CN109295094A

CN109295094A - 人源趋化因子MIP-1α或SDF-1α在真核细胞中的重组表达方法

Info

Publication number: CN109295094A
Application number: CN201811034129.9A
Authority: CN
Inventors: 周志诚; 柴梦莹
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-09-05
Filing date: 2018-09-05
Publication date: 2019-02-01

Abstract

本发明公开了一种人源趋化因子MIP‑1α或SDF‑1α在真核细胞中的重组表达方法，该方法利用载体质粒pSFV2作为携带编码MIP‑1α或SDF‑1α的外源基因的载体，与包装质粒pHelper转染真核细胞后，使得外源基因表达的目的蛋白能够被修饰而具有生物活性，且采用该方法表达纯化出的目的蛋白纯度高、收率大、生理和药理活性强。

Description

人源趋化因子MIP-1α或SDF-1α在真核细胞中的重组表达方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体而言，涉及一种人源趋化因子MIP-1α或SDF-1α在真核细胞中的重组表达方法。

背景技术

目前，具有生物活性的蛋白对真核细胞，尤其是在生物医药方面以及在人类生命系统中都具有重要的生理意义。由于，现有原核细胞表达系统不具备蛋白质合成后翻译和修饰的能力，且低等真核生物的蛋白翻译和修饰系统与高等真核生物的蛋白翻译和修饰系统具有很大的差异，因此，原核生物，如细菌，病毒等无法表达出经修饰后的蛋白质如特殊的糖基修饰等具有生物活性的真核蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人源趋化因子MIP-1α或SDF-1α在真核细胞中的重组表达方法，该方法能够有效地表达出具有生物活性的蛋白。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

一种人源趋化因子MIP-1α或SDF-1α在真核细胞中的重组表达方法，其包括：

将编码MIP-1α或SDF-1α的外源基因连接至载体质粒，再将载体质粒和包装质粒转染包装细胞，培养转染后的包装细胞，得到病毒载体，载体质粒为pSFV2，包装质粒为pHelper，外源基因的终止子后还连接有特异性标签，特异性标签用于编码至少一个特异性标签双连续重复多肽；

将病毒载体转染到宿主细胞中，经培养后，收集上清液，宿主细胞为真核细胞；以及

离心、纯化上清液，得到外源基因表达的具有生物活性的目的蛋白。

本发明提供的编码MIP-1α或SDF-1α在真核细胞中的重组表达方法的有益效果是：通过采用携带编码MIP-1α或SDF-1α的外源基因的pSFV2载体质粒和pHelper包装质粒共转染包装细胞，进行包装后，得到携带外源基因的病毒载体，再将得到病毒载体转染真核宿主细胞进行重组表达。通过该方法，使得外源基因在真核宿主细胞表达出的目的蛋白经过了真核生物的蛋白翻译和修饰系统而具有生物活性；此外，由于外源基因的终止子后还连接的特异性标签能够编码至少一个特异性标签双连续重复多肽，这种特异性标签双连续重复多肽与高效离子交换树脂之间的亲和性更强，使得所制备的MIP-1α或SDF-1α纯度更高、且收率大，生物活性强。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1的载体质粒pSFV2的图谱；

图2为本发明实施例1的包装质粒pHelper的图谱；

图3为本发明实施例1的MIP-1α和SDF-1a蛋白以考马斯亮蓝染色溶液进行显色的凝胶电泳图；

图4为本发明实施例1提供的MIP-1α对CCR5嗜性亚型艾滋病病毒的抑制能力；

图5是本发明实施例1提供的MIP-1α与HEK-CCR5细胞上的CCR5结合的饱和曲线；

图6是采用本发明实施例1提供的方法所获得的SDF-1α对艾滋病CXCR4嗜性亚型病毒株的抑制曲线；

图7是采用本发明实施例1提供的方法所获得的SDF-1α与A3-01T淋巴细胞上的CXCR4结合的饱和曲线；

图8是为实验例4中的重组表达的SDF-1α趋化实验模型图；

图9为实验例4中重组表达的SDF-1α对淋巴细胞趋化迁移数量的影响图；

图10是为实验例5中的重组表达的MIP-1α趋化实验模型图；

图11为实验例5中重组表达的MIP-1α对淋巴细胞趋化迁移数量的影响图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的生物活性蛋白在真核细胞中的重组表达方法进行具体说明。

一种人源趋化因子MIP-1α或SDF-1α在真核细胞中的重组表达方法，其包括如下步骤。

步骤S1：制备病毒载体

将编码MIP-1α或SDF-1α的外源基因连接至载体质粒，再将载体质粒和包装质粒转染包装细胞，培养转染后的包装细胞，得到病毒载体。

其中，较佳地，用于包装的包装细胞与后续步骤中的宿主细胞为同一类细胞。

其中，载体质粒为pSFV2，其结构如图1所示；包装质粒为pHelper，其结构如图2所示。

具体地，用限制性内切酶对载体质粒和包装质粒进行酶切处理，形成线性DNA，再将线性DNA经转录得到RNA，将RNA转染包装细胞，经培养后，得到携带编码MIP-1α或SDF-1α的外源基因的病毒载体。

其中，较佳地，限制性内切酶为SapI，这种内切酶能够更有效的进行酶切，使得被酶切的插入基因片段和pSFV2载体的粘性末端更好的黏连。

现有的蛋白纯化方法由于因为缺乏特异性标记，导致在蛋白纯化的过程中无法达到生物医学和药物水平的功能性纯度或者生理活性，因此，为了提高外源基因表达出的目的蛋白(MIP-1α或SDF-1α)在后续纯化过程中的纯度。因此，需要在目的蛋白(MIP-1α或SDF-1α)的C端融合有特异性标签多肽用于纯化和分离。

