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CN109439624A - 一种用于识别或富集有核红细胞的方法 - Google Patents

一种用于识别或富集有核红细胞的方法 Download PDF

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CN109439624A CN201811452001.4A CN201811452001A CN109439624A CN 109439624 A CN109439624 A CN 109439624A CN 201811452001 A CN201811452001 A CN 201811452001A CN 109439624 A CN109439624 A CN 109439624A
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Abstract

本发明提供了一种用于识别或富集有核红细胞的方法。利用特定的核酸适体与外周血中的有核红细胞的特异性来识别或富集有核红细胞。与现有技术相比，本发明提供的方法具有显著优点，主要表现在：(1)提供了一种新的有核红细胞的捕获或富集方法，具有重要意义；(2)利用核酸适体对有核红细胞进行特异性识别或捕获，可以有效提高目标细胞的识别或捕获效率，对于有核红细胞的相关研究有重要意义；(3)核酸适体分子量小，制备方法是化学合成，具有易修饰、稳定性强、便于保存等优势。(4)核酸适体在识别过程中对有核红细胞的特异性好，亲和力好，操作简单，准确性和灵敏度高。为疾病筛查或者胎儿产前诊断提供了新的方法和途径。

Description

一种用于识别或富集有核红细胞的方法
技术领域
本发明属于有核红细胞检测技术领域，具体涉及一种用于识别或富集有核红细胞的方法。
背景技术
有核红细胞在正常成人外周血中不能见到，在出生1周之内的新生儿外周血中可见到少量。成人外周血中出现有核红细胞均属病理现象。可见于：①增生性贫血：最常见于各种贫血，急性失血性贫血、巨幼红细胞性贫血、严重的低色素性贫血。以出现晚幼红细胞或中幼红细胞为多见。外周血中出现有核红细胞表示骨髓中红细胞系增生明显活跃；②红血病、红白血病：骨髓中幼稚红细胞异常增生并释放入血，以原红细胞、早幼红细胞为多见；③髓外造血：骨髓纤维化时，脾、肝、淋巴结等组织恢复胚胎时期的造血功能，这些组织因缺乏对血细胞释放的调控能力，幼稚血细胞大量进入外周血。各发育阶段的幼红细胞都可见到，并可见到幼稚粒细胞及巨核细胞；④其他：如骨髓转移癌、严重缺氧等。
此外，有核红细胞稳定存在于妊娠妇女外周血中，其生命周期短，产后在妇女外周血中很快消失，用于产前诊断时不受上次妊娠的干扰。除此，在病理状态下具有相对较明显升高的特点，这有助于病理产科的无创产前诊断。在妊娠早期胎儿红系细胞比白系细胞发展得早，在卵黄囊和肝造血期，胎儿红细胞与白细胞比约1000:1，理论上妊娠早期进入母外周血的有核红细胞多于其他类型的胎儿细胞。有核红细胞含有胎儿完整的基因组，能用于胎儿遗传性疾病的分析研究，理论上，一个有核红细胞就可以进行胎儿遗传性疾病的分析和诊断。因此，捕获母亲外周血中的有核红细胞进行产前诊断或者对胎儿的各种可能的遗传疾病做出分析研究将有巨大的潜力。
现在捕获或富集有核红细胞的方法主要是密度梯度离心、磁激活细胞分选、荧光激活细胞分选、显微操作分离法和微流控装置，其中密度梯度离心和显微操作分离法是根据有核红细胞本身的密度和形态特征，磁激活细胞分选、荧光激活细胞分选和微流控装置是通过有核红细胞表面特异性表达的CD71抗原，使用针对CD71的抗体进行特异性的捕获。现有的能捕获CD71的配体包括转铁蛋白和CD71抗体等都有其相应的缺陷。转铁蛋白和抗体的制备成本较高，制备过程中的均一性差，并且不易修饰，而且捕获富集过程操作复杂。
