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CN109414227A - 用于非侵入性监测物质的多路复用经皮提取和检测装置及其使用方法 - Google Patents

用于非侵入性监测物质的多路复用经皮提取和检测装置及其使用方法 Download PDF

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CN109414227A
CN109414227A CN201780039263.5A CN201780039263A CN109414227A CN 109414227 A CN109414227 A CN 109414227A CN 201780039263 A CN201780039263 A CN 201780039263A CN 109414227 A CN109414227 A CN 109414227A
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substance
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gel
electrode
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阿德利娜·伊利耶
卢卡·利帕尼
弗洛里安特·东梅内
伯特兰·吉尔伯特·罗格·雅克·杜邦
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Bath (gb) Claverton Down Bath Ba2 7ay England, University of
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Abstract

公开了用于非侵入性监测物质(例如葡萄糖)的多路复用经皮提取和检测装置及系统，以及使用这些装置在对象中进行物质监测的方法。

Description

用于非侵入性监测物质的多路复用经皮提取和检测装置及其 使用方法
技术领域
本发明涉及用于非侵入性监测物质(例如葡萄糖)的多路复用(multiplexed)经皮提取和检测装置和系统，以及使用这些装置在对象中进行物质监测的方法。
背景技术
GlucoWatch仍然是美国食品和药物管理局(Food&DrugAdministration，FDA)批准用于糖尿病对象中的唯一的非侵入性葡萄糖监测装置。该技术使用离子导入疗法(iontophoresis)(即，在皮肤表面上定位的两个电极之间施加小的直流电)来诱导电渗透提取非常小体积的组织间液(interstitial fluid)(其中葡萄糖以与血液中基本相同的浓度存在)(参见美国专利号：5279543、5362307、5730714、5911223、6542765、6714815、7693573和7555337)。将这种不超过几微升的极小体积的流体收集到水性接收凝胶中并进行稀释(Leboulanger等，Reverse iontophoresis for non-invasivetransdermal monitoring.Physiological Measurement，25(3)：p.R35，2004；Tierney，等，Electroanalysis of Glucose in Transcutaneously ExtractedSamples.Electroanalysis，12(9)：666-671，2000)，并且然后通过葡萄糖氧化酶介导的反应经电化学检测葡萄糖。进行提取的区域为约3cm2，并且在收集凝胶中进行测量的葡萄糖的水平为微摩尔量级(美国公开号：2002/019604)。因此，GlucoWatch操作非常接近其检测限，特别是当糖尿病对象是低血糖时(Accuracy of the Gluco Watch G2 Biographer andthe Continuous Glucose Monitoring System During Hypoglycemia：Experience ofthe Diabetes Research in Children Network.Diabetes Care，27(3)：722-726，2004)。此外，由于稀释因子在对象之间，甚至在单个个体的不同皮肤部位内变化，因此必须在每个采样期之前通过常规的“手指穿刺(finger-stick)”测量来校准装置。由于这些原因和其他原因，GlucoWatch并未获得商业上的成功并且已不再使用。因此，提供避免一些这些缺点的有效的非侵入性葡萄糖监测装置仍然是本领域中尚未解决的问题。
发明内容
概括地说，本发明涉及用于经反向离子导入疗法(reverse iontophoresis)经皮提取和检测物质(例如葡萄糖)的装置、系统和方法，其能够非侵入性监测其在对象中的水平。本发明的装置、系统和方法优选地允许半连续或连续地监测其在对象中的水平。所述装置、系统和方法经皮肤中的优先途径通过经皮提取物质来操作，通常通过皮肤附属物例如皮肤毛孔、毛囊和汗腺。本发明与经皮提取和检测监测物质的现有技术方法的不同在于其能够经多路复用传感器像素(pixel)阵列单独访问优先途径并采样，每个传感器像素执行物质(例如，葡萄糖)提取和检测的双重作用。这可以与现有技术的采样方法相比较，现有技术的采样方法采用相对大的皮肤区域并具有组合经不同提取机制以及越过多个皮肤结构的经皮提取的物质样品之不可避免的结果。本发明利用阵列中的单个传感器像素询问(interrogate)单个优先途径的能力具有以下优点：其能够实现临床相关的经皮监测，通常不需要手指穿刺(或等同的方法)校准。本发明通过使用小型离子导入采样装置实现了这些目的，所述小型化离子导入采样装置设计有的传感器像素阵列的尺寸使得一个或更多个传感器像素对经优先途径提取的分析物进行采样。
尽管本发明的装置、系统和方法对于葡萄糖的非侵入性监测特别有用，但是本发明还可以用于检测其他可经皮提取的物质(分析物)，例如诊断标志物、药物、滥用物质和毒素。可经皮提取的分析物的具体实例包括葡萄糖；氧化应激标志物，例如谷胱甘肽、活性氧和氮物质或过氧亚硝酸盐；金属离子例如Na+和K+；儿科患者中肾疾病的标志物，例如尿素或碘海醇；皮肤健康的标志物，包括与皮肤屏障功能和皮肤水合作用密切相关的所谓的“天然保湿因子”(NMF)的成分；药物包括例如用于连续监测的治疗药物，锂，化学治疗剂例如氟尿嘧啶和甲氨蝶呤，用于哮喘治疗的茶碱，抗抑郁药例如盐酸阿米替林；激素例如胰岛素、前列腺素或类固醇，以及其他分析物，例如乳酸、酒精、蔗糖，半乳糖、尿酸、α淀粉酶、胆碱和L-赖氨酸、乙酰胆碱、毛果芸香碱(例如，用于囊性纤维化诊断)。优选的物质清单包括葡萄糖、锂、乳酸、铵、尿素、尿酸、钾、乙醇、丙戊酸盐、谷胱甘肽、苯丙氨酸、氨基酸、皮肤天然保湿因子(NMF)的成分、碘海醇、治疗性监测代表抗抑郁和抗癌药物的多种化合物、前列腺素、类固醇和其他药物类别，以及对于本领域技术人员来说明显的药物。在美国专利号5,279,543中提供了可以使用本发明的非侵入性采样技术监测的物质的广泛列表，该专利通过引用整体明确地并入，特别参见表4。
在一个特别的应用中，本发明的所述装置、系统和方法可用于监测氧化应激的标志物，例如用于非侵入性监测和间接检测由环境应激物例如紫外线辐射(UV)和污染引起的高度破坏性的活性氧和氮物质。可以提取分子例如谷胱甘肽或过氧亚硝酸盐的稳定衍生物并进行电化学检测。谷胱甘肽在生理条件下以两种形式存在：作为还原形式的GSH和作为氧化形式的GSSG。当活性氧物质以可能导致细胞损伤的浓度产生时，GSH被氧化成GSSG。因此，组织中GSH/GSSG的比与氧化应激高度相关。过氧亚硝酸盐是通过超氧化物与一氧化氮的反应在体内产生的，并且在氧化应激期间有助于细胞损伤。非侵入性地检测和监测这些分子的能力将是检测和开发针对氧化和/或亚硝化应激的保护策略的重大进步。
因此，在第一方面，本发明提供了用于在对象中非侵入性监测一种或更多种物质的多路复用经皮提取和检测装置，所述装置包含传感器像素阵列，每个传感器像素包含：
(a)包含电极组的基底，其用于向对象的皮肤施加电流以通过电迁移和/或通过电渗透从组织间液中经皮提取一种或更多种物质；
(b)与传感器像素关联的储存器(reservoir)，所述储存器包含用于接收来自传感器像素的经皮提取物质的一定体积的凝胶；
(c)检测电极组，其用于电化学检测存在于与传感器像素关联的储存器中的一种或更多种经皮提取物质的浓度；