目的蛋白的C端融合一个特异性标签双连续重复多肽(下文也称为特异性标签多肽)，即Twin-Strep-tag，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该标签是由两个链霉素标签(即中国专利CN105861557中的Strep tag-1与Strep-tag II)缩合后形成的对比中国专利CN105861557氨基酸残基更少，空间体积更小的多肽。相比于同时用Strep tag-1和Strep-tag II作为标签多肽，用Twin-Strep-tag作为特异性标签多肽，其与后续纯化步骤中的离子交换树脂的亲和性更高，能够特异性地结合在具有双倍体积的离子交换树脂上，进而有利于进一步提高纯化蛋白的纯度和产量。

因此，相应地，在本步骤中，在编码MIP-1α或SDF-1α的外源基因的终止子后紧邻羟基末端再连接特异性标签。该特异性标签(命名为tag)用于编码上述特异性标签多肽Twin-Strep-tag，tag的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

需要说明的是，目的蛋白的C端融合的特异性标签蛋白的数量可以根据目的蛋白的分子量进行增加，目的蛋白的分子量越大，其融合的特异性标签蛋白的数量越多。例如两个或四个(以2的倍数)等，得到的融合蛋白与后续步骤中的离子交换树脂的亲和性就越高(但是由于空间结构的原因，其亲和性和结合能力不能随着链霉素标签蛋白(twin-strep-tag)无限增长。

步骤S2：转染宿主细胞

将上述病毒载体转染到宿主细胞中，宿主细胞经培养后，外源基因表达的目的蛋白(MIP-1α或SDF-1α)分泌到宿主细胞外的培养液中，收集上清液即可。当然，在转染前，需要对病毒载体进行失活处理。

其中，较佳地，宿主细胞为真核细胞。

其中，更佳地，真核细胞为哺乳动物细胞。

具体地，哺乳动物细胞为幼仓鼠肾细胞(BHK-21)，且BHK-21细胞具有无限增殖的能力。

采用BHK-21细胞作为外源基因表达的宿主细胞能够克服现有的原核生物表达系统不具备蛋白质合成后翻译和修饰的缺点，且外源基因在BHK-21细胞中能够表达出高纯度、高特异性的目的蛋白，去满足不断提高的生物医学研究和药物研发需求。

步骤S3：离心、纯化上清液

对得到的上清液进行离心、纯化处理，得到目的蛋白(MIP-1α或SDF-1α)，具有较强的生理和药理活性。

具体地，较佳地，利用具有与特异性标签多肽高亲和性的离子交换树脂对目的蛋白进行纯化，获得的目的蛋白的纯度高，其能够用作各类生物、医学、药学临床和基础研究(如药物筛选、中和性抗体筛选、分子标记定位、蛋白标准品制备等)。

步骤S4：蛋白的定量检测

现有的蛋白定量检测的方法(如BCA，双尿酸滴定法等)需要对待检测的蛋白变性才能定量检测。而且采用现有的蛋白定量检测方法的总蛋白的含量无法直接反应蛋白的纯度，也无法确认蛋白的正确表达、表达状态以及多聚体的形成，无法对纯化产品实现最客观的数量和质量控制。

为解决上述缺点，在本发明中，将得到的目的蛋白进行垂直非变性凝胶电泳和考马斯亮蓝染色标记方式来定量所获得的目的蛋白。

具体地，将电泳后的凝胶置于考马斯亮蓝染色液中浸泡14～16小时，进行显色。

具体地，将蛋白Marker、已知浓度的bovine serum albumin(BSA)小牛血清白蛋白(购自Thermofischer，具有不同浓度的系列，用于绘制标准曲线)、以及待定量的目的蛋白在同一凝胶上进行垂直非变性凝胶电泳。电泳完成后，将凝胶浸泡在考马斯亮蓝染色液中14～16小时，进行显色。然后，根据目的蛋白在凝胶上的条带的颜色深浅强度和已知浓度的BSA蛋白条带的颜色深浅强度对比，通过成像仪分析，便可得到目的蛋白的浓度，实现蛋白的非变性定量检测。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种表达纯化人源趋化因子MIP-1α和SDF-1α的基因重组方法：

第一步，制备携带外源基因即编码MIP-1α基因的病毒载体，MIP-1α基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，MIP-1α基因编码MIP-1α蛋白。

需要说明的是，为了提高在后续纯化步骤中，确保MIP-1α蛋白的纯化度较高，在本实施例中，在MIP-1α蛋白的C端融合特异性标签蛋白(Twin-Strep-tag)。该Twin-Strep-tag能够与后续纯化步骤中的离子交换树脂具有高亲和性以及高特异性结合的特性，利用该特性可将目的蛋白进行高纯度的纯化。因此，在MIP-1α基因的终止子后需要连接特异性标签(tag，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，该特异性标签编码Twin-Strep-tag)，得到DNA片段MIP-1α-tag。MIP-1α-tag片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

首先，构建重组载体质粒pSFV2-MIP-1α-tag。

往含有纯化的载体质粒pSFV2的管中，加入限制性内切酶BssHII和XmaI，置于37℃酶切4小时，酶切产物1％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收得到大片段(pSFV2经双酶切后带有黏性末端的线性片段)。

制备带有BssHII和XmaI酶切位点的MIP-1α-tag片段。根据MIP-1α基因的序列，设计分别带有BssHII酶切位点的正向引物，以及带有tag序列和XmaI酶切位点的反向引物。以MIP-1α基因序列为模板进行PCR扩增得到MIP-1α基因的终止子后连接有tag的DNA片段，即MIP-1α-tag片段，再用BssHII和XmaI双酶切对PCR扩增产物MIP-1α-tag片段双酶切。酶切后的产物用1％琼脂糖凝胶电泳，然后切胶回收小片段(经双酶切带有黏性末端的MIP-1α-tag片段)。当然，含有酶切位点的MIP-1α-tag片段也可通过基因合成的方法直接合成，然后经双酶切后连接到pSFV2上。

