CN1094611A - 改性水解植物蛋白微球及其制备方法的用途 - Google Patents

Abstract

本发明描述了改性水解植物蛋白微球及其制备 方法，和作为药剂口服释放系统的用途。

Description

本申请是1992年12月21日申请的美国专利07/995，508的接续申请。本发明涉及改性水解植物蛋白和由其组成的微球。该微球释放性地包裹了活性剂并适合对哺乳动物口腔给药。本发明也公开了这种微球的制备方法。

对哺乳动物释放药物和治疗剂的有效方式常被机体固有的化学或物理障碍，或者这两种障碍严格地限制。例如，如果不存在化学和生理化学碍障象肠中PH极值，暴露于有效的消化酶，和对活性成份来说胃肠道膜的不透性的话，对许多生理活性剂，口腔释放应该是选择的途径。在许多药剂中已知不适合口腔给药的是生理活性肽和蛋白，如胰岛素，这类药剂在肠中可被酸水解和/或蛋白水解酶迅速破坏。

已有许多研究专门开发这类易破坏的药剂的有效口腔药物释放方法和体系。建议的解决方法有：

（a）联合使用辅药（如间苯二酚和非离子表面活性剂聚氧乙烯油醚和正十六烷基聚乙烯醚）来增加肠壁的渗透性;和

（b）联合使用酶抑制剂，如胰蛋白酶抑制剂，二异丙基氟磷酸酯（DFF）和抑肽酶来避免酶的降解。

尽管如此，由于这类物质存在下述的任一原因，在药物释放体系中它们的使用受到限制。

（a）以有效用量使用时它们的本身毒性;或

（b）不能保护活性成分或促进这此活性成分的吸收;或者

（c）与药物有副反应

用作药物释放体系的脂质体也被描述过。该脂质体在所包裹的药剂周围具有脂质层。在美国专利4，239，754中已公开了含有肝素的脂质体的用途，而且好多研究已针对含有胰岛素的脂质体的应用;如，Patel等（1970）FEBS        Letters        Vol.62，60页和Hashimoto等（1979）Endocrinol.Japan，Vol.26，337页。然而，脂质体的应用仍处于开发阶段并存在一些问题，包括有：

（a）稳定性差;

（b）贮存期短;

（c）限于低分子量（＜30，000MW）的载体，

（d）生产困难;

（e）与载体的副反应。

最近，作为包裹性药剂的人工氨基酸多聚体或类蛋白形成的微球已被公开，例如，美国专利4，925，673（′673号专利）描述了这种微球结构及其制备和应用方法，因而该专利申请的说明书全文被引用为参考文献。尽管′673号专利的微球可适于包裹许多活性剂，但本领域需要该微球载体能包裹广谱活性剂如亲脂类药物。

此外，对制备类蛋白来说′673号专利中所用的方法制造的高分子量（MW）（＞1000道尔顿）和低MW（≤1000道尔顿）类肽多聚体的复杂混合物难于分离。而且，只能获得少量的低分子量微球状类蛋白。所以，也需要一种制备低分子量球类类蛋白的改进方法。

本发明涉及一种改性水解植物蛋白微球以及制备这种微球的一种方法。本发明提供了一种可以并不昂贵的水解植物蛋白如，大豆蛋白制得的稳定性微球，以及制备这种微球的一种简便而经济的方法。按照本发明所制备的微球具有改进的稳定性和给哺乳动物释放生理活性物质的性能。

根据本发明，是把水解过的植物蛋白溶于碱性水溶液并加入一种能与存在于该水解蛋白的游离胺残基反应的化学改进物来制备改性水解植物微球。然后降低该反应混合物的PH值直到该改性植物蛋白从该混合物中沉淀出来。这样回收蛋白很容易形成微球并能用来包裹各种载体如药剂。该微球无毒并能对哺乳动物口腔或肠胃外给药。