其中，传感器像素阵列配置成使得至少一个传感器像素能够经对象皮肤上的优先途径提取一种或更多种物质。
在另一方面，本发明提供了本发明的多路复用经皮提取和检测装置用于在对象中非侵入性监测一种或更多种物质的用途。
在另一方面，本发明提供了用于在对象中非侵入性监测一种或更多种物质的多路复用经皮提取和检测系统，所述系统包含：
(i)包含传感器像素阵列的装置，每个传感器像素包含：
(a)包含电极组的基底，其用于向对象的皮肤施加电流以通过电迁移和/或通过电渗透从组织间液中经皮提取一种或更多种物质；
(b)与传感器像素关联的储存器，所述储存器包含用于接收来自传感器像素的经皮提取物质的一定体积的凝胶；和
(c)检测电极组，其用于电化学检测存在于与传感器像素关联的储存器中的一种或更多种经皮提取物质的浓度；
其中，传感器像素阵列配置成使得至少一个传感器像素能够经对象皮肤上的优先途径提取一种或更多种物质；以及
(ii)数据采集、控制和处理系统，其包含：
(a)采集和控制系统，其控制对阵列的每个单独像素的访问，以及它们中的每一个的提取/检测功能；
(b)数据处理系统，其能够将经优先途径通过该装置获得的经皮提取物质的样品与经其他途径提取的物质的样品区分开，以使得经优先途径经皮提取物质的样品用于评估对象中一种或更多种物质的浓度。
在另一方面，本发明提供了用于在对象中非侵入性监测一种或更多种物质的方法，其中所述方法采用多路复用经皮提取和检测系统，其包含：
(i)传感器像素阵列形式的装置，每个传感器像素包含：
(a)包含电极组的基底，其用于向对象的皮肤施加电流以通过电迁移和/或通过电渗透从组织间液中经皮提取一种或更多种物质；
(b)与传感器像素关联的储存器，所述储存器包含用于接收来自传感器像素的经皮提取物质的一定体积的凝胶；
(c)检测电极组，其用于电化学检测存在于与传感器像素关联的储存器中的一种或更多种经皮提取物质的浓度；
其中传感器像素阵列配置成使得至少一个传感器像素能够经对象的皮肤上的优先途径提取一种或更多种物质；
以及
(ii)数据采集/处理系统，其能够控制阵列装置的每个像素内的提取/检测，并且将经优先途径获得的经皮提取物质的样品与经其他途径提取的物质的样品区分开，以使得经优先途径经皮提取物质的样品用于评估对象中一种或更多种物质的浓度；
所述方法包括：
(i)使传感器像素阵列与对象的皮肤接触；
(ii)使用提取电极向对象的皮肤施加电流以在阵列中的传感器像素处通过电迁移和/或通过电渗透从组织间液经皮提取一种或更多种物质；
(iii)将流体样品吸收到阵列中传感器像素的凝胶储存器中；
(iv)电化学检测吸收到凝胶储存器中的一种或更多种物质；
(v)分析存在于单个凝胶储存器中的一种或更多种物质的浓度以确定哪个传感器像素经对象皮肤中的优先途径提取样品；
(vi)使用来自经优先途径提取的样品的物质浓度来确定对象体内一种或更多种物质的浓度。
在本发明的所有方面和实施方案中，可以监测的优选物质是葡萄糖，特别是在糖尿病管理中的非侵入性且优选半连续或连续的葡萄糖监测。
优选地，每个传感器像素处的提取和检测电极放置在柔性且任选透明的基底上。方便地，柔性基底可以由聚合物形成，例如聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)。在一个优选实施方案中，提取电极组包含两个电极，例如Ag和AgCl电极对。通常，检测电极组包含两个或三个电极，例如包括AgCl和石墨烯电极以及任选的Pt电极的电极组。使用石墨烯作为电极材料具有以下优点：其可以通过例如使用标准光刻的等离子体蚀刻或直接通过阴影掩蔽(shadow-masking)的技术将其容易地模式化成合适尺寸(例如，约2×2mm2)的由受控的气相沉积制成的传感器像素。
或者，可以使用印刷技术印刷基于石墨烯的纳米薄片油墨。有利地，石墨烯还可以用于形成与传感器像素的电互连。在所有实施方案中，铂纳米颗粒(Pt NP)固定在石墨烯上，或者，并入印刷的石墨烯内，从而形成检测电极组的一部分以产生催化效果，该催化效果能够提高针对分析物(例如，葡萄糖)检测之背景噪声的可测量电流水平并降低执行电化学反应所需的过电位。铂纳米颗粒可通过例如电化学沉积的技术固定在传感器像素上或通过溅射形成。这些铂纳米颗粒固定在石墨烯电极上以放大例如来自提取的样品中葡萄糖与葡萄糖氧化酶的酶促反应产生的过氧化氢的信号。
使用这样的方法，然后在每个传感器像素处提供用于物质提取和电化学检测二者的电极组，其方式意味着传感器像素可单独寻址(addressable)，以使得该装置能够将通过在一个或更多个传感器像素处测量的优先途径获得的经皮提取物质的样品与通过在其他传感器像素处测量的通过其他途径提取的那些区分开。
除了支撑提取和检测电极的基底之外，该装置还可以包含模式化的支撑膜，通常为由弹性体例如聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)形成的柔性膜的形式。在该装置中，支撑膜覆盖在基底的上部。方便地，支撑膜具有形成为与传感器像素的模式匹配的孔模式，并为填充孔模式的凝胶储存器阵列提供限定和机械支撑。该含凝胶储存器的膜在装置与使用者皮肤之间提供了界面。凝胶储存器填充膜的孔，以使得它们与基底接触。为了最佳功能，优选地，凝胶还与膜的外表面齐平(flush)，以使得其能够与皮肤接触以接收由提取电极提取的一种或更多种物质。优选地，支撑弹性体膜的厚度小于0.5mm，更优选小于0.4mm，更优选小于0.3mm，更优选小于0.2mm，且最优选0.1mm量级。形成传感器像素的凝胶的一系列优选厚度为0.05mm至0.2mm。在一个优选的实施方案中，然后将具有包封的水凝胶的弹性体膜定位在传感器像素阵列的上部，以使得凝胶像素与传感器像素对齐。例如，传感器像素中的凝胶体积通常小于约30μL，更优选小于约20μL，还更优选小于10μL。在一个优选的配置中，传感器像素中的凝胶体积通常为0.1至30μL，更优选为0.1μL至10μL，并且还更优选为例如0.2μL至2μL。方便地，凝胶是水凝胶，例如琼脂糖。
在一个优选的布置中，储存器包含用于检测使用该装置提取的物质的含酶凝胶。为了检测葡萄糖，将酶葡萄糖氧化酶包埋在水凝胶储存器中以通过与样品中的葡萄糖反应产生用于通过检测电极检测的过氧化氢从而为传感器像素提供对葡萄糖的响应特异性。以这种方式，传感器将不会响应离子导入提取的流体中可能存在的干扰物质。通常，酶在液化状态下与水凝胶混合。当制造支撑膜时，使用微量分配器将酶和液化水凝胶注入(根据酶和水凝胶二者的热特性，使用二者的混合物依次，或一步完成)支撑膜的每个孔中并使其固化。允许水凝胶设定为半固态，其通常对应于设定体积为初始体积的约2/3。水凝胶的这种状态促进葡萄糖扩散通过凝胶以及电化学传感期间的有效电子转移二者。在一个实施方案中，支撑膜和凝胶储存器设计成与电极基底配合的可替换部分，从而使电极能够重复使用。
本发明的装置还可以使用丝网印刷技术以产生确定的传感器像素阵列和用于将它们与外部世界互连的部件来制造。在这些实施方案中，例如分别使用基于石墨烯薄片的油墨、基于Ag的油墨和基于Ag/AgCl的油墨，将电极组与其互连件印刷到柔性基底上。
在所有方法中，小型化使得能够选择传感器像素中电极之间的间隔，以使得工作电极和对电极足够接近参比电极和离子导入电极，以使溶液中的欧姆电位下降最小化，以及允许提取的物质(例如葡萄糖)迅速有效地到达检测电极。
通常，本发明的装置包含传感器像素阵列，其具有足够的像素以确保物质的至少一个样品是经优先途径提取的，并且更优选地使得多个样品是这样提取的。这可使用包含至少16个传感器像素的传感器像素阵列，并且更优选地包含至少64个传感器像素的传感器像素阵列来实现。在一些情况下，有利地，传感器像素阵列包含10至100个传感器像素，例如传感器像素阵列包含16或64个传感器像素。优选地，传感器像素的面积为1.0mm2至100.0mm2，例如面积为2.0mm2至50.0mm2或面积为3.0mm2至10.0mm2。
可以使用芯片上系统(system on Chip，SoC)通过定制的软件来执行装置阵列的数据的采集、控制和处理。本发明的装置、系统和方法可以将监测一种或更多种物质的结果无线地输出到本领域已知的任何方便的输出装置，例如个人“智能”装置(例如智能电话、腕带或智能手表)、平板电脑或其他电脑。这将导致显示结果，或允许更复杂的场景，例如设置低血糖警报警告。
现在将参考附图通过示例而非限制的方式描述本发明的实施方案。然而，鉴于本公开内容，本发明的多个其他方面和实施方案对于本领域技术人员而言是明显的。