大片段和小片段按1:3用T4DNA连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌E.coli感受态例如Life Technologies公司的TOP10，Agilents公司的XL-10，例如，再经过氨苄霉素抗性筛选(氨苄霉素购自Interchim)，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行限制性内切酶BssHII和XmaI双酶切鉴定，通过DNA测序确定得到重组载体质粒pSFV2-MIP-1α-tag。

其次，重组载体质粒pSFV2-MIP-1α-tag和包装质粒pHelper共转染包装细胞。

往含有pSFV2-MIP-1α-tag和pHelper的管中，加入限制性内切酶SapI进行单酶切，环形的pSFV2-MIP-1α-tag和pHelper被SapI单酶切形成线性DNA，按照mMESSAGESP6Transcription Kit转录试剂盒的操作说明书操作，以该得到的线性DNA为模板，进行转录。其中，反应体系中的各成分体积比如下，线性DNA模板:转录酶:反应缓冲液(Reaction Buffer):100mM dNTP为3:1:5:1，得到线性的RNA。

接着，包装病毒颗粒，得到病毒载体。

将包装细胞即BHK-21细胞(具有“不死性”，也就是具有无限增殖能力)接种在GMEM培养基中，置于37℃、5％CO₂条件下增殖培养。该GMEM培养基，每500mL含有2％的1M HEPES缓冲液、1％的(购自Life Technologies)的100X penicillin/streptomycin以及2.5％的小牛血清。培养结束后，经消化、离心后，获得BHK-21细胞悬浮液，再用PBS缓冲液稀释，得到每800μL含有10*106个BHK-21细胞的悬浮液。往该悬浮液中加入RNA，按Gene PulserXcellElectroporation Systems仪器(Biorad的电转仪)的操作说明书进行电转染操作，把体外转录RNA转入到BHK-21细胞中，设定参数电压800V、电阻30Us、电流4mA。

将电转染后的悬浮液接种至新鲜的GMEM培养基中进行病毒颗粒的包装，置于37℃、5％CO₂条件下共培养30h。共培养结束后，将共培养液转入SW32Ti离心管(购自BeckmanCoulter公司)，于28000rpm、4℃条件下离心2小时，弃上清，保留沉淀，该沉淀即为包装后的病毒颗粒，往管中加入4℃冰浴后的Tris-NaCl-EDTA溶液重悬沉淀，得到病毒悬浮液，然后于4℃条件下静置2小时，再次重悬，该病毒悬浮液于-80℃保存。

第二步，病毒载体转染宿主细胞

将宿主细胞即BHK-21细胞接种在GMEM培养基中，置于37℃、5％CO₂条件下增殖培养直至细胞汇合度为80％左右，然后去掉上清。该GMEM培养基，每500mL含有10mL 1M HEPES缓冲液、1％的100X penicillin/streptomycin以及2.5％的小牛血清。

取出-80℃保存的病毒悬浮液，加入胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin，购自Bohenringer Mammhem)和按体积比2:1的比例加入50mM无菌CaCl₂溶液，常温下激活病毒30分钟。接着加入抑肽酶(aprotinin，购自Sigma公司)，根据其说明书上建议的Ki抑制浓度对病毒进行失活处理。

往去掉上清的增殖培养后的宿主细胞中加入8mL 2％GMEM培养基(含经失活处理后的病毒)，置于37℃，培养1小时；然后再加入等量的2％GMEM培养基，置于37℃，培养1小时；然后去掉上清。用0％GMEM培养基清洗细胞两次；然后再加入30mL不含小牛血清的GMEM培养基，置于37℃，培养28-30小时。外源基因片段(MIP-1α-tag)随着宿主细胞的增殖，稳定地表达融合蛋白即MIP-1α蛋白-Twin-Strep-tag，并分泌到上清液中，得到蛋白上清液。需要说明的是，该特异性标签蛋白即Twin-Strep-tag并不影响MIP-1α蛋白的生物活性。

第三步，收集蛋白上清液并纯化目的蛋白

培养结束后，收集蛋白上清液。将蛋白上清液转入50mL的5kDa cut-off离心管和50kDa cut-off离心管(小于5kDa、大于50kDa的蛋白将被滤出，本实施例的融合蛋白即MIP-1α-twin-Strep-tag的分子量等于10kDa，所以能够被截留，最后能把蛋白液浓缩并收集)，于4500rpm、4℃条件下离心45分钟，重复离心4次，直至蛋白上清液剩下0.5mL。其中，前3次离心过程中，每次离心结束后，清洗去掉离心管下方收集管的滤液，然后用4℃保存冷冻PBS缓冲液进行等量补充，即加入的PBS缓冲液与剩余的蛋白上清液等体积混合，且该PBS缓冲液中加入有体积比为1:100的1mg/ml的抗生物素蛋白(Avidin)和1:10的1M氯化钠NaCl。

需要说明的是，因为细胞分泌液和含有细胞培养基上清液产生的大量生物素会非特异结合后续步骤中的高效离子交换树脂严重降低融合twin-Strep-tag的MIP-1α蛋白的纯化过程。抗生物素蛋白(已含在洗脱液里)可用于结合并抑制细胞上清分泌出的生物素，有助于提高MIP-1α-twin-Strep-tag蛋白的纯化度。

离心后，剩余的0.5mL蛋白上清液用Gravity flow column离子交换树脂柱(购自IBA公司)进行过柱纯化，过柱方法按其说明书进行；在滤过蛋白上清液后，用2ml 1X清洗缓冲液(Wash Buffer，购自IBA公司)清洗离子交换树脂柱，重复5次；清洗结束后，使用5～10ml的1X洗脱液(Elution Buffer with Biotin购自IBA公司)将目的蛋白从离子交换树脂柱上滤出，得到蛋白滤出液。

