CN109288813B - 含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物制剂领域，涉及一种含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒及其制备方法本发明的制剂由含硒紫杉醇二聚体前药、聚乙二醇‑聚苯丙胺酸两亲性聚合物材料及多肽修饰的聚乙二醇‑聚苯丙胺酸两亲性聚合物材料等制成的含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米给药系统。本发明合成了含硒紫杉醇二聚体前药并将其包封于聚乙二醇‑聚苯丙胺酸两亲性聚合物材料中，通过二聚体的特殊结构，制得高载药聚合物纳米粒，本发明中二聚体前药合成中引入二硒键，能有效提高载体的稳定性，实现药物靶细胞内的可控性释放；本发明中通过多肽分子的修饰，能明显提高纳米粒的乳腺癌靶向性，增加药物的蓄积，从而提高药物的抗肿瘤疗效。

Description

含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒及其制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒及其制备方法

背景技术

近年来，纳米给药系统用于肿瘤药物递送系统的研究屡见报道。与传统化疗相比，纳米给药系统可有效改变药物药动学性质，通过被动靶向或主动靶向的策略，将药物有效传输至肿瘤组织或细胞，降低不良反应，提高化疗药物的治疗效果。常见的纳米粒主要通过物理包封和共价修饰的方法载药，但实践显示，所述的两种方法的载药量都很低，基本在20％以下。为达到靶组织靶细胞的有效药物浓度，传统纳米粒在给药过程中不可避免的会引入大量载体材料，对人体产生潜在安全隐患。因此，业内研究人员认为有必要寻找具有高载药，体内外稳定性好的聚合物纳米粒，以提高药物的治疗效率。

研究显示，抗肿瘤药物需要在靶细胞内以原形药物释放，以达到肿瘤杀伤作用。由于肿瘤组织细胞内相较于胞外生理条件具有更高的还原环境，因此有研究设法设计全新的针对肿瘤胞内强还原条件敏感释药的含硒紫杉醇二聚体前药，并试图制备高载药聚合物纳米粒，进一步提高药物的靶细胞特异杀伤能力。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒及其制备方法，制得的纳米粒药物，能实现药物可控性释放，有效增强药物的体内外稳定性，从而增加药物的有效递送和靶部位蓄积，发挥抗肿瘤疗效。

发明内容

本发明的目的在于为解决现有技术存在的问题，提供一种含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒及其制备方法，尤其涉及一种利用三阴性乳腺癌靶向多肽修饰的含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒体系。

本发明合成了全新还原环境敏感的含硒紫杉醇二聚体前药，并合成聚苯丙胺酸-PEG两亲性聚合物材料，通过共沉淀方法进一步将含硒紫杉醇二聚体前药直接包封于两亲性聚合物材料内，制备一种高载药，可实现药物可控性释放的聚合物纳米粒。可有效增强药物的体内外稳定性，从而增加药物的有效递送和靶部位蓄积，发挥抗肿瘤疗效。

具体的，本发明设计了一种全新的针对肿瘤胞内强还原条件敏感释药的含硒紫杉醇二聚体前药，在该前药化学结构设计中，引入氧化还原敏感化学键二硒键，并通过其特有的二聚体结构中分子间强疏水作用及π-π作用制备高载药聚合物纳米粒；当高载药聚合物纳米粒进入肿瘤细胞内部，肿瘤细胞内高浓度的谷胱甘肽等可以有效切除二硒键，经过进一步环化和电子转移，将抗癌药物紫杉醇以原型药物释放出来，进一步提高药物的靶细胞特异杀伤能力；

本发明中，为进一步提高药物在三阴性乳腺癌肿瘤部位的蓄积，综合三阴性乳腺癌的分子生物学特征，采用更具有特异型识别该肿瘤细胞的靶向配体对其进行修饰，尿激酶纤溶酶原受体(uPAR)在乳腺癌中高表达，因此采用巯基化修饰的尿激酶纤溶酶原片段VSNKYFSNIHW，将其修饰到含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒表面，能有效达到靶向修饰目的。