本文中使用的术语“和/或”被视为具有或不具有另一个的两个指定特征或组件中的每一个的具体公开内容。例如，“A和/或B”将被视为(i)A，(ii)B和(iii)A和B中的每一个的具体公开内容，就像每个在本文中单独列出一样。
除非上下文另有指示，否则上述特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方案。
附图简述
图1.“Glucose Pathfinder”原理。优选的葡萄糖途径(毛囊)是由单个微型像素检测器靶向的。利用足够密集的像素阵列，通过像素化传感器将随机采样许多这样的途径。经毛囊提取的葡萄糖的浓度与组织间液中的浓度成固定关系。
图2.关于通过不同毛发密度的皮肤进行葡萄糖采样(低密度，左侧；高密度，右侧)，“GlucoWatch”和“Glucose Pathfinder”之间的比较：(a)“GlucoWatch”的大面积采样导致可变的稀释因子；(b)“Pathfinder”阵列中的单个像素装置具有足够小的面积以使得仅能够对一个毛囊途径进行采样，这保证了提取的葡萄糖的固定稀释因子而与毛发密度无关。
图3.单个提取和检测微型像素的示意图：电极1(Ag)&2(Ag/AgCl)执行葡萄糖提取；电极2(Ag/AgCl，参比电极)，3(用Pt纳米颗粒装饰的石墨烯，石墨烯/Pt NP，工作电极)以及4(Pt，对电极)电化学地检测葡萄糖。石墨烯上的催化Pt纳米颗粒增强了检测信号。电极2、3和4的尺寸使得它们在葡萄糖被提取到其中的小型化酶包封凝胶储存器中适当地配合。在支撑弹性体膜的孔内形成凝胶储存器。优选的尺寸如下给出。
图4.(a)装置具有至少一个工作像素，其中每个像素具有单个途径的概率P作为像素半径的函数并用于阵列中的像素的多种数目，(b)装置具有至少一个工作像素，其中每个像素具有单个途径的概率P作为阵列中像素的数目的函数并用于多种像素半径。
图5.实施的2×2像素阵列的多种示意布局，具有完全集成的平面(基底上)电极，具有指定的典型尺寸。优选所指定的电极的形状，但是其他形状，例如正方形或圆形也可能是合适的。在该实例中，像素单元的有效面积(包括所有电极(但不包括互连轨道))是3×3mm2，(a)配置1：对于葡萄糖检测，石墨烯/Pt NP电极(黑色)是工作电极，而小的Ag/AgCl电极(黄色)用作对电极和参比电极二者。用于葡萄糖提取的电路与用于检测的电路完全解耦，并在最大的Ag/AgCl电极(黄色)与Ag(绿色)电极之间形成，(b)配置2：石墨烯/Pt NP(黑色)现在用于工作电极和对电极(替代Pt电极)二者；而Ag/AgCl电极(黄色)具有双重功能，在葡萄糖检测期间用作参比电极，以及作为与Ag电极(绿色)组合形成葡萄糖提取电路的提取电极之一。通过在每次提取之后的“恢复(recovery)”期间反转提取电流的极性来获得各个电极内的Ag和AgCl内容物的再循环。(c)配置3：每个像素包含工作石墨烯/Pt NP电极以及两个Ag/AgCl电极，一个小电极和一个大电极，其分别可以起到参比电极和对电极的作用，同时传感提取的葡萄糖。此外，反向离子导入疗法采用位于两个相邻像素装置上的最大的Ag/AgCl电极作为形成提取电路的阳极和阴极。在这种情况下，在操作周期的一半期间，在一个像素中提取葡萄糖，而在该操作周期的后一半期间，提取电流的极性被反转，并且在另一个像素中提取葡萄糖。以这种方式，提取和恢复每个提取电极的AgCl内容物依次涉及两个相邻像素，而不仅仅是如上文配置1和2中的单个像素。
图6.(a)使用Ag/AgCl和Pt线作为外部电极获得的典型的基于石墨烯的电化学葡萄糖传感器的完全响应曲线。示出了所选几何结构的单个凝胶像素内的低血糖和高血糖限；这个目的区域充裕地避免传感器的工作下限，(b)使用完全集成的基底上电化学电极获得的类似响应曲线。插图：传感器在10至100微摩尔范围内的线性响应，包括低血糖浓度至高血糖浓度限值。在0.4V下对微Ag/AgCl电极获得测量值。
图7.在添加(a)抗坏血酸(用紫色箭头表示)和(b)对乙酰氨基酚(用品红箭头表示)后，响应于包埋在凝胶中的葡萄糖的计时电流法(Chronoamperometry)。在0.4V下对微Ag/AgCl电极获得测量值。
图8.经计时电流法检测离体RI-提取的葡萄糖。(a)使用Ag/AgCl和Pt线作为外部电极的实验。相同的微型石墨烯传感器用作工作电极并用于比较具有显著不同的毛发密度的皮肤样品：在RI之前(黑色和浅蓝色曲线)以及在RI参与“单根毛发靶向的”提取之后(红色曲线)记录计时电流法电流基线，使用具有32根毛发/cm2的皮肤样品(标记为H)，并且另外使用仅具有6根毛发/cm2的皮肤样品(标记为L)通过非毛囊皮肤(深蓝色曲线)。(b)使用PET基底上的平面电极证明了葡萄糖提取。
图9.提取的葡萄糖浓度与毛发密度比之间的相关性，结合通过计时电流法或定量NMR检测获得的结果。每个数据点代表不同的提取实验。来自这两种技术的结果都在于相同的“葡萄糖浓度相对于毛发密度”曲线，表明葡萄糖的电化学与NMR测定之间的自我一致性，其中后者提供了前者的验证。
图10.通过计时电流法得出两个相邻装置像素A与B之间不存在串扰。两个像素构建在邻接的石墨烯膜上，但具有单独的凝胶储存器。对像素B进行10μM至1mM的葡萄糖添加。发现未暴露于葡萄糖的相邻像素A中的基线响应增加不超过对应于添加到像素B的葡萄糖总量的3％。
图11.像素阵列至少具有一个工作像素，其中每个像素只有一个途径(以27个毛囊/cm2计算；即人中整个典型毛囊密度范围的中值)的概率P作为像素有效面积的函数并用于阵列中像素的多种数目。此处，有效面积定义为通过其进行葡萄糖提取的像素装置区域，与凝胶储存器的足迹区(footprint area)一致。2至6mm2的像素有效面积使随机定位的非靶向测量中命中单个毛囊的概率最大化。
图12.(a-c)作为像素有效面积并用于不同大小的阵列的函数的概率P，其为具有n×n像素(其中n＝1至4)的阵列装置在以(a)18、(b)27和(c)36个毛囊/cm2应用于皮肤时具有至少一个工作像素的概率。工作像素定义为仅存在单个毛囊“命中”的像素(即，与非工作像素相反，其中没有或多于一个毛囊“命中”)。(d)对于所有三个选定的毛囊密度，P作为4×4阵列的像素有效面积的函数，表明对于前臂腹侧上所有典型的人毛囊密度存在值的重叠范围，即2至5mm2。这随后为工作阵列的设计提供了信息。
图13.对于18、27和36个毛囊/cm2，概率比pF1/pF2作为像素有效面积的函数；其中pF1是单个毛囊被有效面积a的像素命中的概率，而pF2是两个毛囊被有效面积a的像素命中的概率。当像素面积a为2至5mm2时，在所有典型的毛囊密度中，命中单个毛囊的像素的概率pF1占主导地位；a值越小，单个毛囊命中的概率就越大。
图14.柔性基底上功能性的完全集成的基于石墨烯的2×2像素阵列。(a)在柔性(PET)基底上实现基于石墨烯的2×2像素阵列。图1：阵列的完整布局。原型包含用于提取-检测的电极、传感区(各2mm2的Pt纳米颗粒装饰的石墨烯)和具有穿孔的弹性体膜(图2)，其中部署有包封葡萄糖的水凝胶形成各约6mm2的提取区(虚线轮廓，图3)。仅电极1至3参与提取-检测，而电极4在该实验配置中不起作用。(b-c)在～0.5mA/cm2RI电流下，在猪皮肤上离体提取10mM皮下葡萄糖持续5分钟。(b)图1：4像素传感器装置的灵敏度校准曲线，证明了非常相似的电流-浓度依赖性(稍微超线性幂律)。靶向浓度操作范围以紫色表示。图2：在图1中表征的四个像素中的每一个内葡萄糖提取后检测的电流相对于时间；指示了每个像素所靶向的毛囊数。含非葡萄糖的PBS的提取也显示为阴性对照(黑色基线)。图3：使用相同的像素装置在两次连续提取后测量的检测电流相对于时间：皮下葡萄糖浓度分别为10mM和100mM。提取的葡萄糖的浓度由装置的相应校准曲线确定，并且与基于毛囊提取通量和探测的毛囊数目的计算一致。(c)图1和2示出了由每个阵列像素(6mm2提取区域，虚线轮廓)探测的毛囊数目(在这种情况下为～28个毛囊/cm2)与提取后检测到的电流之间视觉相关性的一个实例。通过皮肤可以看到阵列电极。
图15.从两个显示非常接近一致性的基于石墨烯的阵列收集的灵敏度校准曲线。
图16.其中石墨烯已被Au膜替代的阵列的灵敏度校准曲线。阵列设计的所有其他方面都保持不变。所有曲线都可以用一个稍微超线性的单幂律来拟合。
发明详述
非侵入性物质/分析物监测