图1表示取自于口服实施例4中所述的包裹于有胰岛素的微球或原（不被包裹）胰岛素的小鼠血浆中所测得的葡萄糖的含量。

图2表示口服降钙素和如实施例5中所述本发明的包裹于植物蛋白微球中的降钙素的小鼠血浆中钙的含量。

所有专利，专利申请，以及说明书中所引用的文献的全文在此都被引用为参考文献。在出现不一致时，以本发明说明（包括定义）为准。

把一种水解过的植物蛋白与一种能与该蛋白上的游离胺残基反应的化学改性剂反应来本制备发明的改性植物蛋白微球。然后把改性蛋白转化为包裹活性成份如药物的微球。根据本发明，获得的许多优点，（a）使用了易获得并不昂贵的起始物和（b）一种制备和分离所生产的微球改性蛋白的经济有效的方法。该全部改进工艺操作简单并适于大规模工业生产。

根据本发明方法，在实施例本发明中可使用酸或酶水解的植物蛋白，该植物蛋白一般含有可滴定的羧酸基团（COOH）在约3到约8毫当量/g范围，优选约4到约6毫当量/g，总游离胺基（NH₂）在约3到9毫当量/g的范围，优选在约4到约7毫当量/g的范围。该植物蛋白的分子量在约100道尔顿到约2000道尔顿范围，优选约200道尔顿到约500道尔顿。

水解植物蛋白可从不同的商业途径获得。这类途径的非限定实例如Ajinomoto        USA，Inc.（Teaneck，UJ        07666，USA）;Central    Soya        Co.，Inc.（Fort        Wayne，IN，USA）;和Champlain        Industries，Inc.（elifton，NJ，USA）以及列于“Food        Engineering        Master”（美国Chilton        Co.的一种年度出版物，Radner，PA        19089）的其他公司，在实施本发明中的一种特别优选的水解植物蛋白可从Ajinomoto        USA获得，商品名为AJI-EKI。这种产品是源于脱脂大豆粗粉的一种酸水解液体大豆蛋白。

如果需要的活，该水解植物蛋白液的干燥蛋白提取物可用来制备本发明的改性植物蛋白，干燥蛋白提取物可通过用一种适当溶剂如甲醇提取该水解植物溶液，然后蒸发该溶剂提取物的方法制得。

然后把植物蛋白溶于一种金属氢氧化物如氢氧化钠或氢氧化钾的碱性水溶液中，并在约50℃到约70℃，优选约50℃到约60℃之间的温度下加热，时间为约10分钟到约40分钟之间，优选约15分钟。该植物蛋白中可滴定的每毫摩尔NH₂所用的碱量一般在约2到约3毫摩尔之间，优选在约2.2和约2.5毫摩尔之间。该溶液的PH值一般在约8和约13的范围内，优选的约9到约10之间。

此后，搅拌下把一种胺改性剂加入该反应混合物中。这种胺改性剂是能与该蛋白中存在的游离胺（NH₂）残基反应的合成物。在实施本发明中所用的一些非限定性胺改性剂的例子有磺化剂如苯磺酰氯和酰化剂如苯甲酰氯。

与所用的水解植物蛋白量有关的胺改性剂用量是按该植物蛋白中总游离NH₂的当量而定的。因而，对植物蛋白中每摩尔当量总NH₂基要使用约0.3到约1.2当量的改性剂，并且对该水解植物蛋白中每摩尔当量的总NH₂基、优选约0.6到约1.0当量的改性剂。

在实施本发明中，植物蛋白和改性剂混合物一般保持在约50℃到70℃之间，优选约60℃到约65℃之间的温度下，时间为约2到约5小时之间。

该反应通过用一种合适的酸如浓盐酸调节该混合物的PH值，直到PH值达到约2和约3之间而骤然终止。该混合物在室温下不断地分离形成一个乳浊上层和一个黑色粘稠的下层。除去上层物并过滤从下层物中收集改性植物蛋白。然后把改性植物蛋白的粗品溶于PH值在约9和约13之间，优选约11和约13之间的水中。过滤除去不溶物并把滤液真空干燥。改性蛋白的产率一般在约30到约60%的范围内，一般为45%左右。

本发明的改性植物蛋白可溶于碱性水溶液（PH≥9.0）;特别可溶于乙醇，正丁醇和1∶1（V/V）甲苯/乙醇液中并不溶于中性水。改性后存在于该植物蛋白的可滴定的功能团是如下所示的：在约1.5和约3.5毫当量/克，优选约2.3毫当量/克羧酸基（COOH），在约0.3和约0.9毫当量/克，优选约0.5毫当量/克 氨基（NH₂），该改性植物蛋白的分子量在约200道尔顿和2000道尔顿之间，优选约200道尔顿和约500道尔顿之间。