更具体的，本发明提供了一种基于含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒，该制剂由含硒紫杉醇二聚体前药、聚乙二醇-聚苯丙胺酸两亲性聚合物材料及多肽修饰的聚乙二醇-聚苯丙胺酸两亲性聚合物材料制成含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米给药系统。

本发明中，包括含硒紫杉醇二聚体前药(PTXD-Se)，两亲性聚合物材料PEG-pPhe(n)，以及靶向多肽(uPA)，所述纳米粒粒径为50～500nm。

本发明中，所述二聚体前药为含硒紫杉醇二聚体前药，此二聚体前药包含可被胞内高还原环境及高浓度GSH切除的二硒键，可通过二聚体内部化学环化和电子回攻反应，将原形药物紫杉醇释放出。

本发明中，所述含药两亲性聚合物材料由含疏水性氨基酸聚合物聚苯丙胺酸(pPhe)和亲水段聚乙二醇(PEG)通过化学键合连接，所用PEG分子量范围为500～10000，聚苯丙胺酸聚合度为5～50。

本发明中，所述的多肽为一段可以与肿瘤细胞表面的尿激酶纤溶酶原受体(uPAR)特异性结合的配体分子，即uPA肽，序列为VSNKYFSNIHW，将其修饰在高载药二聚体聚合物纳米粒制剂表面，可将药物主动靶向递送至三阴性乳腺癌细胞内。

本发明中，采用纳米共沉淀的纳米粒制备方式制备纳米粒，其包括：两亲性聚合物材料疏水端，通过疏水作用将二聚体前药通过纳米共沉淀方式包裹在纳米粒内部，由于二聚体前药的特殊结构，其分子间作用力可阻止药物直接形成水不溶性沉淀，缓慢将疏水前药包裹于两亲性聚合物材料内，制得超高载药的纳米制剂。

本发明中，提供了一种含硒紫杉醇二聚体前药的合成步骤，其合成方法如图1所示；

本发明中，提供了一种聚乙二醇-聚苯丙胺酸两亲性聚合物的合成方法，其合成方法如图2所示；uPA肽修饰的醇两亲性聚合物的合成方法如1所示。所用聚乙二醇分子量范围包括500～10000，聚苯丙胺酸的聚合度范围5～50；

本发明进而提供了一种含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒的制备方法，其包括步骤：

(1)制备质量浓度为10～100mg/ml的含硒紫杉醇二聚体前药储备液，所用溶剂包含二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、丙酮等与水互溶溶剂；

(2)制备质量浓度为0～100mg/ml的uPA肽修饰聚乙二醇-聚苯丙胺酸两亲性聚合物及非修饰聚乙二醇-聚苯丙胺酸两亲性聚合物，所用溶剂包含二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、丙酮等与水互溶溶剂；

(3)将步骤(1)与步骤(2)的储备液以一系列比例混合，所述含硒紫杉醇二聚体前药与聚乙二醇-聚苯丙胺酸两亲性聚合物质量比范围为20:1～1:20，uPA肽修饰聚乙二醇-聚苯丙胺酸两亲性聚合物比例范围为0～100％；

(4)将步骤(3)制备混合液在搅拌的条件下缓慢滴入去离子水或PBS 7.4中；所用搅拌转速范围为100rpm～8000rpm；所得纳米粒溶液通过分子量3500～10000透析膜透析将残余有机溶剂除去。

本发明提供了一种基于含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒，合成的含硒紫杉醇二聚体前药并将其包封于聚乙二醇-聚苯丙胺酸两亲性聚合物材料中，通过二聚体的特殊结构，制得高载药聚合物纳米粒；本发明中二聚体前药合成中引入二硒键，有效提高载体的稳定性，实现药物靶细胞内的可控性释放；通过多肽分子的修饰，极大提高了纳米粒的乳腺癌靶向性，增加药物的蓄积，从而提高药物的抗肿瘤疗效。

