM2
大肠埃希氏杆菌ATCC 35401对人上皮细胞的粘附：
对两类上皮细胞进行“体外”粘附试验。-新分离的人颊细胞，-肠细胞(收集的细胞系，Intestine 407，得自IstitutoZooprofilattico Sperimentale in Brescia)。
颊细胞分离自不吸烟的健康受试者。用木制压舌板刮面颊的内表面来收集细胞。然后用PBS(磷酸缓冲盐水)溶液洗涤口腔粘膜细胞。
使肠细胞生长于Hanks BSS中的Eagle’s Basal培养基(含10％胎牛血清)中，并于37℃在5％CO2的气氛中温育48小时。根据标准方法(排出生长培养基，用PBS溶液洗涤基质，加入2ml浓度为0.25％的胰蛋白酶-versene)对所形成的单层(monostrata)进行胰蛋白酶处理。再于1700g下将所得悬浮液离心10分钟。用PBS溶液洗涤细胞两次，再用同种溶液稀释，直至达到浓度为100细胞/ml时为止。
向PBS溶液中的105上皮细胞(颊细胞或肠细胞)中加入107个已在适宜条件下生长的细菌来进行粘附试验。于37℃、连续搅动下将混合物温育30分钟。之后，通过将悬浮液经一孔直径为5μm的聚碳酸酯膜(Sartorius)过滤，把非粘附细胞除去。重复洗涤后，将膜置于一载玻片上、在空气中干燥、用甲醇固定并用结晶紫染色，以检测粘附细胞。通过计算粘附到100个细胞上的细菌数目来确定每个细胞上粘附的平均细菌数(x)。
用下式，把受检验的菌株的粘附力与用作对照的菌株ATCC53103的粘附力相比较：
这些实验的结果报告于表1中。
表1.乳酸杆菌菌株对颊细胞和人肠细胞的粘附
    菌株                 颊细胞                    肠细胞
    X±SD     A.I.     X±SD     A.I.
CNCM I-1390CNCM I-1391CNCM I-1447ATCC 53103ATCC 4357ATCC 7994     27.3±7.549.1±6.4-43±5.954±3.23.1±1.7     63.5114.2-100.09.37.2     20.9±6.142.6±5.914.4+5.816.9±5.32.9+1.61.6±1.5     123.7252.185.2100.017.19.5
x＝      每个细胞的乳酸杆菌数目                             ；  SD  ＝  标准偏差；A.I.＝粘附指数
结果表明，本发明的菌株具有极佳的粘附肠细胞和颊粘膜细胞的能力；在一些情形中，其结果远远优于参考菌株。在各种pH值下的生长：
乳酸杆菌生长于pH3(加入HCl而达到)、pH5(培养基的正常pH值)和pH8(加入NaOH而达到)的MRS(Oxoid)液体培养基中。
于37℃、5％CO2气氛中温育样品，在各时间间隔(12小时、24小时和48小时)对细菌细胞进行计数。这些实验的结果列于表2。
表2.各种时间、各种pH值下细菌菌株的生长
菌株               pH312h         24h     48h               pH512h         24h          48h             pH812h        24h      48h
CNCM I-1390CNCM I-1391CNCM I-1447ATCC 53103ATCC 4357ATCC 7994   5.04.94.55.34.0＜3     6.86.54.86.64.6＜3  6.56.34.06.14.8＜3   9.69.59.09.57.57.5   10.09.89.89.58.68.0   10.310.69.69.58.88.8  9.59.59.09.37.8＜3     9.79.59.49.58.0＜3   9.510.49.39.88.5＜3
数值以logCFU/mL表示。    CFU  ＝  菌落形成单位。
结果表明，本发明的菌株可以在很宽的pH值范围内生长。特别是，本发明的菌株表现出对酸性pH值的抗性，这种抗性相当于或优于参考菌株。对胆汁的抗性：
将本发明的菌株和参考菌株ATCC 53103在MRS液体培养基中温育48小时。稀释肉汤培养物(107CFU/ml)，使其在添加有1.5g/l或3g/l胆汁(Oxgall powder，Sigma)的MRS琼脂上生长。于37℃在厌氧条件下温育48小时后，进行细菌计数，以证实对胆汁的抗性。
结果示于表3。
表3.乳酸杆菌菌株对胆汁的抗性
  菌株   MRS琼脂(对照)CFU/mL    MRS+胆汁1.5g/LCFU/mL    MRS+胆汁3.0g/LCFU/mL
CNCM I-1390CNCM I-1391CNCM I-1447ATCC  53103     140187289201     134186283202     90176290161
CFU＝菌落形成单位
结果表明，这些新菌株即使对高浓度的胆汁也具有良好的抗性。特别出乎意料的是，CNCM I-1447即使对更高浓度值的胆汁也具有抗性。在厌氧和有氧条件下的生长：