需要说明的是，该过柱纯化操作利用了离子交换树脂柱Gravity flowcolumn与特异性标签蛋白的高亲和性以及高特异性结合，有效地过滤除去了蛋白上清液中的其他杂质蛋白，确保得到的蛋白滤出液含有的MIP-1α蛋白的纯度非常高，其纯度接近100％。对比IBA公司第二代Gravity flow Strep-TactinSupercolumn产品，本申请采用的是最新的第三代Gravity flowSuperflow column：其特点是具有适合连续的两个strep-tag链霉素标签与离子交换树脂柱高亲和结合的结合位点，可以使上述所表达的重组蛋白中的twin-strep-tag链霉素标签与离子交换树脂柱的亲和能力成倍的提高，且该离子交换柱的体积更大，理论上至少能提升4-10倍的亲和结合能力。

将得到的蛋白滤出液转入50mL的1kDa cut-off离心管(购自Vivaspin公司)，于4500rpm、4℃条件下离心10分钟，重复离心4次直至蛋白滤出液剩下0.2～0.4mL。其中，在前3次离心过程中，每次离心结束后，清洗去掉离心管下方收集管的滤液，然后用4℃保存冷冻PBS缓冲液进行等量补充，即加入的PBS缓冲液与离心管中剩余的蛋白滤出液等体积混合。离心结束后，得到浓缩蛋白滤出液。可于-80℃封装保存。该浓缩蛋白滤出液含有的MIP-1α重组蛋白纯度高，具有生物活性。

此外，本实施例还以SDF-1α为目的蛋白进行表达纯化，进一步说明本发明的特征和性能。表达纯化SDF-1α的原理和步骤同表达纯化MIP-1α，不同之处在于，在制备病毒载体步骤中，用SDF-1α基因替换MIP-1α基因即可，在SDF-1α基因的羟基末端也连接特异性标签tag基因片段，该tag基因片段编码Twin-Strep-tag。SDF-1α蛋白的基因的核苷酸序列如SEQID NO.5。按上述方法所得到的SDF-1α纯度非常高，且具有很强的生物活性和药理活性。

另外，在其他的实施例中，采用本发明生物活性蛋白在真核细胞中的表达方法还可以表达其他类型的艾滋病病毒膜蛋白例如R5型或X4型，或者其他类型的需要经过翻译后修饰后才有生物活性的蛋白，只需要将编码该类型蛋白的相应的外源基因按常规方法克隆至本发明的pSFV2病毒载体上，然后按本实施例提供的相应操作步骤进行，即可表达出高纯度的、具有生物活性的蛋白。

实验例1：

对MIP-1α和SDF-1的非变性定量检测

在该检测实例中对实施例1纯化所得的MIP-1α和SDF-1进行非变性定量检测，同时，以通过中国专利CN105861557提供的重组表达方法所表达的MIP-1α和SDF-1作为对照，即同时采用Strep-Tag1和Strep-Tag2为特异性标签多肽。对比以上专利，本实施例的方法在合成效率，合成时间，纯化水平，产品活性上有较大优势。

首先，采用18孔蛋白电泳凝胶(Criteron 18well)进行蛋白凝胶电泳，上样蛋白：待定量检测的含目的蛋白的浓缩蛋白滤出液、蛋白标记对照(Accuruler,PM-001X，购自Biopioneer、分子量为3.5～240kDa)、以及用于制作标准曲线参照的BSA蛋白(购自Thermofischer公司，BSA原液浓度2mg/mL，上样时稀释成0.5-10μg/μL的标准范围)，电泳参数：150V、1小时。

电泳结束，凝胶先用ddH20清洗一次，然后将凝胶置于考马斯亮蓝染色液(proteinstain buffer)中进行显色，于4℃浸泡过夜，隔天待目的条带出现后，反复使用ddH20摇晃清洗(30min/次，5-6次左右)，直至BSA蛋白参照条带和目的蛋白条带没有其他杂质出现为止。然后利用ChemiDoc XRS+System成像仪提供的分析软件对每个BSA蛋白参照条带颜色深浅强度和其BSA蛋白浓度的对应关系进行分析(共6个BSA蛋白参照条带，其对应的BSA浓度值分别是4μg/μL、2μg/μL、1μg/μL、0.5μg/μL、0.25μg/μL、0.125μg/μL)，以BSA浓度为横坐标、参照条带颜色深浅强度为纵坐标制得标准曲线，结合该标准曲线，通过得到目的蛋白条带的颜色深浅强度计算出目的蛋白的浓度，实现蛋白的非变性定量检测的目的。蛋白凝胶电泳结果如图3所示。

由图3可知，MIP-1α蛋白分子量在8kDa，浓缩蛋白滤出液中的MIP-1α蛋白的浓度为0.25μg/μL左右。#1-#5的目的蛋白条带的位置不一致的原因在于差异性糖基修饰导致目的蛋白的大小有差异。相比于中国专利CN105861557提供的重组表达方法(见图3中第2和第3条带)，本发明实施例1中的这种方法所表达的目的蛋白的含量和纯度更大(见图3中第4和第5条带)。通过蛋白凝胶的染色条带显示，本发明采用的纯化工艺，大大了降低生产成本，提高至少2-4倍的重组蛋白MIP-1α和SDF-1α的产率，并维持接近100％高纯度。

实验例2

对MIP-1α蛋白的生物活性研究：

对上述实施例1提供的重组表达方法所获得的MIP-1α蛋白的生物活性进行研究，即对MIP-1α蛋白抑制人初代CD4+T淋巴细胞被艾滋病病毒(实验室病毒株和初代病毒株)感染的抗病毒能力。同时以通过中国专利CN105861557提供的重组表达方法所表达的MIP-1α作为对照(即同时采用Strep-Tag1和Strep-Tag2为特异性标签多肽的重组表达方法)。

