CN109223778B - C24h24n6o2s3在制备抗结核菌药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了C₂₄H₂₄N₆O₂S₃在制备抗结核菌药物中的新用途，并且提供了一种预防或治疗肺结核的药物组合物。C₂₄H₂₄N₆O₂S₃能够回补α‑KG抑制巨噬细胞自噬相关基因的表达，使巨噬细胞的自噬功能得以恢复，从而有效抑制结核菌在体存活，所以能有效抑制结核菌的感染。因此，C₂₄H₂₄N₆O₂S₃可作为治疗肺结核和/或肺外结核病的先导化合物，并且C₂₄H₂₄N₆O₂S₃本身也特别适用于制备预防或治疗结核病的药物，从而具有广阔的临床应用前景和巨大的市场潜力。

Description

C24H24N6O2S3在制备抗结核菌药物中的用途

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，特别涉及C₂₄H₂₄N₆O₂S₃在制备抗结核菌药物中的用途，还涉及一种预防或治疗肺结核的药物组合物。

背景技术

结核分枝杆菌(M.tuberculosis)简称为结核杆菌(tubercle bacilli)或结核菌。早在1882年，德国细菌学家柯赫(Robert Koch，1843-1910)就已证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。结核菌不产生内、外毒素，其致病性可能与细菌在组织细胞内大量繁殖引起的炎症，菌体成分和代谢物质的毒性以及机体对菌体成分产生的免疫损伤有关。结核菌可通过呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入易感机体，引起多种组织器官的结核病，其中以通过呼吸道引起肺结核为最多。因肠道中有大量正常菌群寄居，结核菌必须通过竞争才能生存并和易感细胞粘附；而肺泡中无正常菌群，结核菌可通过飞沫微滴或含菌尘埃吸入，因此肺结核较为多见。

临床研究结果表明，开放性结核病最常见于肺部(占约90％的病例，参见Lawn,SD；Zumla,AI.Tuberculosis.Lancet.2011-07-02,378(9785):57–72.以及Behera,D.Textbookof Pulmonary Medicine2nd.New Delhi:Jaypee Brothers Medical Publishers.2010:457.)。肺结核的症状可能包含胸痛和长时间带痰咳嗽，而约有25％的人可能不会表现任何症状；偶尔，患者可能小量的咳血、咳嗽，在极为罕见的病例中，感染还可能侵蚀到肺动脉和雷斯莫森氏动脉瘤，从而导致大量出血。进一步地，肺结核还可能演变成慢性疾病，并导致上肺叶产生大疤痕。临床研究表明，上肺叶比下肺叶更易受到肺结核的影响，但这个差别的原因目前还未明；可能的解释为上肺叶的空气流通较佳，或其淋巴引流能力较差。

此外，在15％至20％的开放性结核病案例中，结核杆菌感染可传播至肺外，从而引起其它种类的结核病，这些病症被归类为“肺外结核病”(Golden MP,VikramHR.Extrapulmonary tuberculosis:an overview.American Family Physician.2005,72(9):1761–8.)。其中，常见的肺外结核包括：淋巴结核(俗称“瘰疬”是最常见肺外结核病)、结核性脑膜炎、结核性腹膜炎、肠结核(俗称“五更泻”)、肾结核、附睾结核、女性生殖结核(包括输卵管、子宫内膜、卵巢结核)、骨关节结核等。

可见，各种结核病严重危害着人类健康。

据相关文献报道，化合物BPTES是一种有效的glutaminase抑制剂，其具有一定抗癌活性。化合物BPTES的CAS号为314045-39-1，其化学式为C₂₄H₂₄N₆O₂S₃，且其化学名称为N,N'-[thiobis(2,1-ethanediyl-1,3,4-thiadiazole-5,2-diyl)]bis-benzeneacetamide。现有的实验结果证实，化合物BPTES能够抑制谷氨酰胺酶，在人肾脏细胞中IC50为0.18μM，并通过小胶质细胞抑制谷氨酸盐，IC50为80-120nM(参见Newcomb R.2002.U.S.Pat.6,451,828 B1.)。含有突变型IDH1的D54细胞中，化合物BPTES优先减慢其细胞生长。此外，化合物BPTES也会抑制谷氨酰胺酶活性，降低谷氨酸盐和α-KG水平，并增加糖酵解的中间产物(参见Seltzer MJ,et al.Cancer Res.2010,70(22),8981-8987.)。化合物BPTES(浓度为10μM)还可抑制衍生自LAP/MYC肿瘤的mHCC 3–4细胞的生长。近期的研究表明，化合物BPTES也会通过阻断DNA复制，导致细胞死亡和裂解，从而抑制MYC依赖性P493细胞的生长。在LAP/MYC小鼠中，化合物BPTES(12.5mg/kg,i.p.)延长存活期，而对MYC，GLS，或GLS2水平则没有显著作用；在负荷P493肿瘤异种移植物的小鼠中，化合物BPTES(200μg/mouse,i.p.)也会抑制肿瘤细胞生长(参见Xiang Y,et al.J Clin Invest.2015,125(6),2293-2306.)。