虽然以下讨论集中于葡萄糖监测的具体情况，但是本领域技术人员将清楚，可以通过电迁移和/或电渗透通过皮肤非侵入性地提取其他物质/分析物，其伴随有当在皮肤上施加电场时建立的反向离子导入疗法的过程。在葡萄糖(一种极性和水溶性物质，但在生理条件下不带净电荷)的情况下，其离子导入提取的机制仅通过电渗透。该过程主要通过与皮肤附属物例如皮肤毛孔、毛囊和汗腺相关的低阻力优先途径发生(例如，参见Weaver等，Advanced Drug Delivery Reviews，35：21-39，1999的图1)。这些附属物经皮下穿透到组织间液，组织间液洗浴细胞并且其含有目的物质，例如葡萄糖(图1)。该提取原理已用于先前的经皮技术“Biographer”。在那种情况下，在约3.5cm2的相对大的区域上将葡萄糖不加区别地提取到单个大体积的凝胶储存器中，然后在那里测量取样的葡萄糖。重要的是，该现有技术方法没有认识到或利用由单途径采样提供的优点，相反，大面积的提取导致可变稀释因子，因为毛发密度在皮肤区域之间和用户之间变化(图2a)。这样做的一个结果是需要通过“手指穿刺”血液采样定期(以及至少每天)校准Biographer。
相反，本发明的装置、系统和方法采用单途径采样概念，其避免了对手指穿刺校准的需求，因为提取物质的稀释因子由传感器像素阵列的小型化单个像素装置的几何特征确定(图2b)，以使得通过其提取物质的皮肤附属物(例如皮肤毛囊)的密度对经皮提取的流体中物质浓度的确定没有影响。在用于葡萄糖监测的本发明的一个优选实施中，基于装置尺寸/葡萄糖操作范围以及灵敏度/材料实施的特定技术成果的这种能力是我们技术的独特方面。因此，经皮葡萄糖监测变为真正的非侵入性，有望满足重要的未满足医疗需求。
此外，本发明的装置、系统和方法可以使用数据采集和处理系统(例如，经软件控制实施，例如，使用芯片上系统技术)，从而允许分析由多路复用阵列中每个传感器像素采集的数据，识别对优先葡萄糖途径进行采样的传感器像素，并保留和处理从这些传感器像素产生的数据，因为与阵列中不产生有用信号或者产生经其他途径或机制提取的样品引起的信号之其他传感器像素不同。以这种方式，可以丢弃不反映组织间液中葡萄糖水平的数据。用于本发明的方法的另一个优点是它能够识别在采集/读出周期的早期阶段产生有意义数据的传感器像素，这允许减少用于确定一种或更多种物质的水平的总处理时间。
该阵列包含优化数目(参见下文)的小型石墨烯传感器像素。每个像素(图3)执行葡萄糖提取和检测的关键功能，并且包含(a)葡萄糖经皮提取到其中的单个含酶凝胶储存器，(b)提取电路，其允许葡萄糖被提取到凝胶储存器中，和(c)基于铂纳米颗粒(NP)-装饰的石墨烯材料的基于酶的电化学葡萄糖检测器。在最终形式中，阵列被集成到柔性贴片中，可能是一次性元件(参见下文)，并最终具有无线读出。
1.几何学考虑因素
为了优化阵列的功能，需要根据以下标准仔细选择其像素的数目及其几何尺寸。
标准1：阵列中像素的数目及其每单位面积的数目由使用所选几何结构至少一个毛囊“命中”并且由单个像素探测不超过一个毛囊的概率P决定。作为这种评估的输入参数，装置贴片的总面积设定为2×2cm2(出于实践原因)，并且人毛发分布以约24个毛囊/cm2的峰值为中心(其包括在人前臂上18至32个毛囊/cm2的平均毛发分布)。图4(a)示出了2至3mm直径的含酶凝胶圆柱体的4×4像素阵列保证了至少一个毛囊“命中”。在该最佳范围之外，对于(i)小半径，当监测器的总有效面积太低时，以及在(ii)大半径下，当像素可以命中超过一个优先途径时，P变得小于1。图4(b)更清楚地显示了作为像素半径之函数的这种非单调行为(non-monotonic behaviour)。图(a)和(b)二者都表明，通过增加阵列中像素的数目，每个阵列超过一个像素将命中优先途径，从而确保有用的冗余。
在全面实施中，8×8阵列为探测特别葡萄糖途径(privileged glucose pathway)提供了有用的冗余。
因此，本发明的多路复用离子导入疗法的采样装置优选地包含跨越约2×2cm2的阵列，并且包含4至100个传感器像素，且更优选10至80个传感器像素。在一些实施方案中，传感器像素阵列包含4、9、16、25、36、49或64个传感器像素，例如在阵列2×2、3×3、4×4、5×5、6×6、7×7或8×8传感器像素中。虽然在一些实施方案中，传感器像素以正方形阵列布置，但是可以使用传感器像素的其他布置。
标准2：如果像素内包封酶的凝胶的直径/面积如上文所评估，则其体积由在像素储存器中实现的葡萄糖浓度范围很好地落在传感器的完全可获得范围内的要求来确定。将低血糖和高血糖血液浓度分别设为3.5和12mM，其在24μL的凝胶中稀释后获得11μM和36μM。在1小时提取期内对于0.2mA的提取电流获得这些值，并且与在10mM皮下葡萄糖浓度下，通过单个毛囊途径的葡萄糖提取通量的值3.5nmol.mA-1.hr-1一致，如下面第3部分(“概念验证”)中所确定的。图6示出了使用对典型的单个像素传感器响应的完整葡萄糖浓度范围映射(红色)的这些所选几何结构获得的稀释浓度范围：(a)使用外部(线型)Pt和Ag/AgCl电极的实验；(b)使用芯片上集成电极的实验。
凝胶储存器的体积和提取条件设定了组织间液葡萄糖浓度与在阵列的像素中达到的浓度之间的固定转换因子的值。通过减小储存器体积，浓度增加，允许提取时间和离子导入电流减小，同时仍然获得与图6中相似的工作浓度范围。例如，凝胶储存器的体积减小了～60倍，允许分别使用0.02mA和10分钟的提取电流和时间段来实现将低血糖至高血糖的血糖浓度范围映射到凝胶储存器中的10至40μM葡萄糖浓度(使用在10mM皮下葡萄糖浓度下，毛囊葡萄糖通量值为3.5nmol.mA-1.hr-1进行该评估)。
标准3：凝胶尺寸也对葡萄糖提取/读出循环的总持续时间有影响。必须使凝胶的厚度最小化以减少提取的葡萄糖从面向皮肤的一侧到面向石墨烯传感器的一侧扩散通过凝胶所需的时间。靶向厚度范围约为0.1mm(Tierney等，Electroanalysis of Glucose inTranscutaneously Extracted Samples.Electroanalysis，12(9)：666-671，2000)，因而其是凝胶储存器的最优选厚度值。
总之，例如，直径为2mm且厚度为0.1mm的一定体积的凝胶储存器将允许提取电流和时间段分别降低至例如0.02mA和10分钟，同时在凝胶储存器中实现10至40μM的相同的葡萄糖浓度范围，如图6中红色映射的。
在所有的设计中，对于阵列内的给定像素装置，提取和检测电极的有效面积配合于像素面积内。图5中给出了像素面积内的典型尺寸的一个实例：阵列的单位单元(像素面积)选择为5×5mm2，其中电极的有效面积占据4×4mm2面积，并且其中提取葡萄糖的凝胶储存器的足迹区(在图5中用虚线画出)占据直径为3mm的圆盘区域。在具有较大像素数目的阵列中，所有电极尺寸和间隔距将适当减小以配合于较小的单位单元内，这使凝胶储存器直径的最小值保持为约2mm直径(与来自图4的单个毛囊途径“命中概率”计算一致)。在最终形式中，根据所使用的小型化程度，整个贴片式监测器(包括用于互连的周围区域和芯片上系统)最有可能配合于3×3至4×4cm2的区域。
2.材料和装置实现策略的选择
在该实施方案中用于构建葡萄糖监测器的主要材料是：(i)一起形成传感材料的用铂纳米颗粒装饰的石墨烯膜，(ii)酶、葡萄糖氧化酶，其在与葡萄糖的电化学反应中产生过氧化氢，电化学石墨烯传感器检测到的反应产物，(iii)用于包封酶的水凝胶(基于聚合物例如琼脂糖、壳聚糖、乙基纤维素或甲基纤维素)，以及(iv)生物相容性弹性体(例如，硅酮橡胶，例如聚二甲硅氧烷(PDMS)或PlatSil 7315，得到100微米范围的厚度；或聚对二甲苯，用于其中寻求厚度低于100μm的设计)用于形成穿孔膜，其用于为每个像素的凝胶储存器提供机械支撑和限定。石墨烯是柔性电子产品的首选材料。此处选择它是因为它具有弯曲和折曲的机械回弹性、通过标准微加工技术易于模式化和装置集成(创建像素化阵列所需的特性)、其与绿色电子产品的兼容性以及尤其重要的是其与贵金属电化学电极相比降低商业产品的成本的潜力。与Pt纳米颗粒(或其他催化颗粒)组合，石墨烯/Pt NP电极对葡萄糖的电化学响应跨越多个数量级并且其灵敏度非常好(参见第3部分)。最后，在一个优选的实施方案中，石墨烯不仅可用于提供电化学像素传感器的有效面积，而且还提供将这些传感区域与外部世界连接的电互连(图5)。根据实现策略(参见下文)，待使用的石墨烯的类型可以是通过CVD产生的原子级薄层，或者用于产生印刷区的石墨烯纳米薄片油墨。像素阵列的实现不限于上述传感材料。可以使用其他传感材料，例如进一步用普鲁士蓝(或等同物，具有进一步降低工作电位的作用)、碳基电极(包括碳纳米管)、单独的普鲁士蓝(或等同物)、传统上用于电化学的金属电极，或它们的组合功能化的石墨烯/PtNP(或其他催化颗粒)。
要建立像素阵列，可以采用几种实现策略：