核酸适体是通过体外指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution ofligands by exponential enrichment，SELEX)筛选得到的能够高亲和性和高特异性结合靶标分子的ssDNA或ssRNA。核酸适体与抗体相比，核酸适体分子量小(5-15kD)，制备方法是化学合成，易修饰，稳定性强、便于保存等优势。
我们发现核酸适体TY8能够识别CD71，该核酸适体可以作为CD71的有效配体，并且可以在外周血中识别用于疾病诊断，或者将捕获到的有核红细胞用作研究。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种灵敏度高、特异性强、操作简便，用于识别或富集有核红细胞的方法。
本发明的目的是采用以下技术方案实现的。
一种用于识别或富集有核红细胞的方法，利用核酸适体与外周血中的有核红细胞的特异性结合来识别或富集有核红细胞，所述的核酸适体序列如下：5＇-ACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC-3＇，SEQ NO.1。
所述的用于识别或富集有核红细胞的方法，还可以通过对所述的核酸适体增加或者删减碱基，或者碱基替换获得具有相同功能的核酸适体。
所述的用于识别和富集有核红细胞的方法，还可以将所述的核酸适体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或酶标记物质，得到与所述核酸适体具有相同结合有核红细胞能力的核酸适体衍生物。
所述的用于识别和富集有核红细胞的方法，包括以下步骤：
(1)、外周血的预处理：密度梯度离心获得单个核细胞层；
(2)、核酸适体预处理：连接上生物素；
(3)、富集过程：将核酸适体与外周血孵育，洗涤去除多余的核酸适体，然后加入修饰了链霉亲和素的磁珠孵育，最后在磁铁的作用下捕获出有核红细胞。
本发明核酸适体用于捕获和富集有核红细胞的详细步骤：
1、采集外周血血样，置于肝素抗凝真空采血管，4h内送达实验室；
2、用含有5％BSA和4％EDTA的DPBS等体积稀释血样；
3、加密度为1.077g/ml的ficoll淋巴细胞分离液到离心管中，然后将血液缓慢加入到ficoll淋巴细胞分离液上层，并且使界面清晰；
4、离心机密度梯度离心，转速400rcf，时间30min，获得分层的血样：顶层是黄色澄清的血清，中间是白色透明的淋巴分离液，底部是红色的成熟红细胞沉降物，获取顶层和中间层之间的白色絮状环层，该层即为单核细胞层；
5、加入适量的DPBS，转速250rcf，时间10min，常温离心获得细胞沉淀，重复此步骤；
6、取适量的带有生物素标记的TY8，先95℃加热5min，然后置于4℃冷却10min；
7、用Binding buffer重悬细胞，加入生物素标记的适体TY8，置于4℃摇床孵育40min，使核酸适体识别出血液中的有核红细胞；
8、加入等体积的Washing buffer，混匀后250rcf、5min、4℃离心，获得细胞沉淀，再按照此重复洗涤一次；
9、加入适量修饰了链霉亲和素的磁珠到细胞沉淀中，并且在含有0.1％吐温的Washing buffer的溶液环境中4℃孵育20min，使链霉亲和素和生物素充分的结合；
10、将上面的体系外加到磁铁上，静置1分钟，使磁珠被磁铁吸附，去掉溶液部分，再加入含有0.1％吐温的Washing buffer，重复洗涤一次；
11、在共聚焦下观察捕获到的有核红细胞。
上述方法捕获到有核红细胞之后，不仅仅可以研究有核红细胞，还可以用于相关疾病的研究或者诊断，如果是捕获到妊娠妇女外周血中有核红细胞之后，可以用于胎儿的有核红细胞的研究或者疾病筛查。
本发明的第二个目的是提供上述提及的核酸适体的具体应用，包括：
所述的核酸适体在制备识别或富集有核红细胞的试剂中的应用。