本发明的优点与效果：

1)设计合成的含硒紫杉醇二聚体前药可实现药物在肿瘤细胞内的迅速响应性紫杉醇原药释放，达到药物可控性释放的目的。

2)特殊的二聚体前药结构通过其分子间作用力，可制备超高载药聚合物纳米粒。

3)通过纳米共沉淀方法制备纳米粒，该制备工艺简单可行，且制得纳米粒粒径分布均一。

4)采用uPA肽修饰的含硒紫杉醇二聚体前药高载药聚合物纳米粒，粒径为50～500nm，注射机体后血液循环保持稳定，实现长循环，进而通过uPA肽的肿瘤靶向作用，将包载的治疗药物紫杉醇有效递送到肿瘤部位，增加药物在肿瘤组织中的蓄积，提高药物的抗肿瘤疗效。

附图说明

图1为含硒紫杉醇二聚体前药及的聚乙二醇-聚苯丙胺酸两亲性聚合物制备方法路线图。

图2为含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒的粒径分布图及透射电镜照片，其中A为PTXD-Se NPs的DLS粒径分布图，B为PTXD-Se NPs的透射电镜照片,C为uPA-PTXD NPs的DLS粒径分布图，D为PA-PTXD NPs的透射电镜照片。

图3为含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒的体外释放行为图。

图4为荷瘤小鼠尾静脉注射不同纳米颗粒的肿瘤部位荧光图，其中A为4h、8h、12h的荧光结果(左侧为PTXD-Se NPs，右侧为uPA-PTXD NPs)及12h靶向纳米粒uPA-PTXD NPs的3D模拟图，B离体组织纳米粒分布定量结果，C为离体组织照片(左侧为PTXD-Se NPs，右侧为uPA-PTXD NPs)。

图5-16分别为含硒紫杉醇二聚体前药中间体¹H-NMR鉴定结果。

图17为含硒紫杉醇二聚体前药Q-TOF鉴定结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：含硒紫杉醇二聚体前药的合成

制备方法如图1所示，包括以下步骤：

(1)紫杉醇PTX(427mg,0.5mmol)，DMAP(6mg,0.05mmol)和Et₃N(118μl,0.5mmol)溶解于5ml无水二氯甲烷(DCM)中。对硝基苯甲酰氯(1.5eq.)溶解于5ml无水DMF中，冰浴缓慢加入。反应液恢复室温反应4h，通过TLC板确定反应完成后，反应液悬干后通过柱色谱将产物分离纯化得到化合物2；

(2)化合物2(136mg,0.72mmol)与Et₃N(51μl,0.36mmol)溶解于5ml无水DCM中，5ml化合物2溶液滴加入上述反应液。室温搅拌过夜，通过TLC板确定反应完成后，反应液悬干后通过柱色谱将产物分离纯化得到化合物3；

(3)化合物3(544.8mg,0.5mmol)溶解于2ml DCM/TFA(1:1v/v)混合液中，冰浴搅拌5min。通过TLC板确定反应完成后，将混合物通过100ml DCM，5％NaHCO₃溶液(5×20ml)和纯水(3×20ml)萃取，悬干得到白色化合物4；

(4)硒粉(4.4g,0.056mol)分次加入65℃KOH(85％)，20ml纯水及55％水合肼(1.56ml,0.028mol)混合溶液中，再将该反应液加热至90℃，反应2h后降温至50℃，2-氯乙醇(3.8ml,0.056mol)缓慢滴加入反应液，继续反应3h后将反应液恢复室温。反应液通过Celite过滤，滤液用DCM萃取，干燥，悬干后得到棕色油状化合物6；

(5)150ml含2-氯丙醇(9.45g,100mmol)水溶液中加入叠氮化钠(9.75g,150mmol,1.5equiv)，加热回流22h。产物通过DCM萃取、干燥，悬干后得到化合物8；

(6)冰浴条件下，将三光气(388mg,1.3mmol)加入到5ml化合物8(330mg,3.25mmol)无水DCM溶液中，室温反应过夜，将溶剂悬干，复溶于2ml无水DCM中。将上述溶液加入到化合物6(2.43g,9.8mmol)和DMAP(1.197g,9.8mmol)的无水DCM混合液中，继续反应12h，通过TLC板确定反应完成后，反应液悬干后通过柱色谱将产物分离纯化得到化合物9；