本发明的改性植物蛋白能马上用来微量包裹一种活性药理试剂或者用常规方法把该蛋白浓缩或干燥并贮存为将来使用。

用氧化铝作固体支持柱，甲醇/正丙醇作为流动相;反相柱用三氟乙酸/乙腈混合物作为流动相;和用水作流动相的离子交换谱分馏纯化该改性植物蛋白，在进行阴离子交换色谱分离时，使用一组0-500mM连续梯度的氯化钠。该改性植物蛋白也可用一种低级醇如甲醇，丁醇或异丙醇萃取除去低分子量的污染物来纯化。

下列方法可用来从纯化的改性植物蛋白中制备微球。在约25℃和约60℃之间，优选约40℃，以约75到约200mg/ml之间的浓度，优选约100mg/ml，用去离子水溶解改性植物蛋白。用常规方法如在滤纸上重力过滤法除去残存于该溶液的颗粒物。

其后，保持在40℃左右温度，把该蛋白溶液与一种酸性溶液（也在40℃左右）以1∶1（V/V）混合。该酸性水溶液浓度在约0.05N到约2N之间优选1.7N左右。在40℃把所得到的混合物进一步保温在用小型显微镜法观察到微球的形成的有效时间。在实施本发明中，加入的优选顺序是把该蛋白溶液加入酸性水溶液。

适当的酸包括不能（a）对该蛋白有副作用如化学降解;（b）干扰微球的形成;（c）干扰微球包裹的载体;以及（d）与载体有副反应的任何一种酸。用于本发明最好的酸有乙酸，柠檬酸，盐酸，磷酸，苹果酸和马来酸。

在实施本发明中，一种微球稳定附加物优选在该微球形成步骤前掺入酸性水溶液中或该蛋白溶液中。这种附加物的存在能改善溶液中该微球的稳定性和分散性。

该附加物可以约0.1到5%（W/V）之间的浓度，优选约0.5%（W/V）使用。合适的，但并不限定的微球稳定附加物的例子有阿拉伯树胶，明胶，聚乙二醇，和多聚赖氨酸。

在这些条件下，该改性植物蛋白分子能形成直径小于10微米的中空微球。如果在以前所提到的酸性水溶液中存在一种可溶物质如药剂下形成的该蛋白微球，那么该物质将被包裹在该微球的中部空处封闭于用该球状结构所定义的蛋白壁内。用这种方法，人们能够包裹药理活性物如肽类，蛋白类和多糖类以及带电荷的有机分子如喹诺酮，或者，经口腔途径的生物利用度差的抗微生物剂。可包裹于该微球的药剂用量是以许多因素而定的，这些因素包括在该包裹溶液中药剂的浓度，以及对该载体来说载物的柔和性。

本发明的改性植物蛋白微球是在药理上无害的并不改变活性剂的生理和生物学特性。而且，该包裹步骤不改变该活性剂的药理特性。当任意药剂都能包裹于该蛋白微球中时，对释放化学或生理试剂特别有价值，换句话说这些化学或生理试剂是指给哺乳动物服用后，该微球还未到达靶区（即，该微球内容物将释放的部位）之前，被哺乳动物，体内所预计的条件破坏，或使效果降低，以及在胃肠道吸收较差的那些试剂。

本发明的蛋白微球特别适用于口腔给药的某些药剂如小肽类激素，这些药剂由于其缓慢通过或不能通过胃肠粘膜和/或在胃肠道中易被酸和酶化学分解。这类药剂的非限定例子，如人或牛的生长激素，干扰素和白介素-Ⅱ，降钙素，围鳃自然因子，抗原和多克隆抗体。

该微球颗粒大小在胃肠道靶区中决定释放活性剂起着重要作用。直径在约≤0.1微米和约10微米之间，优选在约5.0微米和约0.1微米之间，并且包裹有活性剂的微球，是足够小能够在胃肠道内的靶区有效释放该活性成分。把小微球悬浮于一种适宜的载体流质（如等渗生理盐水）中也能胃肠外给药，并且可注射到循环系统或皮下。当然所选的给药方式根据给药的活性成分的要求不同而变化。较大蛋白微球（＞10微米）如口腔释放易降低效果。