在厌氧和有氧条件下，于37℃将乳酸杆菌在MRS液体培养基中温育过夜，然后计数。结果示于表4。
表4.厌氧和有氧条件下乳酸杆菌的生长
菌株   厌氧生活log CFU/mL     有氧生活log CFU/mL
CNCM I-1390CNCM I-1391CNCM I-1447ATCC  4357ATCC  7994ATCC  53103     9.610.09.87.39.39.7     9.110.19.77.09.99.8
CFU＝菌落形成单位
结果表明，本发明的菌株在厌氧和有氧条件下都能生长。对肠内病原菌生长的干扰：
在与大肠埃希氏杆菌(肠道毒性ATCC 35401)和肠炎沙门氏菌(IMM2)进行的共培养实验中，评估本发明的菌株抑制肠内病原菌生长的能力。
在第一系列实验中，让本发明的菌株和参考菌株生长过夜，然后，于37℃、5％CO2气氛下，把病原菌与它们在一种培养基中接种。该培养基由两倍浓度的MRS液体培养基与两倍浓度的Mueller-Hilton液体培养基的1∶1混合物组成。24小时和48小时后，对病原菌和研究中的乳酸杆菌进行细胞计数。对照物在于病原菌和作为纯培养物生长的乳酸杆菌菌株。这些实验的结果示于表5和表6中。
在另一系列实验中，用本发明的菌株和参考菌株与病原菌同时接种，并于上述条件下共同生长。温育24小时和48小时后，对病原菌和乳酸杆菌菌株进行细菌计数。对照物如前所述。这些实验的结果示于表7和表8。
病原菌在与乳酸杆菌的共培养中的生长实验的结果令人惊奇地表明，本发明的菌株在抑制有害微生物的生长方面是有效的。实际上，如表5和表6所示，当用埃希氏大肠杆菌和肠炎沙门氏菌与足量乳酸杆菌同时接种时，这两种病原菌的生长都受到强烈抑制(在所有情况下发现，以log CFU/mL表示的数值＜3)。即使当本发明菌株与病原菌同时接种时，也能抑制病原菌的生长(表7和表8)。特别是在肠炎沙门氏菌的情形中，当乳酸杆菌生长过夜再接种时，可观察到相同的结果(对比表8和表6)。除此之外，令人关注的是，同时存在着病原菌并不影响乳酸杆菌菌株的生长。在所有这些实验中，有关乳酸杆菌在共培养中生长的数据可以与其在纯培养中生长的数据相比较。
    表5.肠道毒性的大肠埃希氏杆菌(ATCC 35401)
            和乳酸杆菌在共培养中的生长1
  培养物                  细菌生长(log CFU/mL)
大肠埃希氏杆菌(ATCC 35401)24h        48h   乳酸杆菌(待研究24h  菌株)48h
 CNCM I-1390ATCC 35401CNCM I-1390+ATCC 35401     -           -9.5         9.6＜3         ＜3     9.9       10.8-         -9.8       10.6
 CNCM I-1391ATCC 35401CNCM I-1391+ATCC 35401     -           -9.5         9.6＜3         ＜3     9.5       10.8-         -9.8       10.9
 CNCM I-1447ATCC 35401CNCM I-1447+ATCC 35401     -           -9.5         9.6＜3         ＜3     9.6       9.9-         -9.6       9.8
 ATCC 53103ATCC 35401ATCC 53103+ATCC 35401     -           -9.5         9.6＜3         ＜3     9.7       10.8-         -9.8       10.9
 ATCC 4357ATCC 35401ATCC 4357+ATCC 35401     -           -9.5         9.6＜3         ＜3     9.0       9.3-         -9.0       9.6
 ATCC 7994ATCC 35401ATCC 7994+ATCC 35401     -           -9.5         9.6＜3         ＜3     8.0       8.8-         -8.6       8.8
1  乳酸杆菌生长过夜，再用大肠埃希氏杆菌接种。24小时和48小时后，对病原菌和乳酸杆菌进行细菌计数。CFU＝菌落形成单位。
表6.肠炎沙门氏菌(IMM2)和乳酸杆菌在共培养中的生长1
  培养物                 细菌生长 (log CFU/mL)
    肠炎沙门氏菌(IMM 2)24h        48h   乳酸杆菌(待研究24h  菌株)48h
 CNCM I-1390IMM 2CNCM I-1390+IMM 2     -          -9.5        9.7＜3        ＜3     9.8      10.3-        -9.3      10.9