所述的核酸适体在制备与有核红细胞表面的蛋白CD71结合的试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的方法具有显著优点，主要表现在：(1)提供了一种新的有核红细胞的捕获或富集方法，具有重要意义；(2)利用核酸适体对有核红细胞进行特异性识别捕获，可以有效提高目标细胞的识别捕获效率，对于有核红细胞的相关研究有重要意义；(3)核酸适体分子量小(5-15kD)，制备方法是化学合成，具有易修饰、稳定性强、便于保存等优势；(4)核酸适体在捕获过程中对有核红细胞的特异性好，亲和力好，操作简单，准确性和灵敏度高。(5)为疾病筛查或者胎儿产前诊断提供了新的方法和途径。
附图说明
图1为核酸适体TY8结合人红白血病细胞系；
图2为核酸适体TY8结合造血干细胞诱导的有核红细胞；
A是流式数据，B是共聚焦数据；
图3为核酸适体TY8结合脐带血中的有核红细胞；
图4为核酸适体TY8偶联磁珠捕获外周血中的有核红细胞；
图5为核酸适体TY8结合细胞膜蛋白；
图6为核酸适体TY8结合蛋白SDS-PAGE胶分析；
图7为核酸适体TY8与CD71的抗体共定位荧光共聚焦结果；
图8为证明核酸适体TY8结合的是CD71的western bloting结果图；
最下面的横框中是转膜之后与CD71抗体孵育的发光图片；
图9为核酸适体TY8结合CD71蛋白的解离常数计算。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
本发明实施例中配制的试剂：
Washing buffer：PBS溶液中含以下物质:5mM MgCl2,4.5g/L葡萄糖；
Binding buffer：PBS溶液中含以下物质：5mM MgCl2,4.5g/L葡萄糖,0.1mg/mLyeast tRNA,1mg/mL BSA and 20％FBS。
抗凝缓冲液：DPBS+0.5％BSA+0.4％EDTA。
低渗缓冲液：取25.2mL的Washing buffer于50mL离心管中，分别向其中加入3mL10×cocktail，1.5mL 1M的Tris-HCl，300μL 100×的PMSF，震荡混匀后4℃保存。
膜蛋白裂解液：取5mL的低渗缓冲液于15mL的离心管中，向管中加入50μL的Triton-X-100，4℃保存。
购买的试剂：
ELISA试剂盒购于BD公司，该试剂盒包括：coating buffer(涂层缓冲液)，assaydiluent(封闭液)，SAv-HRP(链霉亲和素包被的HRP试剂)，substrate solution(底物溶液)，stop solution(终止溶液)等。
DPBS，BSA，EDTA，羟乙基淀粉，1.077g/ml的Ficoll淋巴细胞分离液，细胞因子：IL3，scf，epo，fbs；sfem培养基，胰蛋白酶，蛋白酶K，DNA封闭液等购于赛默飞公司。
cocktail，PMSF，Triton-X-100购于sigma公司。
loading buffer，丙烯酰胶,Tris-HCl,SDS,APS，TEMED,溴酚蓝，考马斯亮蓝染色液等购于碧云天公司。
链霉亲和素包被的琼脂糖凝胶珠购于GE公司。
PL45细胞，红白血病细胞系HEL均来自上海细胞库。
实施例1：TY8结合红白血病细胞系实验
(1)培养红白血病细胞系HEL，直至对数生长期，用DPBS洗涤三次；
(2)计数，获取30万个细胞，用200μl的Binding buffer重悬；
(3)加入cy5荧光标记的TY8，使终浓度为250nM；
(4)在4℃，80rpm的摇床上，孵育40min；
(5)用500μl Washing buffer洗涤三次，1000rpm，4℃，5min；
(6)用500μl Washing buffer重悬，上流式分析。
为了确定TY8是否结合有核红细胞，首先采用了红白血病细胞系HEL，将核酸适体和随机文库分别与这种细胞系共孵育然后上流式检测，结果证明TY8能够特异性的结合红白血病细胞系，见图1，红白血病细胞系的细胞类型是有核红细胞。