把改性植物蛋白与水或含有活性剂的一种含水溶液结合所形成的微球大小，能够用不同物理或化学参数的如PH值，容积渗透当量或离子强度的包裹溶液，以及选择包裹步骤所用酸的方法来控制。

本发明于植物蛋白的微球适合于口腔给药的肽激素类，如胰岛素以及多糖类如肝素，换句话说是在胃中被破坏的那些物质。它们也适合于保护胃防止胃刺激物如阿斯匹林和NSAID′S。当含有微球的这种阿斯匹林被口腔给药时，它们通过胃肠粘膜并释放阿斯匹林比常规肠衣包裹的阿斯匹林更加迅速，肠衣包裹的阿斯匹林首先必须通过胃，然后在肠衣溶解后由肠进入血流中。

本发明的微球能以片剂，丸剂、胶囊剂形成的固体状和适合悬乳于液体如水或可食油中的颗粒状单独口腔给药。类似地，该微球也能被配制为含有一种或多种生理相容的载体或赋形剂的一种组合物，并且该组合物能经口腔途径给药。这类组合物可含有常用的组份如明胶，聚乙烯吡咯烷酮，和填充剂如淀粉和甲基纤维基。另一方面，较小的微球（直径小于10μm）能够通过胃肠外的途径给药。

用以下实施例更好地详细说明本发明，它不构成对本发明范围的限制。

实施例1

用苯磺酰氯改性大豆蛋白

a.大豆蛋白的提取

把3.2L酸水解液态大豆溶液（AJI-EKI，Ajinomoto        USA，Inc.）在直空碱压，得到1440g固态粉。该固体用甲醇（2L每次提取）提取3次。从收集在一起的提取物中蒸馏除去甲醇。得到一种黑棕色粉状大豆蛋白，产率为608g。用常规方法滴定大豆蛋白粉中的功能团。参见如“A Laboratory Manual of Analytical Methods of protein Chemistry.”Vol 1-3，编辑者P.Alexander和R.J.Block，Pergamon出版社1960和1961中的常规滴定法。该大豆蛋白含有下列功能团：3.7毫当量/g的COOH：0.44毫当量/g的游离的N-末端NH₂;和3.48毫当量/g总游离NH₂。该大豆蛋白的分子量在100到2000道尔顿之间。

b.大豆蛋白的改性

把步骤（a）的干大豆蛋白（600g，2.5当量的总游离NH₂）溶于3L 2N氢氧化钾水溶液（2.25摩尔，过量）并在60℃加热该溶液30分钟。然后，把苯磺酰氯（460g，2.60摩尔）滴加入该混合物中并监控反应温度使它不超过65℃。在搅拌下反应在63℃持续4小时。反应混合物冷却到室温，然后用20%HCl水溶液酸化到PH3.0，并使改性的大豆蛋白沉淀出来。用蒸馏水（IL）洗两次该改性大豆蛋白并将它溶于2N氢氧化钠水溶液直到PH为8.5～9。将该溶液滤除颗粒物并在真空浓缩干燥得到改性干品（257g，产率24%）。该产物有下列可滴定的基团：2.3毫当量/g COOH;0.2毫当量/gN-末端游离NH₂;和0.3毫当量/g总游离NH₂。

实施例2

用苯甲酰氯改性大豆蛋白

在本实施例中使用了一种商品化水解大豆蛋白水溶液（AJI-EKI，Ajinomoto        USA，Inc.），没有进一步提取。该蛋白溶液中含有下列功能团：2.6毫当量/ml的COOH和2.0毫当量/ml的NH₂。该大豆蛋白的分子量约6.5KD。

在该大豆蛋白溶液中（240ml，0.5当量游离的NH₂）加入107ml 10N氢氧化钾水溶液，然后加入200ml蒸馏水。接着把溶液放在冰浴中（5℃）并滴加苯甲酰氯（70g，0.5摩尔），温度在10到25℃之间。其后在室温下搅拌反应混合物45小时。然后用浓盐酸把反应混合物的PH值从13.2降至2.8。放置1小时后，过滤收集沉淀出的改性的大豆蛋白并用蒸馏水洗涤。把该大豆蛋白溶于2N氢氧化钠溶液中得到溶液（PH12.6），然后蒸发得到48g干品（产率为41%）。