一、实验过程：

人源初代细胞是从健康人体外周血的PBMC分离后，使用Mitenyli Biotec提供的CD4磁珠分离纯化出具有CD4抗原决定簇阳性的T淋巴细胞(CD3+CD4+100％阳性)。

两种CCR5亚型的I型艾滋病病毒株(实验室病毒株JR-CSF和野生型病毒株ADA01)用于人源初代CD4+细胞的感染，其扩增和分化采用以下方式：RPMI培养基加入1％盘尼西林和链霉素(来源于GIBCO)+20ng/ml的重组人源白介素IL-2(购自Mitenyli Biotec)。培养3天后，在培养板细胞密集生长的状态下，并维持细胞密度介于1500000～2000000/毫升培养基之间，细胞进入对数生长期。

取进入对数生长期的细胞，每孔加入50μl培养基(RPMI培养基+1％盘尼西林和链霉素+20ng/ml的重组人源白介素IL-2)、含有200000 CD4+T纯化的初代淋巴细胞、50ul的含感染实验滴定10ng P24艾滋病病毒核蛋白/孔的艾滋病病毒、以及100ul带有不同MIP-1α浓度(自身是CCR5的天然的趋化因子)或者不带有受试药物的培养基。混匀后，然后放入细胞培养箱孵育48小时。

培育后，离心、洗脱两次并加入100μl Promega Renila luciferase试剂盒提供的1倍裂解液混匀，在24小时内进行实验。使用96孔板(PerkimElmer不透明，白色)，加入50μl的含裂解液的细胞裂解物，在分光光度计的喷枪头上，加入足够的Renila Luciferase显色试剂(1倍体积的显色底物混合1000倍稀释的底物缓冲液)，混匀，接入分光光度计(Molecule Devices Spectramax Plus 384)的喷枪输入口，指令让光度计自动对每孔喷入50μl的显色试剂。然后让分光光度计进行读数。然后根据屏幕程序显示的RLU荧光读数，进行定量。

二、实验结果

对于实验室病毒株和野生型病毒株这两种CCR5嗜性的I型艾滋病病毒株，其不同之处在于病毒膜蛋白(gp120)某几个区间的序列不一致，其使用CCR5作为入侵T淋巴细胞的核心机制不变。其二者入侵人源初代淋巴细胞的生理机制相同，对CD4+初代T淋巴细胞的感染能力也相仿。

如图4所示，对于两种艾滋病病毒株的感染，MIP-1α的抑制病毒能力接近(K_d位于约10nM水平)，同时，在抑制表现上，由于CCR5在初代细胞的表达要更少，细胞感染的能力更加弱，每个受试分子对细胞感染的影响力更大。MIP-1α对实验室病毒株的抑制能力强于对野生型病毒株的抑制力，由此说明，通过本发明合成的MIP-1α重组蛋白在抑制艾滋病CCR5嗜性亚型病毒株的感染上表现强大的抑制能力。

MIP-1α蛋白与HEK-CCR5细胞上的CCR5结合的饱和曲线如图5所示。由于稳定细胞膜表面表达的CCR5HEK细胞系，可以特异性识别体外偶联AF647荧光基团标记的重组MIP-1α蛋白，使其可以稳定结合HEK-CCR5细胞的细胞膜表面的CCR5，并确定它的最大分子识别量Bmax。MIP-1α的特异性识别能力很强，尤其是本发明所使用的twin-strep-tag重组蛋白配合IBA第三代strep-tactin纯化系统所制得的MIP-1α，其表达量和亲和力都优于中国专利CN105861557提供的纯化表达系统，这个差别可以从相同的Kd值和50％差异的Bmax最大结合量看得出。由此说明，本发明所合成的重组蛋白MIP-1α能够有效抑制CCR5嗜性亚型艾滋病病毒的感染，具有很好的生物活性。

实验例3

对SDF-1α蛋白在抑制艾滋病毒感染方面的生物活性研究：

对上述实施例1提供的重组表达方法所获得的SDF-1α蛋白的生物活性进行研究，即SDF-1α蛋白抑制人初代CD4+T淋巴细胞被艾滋病病毒CXCR4嗜性(实验室病毒株和初代病毒株)感染的抗病毒能力。同时以通过中国专利CN105861557提供的重组表达方法所表达的SDF-1α作为对照(即同时采用Strep-Tag1和Strep-Tag2为特异性标签多肽的重组表达方法)。

一、实验过程：

两种CXCR4亚型的I型艾滋病病毒株(实验室病毒株NL4.3和野生型病毒株gp120#99)用于人源初代CD4+细胞的感染，其扩增和分化采用以下方式：RPMI培养基加入1％盘尼西林和链霉素(来源于GIBCO)+20ng/ml的重组人源白介素IL-2(购自Mitenyli Biotec)。培养3天后，在培养板细胞密集生长的状态下，并维持细胞密度介乎1500000和2000000/毫升培养基，细胞进入对数生长期。

取进入对数生长期的细胞，每孔加入50ul培养基(RPMI培养基+1％盘尼西林和链霉素+20ng/ml的重组人源白介素IL-2)、含有200000 CD4+T纯化的初代淋巴细胞、50ul的含感染实验滴定10ng P24艾滋病病毒核蛋白/孔的艾滋病病毒、以及100ul带有不同SDF-1α浓度(自身是CXCR4受体的天然的趋化因子)或者不带有受试药物的培养基。混匀后，然后放入细胞培养箱孵育48小时。