实施例2：TY8结合造血干细胞诱导分化的有核红细胞实验
(1)取脐带血，加入适量肝素抗凝，并及时处理。
(2)1:1加入抗凝缓冲液，稀释混匀，然后再以稀释后的脐带血：抗凝缓冲液：6％羟乙基淀粉＝2:2:1的比例加入6％的羟乙基淀粉，室温静置1h。
(3)吸取上清液至新的离心管中，约40ml/管。离心，1500rpm，10min，去上清。
(4)将所得细胞沉淀重悬于抗凝缓冲液中，然后取15ml离心管，加入1.077g/ml的Ficoll淋巴细胞分离液，约3ml/管，将细胞液加到Ficoll淋巴细胞分离液的上层，约7ml/管，离心，1800rpm，30min。
(5)吸取第二层的单核细胞至新的离心管中，加入抗凝缓冲液至满，1500rpm，15min，离心去上清。加入抗凝缓冲液重悬细胞，细胞计数，然后1500rpm，15min，离心去上清。
(6)加入300μl抗凝缓冲液重悬细胞，然后加入100μl封闭液，室温避光静置5min，然后加入适量磁珠，室温避光孵育30min，然后再加入适量抗凝缓冲液洗涤，300rpm，10min，离心去上清。
(7)将细胞再次重悬在抗凝缓冲液中，将分离柱放置到磁板上，加入2ml抗凝缓冲液清洗分离柱，然后加入细胞重悬液，再加入2ml抗凝缓冲液洗涤分离柱，过柱时细胞悬液应沿着柱子的壁逐滴加入。
(8)取下分离柱，放置到新的15ml离心管，加入2ml抗凝缓冲液，将细胞吹下。
(9)然后进行培养，细胞培养前再离心一次，300rpm，10min，弃掉抗凝缓冲液，用配制好的培养基重悬细胞，再加入到培养皿中，此时培养基为含有IL3 10ng/ml，scf 50ng/ml，epo 1u/ml和10％fbs的sfem培养基，直至第6天；第6天时培养基换成含有30％fbs，3u/ml epo的sfem培养基，培养到第14天。
(10)取培养到第8天的细胞，加入适量的DPBS，1000rpm 5min离心洗涤两次，加入标记了cy5的TY8和标记了PE的CD71抗体,冰上避光孵育40min，加入适量预冷的DPBS，1000rpm5min离心洗涤两次；
(11)通过共聚焦和流式分析，可以观察到核酸适体TY8和抗体CD71都能结合该诱导的有核红细胞，并且存在共定位。
为了进一步确定TY8是否结合有核红细胞，采用了由CD34阳性细胞诱导分化的有核红细胞，将分化的有核红细胞进行CD71抗体的标记和核酸适体TY8的标记，可以观察到流式结果的一致性，和共聚焦结果的共定位效果，见图2。
实施例3：TY8结合脐带血中的有核红细胞实验
(1)采集脐带血，置于肝素抗凝真空采血管，4小时内送达实验室；
(2)用抗凝缓冲液等体积稀释血样，加4ml密度为1.077g/ml的ficoll淋巴细胞分离液到15ml洁净的离心管中，然后将血液缓慢加入到该离心管中，使界面清晰；
(3)400rcf，30min密度梯度离心，获得分层的血样：顶层是黄色澄清的血清，中间是白色透明的淋巴分离液，底部是红色的成熟红细胞沉降物，用移液管吸取顶层和中间层之间的白色絮状环层，置于新的15ml离心管，该层是单核细胞层；
(4)在单核细胞层的细胞中加入适量的DPBS，250rcf、10min常温离心获得细胞沉淀，然后加入适量的DPBS重悬，再次250rcf、10min常温离心获得细胞沉淀；
(5)用适量的Binding buffer重悬，并加入相应的CD71抗体、GPA抗体和cy5荧光标记的TY8核酸适体孵育，进行标记，4℃孵育40min；
(6)加入等体积的Washing buffer，混匀后250rcf、5min、4℃离心，获得细胞沉淀，再按照此再重复洗涤一次；
(7)最后用适量的Washing buffer重悬，上流式检测，获得双阳信号的细胞即为有核红细胞，并分析该群细胞标记上了核酸适体TY8。