实施例3

用改性大豆蛋白制备空微球

本实施例详细说明制备和清洁空的改性大豆蛋白微球的一种方法。

步骤

1.试剂：

a.如实施例1中描述的改性蛋白粉

b.无水柠檬酸（USP）

c.阿拉伯树胶NF

d.去离子水

e.冰醋酸。

2.仪器：

a.PH仪

b.Eppendorf吸管和电极

c.水浴，40℃

d.液氮

e.低压冻干烧瓶。

3.溶液的制备：

a.蛋白溶液-在1ml去离子（或多倍去离子水）溶解100mg改性大豆蛋白。如果必要的话，通过Whatman        ＃1滤纸过滤并在水浴中保持40℃为溶液A。

b.含有0.5%阿拉伯胶的1.7N柠檬酸-在1升去离子水中，溶解5g阿位伯树胶和109g柠檬酸。保温在40℃为溶液B。

4.微球的制备

a.在40℃水浴中一次把全部溶液A迅速加到正用手涡转的溶液B中。

实施例4

含有包裹胰岛素的大豆蛋白微球的制备

本实施例描述了胰岛素微球制备和净化的方法。

步骤

1.试剂：

a.如实施例1所述制备的改性蛋白粉

b.肝素

c.冰醋酸（USP）

d.阿拉伯树胶NF

e.去离子水

f.干燥剂

g.液氮。

2.仪器：

a.磁性搅拌器

b.滴定管

c.显微镜

d.分析离心机

e.透析膜管（Spectrum        6，10mm，50，000分子量截止）

f.PH仪

g.冷冻干燥器（Laboonco        ＃75035）

h.冷冻干燥烧瓶（150-300ml）

i.旋转层冷凝器

j.异丙醇/干冰浴或液N₂

k.研钵和研杵

l.贮存容器（500ml）

m.Eppendorf吸管（0-100μl）

n.有塑料盖的透析管（Spectrum）

o.有0.45μm        Acrodisk的2ml注射器

3.溶液的制备：

a.蛋白溶液A⁺（80mg/ml）：

取160mg改性大豆蛋白并溶于1ml去离子水中。用一支2ml注射器滤过0.45μm·Arodidk注入一只10ml试管。在40℃保温。

b.溶液B（含1%树胶的1.7N柠檬酸）：

在1升去离子水中溶入10g阿拉伯树胶和109g的柠檬酸。

c.溶液c（肝素溶液）：

以150mg/ml把肝素溶于溶液B中，并在40℃保温。

4.微球的制备：

a.在40℃水溶中把全部溶液A迅速加入慢慢用手涡转的溶液C中。

5.微球的净化：

a.用一只注射器（无针头）把悬液转移到透折管中并用塑料盖密封。管中溶液应不超过全部的70%。

b.除去沉淀和/或凝结在表面的任何无定形物质。

c.在用一台磁性搅拌器搅拌醋酸溶液的同时，把该微球悬浮液放于醋酸（每毫升微球悬浮液用20ml醋酸溶液）中透析。

d.每小时加入醋酸溶液。连续透析共3小时。

6.冷冻干燥

a.把一份50%海藻糖（Sigma）加入9份透析过的微球溶液中。在一只冷冻干燥的烧瓶中用已调到190rpm转的层式冷凝器，骤然冷冻微球，并浸泡在液氮浴中。

b.当证实需要自身冷却时，冷冻干燥24小时，或到干燥。

c.记录干微球的重量。

d.用研体和研杆研磨成一种细粉。

e.转移到琥珀色容器，并用干燥剂密封，室温下存放。

7.再悬浮

a.称量冷冻干燥过的粉，并计算粉中蛋白的用量。

b.在40℃把0.85N柠檬酸加入到冷冻干燥粉中。蛋白的最终浓度为80mg/ml。

实施例5

用鼠评价胰岛素微球

在本实施例中，用鼠来评价按实施例3中所制备的胰岛素微球。把12只鼠如下分成两组：

1.口服胰岛素微球：3mg胰岛素/Kg体重，用口腔管饲法（6只）;

