CN109463402A

CN109463402A - 一种香樟精油细菌群体感应抑制剂的制备方法及应用

Info

Publication number: CN109463402A
Application number: CN201811448758.6A
Authority: CN
Inventors: 李永裕; 王文婷; 吴少华; 张燎原; 吴英详; 张延辉; 刘靖媛; 葛菲; 葛一菲
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2019-03-15

Abstract

本发明提供了一种植物精油的细菌群体感应抑制剂的制备方法及应用，所述的方法包括精油的制备和细菌群体感应抑制剂的制备。本发明从香樟叶片中获得香樟精油，经实验首次证实，本发明制备的精油具有抑制野生紫色杆菌群体感应系统的活性，导致紫色杆菌没有致病性，而且精油不会引起紫色杆菌产生生存压力，进而产生耐药性；本发明制备的精油可抑制大肠杆菌、紫色杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞杆菌的活性，是一种基于细菌群体感应抑制作用的新型抗菌物质。本发明具有原料易得、新型细菌群体感应抑制剂制备方法简单可靠、抑菌剂对细菌不产生耐药性和无毒害作用等优点和特点。

Description

一种香樟精油细菌群体感应抑制剂的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种香樟精油细菌群体感应抑制剂的制备方法及应用。

背景技术

近年来，抗生素及抗菌药物在防治细菌性病害过程中被大量使用。传统抗菌药物通过干扰病原菌的生化代谢过程，影响其结构和功能，达到抑制和杀死细菌的作用。细菌在巨大的生存压力之下迅速变异，导致耐药细菌或超级细菌快速增加，给细菌性病害的防治带来诸多困难，故开发低耐药性的新型高效抗菌剂是研究者们一直努力的方向。细菌群体感应(Quorum sensing, QS)是细菌群体通讯的一种调控机制，指细菌产生并分泌特定信号分子，并通过信号分子的浓度变化来感知周围环境中细菌的数量变化，当信号分子达到一定浓度阈值时，启动或关闭相关基因的表达来适应环境的变化，QS赋予细菌大量个体在特定条件下共同表达部分基因的功能，从而在自然界生存竞争或与宿主互作过程中处于相对有利的地位，以保证种群的生存和繁衍。细菌生命活动中如致病因子的释放、生物膜的形成、荧光产生、孢子的形成、抗生素的形成、DNA 转录等都离不开群体感应的调控。研究表明，植物源的群体感应抑制剂（Quorum sensing inhibitors, QSI）在不抑制细菌生长的情况下能够抑制细菌的QS系统，降低病原菌的致病性，具有不易诱导细菌耐药性又可以起到防治细菌病害的优点。因此，以细菌群体感应为靶标的植物源生物防治剂的研发已成为热点。

香樟（Cinnamomum camphora），为樟科樟属常绿乔木，是我国亚热带绿阔叶林的主要树种之一，也是常用的绿化芳香树种。樟树的根、皮、叶和果实均可作为药用，且根、茎、叶和果实均含有精油。对其详细研究发现香樟精油能够强烈抑制紫色杆菌QS系统的活性。目前尚未见该化合物具有抑制紫色杆菌QS活性的报道，香樟叶片精油的抗菌活性是否和香樟叶片精油的群体感应抑制活性有关仍不清楚。

发明内容

本发明旨在提供一类来源于植物的新型、环保的具有抑制细菌QS系统的抑制剂，所获得的精油化合物能够用于研发新型抗菌先导药物来制备抗菌剂，防治细菌性病害。本发明以细菌群体感应抑制活性为追踪手段，从香樟植物中提取和制备细菌群体感应抑制剂和抗菌剂。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种香樟精油细菌群体感应抑制剂的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）香樟叶片预处理：将采摘的香樟叶片洗净后晾干，置于-20℃冰箱中备用；

（2）将步骤（1）处理好的香樟叶片置于圆底烧瓶中，按照料液质量比1:10加入蒸馏水，于精油提取器中蒸馏提取2h，提取完成后用离心管收集精油，离心管中加入1g无水硫酸钠以去除多余的水分，获得具有细菌群体感应抑制活性的香樟精油。

