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CN109298180A - 一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法 - Google Patents

一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法 Download PDF

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CN109298180A
CN109298180A CN201811377217.9A CN201811377217A CN109298180A CN 109298180 A CN109298180 A CN 109298180A CN 201811377217 A CN201811377217 A CN 201811377217A CN 109298180 A CN109298180 A CN 109298180A
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carboxymethyl chitosan
aptamers
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肖稳
易洁灿
伍翩
何雅媛
陈翠梅
李晶
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Hunan Province Food Quality Supervision Inspection Research Institute
Central South University
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Hunan Province Food Quality Supervision Inspection Research Institute
Central South University
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Abstract

本发明公开了一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，包括下述的步骤：使羧甲基壳聚糖与鼠伤寒沙门氏菌的特异性适配体序列结合，形成羧甲基壳聚糖‑适配体复合物，所述特异性适配体序列一端用氨基修饰；将羧甲基壳聚糖‑适配体复合物加入到金纳米溶液中，复合物吸附在金纳米表面，得到羧甲基壳聚糖‑适配体‑金纳米材料；将待测样品与羧甲基壳聚糖‑适配体‑金纳米材料混合，定性检测或采用紫外可见分光光度法定量检测鼠伤寒沙门氏菌。本发明所用原料成本低，来源广泛，并且提高了入胞效率，不用提取鼠伤寒沙门氏菌的DNA，可直接对细菌本身进行检测，缩短了检测时间，是一种快速，经济，便捷的检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。

Description

一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种特异性生物传感器用于检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。
背景技术
鼠伤寒沙门氏菌是一种革兰阴性厌氧菌，广泛存在于自然环境中，可通过受污染的家禽、鸡蛋、牛奶、鱼和肉制品感染人类，几乎所有的血清型感染人类后均可能寄生在人体或动物的肠道内。传统的检测方法是食品样品分布增菌法，包括预增菌，选择性增菌，分离培养和生化血清学鉴定等步骤。该方法得到的结果准确，但耗时较长，一般需要4-7天才可得到明确结果，其他方法如依靠抗原抗体反应的ELISA法，反应时易受pH，温度等环境影响，且抗原抗体合成价格昂贵。
羧甲基壳聚糖是壳聚糖的衍生物，它在壳聚糖的基础上对其进行改性，羧甲基在羟基或者氨基上发生取代，通过改变制备条件，根据取代基的不同位置可以形成O-羧甲基壳聚糖，N-羧甲基壳聚糖或者O,N-羧甲基壳聚糖。羧甲基壳聚糖是一种羧酸钠盐，因而具有水溶性，且又引入了羧甲基，改变了壳聚糖本身的结构，从而使其水溶性加强。羧甲基壳聚糖具有稳定的性质，抗菌抗感染性强，多年来在化工，医药，环保等方面有许多应用。