2.原胰岛素（未包裹）：3mg胰岛素/Kg体重，用口腔管饲法（6只）。

给小鼠进行口腔管饲法给药。给药前马上制备胰岛素微球，第1组中每只小鼠得到适当剂量的微球。第2组中的小鼠获得未包裹的胰岛素。就在给药前（时间为“0”）和给药后1到6小时，从每只小鼠中取约0.5ml的血液。血样中的血清贮放于-20℃。

用常规方法分析取自鼠的解冻血清的葡萄糖的含量。如图1所示，可观察到在第4组获得包裹的胰岛素的小鼠的血清葡萄糖含量，骤然下降。比较起来，第2组小鼠中血清葡萄糖含量从t＝0起缓慢地增长。结果表明当口腔给药时，与未包裹的胰岛素相比，包裹的胰岛素有一个较大的生理作用。

实施例6

包裹降钙素微球的制备

用实施例7中所描述的相同方法进行大豆蛋白微球中包裹鲑降钙素。降钙素是从Sandoz（Basil，瑞士）获得的，并如实施例3中所描述的，制备在有1%树胶，1.7N柠檬酸溶液中的150mg/ml降钙素溶液。

实施例7

用小鼠评价降钙素微球

在该实施例中，用小鼠来评价按实施例5所制备的降钙素微球。十二只小鼠分为以下两组：

1.口服降钙素微球：用口服管饲法60μg降钙素/Kg体重（6只小鼠）

2.口服未包裹的微球：用口服管饲法60μg降钙素/Kg体重（3只小鼠）（对照）。

给小鼠进行口服管饲法给药。给药前马上制备降钙素微球并且第1组小鼠得到适当剂量的微球悬浮液。第2组小鼠得到未包裹的降钙素。就在给药前（时间为“0”）和给药后1小时，2小时和3小时，从每只小鼠中取约0.5ml血液。血样中的血清放于-20℃。

用常规方法分析取自第1和2组小鼠中解冻血清中钙的含量。如图2所示，可观察到获得包裹降钙素的第1组小鼠的血清中钙的含量骤然下降。相对照，第2组小鼠的钙的含量从t＝0起轻微地下降。该结果表明当口腔给药时，与未包裹的降钙素比较，包裹的降钙素有较大的生理作用。

Claims (15)

1、一种包裹有一种负载的微球，该微球含有用一种胺反应改性剂改性的水解植物蛋白。

2、根据权利要求1的微球，其中所述的水解植物蛋白含有酸水解大豆蛋白。

3、根据权利要求1的微球，其中所述的微球有等于或低于10微米的直径。

4、根据权利要求2的微球，其中所述的胺反应改性剂选自苯磺酰氯和苯甲酰氯。

5、含有包裹在一种水解植物蛋白微球中的一种生理活性剂的组合物，所述的微球含有由一种胺反应改性剂变性的水解植物蛋白组成的一种生理相容蛋白壁。

6、根据权利要求5的组合物，其中所述的胺反应改性剂选自苯磺酰氯和苯甲酰氯。

7、根据权利要求5的组合物，其中所述的生理活性剂包含一种单克隆抗体，胰岛素、降钙素或促红细胞生成素。

8、根据权利要求5的组合物，其中所述的水解植物蛋白含有酸水解大豆蛋白。

9、制备一种改性水解植物蛋白微球的方法，其含有的步骤为：

（a）混合水解植物蛋白和碱性水溶液形成溶液;

（b）用胺反应剂处理该溶液形成含有改性水解植物蛋白的混合物;

（c）回收该改性水解植物蛋白;

（d）在一种酸性水溶液中保温该改性水解植物蛋白形成该改性水解植物蛋白微球，并

（e）收集该蛋白微球。

10、根据权利要求9的方法，其中所述碱水溶液含有氢氧化钾或氢氧化钠。

11、根据权利要求9的方法，其中在约35℃和约40℃之间范围内的温度下，操作步骤（a）。

12、根据权利要求9的方法，其中该胺反应剂选自苯磺酰氯和苯甲酰氯。

13、根据权利要求12的方法，其中所述的酸水溶液还含有一种生理活性剂。

14、根据权利要求13的方法，其中所述的生理活性剂含有一种单克隆抗体，胰岛素，降钙素，或促红细胞生成素。

15、根据权利要求1的微球，其中所述的水解植物蛋白含有酸水解大豆蛋白。

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