策略no.1
1.使用湿法或干法工艺将通过化学气相沉积(CVD)产生的通常为1.6×1.6cm2的大面积石墨烯的贴片转移到柔性(可能也是透明的)基底上。基底可以是聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，其是多种柔性电子应用的所选基底，包括基于石墨烯的那些。可能的柔性基底的另一些实例是聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)或聚酰亚胺膜(例如kapton)。
2.然后通过使用标准光刻的等离子体蚀刻或者直接通过阴影掩蔽将石墨烯模式化成约2×2mm2的像素；以这种方式，蚀刻掉不需要的石墨烯区域。这允许限定基于石墨烯的像素传感区域以及另外(但不是基本上)与外部世界的电互连二者，如图5所示。
3.然后通过电化学沉积将Pt纳米颗粒固定在石墨烯像素传感区上(参见第4部分“支撑方法”)；或者，其可以通过溅射形成。它们的催化作用提高了针对葡萄糖检测的背景噪声的可测量电流水平并降低了进行反应所需的过电位。
4.然后在每个像素内产生用于葡萄糖提取和电化学葡萄糖检测二者的电极。图3示出了早期设计，其中分别由Ag和AgCl制成的电极1和2用于提取；而分别由AgCl、石墨烯和Pt制成的电极2、3和4用于检测。在更近期的设计图5中，Pt电极已被移除。
这些不同材料(Ag、AgCl、Pt)的电极通过定制的模板掩模通过几个阶段的热蒸发或溅射方便地限定，或者，它们也可以使用标准光刻来实现。可以从下面的Ag层开始形成AgCl区，然后将其化学转化(例如，通过与FeCl3反应)为AgCl，或者通过预沉积的Ag层的电化学阳极氧化进行(参见第4部分“支撑方法”)。
5.模式化的绝缘层(例如氧化物或绝缘聚合物)沉积在阵列装置上。该步骤将仅暴露每个像素的有效面积(其中发生葡萄糖提取和检测)，覆盖其他所有，即，将阵列内的每个像素装置的有效面积与芯片上采集和控制系统的连接器连接的所有电互连。通过这种方式，在操作期间保护互连免受湿气、液体和汗液的影响。
6.分别形成薄的、柔性的和无支撑的(free-standing)弹性体膜(例如PDMS、Platsil或聚对二甲苯)或类似材料(参见图3中的示意图)，其中孔的模式与石墨烯像素阵列模式匹配。膜可以通过例如旋铸、聚合物气相沉积或注射成型的方法形成。该膜为含酶凝胶储存器提供限定和机械支撑，含酶凝胶储存器随后填充膜中的孔并与膜表面齐平。该膜的优选厚度约为0.1mm，这是凝胶储存器的优选厚度强加的要求；这样的厚度可以通过例如旋铸获得。弹性体-凝胶单元还提供了装置与皮肤之间的界面。在一个优选的实施方案中，然后将具有包封的凝胶的弹性体膜定位在石墨烯像素阵列的上方，以使得凝胶像素与石墨烯传感像素对齐。
7.酶葡萄糖氧化酶被包埋在水凝胶储存器中(参见第4部分“支撑方法”)，以提供对传感器响应(对葡萄糖)的特异性。以这种方式，传感器将不会响应可能存在于离子导入提取物中的干扰物质。在液化状态下将酶与水凝胶混合。
8.根据它们的热特性，将酶和液化水凝胶依次注入(以避免酶变性)，或使用微量分配器将其混合在一起注入支撑膜的各个孔中，并使其固化。在全尺寸阵列的情况下，可以使用商业微分配系统，例如Biodot xyz或Biojet。用于实现该步骤的其他方法可以涉及某种形式的模式化或机械转移。
使水凝胶变成半固体，此时其体积约为初始值的2/3；水凝胶的半固体性质促进葡萄糖扩散通过凝胶和电化学传感期间的有效电子转移二者。具有包封的凝胶的弹性体单元可代表该装置的可替换部分。
策略no.2
该策略广泛使用丝网印刷技术用于限定阵列的像素以及将它们与外部世界连接的互连。在一个优选实现中(参见图5)，如下创建阵列的多个区域：(i)通过印刷基于石墨烯薄片油墨来限定电互连和工作电极(阵列的早期设计具有基于Ag的油墨的互连)；(ii)待用作葡萄糖检测的伪参比电极和葡萄糖提取过程中的反向离子导入疗法的Ag/AgCl电极，分别由基于Ag和AgCl的油墨的后续印刷阶段限定。
图5示出了2×2阵列的多个部件的相对定位：选择像素中的电极之间的间隔，以使得工作电极和对电极足够接近参比电极和离子导入疗法电极，以使溶液中的欧姆电位下降最小化，以及允许提取的葡萄糖迅速有效地到达检测电极。由于使用单个Ag/AgCl电极进行提取和检测二者(如图5(b)中的布局所示)可能会及时影响其性能，因此设计了第二种布局，其中传感电路和反向-离子导入疗法电路完全解耦(即，它们不共用任何电极)(图5(a))。其中只有两个电极用于电化学检测的图5(a)的设计是用于低电流电化学传感的常用策略(Nature 2016，529，509-514，Anal.Chem.2015，87，394-398)。
与策略1的步骤5类似，可以使用适当的油墨来印刷绝缘层。存在几种这样的油墨，包括生物相容的变体。然后将印刷的阵列与使用如上所述(策略no.1)相同的步骤6至8产生的弹性体-水凝胶膜耦合。
无论用于制造阵列的策略如何，当使用图5(a)和5(b)中描述的布局时，阵列中的所有像素装置都预期执行反向离子导入提取，然后电极材料“恢复”以避免在长期操作期间其各自电极内的AgCl和Ag耗尽。对于每个像素，这利用了每个像素中存在的Ag和AgCl电极。相比之下，图5(c)中的布局在依次提取/恢复阶段使用两个相邻的像素装置，因此在任何给定时间，阵列的仅一半像素提取葡萄糖，而另一半仅提供完成提取电路所需的AgCl电极。然后，通过反转所施加电流的极性，在下一个操作周期中通过阵列的另一半像素提取葡萄糖；由此确保了在各像素装置对之间依次再循环Ag和AgCl。电极极性的这种依次变化也可以限制已被认为与刺痛和红斑相关的皮肤的任何极化。
3.概念验证
测试用于非侵入性监测经皮葡萄糖的本发明小型化像素装置的实例以确定其检测范围、检测限、对葡萄糖响应的特异性，以及其通过单个毛囊途径进行双重葡萄糖提取/检测的能力。另外，还评估了两个相邻像素装置之间的串扰。
图6(a)示出了通过策略no.1实现的实施方案中像素装置的典型电化学电流相对于葡萄糖浓度的校准曲线。像素装置的直径为约3mm，并且包含24μL含有8mg/mL葡萄糖氧化酶的包封酶的凝胶储存器，以及与凝胶储存器接触的外部(线)Ag/AgCl和Pt电极。得到的校准曲线示出在从微摩尔至超过毫摩尔的浓度范围内的单律依赖性(single-lawdependence)，并且示出4微摩尔的低检测限(LoD)。在储存器凝胶体积(24μL)内稀释后，将糖尿病的低血糖至高血糖范围(即血液中为3.5至12mM，以及组织间液中非常相似的范围)完全映射到传感器校准曲线；因此，对于该实例中使用的几何尺寸，测量的葡萄糖浓度范围是10至40微摩尔，已经远高于传感器的LoD。在1小时的提取期内施加0.2mA的提取电流达到这些浓度。凝胶储存器体积的进一步减小使传感器工作范围转向甚至更高的浓度和更高的灵敏度。
图6(b)示出了完整的芯片上像素装置的电化学电流相对于葡萄糖浓度的校准曲线，其中所有电极都是平面的并且与PET基底集成。像素装置具有4×2mm2面积，10μL含有16mg/ml葡萄糖的凝胶储存器，以及分别由铂纳米颗粒装饰的石墨烯和Ag/AgCl膜制成的两个平面电化学电极(参见第4部分，“支撑方法”)。对于该实施方案，在该范围的较低葡萄糖浓度端获得与图6(a)对应的实施方案的情况中相比较大的电流；这很可能是使用的平面电极几何结构结合可以加速酶反应的初始速率之较大浓度的包封酶的结果。发现在整个浓度范围内具有单律依赖性，并且发现检测限降低至低于2微摩尔。
在最近的实验中，凝胶储存器的体积减小至约1μL，导致厚度为约0.1mm，是极大降低葡萄糖在整个凝胶中的扩散时间的最优选的值。这种改进允许人们减少提取时间和提取电流二者，使装置的这些操作参数进入最优选的范围。
为了证明对葡萄糖的特异性响应，将像素检测器暴露于抗坏血酸和尿酸以及对乙酰氨基酚(离子导入提取物中除了葡萄糖之外可能存在的潜在干扰物质)。图7示出在每次添加葡萄糖后，电流计电流的平台(plateau)提高，并且当添加任一种可能的干扰物时，平台降低。这与已经存在于凝胶中的葡萄糖的稀释一致，并且表明传感器对不与固定的酶特异性相互作用的物质基本上不灵敏。