金纳米是粒径一般为15nm以下的微颗粒。金纳米结构稳定，粒径尺寸小，可与许多生物大分子结合，且结合后不会改变其生物活性，可用于人体内药物治疗，是一种广泛应用于各个领域的具有良好光学、电化学特性的物质。
适配体是通过SELEX技术筛选出的对靶标具有高特异性和高亲和力的寡核苷酸序列。适配体具有多方面的优点，如易于合成，稳定性高，重复性好，价格低廉，且适配体靶标广泛，与细胞，病毒，毒素，蛋白质和维生素等均可特异性结合。由于适配体的这些优点，近年来，适配体的应用范围越来越广。在检测方面，由于适配体可与多种细菌，毒素等共轭形成复合物，从而实现对其的检测，这是一种快速便捷的检测手段，并且具有良好的灵敏度和选择性，与传统的检测方法相比，检测周期短，过程简单。
由于适配体对目标菌具有特异性，可进行靶向检测，金纳米在盐溶液下产生颜色变化的特性，适配体技术结合金纳米进行可视化检测成为可能，但适配体本身是寡核苷酸，难以跨越表面负电荷的细胞膜，入胞率很低，现有方法是提取鼠伤寒沙门氏菌的DNA，再对其进行检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种快速、灵敏、成本低廉，且可以解决入胞率过低的可视化检测鼠伤寒沙门氏菌的方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，包括下述的步骤：
使羧甲基壳聚糖与鼠伤寒沙门氏菌的特异性适配体序列结合，形成羧甲基壳聚糖-适配体复合物，所述特异性适配体序列一端用氨基修饰；
将羧甲基壳聚糖-适配体复合物加入到金纳米溶液中，复合物吸附在金纳米表面，得到羧甲基壳聚糖-适配体-金纳米材料；
将待测样品与羧甲基壳聚糖-适配体-金纳米材料混合，定性检测或采用紫外可见分光光度法定量检测鼠伤寒沙门氏菌。
进一步的，所述羧甲基壳聚糖为O,N-羧甲基壳聚糖。
进一步的，所述特异性适配体序列为交联环状结构。特异性适配体核苷酸序列为NH2-GCGCTCGGCCTCCTCTGCCATCTCATTCGCGAGCGC。
进一步的，羧甲基壳聚糖与适配体的质量比为3～5:1。
进一步的，在羧甲基壳聚糖与特异性适配体序列结合前，先将羧甲基壳聚糖进行下述处理使羧基活化：加入N-羟基琥珀酰亚胺进行第一步反应，然后搅拌下加入1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺，进行第二步反应。第二步反应在冰水浴下进行。
进一步的，羧甲基壳聚糖、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺，三者的质量比为0.28～0.32:0.15～0.18:0.24～0.28。
进一步的，羧甲基壳聚糖-适配体复合物加入金纳米溶液后孵育20～35h。
进一步的，待测样品与羧甲基壳聚糖-适配体-金纳米材料混合后孵育20～30min，然后加入无机盐使金纳米颗粒团聚。
本发明是基于以下技术原理，如图1所示：特异性的鼠伤寒沙门氏菌的适配体序列能特异性识别鼠伤寒沙门氏菌并与其稳定结合。而金纳米颗粒可通过静电作用与适配体结合，形成能特异性检测鼠伤寒沙门氏菌的靶向复合物。
将羧甲基壳聚糖与该复合物结合的原因在于：仅适配体与金纳米颗粒形成的复合物的表面为负电荷，难以跨越表面负电荷的细胞膜，易被核酸酶降解，所以本身不能进入细胞，需要理想的转运载体携带进入细胞。因此用正电荷的羧甲基壳聚糖-适配体复合物和负电荷的金纳米解决入胞效率低的问题。选用的羧甲基壳聚糖上有大量羧基和氨基，其羧基和氨基修饰的适配体结合，适配体再由静电作用和金纳米结合，整个材料因羧甲基壳聚糖上的氨基而带正电，可以提高材料的入胞效率，实现不用提取DNA，可直接对菌液进行检测。
与现有技术相比，本发明的优点：
1.本发明首次使用羧甲基壳聚糖为载体，结合鼠伤寒沙门氏菌特异性适配体，以金纳米溶液为可视化指标，设计的生物传感器型检测体系集高效率、检测时间短，成本低等诸多优点于一身，同时具有高特异性和检测结果可视化的优势，可通过肉眼直接定性观察检测结果，能够专一地对鼠伤寒沙门氏菌进行检测，并且缩减了样品前处理工序，可直接对菌液进行检测。
2.本发明采用羧甲基壳聚糖作为转运载体，利用其表面电荷，携带适配体-金纳米复合物进入细胞，解决入胞效率低的问题，从而达到不用提取DNA，可直接对鼠伤寒沙门氏菌的菌液进行检测。
3.本发明使用的金纳米溶液在高盐溶液中颜色发生变化的性质，使检测结果具有可视性。选用的特异性适配体，来源广，成本低，很大程度上提升了该法的经济效益，能特异性识别鼠伤寒沙门氏菌，可对鼠伤寒沙门氏菌进行定量检测。