培育后，离心、洗脱两次并加入100ul Promega Renila luciferase试剂盒提供的1X裂解液混匀，在24小时内进行实验。使用96孔板(PerkimElmer不透明，白色)，加入50ul的含裂解液的细胞裂解物，在分光光度计的喷枪头上，加入足够的Renila Luciferase显色试剂(1倍体积的显色底物混合1000倍稀释的底物缓冲液)，混匀，接入分光光度计(MoleculeDevices Spectramax Plus 384)的喷枪输入口，指令让光度计自动对每孔喷入50ul的显色试剂。然后让分光光度计进行读数。然后根据屏幕程序显示的RLU荧光读数，进行定量。

二、实验结果

对于实验室病毒株和野生型病毒株这两种CXCR4嗜性的I型艾滋病病毒株，其不同之处在于病毒膜蛋白(gp120)某几个区间(如影响CCR5与gp120结合的gp120膜蛋白可变区V3结构上的几个氨基酸序列)的序列不一致。然而，其二者入侵人源初代淋巴细胞的生理机制相同，对CD4+T淋巴初代细胞的感染能力也相仿。

如图6所示，对于两种艾滋病病毒株的感染，SDF-1α的抑制病毒能力接近(K_d位于约5nM水平)，同时，在抑制表现上，由于CXCR4在初代细胞的表达量大，细胞感染的能力会更强，每个受试分子对细胞感染的影响力更大。本发明合成的两种SDF-1α对两种CXCR4病毒株的抑制能力强于对野生型病毒株的抑制力，由此说明，通过本发明合成的SDF-1α重组蛋白在抑制艾滋病CXCR4嗜性亚型病毒株的感染上表现强大的抑制能力。

SDF-1α蛋白与HEK-CXCR4细胞上的CXCR4结合的饱和曲线如图7所示。利用稳定细胞膜表面表达的A3-01T淋巴细胞系，可以特异性识别体外偶联AF647荧光基团标记的重组SDF-1α蛋白，使其可以稳定结合HEK-CXCR4细胞的细胞膜表面自身大量表达的CXCR4，并确定它的最大分子识别量Bmax。SDF-1α的特异性识别能力很强，尤其是本发明所使用的twin-strep-tag重组蛋白配合IBA第三代strep-tactin XT纯化系统所获得的SDF-1α，其表达量和亲和力都优于中国专利CN105861557提供的纯化表达系统，这个差别可以从相同的Kd值和接近大于150％差异的Bmax最大结合量看得出两个方法的产量和产率和质量的差异。由此说明，本发明所合成的重组蛋白SDF-1α能够有效抑制CXCR4嗜性亚型艾滋病病毒的感染并且对CXCR4有效的特异性识别。

实验例4

重组表达SDF-1α对A3.01T淋巴细胞趋化作用的影响

一、实验原理

趋化作用是淋巴细胞活动的一个重要标记，在病理学上，通常是被感染淋巴细胞迁移、癌细胞局部性扩散的一个功能性体现和病理指标。其趋化活动机制是来自于细胞上粘连分子整联蛋白包括integrins、desintegrins和它们之间相互作用以及趋化因子和趋化因子受体相互结合、信号调控等复杂作用。SDF-1作为CXCR4受体唯一的激动剂，对于高量表达CXCR4的T淋巴细胞产生不可逆的转移作用。损伤和被感染的组织和寄主细胞都会上调CXCR4和SDF-1α表达，使得这个淋巴细胞因趋化因子诱导的趋化作用更显强烈。因此SDF-1α的重组表达工艺对于将来作为影响CCR5生理功能的药用活性蛋白(淋巴细胞迁移和趋化活化功能)有明显的指导性作用。

二、实验方法

细胞趋化实验模型如图8所示，实验使用Corning公司的提供的Transwellbicarbonate filter chamber(48wells)，首先在分别在上层和下层分别加入50ul和500ul的混合液(RPMI1640培养基+100ug/ml的盘尼西林+100ug/ml的链霉素(Gibco)+10％购自Biowest的100％小牛血清)，放入37℃培养箱中培育4小时，然后在上层加入50ul含有50000个A3.01表达CXCR4的T淋巴细胞，在下层加入50ul不同梯度浓度的来自本申请方法和来自中国专利CN105861557方法表达的重组SDF-1α和阴性对照分子AMD3100。

放入37℃培养箱，等待迁移5h。5小时后，将下层细胞全部收集，浓缩到100ul的流式细胞仪分析的缓冲液中，然后经流式细胞仪Canto-II的FSC和SSC的通道，进行180秒的细胞读数分析(每3个孔为一个浓度)，统计分析在每个浓度的受试分子诱导细胞从上层往下层移动的细胞数量，结果如图9所示。

三、实验结果：

图9中标注的，“SDF-1alpha(previous method)”即指由中国专利CN105861557提供的方法表达的重组SDF-1α；同理，“SDF-1alpha(current method)”是指由本申请实施例1提供的方法表达的重组SDF-1α。

由图9可见，SDF-1a诱导的CXCR4趋化过程引起大量的A3.01T淋巴细胞从上层迁移至下层，当SDF-1a浓度在10^-10M～10^-8M区间依次增大时，A3.01T淋巴细胞的迁移数量逐渐增多；当SDF-1a浓度大于10^-8M时，A3.01T淋巴细胞的迁移数量逐渐减少。说明SDF-1α对A3.01T淋巴细胞有正态分布的浓度趋化效应。通过本发明提供的Strep-tactin XT+twin-strep-tag新一代纯化表达系统表达的SDF-1α重组蛋白在同一个浓度从10^-9M～10^-5M从刺激下诱导趋化的细胞数比起CN105861557中Strep-tactin+strep-tag系统的细胞数量要更高和差异更加显著，在低浓度诱导下的效率要更好。作为阴性对照，从SIGMA购买的商业化AMD3100(为已知CXCR4的小分子抑制剂)没有对CXCR4产生特异的趋化效应。