采用临床样本脐带血进行TY8结合胎儿有核红细胞的考察，首先对脐带血密度梯度离心获得单核细胞层，对它进行有核红细胞标记物CD71和GPA的抗体荧光标记，同时分别与TY8、随机文库进行孵育，然后进行流式分析，对于CD71和GPA双阳的有核红细胞群中，TY8可以特异性的识别，见图3。
实施例4：TY8偶联磁珠捕获到有核红细胞实验
(1)采集外周血血样，置于肝素抗凝真空采血管，4小时内送达实验室；
(2)用含有5％BSA和4％EDTA的DPBS等体积稀释血样，加4ml密度为1.077g/ml的ficoll淋巴细胞分离液到15ml洁净的离心管中，然后将血液缓慢加入到该离心管中，使界面清晰；
(3)400rcf，30min密度梯度离心，获得分层的血样：顶层是黄色澄清的血清，中间是白色透明的淋巴分离液，底部是红色的成熟红细胞沉降物，用移液管吸取顶层和中间层之间的白色絮状环层，置于新的15ml离心管中，该层即为单核细胞层；
(4)在单核细胞层的细胞中加入适量的DPBS，250rcf、10min常温离心获得细胞沉淀，然后加入适量的DPBS重悬，再次250rcf、10min常温离心获得细胞沉淀；
(5)用Binding buffer重悬细胞，加入适量标记上带有PE染料的CD71抗体，和带有生物素的核酸适体TY8，置于冰上40min，使核酸适体识别出血液中的有核红细胞；
(6)加入等体积的Washing buffer，混匀后250rcf、5min、4℃离心，获得细胞沉淀，再按照此再重复洗涤一次；
(7)加入适量标记了链霉亲和素的磁珠和核染料hoechst33342，并且在含有0.1％的吐温的Washing buffer的溶液环境中4℃孵育20min，使链霉亲和素和生物素充分的结合；
(8)将上面的体系外加到磁铁上，静置1分钟，使磁珠被磁铁吸附，去掉溶液部分，再加入含有0.1％吐温的Washing buffer洗涤，重复三次；
(9)最后用0.1％吐温的Washing buffer重悬，并在共聚焦下观察到磁珠捕获到有核红细胞，见图4。
实施例5：适体TY8结合靶标的类型鉴定试验
实验步骤如下：
(1)ssDNA的准备：取核酸适体TY8和随机文库链，95℃变性5min，后在冰上复性10min，离心4℃5000rpm，3min，加入预冷的Binding buffer使DNA浓度为250nM,置于冰上待用。
(2)细胞的准备：培养四个皿的PL45细胞，至对数生长期，弃掉培养基，用2mL DPBS洗两次，向其中两个皿分别加入200μl 0.25％胰蛋白酶和200μl 0.1mg/ml蛋白酶K室温消化10min，另外两个皿分别加入0.2％的EDTA同等条件消化，随后加入500μl完全培养基终止消化，离心800rpm 4min，吸弃上清。用Washing buffer洗两遍，细胞计数板计数，使每组细胞数目为3×105个。
(3)ssDNA与细胞的孵育：将上述随机文库链取200μl到EDTA消化的细胞中，将TY8分别取200μl到另外三种方式消化的细胞中，重悬细胞轻轻吹打混匀，4℃摇床避光孵育1h，孵育完后，加入Washing buffer离心洗涤两次，加入500μl Washing buffer，将准备好的待测样品过膜，使其分散成单个细胞，流式细胞仪检测细胞的荧光强度。结果如图5所示，TY8可以靶向识别经EDTA处理的PL45细胞，而不能识别蛋白酶K和胰蛋白酶处理的PL45细胞，说明TY8结合的靶标类型为蛋白。
实施例6：核酸适体靶标质谱鉴定实验
(一)提取细胞膜蛋白
(1)培养PL45(胰腺癌细胞系)至对数生长期，吸弃旧培养基，DPBS清洗两次，加入EDTA室温消化，收集细胞，用Washing buffer离心洗涤两次；
(2)加入适量的低渗缓冲液，震荡混匀后在4℃摇床30min；后离心,4000rpm,10min,弃上清；再用低渗缓冲液洗涤3次；
(3)向离心管中加入适量膜蛋白裂解液,震荡混匀后在4℃,裂解30min,后离心保留上清,4000rpm,4℃,10min。保留的上清液即蛋白质样品,放在-80℃保存。