综上，本发明所用原料成本低，来源广泛，并且提高了入胞效率，不用提取鼠伤寒沙门氏菌的DNA，可直接对细菌本身进行检测，缩短了检测时间，是一种快速，经济，便捷的检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，可广泛用于食品中鼠伤寒沙门氏菌的检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的羧甲基壳聚糖、适配体及金纳米的反应原理图；
图2是实施例2中在不同孵育时间下反应体系对鼠伤寒沙门氏菌的检测效果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
图1是本发明的羧甲基壳聚糖、适配体及金纳米的反应原理图。本发明所用的鼠伤寒沙门氏菌的特异性适配体序列，可以商购得到。在其一端用氨基修饰，以便与壳聚糖的羧基反应结合。优选为交联环状结构，适配体更稳定。下述实施例所用特异性适配体核苷酸序列为NH2-GCGCTCGGCCTCCTCTGCCATCTCATTCGCGAGCGC。
本发明所用羧甲基壳聚糖优选为O,N-羧甲基壳聚糖。与O-羧甲基壳聚糖和N-羧甲基壳聚糖相比，O,N-羧甲基壳聚糖的羧甲基在-OH和-NH上均发生取代，能够引入更多的羧甲基，便于与氨基修饰的适配体较好的结合，且由于羧甲基的引入，提高了羧甲基壳聚糖的水溶性。
在羧甲基壳聚糖与特异性适配体序列结合前，先将羧甲基壳聚糖进行下述处理使羧基活化，其机理为：EDC中的-NH2与羧甲基发生酸碱中和反应，羧甲基中的羟基失去氢离子，成为活化状态，NHS通常和EDC联用，可用于提高反应效率。
实施例1：
本实施例的检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，具体包括以下步骤：
(1)制备金纳米溶液：吸取1％氯金酸1.65ml于250ml锥形瓶中，加入38.35ml水，将锥形瓶置于磁力加热搅拌器上进行避光回流(锥形瓶上接冷凝管)，锥形瓶中放入搅拌子，同时磁力搅拌，待溶液沸腾，立即加入6.4ml 38.8mmol/L的柠檬酸三钠溶液，继续避光回流，加热搅拌，保持沸腾15min。移除热源，搅拌至冷却，得到酒红色的分散状态的纳米金溶液。用0.22μm针头式水溶性过滤器过滤金纳米溶液后，置于125mL棕色磨口试剂瓶中，铝箔纸包裹，避光4℃保存备用。
(2)制备羧甲基壳聚糖-适配体复合物：取羧甲基壳聚糖(购自BELLANCOM LIFESCIENCES DEP，100g/瓶)0.3g于50ml烧杯中，加入10ml去离子水，玻璃棒搅拌溶解得质量浓度为30mg/ml的羧甲基壳聚糖溶液。向上述溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.17g，搅拌15min，然后在2℃冰水浴搅拌器中，以800r/min搅拌下，缓慢滴入1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的水溶液(0.26g EDC在15ml离心管中，加入5ml去离子水溶解)。10min滴加完成后，仍在冰水浴下继续搅拌反应1h，使羧甲基壳聚糖的羧基充分活化。按羧甲基壳聚糖和适配体的质量比为4:1，加入鼠伤寒沙门氏菌的特异性适配体(购自生工生物工程(上海)股份有限公司，5’端有氨基修饰)至上述溶液中，处理1h。得到羧甲基壳聚糖-适配体复合物。
(3)制备羧甲基壳聚糖-适配体-金纳米材料：取1mL自制纳米金溶液于1.5mL EP管中，4℃、10000r/min离心10min，弃上清，重悬。向上述纳米金溶液中加入配好的羧甲基壳聚糖-适配体复合物100μL，混匀，置于37℃摇床中孵育30h。为除去可能过量的适配体，将上述混合液在4℃、10000r/min离心10min，弃上清，最终得到羧甲基壳聚糖-适配体-纳米金材料，4℃避光保存备用。
鼠伤寒沙门氏菌样品检测：
取9个1.5ml的EP管，加入配好的羧甲基壳聚糖-分子信标-金纳米复合物100μL，加入鼠伤寒沙门氏菌菌液，倍比稀释6个稀释度分别为1：10、1：102、1：103、1：104、1：105和1：106，(菌液浓度为10cfu/ml、102cfu/ml、103cfu/ml、104cfu/ml、105cfu/ml、106cfu/ml)于37℃孵育30min。
加入1.5mol/L的NaCl溶液使释放出的金纳米颗粒团聚，用紫外可见分光光度计检测最大吸收波长处的吸光度A值，绘制标准曲线，进行定量测定。
实施例2：