在趋化作用下，CXCR4与趋化因子SDF-1α的结合是一个剂量效应的相互作用过程；大量的SDF-1α涌入会影响CXCR4的趋化作用，产生内部的肌动蛋白(actin)和灯丝蛋白(filament)的聚合，通过活动性较强的趋化爬行机制(pseudopodia)使细胞形成局部极化状态，从上层迁移进入下层(或者平行移动)。而其受试分子则没有对此产生任何趋化作用。但是过多的SDF-1α累积会形成SDF-1α双聚物(dimer)，不利于SDF-1α的趋化效应。反而造成了双聚物的位阻效应影响SDF-1α的结合位点与CXCR4的结合。而且本身SDF-1α可以从T淋巴细胞本身自己释出，形成自分泌的循环效应，直接影响SDF-1α本身的趋化效应(作用量远远小于试验用的重组蛋白用量)。

实验例5

重组表达MIP-1α对A3.01–CCR5T淋巴细胞趋化作用的影响

一、实验原理

同样地，MIP-1α作为CCR5受体重要的趋化因子和天然激动剂，对于表达大量CCR5的T淋巴细胞产生不可逆的转移作用。损伤和被感染的组织和寄主细胞都会上调CCR5和MIP-1α表达，使得这个CCR5表达的淋巴细胞(尤其是T淋巴细胞)因趋化因子诱导的趋化作用更显强烈。CCR5受体还可以结合CCL4(MIP-1β)和CCL5(RANTES),其中CCL4和CCL5也能结合CCR5诱导淋巴细胞的趋化作用，但是CCL4和CCL5结合CCR5的亲和力比CCL3要弱(Kd分别为20-50nM)，而CCL3的Kd约为3.3-8nM,其Kd的天然差异根据具体不同的细胞系和其不同的表达系统和受体数量，因此，指MIP-1α的重组表达工艺对于将来作为影响CCR5生理功能的药用活性蛋白(淋巴细胞迁移和趋化活化功能)有明显的指导性作用。

其中，MIP-1α(也称作CCL3)，为人源巨噬细胞炎性蛋白1α,为CCR5受体天然激动剂和淋巴细胞和白细胞趋化因子。

受到趋化因子的诱导作用，细胞会产生极性细胞膜变化，并向形成趋向趋化因子高浓度的地方极化迁移。这个趋化过程受到趋化因子浓度、趋化因子受体的表达量以及细胞的常态的影响。

二、实验过程：

细胞趋化实验模型如图10所示，实验使用Corning公司的提供的Transwellbicarbonate filter chamber(48wells)，首先在分别在上层和下层分别加入50ul和500ul的混合液(RPMI1640培养基+100ug/ml的盘尼西林+100ug/ml的链霉素(Gibco)+10％购自Biowest的100％小牛血清)，放入37℃培养箱中培育4小时，然后分别在上层加入50ul含有50000个A3.01-CCR5表达CCR5的T淋巴细胞、以及50ul来自本申请方法和来自中国专利CN105861557方法表达的重组MIP-1α和阴性对照分子Maraviroc(简称MVC，CAS号为376348-65-1，其为商业化CCR5拮抗剂的小分子药物，同时也是CCR5的拮抗剂)。

放入37℃培养箱，等待迁移5h。5小时后，将下层细胞全部收集，按照同样的方式进行检测，结果如图11所示。

三、实验结果：

图11中标注的，“MIP-1alpha(previous method)”即指由中国专利CN105861557提供的方法表达的重组MIP-1a；同理，“MIP-1alpha(current method)”是指由本申请实施例1提供的方法表达的重组MIP-1α。

由图11可见，MIP-1α诱导的CCR5趋化过程引起大量的A3.01-R5淋巴细胞从上层迁移至下层，当MIP-1α浓度在10^-10M～10^-7M区间依次增大时，A3.01-R5淋巴细胞的迁移数量逐渐增多；当MIP-1α浓度大于10^-7M时，A3.01-R5淋巴细胞的迁移数量逐渐减少。说明MIP-1α对A3.01-R5淋巴细胞有正态分布的浓度趋化效应。通过本申请实施例1提供的strep-tactinXT+twin-strep-tag新一代纯化表达系统表达的MIP-1α重组蛋白在同一个浓度从10^-9M～10^-5M从刺激下诱导趋化的细胞数比起CN105861557中Strep-tactin+strep-tag系统的细胞数要高，效率要更好。作为阴性对照，从SIGMA购买的商业化Maraviroc，没有对CCR5产生特异的趋化效应。

在趋化作用下，CCR5与趋化因子MIP-1α的结合是一个剂量效应的相互作用过程；大量的MIP-1α涌入会影响CCR5的趋化作用，产生内部的肌动蛋白(actin)和灯丝蛋白(filament)的聚合，通过活动性较强的趋化爬行机制(pseudopodia)使细胞形成局部极化状态，从上层迁移进入下层(或者平行移动)。而其受试分子则没有对此产生任何趋化作用。但是过多的MIP-1α累积会形成MIP-1α双聚物(dimer)，无助于MIP-1α的趋化效应反而造成了双聚物的位阻效应影响MIP-1α的结合位点与CCR5的结合。而且本身MIP-1α可以从T淋巴细胞本身自己释出，形成自分泌的循环效应，直接影响MIP-1α本身的趋化效应(作用量远远小于试验用的重组蛋白用量)。

由此说明，通过本专利描述的系统所表达的SDF-1α和MIP-1α蛋白证明了目前实验所表达的产物是唯一的；也是对比CN105861557中的上一代系统，证明本专利和试验方法为目前最优的可以诱导T淋巴细胞(表达CXCR4或者CCR5)的趋化因子和针对CXCR4和CCR5通过生物合成的激动剂的合成工艺和方法。