(二)PAGE胶蛋白样品的制备
(1)链霉亲和素包被的琼脂糖凝胶珠的封闭：取三个1.5ml EP管,均加入100μl的琼脂糖凝胶珠，离心2500rpm 3min，分别标记为空白样、文库样、TY8样。向每个EP管中加入1mL的5％的BSA,震荡混匀，在4℃摇床封闭1h。
(2)膜蛋白的封闭:向收集的蛋白样品中加入3ml的DNA封闭液,震荡匀后在4℃,孵育1h,封闭完之后,取出适量留作全蛋白样品组。
(3)琼脂糖凝胶珠和膜蛋白封闭完之后,用Washing buffer洗涤5次,2500rpm 4℃,3min,置于冰上待用。
(4)琼脂糖凝胶珠、文库、核酸适体与膜蛋白孵育:将封闭之后的膜蛋白均匀分成3组并各自加入3个已封闭好的琼脂糖凝胶珠的EP管中,并按相应标记分别加入修饰了生物素的随机文库和TY8。震荡混匀放入4℃摇床孵育1h。
(5)孵育完之后,Washing buffer洗涤离心5次,2500rpm,4℃,3min,离心之后弃上清。
(6)蛋白质变性：加入与琼脂糖凝胶珠等体积的2×loading buffer，100℃变性10min,置于冰上10min,-80℃保存。
(三)SDS-PAGE
(1)PAGE胶的制备:8％分离胶和5％浓缩胶10％SDS-PAGE蛋白分离胶(5mL):在小烧杯中,按顺序加入2mL ddH2O,1.6mL30％丙烯酰胶,1.25mL 1.5M Tris-HCl(pH8.8),0.05mL10％SDS,0.05mL10％APS，0.002mLTEMED,充分混匀加入胶板中。室温放置，待胶凝固后加入5％SDS-PAGE蛋白浓缩胶。按顺序吸取3.4mL ddH2O,0.85mL 30％丙烯酰胺，0.625mL1.0M Tris-HCl(pH6.8),0.05mL10％SDS,0.05mL10％APS,0.005mLTEMED。
(2)电泳:将配置好的SDS-PAGE胶正确装入电泳槽中,入1×电泳液(一块胶用量750mL),将已经准备好的样品按marker、空白珠子样、文库组珠子样、核酸适体珠子样顺序将样品加入孔内60V电压进行电泳,待溴酚蓝条带迁移至下层分离胶之后,升高电压至120V继续电泳,直至溴酚蓝条带迁移至胶底品,完成电泳。
(3)蛋白固定：取出SDS-PAGE胶,去除浓缩胶,将分离胶放入固定液中2h,后用超纯水漂洗3次,每次15min。
(4)将PAGE胶转移到考马斯亮蓝染色液中过夜，用超纯水洗涤考马斯亮蓝染液染好的胶洗涤4次,每次15min。至胶上蛋白条带清晰可见。
(5)扫描仪扫描SDS-PAGE胶，结果如图6所示。
(四)切胶做质谱分析
为了鉴定SDS-PAGE胶中显示出的差异蛋白，将其酶切提取，进行质谱鉴定。结果如表1所示，在差异条带中共检测到的蛋白质中CD71得分最高排在第一位为2088.63，远远高于排在第二位的蛋白角蛋白Keratin(常见的来源于头发和皮肤的蛋白，其出现可能是由于操作处理过程不当造成)，且条带覆盖率达到了70.13％。考虑到CD71为一种跨膜蛋白，我们推测CD71蛋白很可能是TY8结合的靶标。
表1：TY8结合蛋白的质谱分析结果
实施例7：TY8与CD71抗体的共定位实验
(1)FITC-TY8和PE-antiCD71的准备：取修饰了FITC的TY8 95℃变性5分钟，冰上冷却10分钟，加入Binding buffer配制成250nM的DNA溶液。取出10μl修饰了PE的CD71抗体，加入190μl Binding buffer置于冰上待用。
(2)细胞的准备：将PL45细胞接种到光学培养皿中培养。弃掉培养基，加入DPBS清洗细胞两次，待用。
(3)TY8和CD71抗体与细胞的孵育：取200μl修饰了FITC的TY8和200μl修饰了PE的CD71抗体加入到同一个PL45细胞的光学培养皿中，轻轻混匀，4℃避光摇床孵育1h。
