CN109307764B - 一组代谢标志物在制备胶质瘤诊断试剂盒方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组代谢标志物在制备胶质瘤诊断试剂盒方面的应用。本发明发现，亚甲基‑L‑谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基‑L‑肉碱和月桂酰‑L‑肉碱可以联合用于诊断胶质瘤，诊断准确度高。本领域技术人员可以将其开发成胶质瘤早期诊断试剂盒，该试剂盒中含有亚甲基‑L‑谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基‑L‑肉碱和月桂酰‑L‑肉碱这四种化合物的标准品，用于检测待测样本中的亚甲基‑L‑谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基‑L‑肉碱和月桂酰‑L‑肉碱。该试剂盒还可以含有2‑氯‑L‑苯丙氨酸的标准品用作检测内标。

Description

一组代谢标志物在制备胶质瘤诊断试剂盒方面的应用

技术领域

本发明属于生物化学领域，涉及代谢标志物在疾病诊断中的应用，具体一组代谢标志物在制备胶质瘤诊断试剂盒方面的应用。

背景技术

胶质瘤(Glioma)是一种起源于大脑或脊椎神经胶质细胞的原发性肿瘤，在颅内肿瘤中最为常见，多呈恶性，占所有恶性脑瘤的80％。胶质瘤以侵润性生长为特点，与周围组织界限模糊，具有发病率高、复发率高、死亡率高及治愈率低的特点，严重威胁着人类健康。积极的外科手术辅助放化疗仍是目前治疗胶质瘤的主要策略，而手术预后与胶质瘤的级别或恶性程度密切相关，因此，早期诊断和早期干预是提高患者预后和降低病死率的关键。

胶质瘤早期大多发病隐匿，临床症状无特异性，因此，其临床诊断目前主要依赖于头颅CT、MRI等影像学检查及活体组织病理学检查等手段。然而，CT检查并不能很好地区分胶质瘤与其他脑部病变(如炎症、缺血等)，且具有一定的辐射危害；而MRI的检查费用较为昂贵；组织活检的诊断准确率高于影像学诊断，但是受肿瘤的异质性、靶区选择等因素的影响仍然存在一定的误诊率，且组织活检是一种有创的诊断方法。总之，种种因素限制了这些诊断技术在胶质瘤早期诊断和人群筛查中的应用。近年来，异柠檬酸脱氢酶(IDH)、肿瘤蛋白p53(TP53)、磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)等分子生物标志物在胶质瘤临床诊断中逐渐得到重视，但这些标志物多是集中在基因和蛋白层面，灵敏度和特异性存在不足。

因此，发展快速、无创、有效的胶质瘤新型诊断标志物十分必要。

发明内容

本发明旨在克服现有技术不足，提供代谢标志物在制备胶质瘤诊断试剂盒方面的应用。

本发明目的通过如下技术方案得以实现：

一组用于诊断胶质瘤的代谢标志物，由亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱组成。

上述代谢标志物在制备胶质瘤诊断试剂盒方面的应用。

进一步地，所述试剂盒中含有亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱的标准品。

进一步地，所述试剂盒中还含有2-氯-L-苯丙氨酸的标准品等。

通过绘制ROC曲线检验上述四种代谢标志物对胶质瘤的诊断准确率。结果显示：在训练集中，亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱或月桂酰-L-肉碱单个用于胶质瘤诊断时，ROC曲线下面积(AUC)分别为0.797、0.809、0.804和0.776，四个标志物联合用于诊断时，AUC达0.959(灵敏度88.0％，特异性93.5％)；在测试集中，亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱或月桂酰-L-肉碱单个用于胶质瘤诊断时，ROC曲线下面积(AUC)分别为0.748、0.873、0.788和0.712，四个标志物联合用于诊断时，AUC达0.968(灵敏度95.6％，特异性86.0％)。本领域技术人员知道，ROC曲线评价方法中，ROC曲线下的面积值AUC在大于0.5的情况下，越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。经验证，亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱单个用于胶质瘤诊断时，AUC在0.8左右，只具有一定准确性；四个联合应用时，AUC高达0.96左右，准确度高。

在训练集中，亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱四个代谢标志物组合联合诊断时，基于最佳灵敏度和特异性，得到最优临界值(Cut-offvalue)为0.444。运用该临界值进行样本预测，结果显示：此四种代谢物组成的代谢标志物组对训练集的预测准确率为90.6％，对测试集的预测准确率为90.5％。准确率高。