（3）将制备得到的香樟精油用甲醇-水稀释至亚致死浓度下，即获得香樟精油细菌群体感应抑制剂。

步骤（3）所述甲醇-水为甲醇和水按照体积比1:200混合均匀。

步骤（3）所述亚致死浓度为2.5mg/mL。

进一步地，将上述制备得到的香樟精油细菌群体感应抑制剂应用于制备抗菌先导药物中。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明基于香樟精油制备的细菌QS抑制剂能显著地降低由QS系统介导的紫色杆菌素合成，抑制受QS系统调控的生物膜的形成和群集运动。

（2）本发明基于香樟精油制备的细菌抑制剂能显著地抑制野生紫色杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞杆菌的生长。

（3）本发明具有制备原料易获得、制备方法简单可靠、所制备的细菌群体感应抑制剂对细菌不产生耐药性和无毒害作用等优点。

附图说明

图1为以细菌群体感应抑制活性为追踪手段，从香樟植物中提取精油的群体感应活性筛选结果图。

图2为不同浓度香樟精油对紫色杆菌菌体生长的影响。

图3为不同浓度香樟精油对紫色杆菌素产量的影响。

图4为不同浓度香樟精油对紫色杆菌生物膜生物量及其形成的影响。

图5为不同浓度香樟精油对紫色杆菌群集运动的影响。

具体实施方式

实施例一：细菌群体感应抑制剂的筛选

从香樟植物的叶片、根系、枝条中分别提取多酚、多糖、精油、生物碱等物质，以细菌群体感应抑制活性为追踪手段，筛选具有细菌群体感应抑制活性的有效部位和有效成分，从香樟叶片中分离到具有明显细菌群体感应抑制活性的香樟精油。

实施例二：具有细菌群体感应抑制活性的香樟精油的提取制备

香樟叶片的处理方法：将采摘的香樟叶片洗净后晾干，置于-20℃冰箱中备用。

称取50g处理好的香樟叶片置于圆底烧瓶中，按照料液质量比1：10加入蒸馏水，于精油提取器中蒸馏提取2h，提取完成后用2mL离心管收集精油，离心管中加入1g无水硫酸钠以去除多余的水分，获得具有细菌群体感应抑制活性的香樟精油。

实施例三：香樟精油的群体感应抑制活性测试

1. 实验样品及实验方法

选用预先制备的野生型紫色杆菌Chromobacterium violaceum ATCC31532，在30 °C、150 rpm条件下于液体LB培养基中培养12 h，得菌悬液(OD ₆₀₀ , 0.9)待用。加热固体LB培养基（含2%琼脂），冷却至50 °C左右按1%（V/V）加入菌悬液，摇匀后迅速倒入培养皿，20mL/皿。采用滤纸片法研究细菌群体感应抑制活性，具体方法为：将直径为6mm的滤纸片放置在上述制备好的培养基中，往滤纸片注入15µL的香樟精油，用封口膜封好培养皿置于30 ℃条件下培养24 h后观察。为了验证群体感应抑制圈中细菌是否存活，分别取抑制圈中的细菌在固体LB培养基上划线培养24 h后进行验证，有细菌存活即证明抑制圈中的细菌并未被杀死。

2. 实验结果

附图1是香樟精油抑制紫色色杆菌群体感应活性的实验结果图。在香樟精油样品的周围具有透明度不同的两个圈，内圈颜色透明为抑菌圈，外圈较为浑浊为群体感应抑制圈。取浑浊圈中的细菌划线培养24h后，均有菌落生长，说明该圈中的细菌没有被杀死。这种结果表明，香樟精油具有群体感应抑制的效果，同时也具有抑菌的作用。

实施例四：香樟精油对紫色杆菌的最小抑菌浓度（MIC）及生长曲线测试

1. 实验样品及实验方法

最低抑菌浓度试验采用两倍稀释法，略改动。取用灭菌后的1.5mL离心管，每管中加入液体LB培养基150 µL，并往第一孔中加入终浓度80 mg/mL的香樟精油混匀稀释，随后逐孔稀释两倍，配成一系列样品浓度（80-0.625mg/mL）的培养液，随后往每孔中加入供试野生紫色杆菌菌悬液(OD ₆₀₀ , 0.9)5 µL；并将离心管于30 °C、150 rpm条件下培养，24 h后取培养后的培养液，将其置于96孔板，采用iMark酶标仪测定600 nm处吸光度确定细菌活性，并观察溶液中无明显菌体生长的最低样品浓度即为最低抑菌浓度。