(7)化合物9(188mg,0.5mmol)，DMAP(6mg,0.05mmol)和Et₃N(118μl,0.5mmol)溶解于5ml无水DCM。对硝基苯甲酰氯(1.5eq.)溶解于5ml无水DMF中，冰浴缓慢加入上述溶液。反应液恢复室温反应4h，通过TLC板确定反应完成后，反应液悬干后通过柱色谱将产物分离纯化得到化合物10；

(8)化合物11(2g,11.9mmol)与咪唑(2.02g,29.7mmol)溶解于10ml无水DMF中。叔丁基二甲基硅烷(4.5g,29.7mmol)溶解于5ml无水DMF中，冰浴缓慢加入。反应液恢复室温搅拌过夜，通过TLC板确定反应完成后，反应液悬干后通过柱色谱将产物分离纯化得到化合物12；

(9)化合物12(1.53g,3.9mmol)和Et₃N(1.92ml,11.7mmol)溶解于10ml无水四氢呋喃(THF)中。对硝基苯甲酰氯(1.5eq.)溶解于5ml无水THF中，冰浴缓慢加入。反应液恢复室温反应4h，通过TLC板确定反应完成后，反应液悬干后通过柱色谱将产物分离纯化得到化合物13；

(10)化合物13(662mg,1.2mmol)溶解于无水DMF中，迅速加入化合物20(264.1mg,1.4mmol)，室温反应4h,，通过TLC板确定反应完成后，反应液悬干后通过柱色谱将产物分离纯化得到化合物14；

(11)化合物14(531.3mg,0.9mmol)溶解于二氯甲烷/甲醇(2:1v/v)混合溶剂中，加入100mgAmberlyst-15反应过夜。柱色谱快速分离得到化合物15；

(12)化合物15(100mg,0.26mmol),Et₃N(109μl,0.78mmol)和催化量DMAP溶解于5ml无水二氯甲烷(DCM)中，冰浴缓慢滴加入对硝基苯甲酰氯(2.5eq.)无水DCM溶液中。反应液恢复室温反应4h，通过TLC板确定反应完成后，反应液悬干后通过柱色谱将产物分离纯化得到化合物16；

(13)化合物4((292.8mg,0.3mmol),Et₃N(42μl,0.3mmol)和催化量DMAP溶解于5ml无水DCM中。化合物16(54mg,0.075mmol)溶解于无水DCM溶液中，缓慢冰浴滴加入上述混合液。反应液恢复室温反应4h，通过TLC板确定反应完成后，反应液悬干后通过柱色谱将产物分离纯化得到化合物17；

(14)化合物17(64mg,0.027mmol)溶解于2ml DCM/TFA(1:1v/v)混合液中，冰浴搅拌5min。通过TLC板确定反应完成后，将混合物通过100ml DCM，5％NaHCO₃溶液(5×20ml)和纯水(3×20ml)萃取，悬干得到中间化合物18；

化合物18(42mg,0.018mmol)，Et₃N(5μl,0.036mmol)和催化量DMAP溶解于5ml无水DCM中，快速加入化合物10(20mg,0.036mmol)。TLC检测反应完成后，柱层析纯化得到含硒紫杉醇二聚体前药化合物19(PTXD-Se)。

实施例2：uPA肽修饰聚乙二醇-聚苯丙胺酸两亲性聚合物及非修饰聚乙二醇-聚苯丙胺酸两亲性聚合物的合成(如图2所示)

1)聚乙二醇-聚苯丙胺酸两亲性聚合物的合成

(1)称取苯丙胺酸(3g,18.2mmol)和三光气(2.69g)于100ml两口瓶中，油泵抽真空，氮气保护下用注射器加入无水THF(30ml)，50℃油浴搅拌3h,反应结束后冷却至室温，将反应液滴入无水正己烷(150ml)中不断搅拌，析出白色晶体，-20℃结晶过夜，抽滤干燥后得到白色固体Phe-NCA；