有益效果：

本发明发现，亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱可以联合用于诊断胶质瘤，诊断准确度高。本领域技术人员可以将其开发成胶质瘤早期诊断试剂盒，该试剂盒中含有亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱这四种化合物的标准品，用于检测待测样本中的亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱。该试剂盒还可以含有2-氯-L-苯丙氨酸的标准品用作检测内标。

附图说明

图1为实施例中胶质瘤患者vs健康对照组的主成分分析(PCA)得分图；

图2为实施例中胶质瘤患者vs健康对照组的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)得分图；

图3为实施例中胶质瘤患者vs健康对照组建立的OPLS-DA模型的置换检验图；

图4为实施例中亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱四种代谢标志物单独及联合使用对训练集胶质瘤诊断的受试者工作特征曲线(ROC)分析；

图5为实施例中亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱四种代谢标志物单独及联合使用对测试集胶质瘤诊断的受试者工作特征曲线(ROC)分析；

图6为实施例中亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱四种代谢标志物联合使用在训练集中对胶质瘤患者的诊断准确率验证图；

图7为实施例中亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱四种代谢标志物联合使用在测试集中对胶质瘤患者的诊断准确率验证图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

一、实验仪器和试剂

Ultimate 3000超高效液相色谱系统(Dionex公司，美国)串联Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(Thermo Fisher Scientific公司，美国)；色谱柱采用WatersACQUITY UPLC BEH C18(50×2.1mm，1.7μm)；Heraeus Fresco 17离心机(Thermo FisherScientific)。

HPLC级别乙腈、甲醇、甲酸购自美国Thermo Fisher公司；实验用水为娃哈哈纯净水；2-氯-L-苯丙氨酸标准品购自J&K Chemical(中国北京)。

二、实验方法

1、实验样本

在取得患者同意后，以影像学检查结果及术后病理诊断为依据，收集2016年12月至2017年12月在郑州大学第一附属医院收入住院的胶质瘤患者95例，所有胶质瘤患者均无其他代谢性疾病。此外，从体检科收集健康志愿者96例作为正常对照组。所有血样采集于患者清晨空腹状态下，每个研究对象采集静脉血3mL置于EDTA抗凝采血管中，采集后于4℃条件下3000r/min离心10min，吸取上清(血浆)，分装后立即于-80℃冰箱内冷冻保存。从以上191例样本中随机选取96例样本(包括46例健康人样本和50例胶质瘤患者样本)组成训练集，用于寻找胶质瘤患者和健康人群的差异代谢物，构建诊断模型；剩余95个样本(包括50例健康人样本和45例胶质瘤患者样本)组成测试集，用于验证差异代谢物作为代谢标志物诊断胶质瘤的能力。

2、样品制备

血浆样品取出后放置于冰上解冻，涡旋混匀后吸取50μL血浆样品于1.5mL离心管中，加入150μL含内标的甲醇溶液(含2-氯-L-苯丙氨酸50ng/mL)，涡旋30秒混匀，13000rpm离心10min(4℃)，吸取上清于进样小瓶，即得。

质控(QC)样品：从所有血浆样本中分别吸取5μL涡旋混匀，按照上述同样方法进行QC样品前处理，即得。为了保证数据的可靠性，QC样本分析穿插在所有样本代谢组学数据采集过程中，在样本分析前，连续检测5个QC样品，待仪器稳定后开始分析样本，每隔10个样本检测一次QC溶液。

3、样品中代谢物的检测方法

色谱条件色谱分离采用超高效液相色谱(UPLC，Waters Ultimate 3000，USA)，色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(50×2.1mm，1.7μm)，柱温40℃。流动相组成是A相为乙腈，B相为0.1％甲酸水溶液。梯度洗脱条件：0～0.5min，5％A；0.5～1.0min，5％～60％A；0.5～1.0min，5％～60％A；1.0～7.0min，60％～80％A；7.0～9.0min，80％～100％A；9.0～11.0min，100％A；11.0～13.0min，5％A；流速0.2mL/min，柱后流出液不分流直接入质谱进行检测。

质谱条件质谱分析采用Q Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱，离子源为可加热的电喷雾离子源(HESI)。辅助气温度300℃，离子源温度350℃，毛细管温度320℃，辅助气流速为10μL/min，质谱分辨率为17,500，质谱分析扫描模式：full scan/ddms2，扫描范围m/z 80.00～1200.00。碰撞能梯度为20、30和40eV。采用正离子模式检测，喷雾电压3.50kV，鞘气流速40μL/min。所有样本随机进样，每检测10个样本插入一针空白，以避免交叉污染。