(4)孵育完后，Washing buffer清洗两次，后在光学培养皿中加入1mL Washingbuffer，在激光共聚焦显微镜下拍照，如图7所示TY8与CD71抗体存在共定位。
实施例8：aptamer-pull down实验
(一)提取细胞膜蛋白
(1)培养PL45至对数生长期，吸弃旧培养基，DPBS清洗两次，加入EDTA室温消化，收集细胞，用Washing buffer离心洗涤两次；
(2)加入适量的低渗缓冲液，震荡混匀后在4℃摇床30min；后离心,4000rpm,10min,弃上清；再用低渗缓冲液洗涤3次；
(3)向离心管中加入适量膜蛋白裂解液,震荡混匀后在4℃,裂解30min,后离心保留上清,4000rpm,4℃,10min。保留的上清液即蛋白质样品,放在-80℃保存。
(二)PAGE胶蛋白样品的制备
(1)链霉亲和素包被的琼脂糖凝胶珠的封闭：取三个1.5ml EP管,均加入100μl的琼脂糖凝胶珠，离心2500rpm 3min，分别标记为空白样、文库样、TY8样。向每个EP管中加入1mL的5％的BSA,震荡混匀，在4℃摇床封闭1h。
(2)膜蛋白的封闭:向收集的蛋白样品中加入3ml的DNA封闭液,震荡匀后在4℃,孵育1h,封闭完之后,取出适量留作全蛋白样品组。
(3)琼脂糖凝胶珠和膜蛋白封闭完之后,用Washing buffer洗涤5次,2500rpm 4℃,3min,置于冰上待用。
(4)琼脂糖凝胶珠、文库、核酸适体与膜蛋白孵育:将封闭之后的膜蛋白均匀分成3组并各自加入3个已封闭好的琼脂糖凝胶珠的EP管中,并按相应标记分别加入修饰了生物素的随机文库和TY8。震荡混匀放入4℃摇床孵育1h。
(5)孵育完之后,Washing buffer洗涤离心5次,2500rpm,4℃,3min,离心之后弃上清。
(6)蛋白质变性：加入与琼脂糖凝胶珠等体积的2×loading buffer，100℃变性10min,置于冰上10min,-80℃保存。
(三)SDS-PAGE
(1)PAGE胶的制备:8％分离胶和5％浓缩胶10％SDS-PAGE蛋白分离胶(5mL):在小烧杯中,按顺序加入2ml ddH2O,1.6ml 30％丙烯酰胶,1.25mL 1.5M Tris-HCL(pH8.8),0.05ml 10％SDS,0.05ml 10％APS，0.002ml TEMED,充分混匀加入胶板中。室温放置，待胶凝固后加入5％SDS-PAGE蛋白浓缩胶。按顺序吸取3.4ml ddH2O,0.85mL 30％丙烯酰胺，0.625ml 1.0M Tris-HCl(pH6.8),0.05ml 10％SDS,0.05ml 10％APS,0.005ml TEMED。
(2)电泳:将配置好的SDS-PAGE胶正确装入电泳槽中,入1×电泳液(一块胶用量750mL),将已经准备好的样品按marker、空白珠子样、文库组珠子样、核酸适体珠子样顺序将样品加入孔内60V电压进行电泳,待溴酚蓝条带迁移至下层分离胶之后,升高电压至120V继续电泳,直至溴酚蓝条带迁移至胶底品,完成电泳。
(3)蛋白固定：取出SDS-PAGE胶,去除浓缩胶,将分离胶放入固定液中2h,后用超纯水漂洗3次,每次15min。
(4)将PAGE胶转移到考马斯亮蓝染色液中过夜，用超纯水洗涤考马斯亮蓝染液染好的胶洗涤4次,每次15min。至胶上蛋白条带清晰可见。
(四)转膜发光
(1)提前配置好转膜缓冲液，放置4℃待用。
(2)SDS-PAGE电泳结束后，将胶取出，去除上层浓缩胶，按照正极夹板、海绵、滤纸、NC膜、胶、滤纸、海绵、夹板的顺序组装，放入转膜槽，转膜300mA,90min。转膜时需要将转膜槽置于冰中。
(3)取出NC膜，用丽春红染液染色，将CD71蛋白和GAPDH蛋白(对照蛋白)所在位置剪下，用5％的牛奶室温封闭1h.
(4)将蛋白条带与各自一抗抗体孵育，4℃过夜。
(5)将蛋白条带用TBST清洗3次，每次10min。
(6)将蛋白条带与相应二抗抗体孵育室温1h,后用TBST清洗3次，每次10min.