平台的葡萄糖提取功能通过在使用猪皮的简单扩散细胞中离体进行反离子导入疗法(RI)来显示(参见第4节“支撑方法”)，其是人对应物的优秀模型(Schmook，F.P.，J.G.Meingassner和A.Billich，Comparison of human skin or epidermis models withhuman and animal skin in in-vitro percutaneous absorption.InternationalJournal of Pharmaceutics，2001.215(1-2)：第51-56页)。由于哺乳动物皮肤在pH 7.4下带有净负电荷，电渗透传递在阳离子迁移的方向上发生(Marro，D.，等，Contributions ofelectromigration and electroosmosis to iontophoretic drug delivery.Pharm Res，2001.18(12)：第1701-8页)。在这些实验中，在1小时的提取时间内施加0.2mA的电流。当在不同浓度的皮下溶液中存在时，通过在凝胶中测量的计时电流(图8)证明葡萄糖的成功反向离子导入疗法(RI)采样，然后使用图6中所示类型的校准曲线将该电流转换为葡萄糖浓度。当皮下溶液中不存在葡萄糖时进行的阴性对照RI实验证实没有明显的来自皮肤本身的干扰作用。此外，如下所讨论的，通过定量1H-核磁共振(1H-qNMR)独立地验证像素装置中葡萄糖的电化学检测。如标题为“几何学考虑因素”的部分中所述，弹性体膜的厚度为0.1mm，其中含有直径为2mm的凝胶，凝胶体积减少了～60倍，使得提取时间和施加的RI电流二者均分别减少至通常为10至15分钟和0.02mA，同时将凝胶中的葡萄糖浓度充裕地保持在检测范围内。
如图8(a)所示，在两个实验中建立了通过毛囊进行的葡萄糖的优先RI提取：首先，通过毛发“靶向”，其中微型弹性体支撑的凝胶“像素”直接定位在单根毛囊上，第二，通过比较不同毛发密度的皮肤样品上的提取。在这两个实验中，在相同条件下在具有不同毛发密度的两个皮肤样品上进行RI；使用相同的凝胶储存器体积，并用相同的石墨烯传感器在其中进行葡萄糖的电化学检测。在具有34根毛发/cm2的皮肤样品上进行的单毛囊、毛发靶向的“优先提取”与另一种仅有6根毛发/cm2的相对缺乏毛囊的情况进行对比(图8)。这些测量的结果允许评估通过毛囊和非毛囊途径的RI提取通量的相对量级。当葡萄糖的真皮下浓度为10毫摩尔时，通过优先途径的通量为3.5nmol.mA-1.hr-1，而通过非毛囊皮肤的是0.4nmol.mA-1.hr-1。这些值与早期报道的在猪皮肤上离体的总葡萄糖提取通量(4.5nmol.mA-1.hr-1)一致(Sieg，A.，R.H.Guy和M.B.Delgado-Charro，Electroosmosis inTransdermal Iontophoresis：Implications for Noninvasive and Calibration-FreeGlucose Monitoring.Biophysical Journal，2004.87(5)：第3344-3350页)。优先途径对照物也与通过使用扫描电化学显微术直接观察和定量电渗透所确定的毛囊处氢醌之增强的离子导入通量一致(Bath，B.，H.White和E.Scott，Visualization and Analysis ofElectroosmotic Flow in Hairless Mouse Skin.Pharmaceutical Research，2000,17(4)：第471-475页)。图9收集了几个实验的结果，其中葡萄糖提取的效率与毛发密度相关，并且经电化学或通过1H-qNMR检测分析物。显示通过富含毛囊和毛囊缺乏的皮肤样品提取的浓度比与其各自的毛发密度比之间存在明显的相关性之数据表明通过RI将葡萄糖提取到微型“像素”中确实主要通过优选的毛囊途径发生。电流法和NMR分析技术之间极好的一致性为像素装置的双重提取-检测功能提供了进一步的信心。
图8(b)示出了采用与PET基底完全集成的平面电极的反向离子导入疗法。数据的趋势非常类似于图8(a)中描述的那些。
还证明了相邻“像素”装置之间可忽略的干扰(图10)。将含有酶的两个“像素”储存器并入弹性体基质中并分开约1.5mm。“像素”位于单个连续的石墨烯传感器上，其面积是单个“像素”面积的两倍。这产生了通过石墨烯膜耦合的两个装置，其在电化学反应中充当工作电极，但在两个单独的水凝胶储存器中发生的酶反应方面是解耦的。计时电流法首先在其中一个“像素”上进行，其储存器不含葡萄糖，并获得对照基线响应。然后在添加10微摩尔至1毫摩尔的多种浓度的葡萄糖之前和之后测量第二“像素”中的计时电流。最后，重新确定第一个“像素”中的计时电流响应以评估两个装置之间的任何串扰。发现第一“像素”中的基线响应增加不超过对应于添加到第二“像素”的葡萄糖总量的3％。换言之，即使使用两个装置共用的石墨烯电极，使用单独的水凝胶储存器也有效地解耦了单个“像素”的响应。在设想单个石墨烯检测器的阵列的一个实际实施方案中，预期实现完全解耦。
4.支撑方法
检测装置制造。材料加工。
基于石墨烯的传感器制造。最初在Cu箔上合成的3×3或2×2mm2的化学气相沉积(CVD)石墨烯方块通过标准程序(Bae，S.等，Roll-to-roll production of 30-inchgraphene films for transparent electrodes.Nat Nano，2010.5(8)：第574-578页)转移到SiO2/Si(在早期实验中)或柔性PET基底上。通过连续沉积Ti和Au轨道(例如，厚度分别为10/60nm)能够在SiO2/Si上与石墨烯电互连，其中Ti用作Au膜的粘附层；在石墨烯在PET上的情况下，电互连由与PET直接粘附的Ag制成。这些金属互连随后被石墨烯本身替换。然后将Pt纳米颗粒电化学沉积到石墨烯方块上，从而产生在电化学葡萄糖检测期间用作工作电极的杂合石墨烯/Pt NP像素材料。在像素装置内，然后用聚二甲基硅氧烷(PDMS)或具有中心圆柱孔的硅酮橡胶框架(其中水凝胶储存器浇铸在石墨烯的上方)将电化学中使用的石墨烯区域与电路的其余部分绝缘。在早期实验中，(i)用外部Ag、Ag/AgCl和Pt线完成电化学电路，和(ii)在后面的实施方案中用芯片集成的Ag/AgCl(以及在一些变体中的Pt)电极完成电化学电路。
外部参比微电极。通过计时电流法在3.5M KCl溶液中通过用AgCl涂覆99.95％的纯银线，以Pt作为参比和对电极，在1V下制造Ag/AgCl微电极持续1小时。然后将线包封在含有0.1M KCl的1％w/v琼脂糖凝胶中。电极仅保持低(0.1M)KCl浓度以限制存在的葡萄糖氧化酶抑制剂的量。在不使用时将电极在4℃下储存在0.1M KCl中，并且使用循环伏安法定期确认其性能和随时间的稳定性。
芯片集成的电化学电极。为了制造完全集成的传感器，电化学中涉及的所有电极都直接在基底上限定。如图5所示，这需要产生Ag/AgCl电极。
热/电子束蒸发：首先，使用模板掩模将850nm厚的Ag模式化区域直接沉积在PET上。注意，在用于概念验证研究的其他基底(例如SiO2)上，首先沉积5至10nm的Ti层以确保Ag层的粘附。然后，在Ag区域的上方沉积厚度约为300nm的另外的AgCl层以产生稳定的AgCl/Ag参比电极。需要这样厚的Ag和AgCl层以确保参比电极的长寿命(B.J.Polk等，Sensors and Actuators B 114(2006)239-247)。
化学和电化学方法：(i)化学方法，在室温下将50mM FeCl3溶液施加到Ag表面20秒，然后用去离子水清洗；(ii)电化学方法，通过计时电流法在1M KCl溶液中产生AgCl，其中芯片上Ag电极作为工作电极，且Pt线作为参比电极和对电极，然后用去离子水清洗。
在多种氯离子浓度的溶液中获得Nernstian行为，与AgCl/Ag电极的制备途径无关。
印刷技术：Ag/AgCl电极也可以使用直接印刷基于Ag和AgCl油墨的堆叠层来创建。
凝胶浇铸和酶包埋。将12μL的8mg/mL葡萄糖氧化酶溶液直接沉积在由PDMS或硅酮橡胶框架限定的直径为2或3mm的石墨烯传感器区上。通过将混合物加热至高于80℃然后冷却至28℃，即低于～36℃的胶凝温度来制备在0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.4中的1％w/v低温胶凝琼脂糖的澄清溶液。然后，将12μL凝胶(仍然在28℃)添加到酶溶液，以使得保持酶的催化和结构性质(Zoldak，G等，Irreversible Thermal Denaturation of Glucose Oxidasefrom Aspergillus niger Is the Transition to the Denatured State with ResidualStructure.Journal of Biological Chemistry，2004，279(46)：第47601-47609页)并且能够有效地包埋在凝胶中。