本实施例的检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，具体包括以下步骤：
(1)制备金纳米溶液：吸取1％氯金酸1.65ml于250ml锥形瓶中，加入38.35ml水，将锥形瓶置于磁力加热搅拌器上进行避光回流(锥形瓶上接冷凝管)，锥形瓶中放入搅拌子，同时磁力搅拌，待溶液沸腾，立即加入6.4ml 38.8mmol/L的柠檬酸三钠溶液，继续避光回流，加热搅拌，保持沸腾15min。移除热源，搅拌至冷却，得到酒红色的分散状态的纳米金溶液。用0.22μm针头式水溶性过滤器过滤金纳米溶液后，置于125mL棕色磨口试剂瓶中，铝箔纸包裹，避光4℃保存备用。
(2)制备羧甲基壳聚糖-适配体复合物：取羧甲基壳聚糖(购自BELLANCOM LIFESCIENCES DEP，100g/瓶)0.3g于50ml烧杯中，加入10ml去离子水，玻璃棒搅拌溶解得质量浓度为30mg/ml的羧甲基壳聚糖溶液。向上述溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.17g，搅拌15min，然后在2℃冰水浴搅拌器中，以800r/min搅拌下，缓慢滴入1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的水溶液(0.26g EDC在15ml离心管中，加入5ml去离子水溶解)。10min滴加完成后，仍在冰水浴下继续搅拌反应1h，使羧甲基壳聚糖的羧基充分活化。按羧甲基壳聚糖和适配体的质量比为4:1，加入鼠伤寒沙门氏菌的特异性适配体(购自生工生物工程(上海)股份有限公司，5’端有氨基修饰)至上述溶液中，处理1h。得到羧甲基壳聚糖-适配体复合物。
(3)制备羧甲基壳聚糖-适配体-金纳米材料：取1mL自制纳米金溶液于1.5mL EP管中，4℃、10000r/min离心10min，弃上清，重悬。向上述纳米金溶液中加入配好的羧甲基壳聚糖-适配体复合物100μL，混匀，置于37℃摇床中分别孵育12h、18h、24h、30h、36h和42h。为除去可能过量的适配体，将上述混合液在4℃、10000r/min离心10min，弃上清，最终得到羧甲基壳聚糖-适配体-纳米金材料，4℃避光保存备用。
鼠伤寒沙门氏菌样品检测：
取9个1.5ml的EP管，加入配好的羧甲基壳聚糖-分子信标-金纳米复合物100μL，加入鼠伤寒沙门氏菌菌液，倍比稀释6个稀释度分别为1：10、1：102、1：103、1：104、1：105和1：106，于37℃孵育30min。
加入1.5mol/L的NaCl溶液使释放出的金纳米颗粒团聚，用紫外可见分光光度计检测最大吸收波长处的吸光度A值，绘制标准曲线，进行定量测定。
本实施例得到的反应体系对鼠伤寒沙门氏菌DNA序列的检测效果如图2所示，由图可知，当孵育时间为30h时，检测效果最佳。
实施例3：
本实施例的检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，具体包括以下步骤：
(1)制备金纳米溶液：吸取1％氯金酸1.65ml于250ml锥形瓶中，加入38.35ml水，将锥形瓶置于磁力加热搅拌器上进行避光回流(锥形瓶上接冷凝管)，锥形瓶中放入搅拌子，同时磁力搅拌，待溶液沸腾，立即加入6.4ml 38.8mmol/L的柠檬酸三钠溶液，继续避光回流，加热搅拌，保持沸腾15min。移除热源，搅拌至冷却，得到酒红色的分散状态的纳米金溶液。用0.22μm针头式水溶性过滤器过滤金纳米溶液后，置于125mL棕色磨口试剂瓶中，铝箔纸包裹，避光4℃保存备用。
(2)制备羧甲基壳聚糖-适配体复合物：取羧甲基壳聚糖(购自BELLANCOM LIFESCIENCES DEP，100g/瓶)0.3g于50ml烧杯中，加入10ml去离子水，玻璃棒搅拌溶解得质量浓度为30mg/ml的羧甲基壳聚糖溶液。向上述溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)0.17g，搅拌15min，然后在2℃冰水浴搅拌器中，以800r/min搅拌下，缓慢滴入1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的水溶液(0.26g EDC在15ml离心管中，加入5ml去离子水溶解)。10min滴加完成后，仍在冰水浴下继续搅拌反应1h，使羧甲基壳聚糖的羧基充分活化。按羧甲基壳聚糖和适配体的质量比为4:1，加入鼠伤寒沙门氏菌的特异性适配体(购自生工生物工程(上海)股份有限公司，5’端有氨基修饰)至上述溶液中，处理1h。得到羧甲基壳聚糖-适配体复合物。