 CNCM I-1391IMM 2CNCM I-1391+IMM 2     -          -9.5        9.7＜3        ＜3     9.8      10.3-        -9.9      10.9
 CNCM I-1447IMM 2CNCM I-1447+IMM 2     -          -9.5        9.7＜3        ＜3     9.5      9.8-        -9.3      9.9
 ATCC 53103IMM 2ATCC 53103+IMM 2     -          -9.5        9.7＜3        ＜3     9.6      9.9-        -9.7      10.9
 ATCC 4357IMM 2ATCC 4357+IMM 2     -          -9.5        9.7＜3        ＜3     8.3      9.0-        -8.6      8.8
 ATCC 7994IMM 2ATCC 7994+IMM 2     -          -9.5        9.7＜3        ＜3     8.7      8.3-        -8.7      8.3
1  乳酸杆菌生长过夜，再用肠炎沙门氏菌接种。24小时和48小时后，对病原菌和乳酸杆菌进行细菌计数。CFU＝菌落形成单位。
表7  同时接种后，肠道毒性的大肠埃希氏杆菌(ATCC 35401)
     和乳酸杆菌在共培养中的生长1
  培养物                细菌生长  (log CFU/mL)
大肠埃希氏杆菌(ATCC 35401)24h     48h 乳酸杆菌(待研究24h  菌株)48h
 CNCM I-1390ATCC 35401CNCM I-1390+ATCC 35401     -        -9.7      9.85.5      4.6     10.3      11.0-         -9.8       11.4
 CNCM I-1391ATCC 35401CNCM I-1391+ATCC 35401     -        -9.7      9.85.3      5.2     10.0      10.9-         -9.7       11.4
 CNCM I-1447ATCC 35401CNCM I-1447+ATCC 35401     -        -9.7      9.85.6      5.0     9.6       9.8-         -9.6       9.8
 ATCC 53103ATCC 35401ATCC 53103+ATCC 35401     -        -9.7      9.84.9      5.0     9.8       10.9-         -9.5       11.0
 ATCC 4357ATCC 35401ATCC 4357+ATCC 35401     -        -9.7      9.85.6      5.3     9.0       9.3-         -8.9       9.5
 ATCC 7994ATCC 35401ATCC 7994+ATCC 35401     -        -9.7      9.85.4      5.0     8.8       8.9-         -8.6       8.9
1  乳酸杆菌和大肠埃希氏杆菌同时接种，24小时和48小时后，对病原菌和乳酸杆菌进行细菌计数。CFU＝菌落形成单位。
表8.同时接种后，肠炎沙门氏菌(IMM2)和乳酸
    杆菌在共培养中的生长1
 培养物            细菌生长          (log CFU/mL)
    肠炎沙门氏菌(IMM2)24h         48h   乳酸杆菌(待研究24h  菌株)48h
 CNCM I-1390IMM 2CNCM I-1390+IMM 2     -           -9.7         9.6＜3         ＜3     9.6      10.7-        -9.1      11.7
 CNCM I-1391IMM 2CNCM I-1391+IMM 2     -           -9.7         9.6＜3         ＜3     9.6      10.7-        -10.0     10.5
 CNCM I-1447IMM 2CNCM I-1447+IMM 2     -           -9.7         9.6＜3         ＜3     9.5      9.8-        -9.2      9.7
 ATCC 53103IMM 2ATCC 53103+IMM 2     -           -9.7         9.6＜3         ＜3     9.7      10.3-        -9.1      11.5