为了减少提取电流和时间段，需要减少凝胶的体积(参见标题为“几何学考虑因素”部分)。因此，将2μL含酶凝胶浇注到0.1mm厚的PDMS膜的孔(1.5至2mm直径)中。通常，含酶凝胶的体积随着由支撑弹性体膜的厚度限定的体积和其内的储存器孔的尺寸减小而缩小。
使用胶凝温度低于酶的变性点的其他类型的水凝胶可以允许酶与水凝胶直接混合，然后将混合物直接注入弹性体膜的孔中。
铂纳米颗粒的沉积。电化学方法：在10μL的0.1M H2SO4，1.7mM六氯铂酸氢盐中以20mV/sec扫描速率获得的循环伏安图显示相对于微Ag/AgCl参比电极，在约-0.35V处的典型氯化物还原峰。
溅射：在基础压力优于9×10-7mbar下，进行氩气下的DC溅射。沉积10nm的标称厚度的Pt，得到直径为3至5nm的粒径。该方法可适用于大规模生产。
反离子导入疗法(RI)，离体(在猪皮肤上)。输出数据。
材料准备。从当地屠宰场获得猪腹部皮肤，取皮刀取至标称厚度750μm，在屠宰后24小时内冷冻并在使用前解冻。通过光学显微镜下的检查确定其毛囊密度。在完整强度PBS中制备10和100mM D-葡萄糖溶液(在去离子的MilliQ-水中)并使其变旋(mutarotate)过夜以用作RI的皮下溶液。满足电化学反应要求所需的氯化物的量估计为0.9mM，这完全在用于葡萄糖溶液的PBS提供的范围内。
经皮RI葡萄糖提取。一块皮肤将垂直Franz扩散池分成两半，其中表皮侧面向上方的隔室。细胞的下部皮下室中填充7.5mL的10或100mM葡萄糖溶液，并磁力搅拌1小时。RI提取在两种实验配置中进行：(i)首先，使用外部线提取电极，然后(ii)使用芯片集成的提取电极。
外部电极：含酶凝胶储存器定位于具有与“像素”接触的Ag/AgCl多孔阴极的皮肤表面。将银阳极插入皮下隔室中。因为两个电极因此位于皮肤的相对侧，所以离子导入疗法电路的电阻大约是体内预期电阻的一半，其中两个电极将位于皮肤表面上并且结果是离子导入电流必须穿过皮肤两次。然而，由于RI提取是在恒定电流下进行的，因此体外和体内情况之间的唯一区别是驱动后一种情况下使用的电流所需的电压大约高两倍(Potts，R.O.，Mechanisms of Transdermal Drug Delivery.1997：Taylor&Francis)。通过在从电源的阳极和阴极之间使0.2mA的恒定电流流过1小时来执行RI；在电流通过期间，定期监测皮肤上的电位。所采用的RI电流施加时间允许提取的葡萄糖在凝胶储存器的整个厚度上基本上均匀地分布。
芯片集成的RI电极：通过与上述用于制造芯片上电化学电极的方法相同的方法产生芯片上Ag和Ag/AgCl电极对。
装置的输出数据：通常在每次测量中记录计时电流(图9)持续700秒，然后在总测量期间的最后600秒(即，对应于平台区)进行平均，并相应的减去背景值(即在RI之前)。
柔性基底上的像素阵列：特性和操作
1.概念验证
图14和图15包含代表性离体(猪皮肤)提取-检测实验的汇编，其涉及通过“详细讨论/材料的选择和装置实现策略”部分中描述的策略no.1实现的四种不同的基于2×2石墨烯的阵列。如下所详述，数据证明了所有预期的功能方面：(i)靶向提取(图14B和C)，(ii)与各个像素探测的毛囊数目的相关性和比例性(图14B和C)，(iii)检测通过单个毛囊提取的葡萄糖的能力(图14C)，(iv)与皮下葡萄糖浓度成比例(图14B，图3)，以及(v)阵列内(图14B，图1)以及不同阵列之间(图15)的像素的封闭操作特性。
已经使用适合于实际使用的参数(提取时间和电流以及皮下葡萄糖浓度)：例如，对于提取和检测时间各自5分钟，10mM皮下葡萄糖浓度，0.5mA/cm2提取电流密度和在像素装置内1至2微升体积的凝胶，证明了这种2×2阵列的功能性。像素和多种电极和组件的尺寸与最终实施中所需的尺寸兼容(图14A)。
阵列设计遵循先前部分(策略1，另请参见下文“材料的选择和阵列实现”)中描述的原理。对于葡萄糖提取，实验使用图5(c)中所示的配置(并标记为“配置3”)，其中反向离子导入疗法使用位于两个相邻像素装置上的最大的Ag/AgCl电极(在图14A中标记为1)作为形成提取电路的阳极和阴极。在该配置中，在操作周期的一半期间，在一个像素中提取葡萄糖，而在后一半期间中，提取电流的极性被反转，并且在另一个像素中提取葡萄糖。以这种方式，每个提取电极的AgCl内容物的提取和恢复依次包括两个相邻的像素。通过在每次提取之后的“恢复”期间反转提取电流的极性来获得各个电极内的Ag和AgCl内容物的再循环。图14A中用4标记的电极在该配置中不起作用。由于AgCl(离子固体)能够在电化学应激后恢复其表面化学成分，因此选择Ag/AgCl作为提取电极对的材料，从而确保其在需要电极极性交替的反复循环的提取/恢复后的稳定性。相反，纯Ag电极的表面经受可改变其化学性质的反应(例如氧化)。发现在用阵列进行四个循环的提取/检测之后，Ag/AgCl电极的电势变化可忽略不计(仅～30mV)，从而确立了它们的恢复。
图14B，图2示出了通过阵列的每个像素提取后获得的一组电流-时间检测曲线(其灵敏度校准曲线示于图14B，图1中)；如通过各像素装置探测的通过多种数目的毛囊进行提取。图14B，图2的插图显示，对于每个电流-时间检测曲线，沿曲线的平台对检测电流进行平均，然后绘制在灵敏度校准曲线上：这允许人们通过插值法(interpolation)确定每个像素的凝胶内提取的葡萄糖的浓度。为了简化分析，插图中的图表是图14B，图1中示出的四个电流-浓度校准曲线的算术平均值。在每种情况下，由此确定的葡萄糖浓度与各自的像素所靶向的毛囊数目成比例，并且与基于先前确定的葡萄糖毛囊提取通量的评估一致。另外，在类似条件下通过非毛囊皮肤提取导致检测到的电流比在毛囊提取的情况下衰减得更快(图14B，图2)，这是由于像素凝胶内的葡萄糖含量非常低。总之，这些实验明确地证明了阵列按所设计的通过利用毛囊作为葡萄糖的优先经皮提取途径而操作。此外，图14B，图3示出了在通过相同像素装置提取后，检测到的电流与皮下葡萄糖浓度成比例。图14C示出了作为用阵列实际执行的提取-检测的方式的一个实例，与阵列的各个像素所靶向的毛囊的图像相关的检测电流相对于时间的曲线。在这种情况下，也可以探测通过单个毛囊提取后的检测。除了石墨烯(其是选择用于与阵列一起使用的材料)之外，我们还通过使用更传统的传感材料(在这种情况下为金)证明了阵列设计的可行性(图16)。比较显示，当石墨烯和金二者与铂纳米颗粒结合使用时，当集成在相同的阵列设计中时，给出非常相似的灵敏度校准曲线(比较图14B，图1和图16)。
2.材料的选择和阵列实现
平面基于石墨烯的阵列。程序步骤：
将石墨烯湿转移到PET片上。使用标准湿转移程序将在铜基底上生长的化学气相沉积(CVD)-合成的石墨烯转移到柔性的，预先抛光的PET片上(Li，X.，Zhu，Y.，Cai，W.，Borysiak，M.，Han，B.，Chen，D.，Piner，R.D.，Colombo，L.和Ruoff，R.S.，Transfer ofLarge-Area Graphene Films for High-Performance Transparent ConductiveElectrodes.Nano Letters，2009，9(12)：4359-4363)。对于2×2阵列，使用模板掩模(设计用于随后的电极和轨道限定)将四个这样的石墨烯贴片(大于最终的所需尺寸)大致放置在所需位置的PET片上以引导对齐。石墨烯贴片在葡萄糖的电化学检测中为阵列的每个像素提供工作电极。为了防止石墨烯层中的潜在结构不连续/撕裂(在CVD生长期间或在转移过程期间由机械应激引起)导致层的电不连续性，第二石墨烯层随后转移到每个先前转移的贴片上方。
通过物理气相沉积(热蒸发)进行电极和轨道沉积。为了沉积具有确定几何结构的薄膜电极，依次放置成套定制或聚酰亚胺工业胶带激光加工的模板掩模，并在PET支撑的石墨烯贴片的上方对齐。模板掩模组是根据阵列布局定制的，图4给出了这种布局一些实例；在这种特定情况下，使用了图4(a)的设计。将500nm银膜沉积在预先沉积以促进银层粘附的30nm钯层的上方。随后将500nm厚的AgCl层沉积在银膜的上方以使参比/对电极完整。需要这样厚的Ag和AgCl层以确保参比电极的长寿命(Polk，B.J.，Stelzenmuller，A.，Mijares，G.，MacCrehan，W.和Gaitan，M.，Ag/AgCl microelectrodes with improvedstability for microfluidics.Sensors and Actuators B：Chemical，2006，114(1)：239-247)。