(2)分别以mPEG-NH₂和N₃-PEG-NH₂为引发剂，通过开环聚合反应合成聚乙二醇-聚苯丙胺酸两亲性聚合物，分别得到非修饰PEG-pPhe(15)和N₃-PEG-pPhe(15)；

2)uPA肽修饰的前药-聚乙二醇两亲性聚合物的合成

将化合物N₃-PEG-pPhe、炔基化修饰uPA肽、CuBr和PMDTA溶解于2ml DMF溶液中室温反应24h。产物在EDTA溶液中透析1天，去离子水中透析1天后冻干，得到uPA肽修饰的聚乙二醇-聚苯丙胺酸两亲性聚合物(uPA-PEG₅₀₀₀-pPhe(15))。

实施例3：制备uPA肽修饰含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒(uPA-PTXD NPs)

(1)将含硒紫杉醇二聚体前药PTXD，两亲性聚合物材料PEG₅₀₀₀-pPhe(15)和uPA肽修饰的含药两亲性聚合物材料uPA-PEG₅₀₀₀-pPhe(15)分别溶于DMF中配制质量浓度为10mg/ml储备液；

(2)分别吸取10μl CPTD储备液,4μl PEG₅₀₀₀-pPhe(15)储备液和1μl uPA-PEG₅₀₀₀-pPhe(15)储备液混合均匀；

(3)将上述混合液滴入到1ml高速搅拌的去离子水中(转速6000rpm)，通过纳米共沉淀方法得到澄清透明的uPA肽修饰的高载药二聚体前药聚合物纳米粒(uPA-PTXD NPs)。该纳米粒为球形粒子，具有明显的核壳式结构，内核为致密的前药聚集体。该纳米粒粒径分布均一，平均粒径在100nm左右(如图2所示)；

通过体外释放实验对制备的含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒进行考察，结果显示，在释放介质中加入模拟胞内还原条件的谷胱甘肽(GSH)后，累计药物释放量显著增加，说明该纳米粒具有氧化还原敏感释放的特性(如图3所示)。通过体内靶向性实验显示，uPA肽修饰的含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒可明显提高药物在肿瘤部位的蓄积，增强治疗效率(如图4所示)。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> 含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒及其制备方法

<130> 20170724

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> uPA肽

<400> 1

Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile His Trp

1 5 10

Claims (3)

1.一种含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒，其特征在于，由含硒紫杉醇二聚体前药，聚乙二醇-聚苯丙胺酸两亲性聚合物材料及uPA肽修饰的聚乙二醇-聚苯丙胺酸两亲性聚合物材料制成含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米给药系统；

所述的含硒紫杉醇二聚体前药与聚乙二醇-聚苯丙胺酸两亲性聚合物材料质量比范围为20:1 ~ 1:20；

所述的两亲性聚合物材料为聚乙二醇经开环聚合反应直接合成所得；uPA肽为尿激酶纤溶酶原受体配体uPA肽，序列为VSNKYFSNIHW。

2.按权利要求1所述的含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒的制备方法，其特征在于，其包括步骤：

（1）制备体积质量浓度为10 ~ 100 mg/ml的含硒紫杉醇二聚体前药PTXD-Se，两亲性聚合物材料PEG₅₀₀₀-pPhe(n)和uPA肽修饰的含药两亲性聚合物材料uPA-PEG₅₀₀₀-pPhe(n)储备液；

（2）将步骤(1)所得储备液以系列比例混合，所述含硒紫杉醇二聚体前药与两亲性聚合物材料质量比范围为20:1 ~ 1:20；

（3）将步骤(2)制备混合液在搅拌的条件下缓慢滴入去离子水或PBS 7.4中；所用搅拌转速范围为100 rpm ~ 8000 rpm；所得纳米粒溶液去除有机溶剂，得含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒。

3.按权利要求2所述的含硒紫杉醇二聚体前药聚合物纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的储备液溶剂包括二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、丙酮、甲醇(MeOH)与水互溶溶剂。

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