 ATCC 4357IMM 2ATCC 4357+IMM 2     -           -9.7         9.6＜3         ＜3     8.8      9.5-        -9.0      9.3
 ATCC 7994IMM 2ATCC 7994+IMM 2     -           -9.7         9.6＜3         ＜3     8.8      9.0-       -8.0      8.5
1  乳酸杆菌和肠炎沙门氏菌同时接种，24小时和48小时后，
对病原菌和乳酸杆菌进行细胞计数。CFU＝菌落形成单位。
在另一系列实验中，把本发明乳酸杆菌的混合物与大肠埃希氏杆菌和肠炎沙门氏菌一起接种，以便评估这些混合物是否能在抑制病原菌菌株生长方面具有协同效果。表9报道了肠道毒性的大肠埃希氏杆菌菌株35401在与同时接种的乳酸杆菌的共培养中获得的一些数据。
  表9.同时接种后，共培养中各种乳酸杆菌混合物对肠道
     毒性的大肠埃希氏杆菌(ATCC 35401)的抑制1
培养物     细菌生长(log CFU/mL)大肠埃希氏杆菌  (ATCC 35401)24h           48h
 ATCC 35401ATCC 35401+CNCM I-1390+CNCM I-1391ATCC 35401+CNCM I-1390+CNCM I-1447ATCC 35401+CNCM I-1391+CNCM I-1447ATCC 35401+CNCM I-1390+CNCM I-1391+CNCM I-1447     8.65          8.723.40          ＜23.18          2.70＜2           ＜22.30          ＜2
1    大肠埃希氏杆菌与各种乳酸杆菌混合物同时接种。24小时和48小时后，
对病原菌和乳酸杆菌进行细菌计数。CFU＝菌落形成单位。
数据清楚地表明，24小时和48小时之后，乳酸杆菌混合物能够完全抑制病原菌的生长。而且，在抑制病原菌生长方面，乳酸杆菌混合物比单一乳酸杆菌菌株更有效(对比表9和表7)。这些数据是对与乳酸杆菌同时接种的病原菌得到的。同样，在这些实验中，乳酸杆菌的生长并未受到同时存在的病原菌和其它乳酸杆菌菌株的影响。对肠炎沙门氏菌，得到了类似结果。
从上述数据可明显看出，本发明的各菌株具有使其特别适合于制备药物的一系列特征。本发明的菌株具有粘附人上皮细胞的能力(移生所需的重要特征)，它们对胆汁有良好的(即使有时不是极佳的)抗性。它们在酸性pH值时有抗性并能生长，在厌氧和有氧条件下都能生长。此外，本发明的单一菌株或各种菌株的混合物显示出抑制胃肠道中病原菌生长的惊人能力。在冻干后这些特性仍能保留。
于4℃、3个月后，本发明的各菌株对冻干的抗性从35到60％不等。它们还表现出高生长速率、不出现溶源性。
这些特征使这些菌株特别适合于预防和治疗由污染食品或污染水所引起的疾病，以及作为用抗生素治疗过程中或在一般紧张条件下的辅药。此外，它们的稳定性使它们在预防和治疗侵染旅客的病原菌的应用中特别有前途。在可能发生不那么有利的微生物的移生的所有情形中，这些菌株也特别适合于治疗新生儿(例如，剖腹产婴儿、早产婴儿、瓶喂的婴儿)。最后，它们也可用于生产乳制品和有关食品。
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Claims (9)

1.乳酸杆菌属菌株，保藏于the CNCM collection of the InstitutPasteur，编号为I-1390、I-1391、I-1392和I-1447。
2.药物、兽药或营养组合物，含有权利要求1的乳酸杆菌菌株CNCM I-1390、CNCM I-1391、CNCM I-1392和CNCM I-1447中的至少一种菌株，该组合物为与相容载体的混合物形式。
3.药物、兽药或营养组合物，含有权利要求1的一种或多种乳酸杆菌菌株，该组合物为与产生大量L-乳酸的其它菌株的混合物形式。
4.根据权利要求2的药物、兽药或营养组合物，其中的菌株中至少有一种属于嗜酸性乳酸杆菌品种，至少有一种属于非嗜酸性品种。
5.根据权利要求2的组合物，含有CNCM I-1390、CNCM I-1391、CNCM I-1392和CNCM I-1447所有这些菌株的一种混合物。
6.根据权利要求2的组合物，其中菌株CNCM I-1390和/或CNCM I-1391和/或CNCM I-1392和/或CNCM I-1447以冻干形式存在。
7.根据权利要求2-6任一项的组合物，其为胶囊、溶液或可饮用悬浮液或者袋装粉剂的形式。
8.根据权利要求2-7中任一项的组合物，每单一剂量含有每一菌株的细胞为106～1010。
9.权利要求1的乳酸杆菌菌株作为制备乳制品的应用。
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