石墨烯模式化。然后将石墨烯贴片以预限定的几何结构模式化(例如，根据来自图5的布局)。尽管可以使用低能氧等离子体来蚀刻由塑料基底支撑的石墨烯，但是在电流的实现中，成功地使用机械切割(使用手术刀)从像素贴片去除多余的石墨烯。
设计用于支撑包封酶的凝胶之弹性体膜的实现和转移。将与固化剂混合的PDMS旋涂在PET支撑片上并固化，得到100μm厚的膜。然后钻出圆孔(直径1.5至3mm)以产生储存器凝胶的插口(socket)。在去离子水浴中进行仔细地水下剥离后，将PDMS膜转移到具有限定电极和轨道的阵列上，确保插口与每个像素的电化学池区域对齐。然后将组件在空气中干燥。
铂纳米颗粒沉积在石墨烯像素电极上。通过在氩气下的DC溅射通过适当的模板掩模，形成铂纳米颗粒并沉积在像素的石墨烯区上。通过调节氩气压力和溅射时间(通常为20秒)，获得直径为3至5nm的颗粒。
凝胶浇铸和酶包埋。通过加热至高于80℃，形成1mL在PBS pH 7.4中的2％w/v琼脂糖的澄清溶液。然后将其浇铸在载玻片上(使其展开并展平)，并在通风橱中放置15分钟以实现快速胶凝。随后，切下足迹区对应于预定像素面积的凝胶块(具有约5μL的体积)。然后，在凝胶块的电极侧放置并吸收0.5至1μL的酶溶液(12mg/mL)。最后，将凝胶块放置在PDMS膜的插口内的各个像素上方。在其最终形式中，凝胶块缩小至体积为约1至2μL。
平面基于金的阵列。除了涉及石墨烯膜的那些之外，用于基于石墨烯阵列的所有工艺步骤保持相同。代替石墨烯，通过适当的模板掩模在所需位置通过热蒸发沉积约200nm厚的金像素区。
本文中引用的或与本申请一起提交的所有出版物、专利和专利申请，包括作为信息公开声明的一部分提交的参考文献均整体通过引用并入。

Claims (29)

1.用于在对象中非侵入性监测一种或更多种物质的多路复用经皮提取和检测装置，所述装置包含传感器像素阵列，每个传感器像素包含：
(a)包含电极组的基底，其用于向所述对象的皮肤施加电流以通过电迁移和/或通过电渗透从组织间液中经皮提取一种或更多种物质；
(b)与所述传感器像素关联的储存器，所述储存器包含用于接收来自所述传感器像素的经皮提取物质的一定体积的凝胶；
(c)检测电极组，其用于电化学检测存在于与所述传感器像素关联的储存器中的一种或更多种经皮提取物质的浓度；
其中，所述传感器像素阵列配置成使得至少一个所述传感器像素能够经所述对象皮肤上的优先途径提取所述一种或更多种物质。
2.用于在对象中非侵入性监测一种或更多种物质的多路复用经皮提取和检测系统，所述系统包含：
(i)包含传感器像素阵列的装置，每个传感器像素包含：
(a)包含电极组的基底，其用于向所述对象的皮肤施加电流以通过电迁移和/或通过电渗透从组织间液中经皮提取一种或更多种物质；
(b)与所述传感器像素关联的储存器，所述储存器包含用于接收来自所述传感器像素的经皮提取物质的一定体积的凝胶；和
(c)检测电极组，其用于电化学检测存在于与所述传感器像素关联的储存器中的一种或更多种经皮提取物质的浓度；
其中，所述传感器像素阵列配置成使得至少一个传感器像素能够经所述对象皮肤上的优先途径提取所述一种或更多种物质；以及
(ii)数据处理系统，其能够将经优先途径通过所述装置获得的经皮提取物质的样品与经其他途径提取的物质的样品区分开，以使得经所述优先途径经皮提取物质的样品用于评估所述对象中所述一种或更多种物质的浓度。
3.用于在对象中非侵入性监测一种或更多种物质的方法，其中所述方法采用多路复用经皮提取和检测装置，所述装置包含传感器像素阵列，每个传感器像素包含：
(a)包含电极组的基底，其用于向所述对象的皮肤施加电流以通过电迁移和/或通过电渗透从组织间液中经皮提取一种或更多种物质；
(b)与传感器像素关联的储存器，所述储存器包含用于接收来自所述传感器像素的经皮提取物质的一定体积的凝胶；
(c)检测电极组，其用于电化学检测存在于与所述传感器像素关联的储存器中的一种或更多种经皮提取物质的浓度；
其中，所述传感器像素阵列配置成使得至少一个所述传感器像素能够经所述对象皮肤上的优先途径提取所述一种或更多种物质；
(d)数据处理系统，其能够将经优先途径获得的经皮提取物质的样品与经其他途径提取的物质的样品区分开，以使得经所述优先途径经皮提取物质的样品用于评估所述对象中所述一种或更多种物质的浓度；
所述方法包括：
(i)使所述传感器像素阵列与所述对象的皮肤接触；
(ii)使用提取电极向所述对象的皮肤施加电流以在所述阵列中的传感器像素处通过电迁移和/或通过电渗透从组织间液中经皮提取一种或更多种物质；
(iii)将流体样品吸收到所述阵列中所述传感器像素的凝胶储存器中；
(iv)电化学检测吸收到所述凝胶储存器中的所述一种或更多种物质；
(v)分析存在于单个凝胶储存器中的所述一种或更多种物质的浓度以确定哪个传感器像素经所述对象皮肤中的优先途径提取了所述一种或更多种物质的样品；
(vi)使用来自经优先途径提取的样品的物质浓度来确定所述对象的身体中所述一种或更多种物质的浓度。
4.权利要求1至3中任一项所述的装置、系统或方法，其中所述经皮提取物质包括一种或更多种标志物、药物、滥用物质和毒素。
5.前述权利要求中任一项所述的装置、系统或方法，其中所述经皮提取的物质包括葡萄糖。
6.前述权利要求中任一项所述的装置、系统或方法，其中所述基底是柔性的并且任选是透明的。
7.权利要求6所述的装置、系统或方法，其中所述柔性基底由聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)形成。
8.前述权利要求中任一项所述的装置、系统或方法，其中提取电极组包含银电极和银/氯化银电极。
9.前述权利要求中任一项所述的装置、系统或方法，其中所述检测电极组包含石墨烯电极。
10.前述权利要求中任一项所述的装置、系统或方法，其中所述检测电极组包含氯化银电极和石墨烯电极以及任选的铂电极。
11.权利要求9或权利要求10所述的装置、系统或方法，其中石墨烯电极包含能够增强电化学信号的催化颗粒。
12.权利要求9至11中任一项所述的装置、系统或方法，其中所述石墨烯电极由受控气相沉积(CVD)石墨烯和石墨烯-纳米薄片油墨制成。
13.权利要求9至12中任一项所述的装置、系统或方法，其中石墨烯被模式化或印刷在所述基底上以提供所述石墨烯检测电极以及与其他电极和/或外部电路的电互连。
14.前述权利要求中任一项所述的装置、系统或方法，其中所述传感器像素阵列包含至少16个传感器像素。
15.前述权利要求中任一项所述的装置、系统或方法，其中所述传感器像素阵列包含至少25个传感器像素。
16.前述权利要求中任一项所述的装置、系统或方法，其中所述传感器像素阵列包含10至100个传感器像素。
17.前述权利要求中任一项所述的装置、系统或方法，其中所述传感器像素阵列包含16或64个传感器像素。
18.前述权利要求中任一项所述的装置、系统或方法，其中所述传感器像素的面积为1.0mm2至100.0mm2。
19.前述权利要求中任一项所述的装置、系统或方法，其中所述传感器像素的面积为2.0mm2至50.0mm2。
20.前述权利要求中任一项所述的装置、系统或方法，其中所述传感器像素的面积为3.0mm2至10.0mm2。
21.前述权利要求中任一项所述的装置、系统或方法，其中传感器像素中凝胶的体积小于约30μL。
22.前述权利要求中任一项所述的装置、系统或方法，其中传感器像素中的凝胶体积为0.2μL至2μL。
23.前述权利要求中任一项所述的装置、系统或方法，其中传感器像素中凝胶的厚度为0.05mm至0.2mm。
24.前述权利要求中任一项所述的装置、系统或方法，其中所述凝胶含有葡萄糖氧化酶，其用于与样品中的葡萄糖反应以产生过氧化氢以通过检测电极进行检测。
25.前述权利要求中任一项的装置、系统或方法，其中铂纳米颗粒固定在所述石墨烯电极上以放大来自过氧化氢的信号。
26.前述权利要求中任一项所述的装置、系统或方法，其中所述凝胶是水凝胶，例如琼脂糖。
27.前述权利要求中任一项所述的装置、系统或方法，其中所述凝胶的储存器被弹性体包封以为每个传感器像素阵列内的凝胶的体积提供机械支撑。
28.前述权利要求中任一项所述的多路复用经皮提取和检测装置用于在对象中非侵入性监测一种或更多种物质的用途。
29.权利要求28所述的用途，其中所述装置用于葡萄糖监测或用于监测氧化应激的标志物。
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