(7)配制发光液，将蛋白条带上面均匀加入发光液，置入凝胶成像仪中进行成像。
结果见图8，证明核酸适体TY8结合的是CD71。
实施例:9：ELISA实验
(1)取elisa板，共八孔。在新的1.5ml EP管中加入coating buffer，后加入CD71纯蛋白，终浓度为0.3μM。后均匀加入到elisa孔中，4℃摇床孵育过夜。
(2)次日吸出coating buffer，用Washing buffer清洗三次。
(3)每孔加入250μl assay diluent，室温摇床孵育1h。
(4)吸弃溶液，用Washing buffer洗涤三次。
(5)根据实验用量，提前将核酸适体TY8 95℃变性5min，冰上复性10min。用Binding buffer配制不同浓度的biotin-TY8:
5＇-biotin-TTTTTTACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC-3＇，SEQ NO.2,使每孔浓度分别为0，0.025，0.05，0.1，0.15，0.25，0.5，0.75μM，配制不同浓度的核酸适体时采用逐步稀释法配制，4℃摇床孵育1h。
(6)吸弃溶液，Washing buffer洗四次。
(7)每孔加入100μl SAv-HRP,室温孵育1h。
(8)吸弃溶液，Washing buffer洗涤五次。
(9)每孔加入100μl substrate solution,室温摇床避光孵育30min。
(10)每孔加入50μl stop solution。
(11)酶标仪检测A450nm和A570nm的吸收值，求得差值，检测过程中注意避光操作。
(12)根据所测吸收值，利用Graphpad软件制作Kd曲线。
考察了TY8对转铁蛋白受体1(CD71蛋白)的亲和力，利用了GraphPad软件计算了核酸适体与靶标的解离常数(见图9)。将CD71纯蛋白与不同浓度的标有biotin-TY8的核酸适体直接孵育，后加入SAv-HRP，利用酶标仪检测后计算得出TY8结合CD71纯蛋白的解离常数Kd＝50.48nM。Kd值在nM级别，这一结果证明了TY8对CD71蛋白具有很强的亲和力。
序列表
<110> 湖南大学
<120> 一种用于识别或富集有核红细胞的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
actcataggg ttaggggctg ctggccagat actcagatgg tagggttact atgagc 56
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
ttttttactc atagggttag gggctgctgg ccagatactc agatggtagg gttactatga 60
gc 62

Claims (10)

1.一种用于识别或富集有核红细胞的方法，其特征在于，利用核酸适体与外周血中的有核红细胞的特异性结合来识别或富集有核红细胞，所述的核酸适体序列如下：5＇-ACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC-3＇。
2.根据权利要求1所述的用于识别或富集有核红细胞的方法，其特征在于，通过对所述的核酸适体增加或者删减碱基，或者碱基替换获得具有相同功能的核酸适体。
3.根据权利要求1或2所述的用于识别或富集有核红细胞的方法，其特征在于，所述的核酸适体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或酶标记物质，得到与所述核酸适体具有相同结合有核红细胞能力的核酸适体衍生物。
4.根据权利要求1或2或3所述的用于识别或富集有核红细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、外周血的预处理：密度梯度离心获得单个核细胞层；
(2)、核酸适体预处理：连接上生物素；
(3)、富集过程：将核酸适体与外周血孵育，洗涤去除多余的核酸适体，然后加入修饰了链霉亲和素的磁珠孵育，最后在磁铁的作用下捕获出有核红细胞。
5.一种核酸适体在制备识别或富集有核红细胞的试剂中的应用，其特征在于，所述的核酸适体序列如下：
5＇-ACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC-3＇。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过对所述的核酸适体增加或者删减碱基，或者碱基替换获得具有相同功能的核酸适体。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述的核酸适体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或酶标记物质，得到与所述核酸适体具有相同结合有核红细胞能力的核酸适体衍生物。
8.一种核酸适体在制备与有核红细胞表面的蛋白CD71结合的试剂中的应用，其特征在于，所述的核酸适体序列如下：
5＇-ACTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC-3＇。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，通过对所述的核酸适体增加或者删减碱基，或者碱基替换获得具有相同功能的核酸适体。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述的核酸适体连接上荧光物质、放射性物质、治疗性物质、生物素、或酶标记物质，得到与所述核酸适体具有相同结合CD71蛋白能力的核酸适体衍生物。
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