综上所述，本发明提供的生物活性蛋白在真核细胞中的表达方法，所得到的目的蛋白均经过了幼仓鼠肾细胞的蛋白翻译和修饰系统的翻译修饰，具有较强的正常分子量、生物活性、生理活性以及药理活性；且实际纯化分离出的目的蛋白与理论上的目的蛋白的相似性接近100％，纯度高；采用该表达方法得到的目的蛋白可以通过代谢标记法标记荧光标签或者放射性同位素标签作各类生物、医学、药学临床和基础研究，如药物筛选、中和性抗体筛选、分子标记定位、蛋白标准品制备；采用该表达方法表达蛋白还具有生产周期短，成本低等特点。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 柴梦莹

<120> 一种人源趋化因子MIP-1α或SDF-1α在真核细胞中的重组表达方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25 30

<210> 2

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tggagccacc cccagttcga gaagggcggc ggcagcggcg gcggcagcgg cggcagcagc 60

gcctggagcc acccccagtt cgagaag 87

<210> 3

<211> 279

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgcaggtct ccactgctgc ccttgctgtc ctcctctgca ccatggctct ctgcaaccag 60

ttctctgcat cacttgctgc tgacacgccg accgcctgct gcttcagcta cacctcccgg 120

cagattccac agaatttcat agctgactac tttgagacga gcagccagtg ctccaagccc 180

ggtgtcatct tcctaaccaa gcgaagccgg caggtctgtg ctgaccccag tgaggagtgg 240

gtccagaaat atgtcagcga cctggagctg agtgcctga 279

<210> 4

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgcaggtct ccactgctgc ccttgctgtc ctcctctgca ccatggctct ctgcaaccag 60

ttctctgcat cacttgctgc tgacacgccg accgcctgct gcttcagcta cacctcccgg 120

cagattccac agaatttcat agctgactac tttgagacga gcagccagtg ctccaagccc 180

ggtgtcatct tcctaaccaa gcgaagccgg caggtctgtg ctgaccccag tgaggagtgg 240

gtccagaaat atgtcagcga cctggagctg agtgcctgat ggagccaccc ccagttcgag 300

aagggcggcg gcagcggcgg cggcagcggc ggcagcagcg cctggagcca cccccagttc 360

gagaag 366

<210> 5

<211> 282

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgaacgcca aggtcgtggt cgtgctggtc ctcgtgctga ccgcgctctg cctcagcgac 60

gggaagcccg tcagcctgag ctacagatgc ccatgccgat tcttcgaaag ccatgttgcc 120

agagccaacg tcaagcatct caaaattctc aacactccaa actgtgccct tcagattgta 180

gcccggctga agaacaacaa cagacaagtg tgcattgacc cgaagctaaa gtggattcag 240

gagtacctgg agaaagcttt aaacaagagg ttcaagatgt ga 282

<210> 6

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgaacgcca aggtcgtggt cgtgctggtc ctcgtgctga ccgcgctctg cctcagcgac 60

gggaagcccg tcagcctgag ctacagatgc ccatgccgat tcttcgaaag ccatgttgcc 120

agagccaacg tcaagcatct caaaattctc aacactccaa actgtgccct tcagattgta 180

gcccggctga agaacaacaa cagacaagtg tgcattgacc cgaagctaaa gtggattcag 240

gagtacctgg agaaagcttt aaacaagagg ttcaagatgt gatggagcca cccccagttc 300

gagaagggcg gcggcagcgg cggcggcagc ggcggcagca gcgcctggag ccacccccag 360

ttcgagaag 369

Claims

1.一种人源趋化因子MIP-1α或SDF-1α在真核细胞中的重组表达方法，其特征在于，其包括：

将编码MIP-1α或SDF-1α的外源基因连接至载体质粒，再将所述载体质粒和包装质粒转染包装细胞，培养转染后的所述包装细胞，得到病毒载体，所述载体质粒为pSFV2，所述包装质粒为pHelper，所述外源基因的终止子后还连接有特异性标签，所述特异性标签用于编码至少一个特异性标签双连续重复多肽；

将所述病毒载体转染宿主细胞，经培养后，收集上清液，所述宿主细胞为真核细胞；以及

离心、纯化所述上清液，得到所述外源基因表达的具有生物活性的目的蛋白。

2.根据权利要求1所述的人源趋化因子MIP-1α或SDF-1α在真核细胞中的重组表达方法，其特征在于，所述特异性标签双连续重复多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的人源趋化因子MIP-1α或SDF-1α在真核细胞中的重组表达方法，其特征在于，所述特异性标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求1所述的人源趋化因子MIP-1α或SDF-1α在真核细胞中的重组表达方法，其特征在于，所述特异性标签为两个。

5.根据权利要求1所述的人源趋化因子MIP-1α或SDF-1α在真核细胞中的重组表达方法，其特征在于，所述真核细胞为哺乳动物细胞。

6.根据权利要求5所述的人源趋化因子MIP-1α或SDF-1α在真核细胞中的重组表达方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞是幼仓鼠肾细胞。

7.根据权利要求1所述的人源趋化因子MIP-1α或SDF-1α在真核细胞中的重组表达方法，其特征在于，制备所述病毒载体的步骤还包括：用限制性内切酶对所述载体质粒和所述包装质粒进行酶切处理，形成线性DNA，再将所述线性DNA经转录得到RNA，将所述RNA转染所述包装细胞。

8.根据权利要求8所述的人源趋化因子MIP-1α或SDF-1α在真核细胞中的重组表达方法，其特征在于，所述限制性内切酶为SapI。

9.根据权利要求1所述的人源趋化因子MIP-1α或SDF-1α在真核细胞中的重组表达方法，其特征在于，还包括：将得到的所述目的蛋白在凝胶上进行垂直电泳，将电泳后的所述凝胶置于考马斯亮蓝染色液中浸泡14～16小时，进行显色。