4、数据处理和分析

将Thermo Xcalibur 3.0采集得到的数据经过Sieve软件(version 2.2，ThermoFisher Scientific)进行峰提取、峰对齐、峰校正、归一化等数据前处理，输出由样本名称、谱峰信息(包括保留时间和质荷比)、及峰面积组成的三维数据矩阵。将数据矩阵导入SIMCA(version14.0,Umetrics)进行多元统计分析。通过建立正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型，得到变量权重重要性排序VIP(Variable Importance in the Projection)值。选择对区分胶质瘤患者与正常人群之间代谢差异贡献较大(VIP>1.5)且具有显著变化(p<0.05)的代谢物作为表征胶质瘤的差异代谢物。

经软件CompoundDiscovererTM 2.1、结构剖析软件Mass Frontier、及人类代谢组学数据库(Human Metabolome Database,HMDB)等谱库辅助检索等方法对差异内源性代谢物进行鉴定，最终通过与标准品比对确证化合物结构。

利用SPSS软件(version 22.0,SPSS,Chicago,Illinois)，通过逐步回归分析，筛选出具有显著影响的因子作为自变量，建立最优回归方程，找出用于区分胶质瘤患者和正常人群的潜在生物标志物，结合Logistic回归和受试者工作特征(Receiver OperatorCharacteristic，ROC)曲线分析评价潜在生物标志物在训练集和测试集中的诊断准确性、敏感度和特异性。通过ROC曲线分析计算尤登指数最大值时所取的坐标值为Cut-off值，对测试集样本进行预测，评价代谢标志物群对胶质瘤的预测能力。

三、实验结果

通过主成分分析(PCA)和构建OPLS-DA模型(如图1～3，图1～3中的A代表训练集，B代表验证集)可以看出，在训练集和测试集中，胶质瘤组(Glioma，G)和正常对照组(Normal，H)均能明显分开，各自聚集，表明胶质瘤患者和健康人群的代谢谱具有明显差异。PCA图中QC样本聚集较好，反映出本研究采用的仪器和方法具有良好的稳定性和重复性。OPLS-DA的模型评价参数表明模型具有良好的解释能力和预测能力，采用响应排序检验(RPT)方法经过200次建模进行置换验证，证实模型稳定可靠，无过拟合现象。

以VIP>1.5且p<0.05为标准筛选出差异代谢物，进一步经SPSS逐步回归分析筛选得到4个代谢标志物，分别为：亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱，结果见表1。与正常组相比，上述4个代谢标志物在胶质瘤患者血浆中的表达水平均显著下调，变化倍数在0.5-0.8倍之间，可以作为胶质瘤潜在诊断标志物。

表1胶质瘤患者血浆代谢标志物

进一步通过绘制ROC曲线检验上述四种代谢标志物对胶质瘤的诊断准确率。结果显示：在训练集中，亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱单个用于胶质瘤诊断时，ROC曲线下面积(AUC)分别为0.797、0.809、0.804和0.776，四个标志物联合用于诊断时，AUC达0.959(灵敏度88.0％，特异性93.5％)；在测试集中，亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱单个用于胶质瘤诊断时，ROC曲线下面积(AUC)分别为0.748、0.873、0.788和0.712，四个标志物联合用于诊断时，AUC达0.968(灵敏度95.6％，特异性86.0％)。结果如图4～5所示。

本领域技术人员知道，ROC曲线评价方法中，ROC曲线下的面积值AUC在大于0.5的情况下，越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。经验证，亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱单个用于胶质瘤诊断时，AUC在0.8左右，只具有一定准确性；四个联合应用时，AUC高达0.96左右，诊断准确度高。

在训练集中，亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱四个代谢标志物组合联合诊断时，基于最佳灵敏度和特异性，得到最优临界值(Cut-offvalue)为0.444。运用该临界值进行样本预测，结果显示：此四种代谢物组成的代谢标志物组对训练集的预测准确率为90.6％，对测试集的预测准确率为90.5％。结果如图6～7所示。

综上可见，亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱可以联合用于诊断胶质瘤，诊断准确度高。本领域技术人员可以将其开发成胶质瘤早期诊断试剂盒，该试剂盒中含有亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱这四种化合物的标准品，用于检测待测样本中的亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱。该试剂盒还可以含有2-氯-L-苯丙氨酸的标准品用作检测内标。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (4)

1.一组用于诊断胶质瘤的代谢标志物，其特征在于：由亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱组成。

2.权利要求1所述的代谢标志物在制备胶质瘤诊断试剂盒方面的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述试剂盒中含有亚甲基-L-谷氨酸、烯丙基半胱氨酸、癸酰基-L-肉碱和月桂酰-L-肉碱的标准品。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述试剂盒中还含有2-氯-L-苯丙氨酸的标准品。

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