野生型紫色杆菌(Chromobacterium violaceum ATCC31532)预先在30 °C、150rpm条件下于液体LB培养基中活化培养12h。在含有1%（V/V）紫色杆菌菌悬液的20mL的液体培养基中，加入经甲醇-水稀释后不同浓度（MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC，其中MIC为2.5mg/mL）的香樟精油1.2mL，在30 °C、150r/min的摇床中活化，测定在3h-48h的OD ₆₀₀吸光值。

2. 实验结果

香樟精油抑制紫色杆菌的MIC为2.5mg/mL。

附图2为香樟精油处理下紫色杆菌的生长曲线结果图。在处理前期（0-3h），各处理组与对照组中紫色杆菌生长均处于生长迟缓期；3-6h时，各浓度香樟叶片精油处理下的紫色杆菌与对照组（control）皆处于生长指数期，且无明显差异；在处理后期（≥6h），对照组（Control）和精油处理组中，紫色杆菌的生长情况总体一致，无明显差别。结果表明，在该试验浓度下，香樟精油对紫色杆菌的生长无抑制作用。

实施例五：香樟精油抑制紫色杆菌色素的生成

1. 实验样品及实验方法

采用两倍稀释法进行试验，将240mL经甲醇-水稀释后不同浓度（MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC，其中MIC为2.5mg/mL）的香樟精油，置于含1%（v/v）的野生紫色杆菌菌液和4mL LB液体培养基的试管中，试验混合液在30 °C条件下培养24h后，对紫色杆菌素进行测定。测定方法如下：吸取1 mL上述培养好的菌液于1.5 mL 离心管中，12000 g、4 °C离心 20 min，使菌体和紫色菌素沉淀至离心管底部；去上清，加入1 mL 二甲基亚砜于离心管中，涡旋震荡使紫色菌素充分溶解于二甲基亚砜中；12000 g 室温再次离心3 min，去除菌体及碎屑；吸取200 μL 上清, 在酶标仪上测定OD ₆₀₀光吸收值。实验重复3次。

紫色杆菌素抑制率=（空白对照吸光值-样品吸光值）/空白对照吸光值 ×100%

2. 实验结果

附图3是香樟精油抑制紫色杆菌色素产生的结果图。经精油处理的菌液中，紫色杆菌素的含量均低于对照组（CK）, 且随着处理浓度的增加而减少（图-3A）。定量结果（图-3B）显示：不同浓度精油（MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC）处理下紫色杆菌素的抑制率分别为63%、56.23%、51.08%、38%。由此可得出：香樟叶片精油能够明显抑制紫色杆菌中紫色杆菌素的合成，且随着精油浓度的增加，抑制作用逐渐增大。

实施例六：香樟精油抑制紫色杆菌生物膜形成

1. 实验样品及实验方法

采用灭菌后的96孔板，每个孔中含有液体培养基100mL，1%（v/v）紫色杆菌原液和经甲醇-水稀释后不同浓度（MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC，其中MIC为2.5mg/mL）的香樟精油20μL，于30℃条件下培养24h。具体为：将培养液倒出，用无菌PBS缓冲液清洗多次，每孔加入200µL甲醇固定15min，烘干后每孔加入200μL浓度为1%（w/v）的结晶紫溶液，室温染色5mim，倒出培养孔中的结晶紫染色液，用流水将多余的染料冲洗干净，待完全干燥后，每孔加入200µL 33%冰乙酸，在30 °C恒温箱中作用30min，酶标仪测定OD ₆₀₀的吸光值。

显微镜观测生物膜：将规格为1×1cm的盖玻片置于灭菌后的6孔板底部，每个孔中含有液体培养基5mL，1%紫色杆菌原液和不同浓度（MIC和1/4 MIC）的香樟精油，于30 °C条件下培养24h。处理方法同实施例五，经结晶紫染色后，将盖玻片覆盖于干净的盖玻片上，随后置于光学显微镜下观测。