(3)制备羧甲基壳聚糖-适配体-金纳米材料：取1mL自制纳米金溶液于1.5mL EP管中，4℃、10000r/min离心10min，弃上清，重悬。向上述纳米金溶液中加入配好的羧甲基壳聚糖-适配体复合物100μL，混匀，置于37℃摇床中孵育30h。为除去可能过量的适配体，将上述混合液在4℃、10000r/min离心10min，弃上清，最终得到羧甲基壳聚糖-适配体-纳米金材料，4℃避光保存备用。
鼠伤寒沙门氏菌样品检测：
取9个1.5ml的EP管，加入配好的羧甲基壳聚糖-分子信标-金纳米复合物100μL，加入鼠伤寒沙门氏菌菌液，倍比稀释6个稀释度分别为1：10、1：102、1：103、1：104、1：105和1：106，于37℃孵育30min。
加入1.5mol/L的NaCl溶液使释放出的金纳米颗粒团聚，用紫外可见分光光度计检测最大吸收波长处的吸光度A值，绘制标准曲线，进行定量测定。
上述只是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应落在本发明技术方案保护的范围内。

Claims (10)

1.一种检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，其特征在于，包括下述的步骤：
使羧甲基壳聚糖与鼠伤寒沙门氏菌的特异性适配体序列结合，形成羧甲基壳聚糖-适配体复合物，所述特异性适配体序列一端用氨基修饰；
将羧甲基壳聚糖-适配体复合物加入到金纳米溶液中，复合物吸附在金纳米表面，得到羧甲基壳聚糖-适配体-金纳米材料；
将待测样品与羧甲基壳聚糖-适配体-金纳米材料混合，定性检测或采用紫外可见分光光度法定量检测鼠伤寒沙门氏菌。
2.根据权利要求1所述的检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，其特征在于，所述羧甲基壳聚糖为O,N-羧甲基壳聚糖。
3.根据权利要求1所述的检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，其特征在于，所述特异性适配体序列为交联环状结构。
4.根据权利要求1～3之一所述的检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，其特征在于，特异性适配体核苷酸序列为NH2-GCGCTCGGCCTCCTCTGCCATCTCATTCGCGAGCGC。
5.根据权利要求1所述的检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，其特征在于，羧甲基壳聚糖与适配体的质量比为3～5:1。
6.根据权利要求1、2或5所述的检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，其特征在于，在羧甲基壳聚糖与特异性适配体序列结合前，先将羧甲基壳聚糖进行下述处理使羧基活化：加入N-羟基琥珀酰亚胺进行第一步反应，然后搅拌下加入1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺，进行第二步反应。
7.根据权利要求6所述的检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，其特征在于，第二步反应在冰水浴下进行。
8.根据权利要求6所述的检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，其特征在于，羧甲基壳聚糖、N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺，三者的质量比为0.28～0.32:0.15～0.18:0.24～0.28。
9.根据权利要求1～3之一所述的检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，其特征在于，羧甲基壳聚糖-适配体复合物加入金纳米溶液后孵育20～35h。
10.根据权利要求1～3之一所述的检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，其特征在于，待测样品与羧甲基壳聚糖-适配体-金纳米材料混合后孵育20～30min，然后加入无机盐使金纳米颗粒团聚。
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