2. 实验结果

附图4是香樟精油抑制紫色杆菌生物膜生物量及其形成的抑制结果图。定量结果显示（图-4A），紫色杆菌的生物膜量随着香樟叶片精油浓度的增加而降低。不同浓度（MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC）香樟精油处理下，生物膜的抑制率分别为：77.64%、69.21%、64.03%和26.83%。如图-4B所示，香樟精油亦能抑制紫色杆菌生物膜的形成，对照组（Control）中，生物膜分布较为密集且聚集成块；香樟叶片精油处理组中紫色杆菌的生物膜分布松散且不能连成块。

实施例七：香樟精油抑制紫色杆菌的群集运动

1. 实验样品及实验方法

Swarming培养基：包含1%（w/v）细菌学蛋白胨、0.5%（w/v）氯化钠、0.5%（w/v）葡萄糖和0.5%（w/v）琼脂。加热固体培养基使其融化，待培养基温度降至约为50℃时加入1.2mL经甲醇-水稀释后浓度为MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC的香樟精油样品，并倒入培养皿，待培养基冷却后，取上述菌悬液5 µL点到培养基中央，随后取封口膜封口培养皿并于30 °C条件下培养18h，其中MIC为2.5mg/mL。

2. 实验结果

附图5是香樟精油抑制紫色杆菌群集运动的结果图。紫色杆菌以鞭毛的形式向外迁移。在加入不同浓度（MIC和1/4MIC）香樟精油的实验组中，紫色杆菌的迁移直径与对照相比明显变小，因此群集运动减弱，MIC浓度对紫色杆菌群集运动的抑制效应更明显。

实施例八：香樟精油的抑菌性测试

1. 实验样品及实验方法

试验菌株为野生紫色杆菌（Chomobacterium violacein ATCC31532）、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC25933)、大肠杆菌（Escherichia coli ATCC25922）和铜绿假单胞杆菌（Pseudomonas aeruginosa PAO1），在LB液体培养基中以150 rpm、30 °C条件培养活化12 h备用，并用甲醇将香樟精油依次稀释为50%，25%和12.5%的浓度。试验采用平板打孔法：加热固体LB培养基（含2%琼脂），冷却至50 °C左右按1%（v/v）加入上述菌悬液(OD ₆₀₀ , 0.9)，摇匀后迅速倒入培养皿。待培养基冷却后，用灭菌后的打孔器在培养基边缘处每旋转 120°打一个孔，重复3次。依次在孔中加入25µL不同浓度（100%，50%，25%和12.5%）的香樟精油。将培养皿分别置于恒温箱中培后，测量抑菌圈直径（包含原孔直径6mm）。以甲醇溶液为对照。

2. 实验结果

香樟叶片精油对细菌的抑菌性结果如表1所示，香樟叶片精油对紫色杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞杆菌均有较为明显的抑制作用，且抑制作用随着精油浓度的增加而增大。相同浓度下的精油，对铜绿假单胞杆菌的抑制作用明显大于大肠杆菌、紫色杆菌和金黄葡萄球菌，说明三种菌株对香樟叶片精油的敏感度不同，而铜绿假单胞杆菌对香樟叶片精油的敏感度较高。

表1香樟精油抑菌性评定

注：表格同一行中的不同字母表示同一样品在不同浓度下的显著性差异（P<0.05）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种香樟精油细菌群体感应抑制剂的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（2）将步骤（1）处理好的香樟叶片置于圆底烧瓶中，按照料液质量比1:10加入蒸馏水，于精油提取器中蒸馏提取2h，提取完成后用离心管收集精油，离心管中加入1g无水硫酸钠以去除多余的水分，获得具有细菌群体感应抑制活性的香樟精油；

2.根据权利要求1所述一种香樟精油细菌群体感应抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述甲醇-水为甲醇和水按照体积比1:200混合均匀。

3.根据权利要求1所述一种香樟精油细菌群体感应抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述亚致死浓度为2.5mg/mL。

4.如权利要求1-3任一所述一种香樟精油细菌群体感应抑制剂的制备方法在制备抗菌先导药物中的应用。