由此可见，现有技术仅披露了化合物BPTES在抑制肿瘤方面的效果，而并没有提及化合物BPTES可用于预防或治疗结核病。

发明内容

本发明旨在提供已知的化合物BPTES在作为抗结核菌药物方面的新用途。本发明的发明人在研究和筛选抗结核菌化合物的过程中，意外地发现化合物BPTES能够通过回补α-KG抑制巨噬细胞自噬相关基因的表达而有效抑制结核菌在体存活。

因此，本发明第一方面提供了C₂₄H₂₄N₆O₂S₃在制备抗结核菌药物中的用途；其中，C₂₄H₂₄N₆O₂S₃的结构式如下：

该化合物的CAS号为314045-39-1，其化学名称为：

N,N'-[thiobis(2,1-ethanediyl-1,3,4-thiadiazole-5,2-diyl)]bis-benzeneacetamide。并且，本发明所述的化合物BPTES可由化学合成方法制得，亦可直接从Selleck公司购买获得。

在本发明的一个优选实施方式中，C₂₄H₂₄N₆O₂S₃与第二抗结核菌药物联合使用。

在本发明的一个进一步优选的实施方式中，所述第二抗结核菌药物选自以下任一种或多种的组合：异烟肼，利福平，利福喷汀，吡嗪酰胺，乙胺丁醇，对氨基水杨酸，卷曲霉素，氨硫脲，乙硫异烟胺，加替沙星，莫西沙星，环丙沙星，左氧氟沙星。

并且，本发明第二方面提供了一种预防或治疗肺结核的药物组合物，其包含有效量的C₂₄H₂₄N₆O₂S₃和药学上可接受的载体；其中，C₂₄H₂₄N₆O₂S₃的结构式如下：

优选地，上述预防或治疗肺结核的药物组合物还包含第二抗结核菌药物。

进一步优选地，所述第二抗结核菌药物选自以下任一种或多种的组合：异烟肼，利福平，利福喷汀，吡嗪酰胺，乙胺丁醇，对氨基水杨酸，卷曲霉素，氨硫脲，乙硫异烟胺，加替沙星，莫西沙星，环丙沙星，左氧氟沙星。

优选地，上述预防或治疗肺结核的药物组合物的剂型选自以下任一种：片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、口服液、经皮吸收制剂、气雾剂和注射剂。

为了避免首过效应，进一步优选地，上述预防或治疗肺结核的药物组合物的剂型选自以下任一种：经皮吸收制剂、气雾剂和注射剂。

发明人通过实验证实，所述化合物BPTES(即C₂₄H₂₄N₆O₂S₃)能够有效抑制结核菌感染巨噬细胞后的胞内存活。同时，相关动物实验的结果表明，用结核菌感染小鼠一周后，给予5mg/kg/天剂量的C₂₄H₂₄N₆O₂S₃，且连续口服给药三周后，小鼠肺部病理损伤明显减轻，肺内荷菌量明显降低。

综上所述，本发明提供了C₂₄H₂₄N₆O₂S₃在制备抗结核菌药物中的新用途，其中，C₂₄H₂₄N₆O₂S₃通过回补α-KG抑制巨噬细胞自噬相关基因的表达，使得巨噬细胞的自噬功能得以恢复，从而有效抑制结核菌在体存活，所以能有效抑制结核菌的感染。因此，C₂₄H₂₄N₆O₂S₃可作为治疗肺结核和/或肺外结核病的先导化合物，并且C₂₄H₂₄N₆O₂S₃本身也特别适用于制备预防或治疗结核病的药物，从而具有广阔的临床应用前景和巨大的市场潜力。

附图说明

图1为分别用DMSO、化合物BPTES处理后的WT和DB/db小鼠巨噬细胞在结核菌感染24小时后的胞内CFU图；

图2为对小鼠肺部切片实施苏木精——伊红染色(hematoxylin-eosin staining，H&E)的结果图；

图3为小鼠肺内结核菌的荷菌量的统计图；

图4为小鼠自噬相关基因LC3b的realtime PCR检测结果图；

图5为小鼠自噬相关基因ATG5的realtime PCR检测结果图；

图6为小鼠自噬相关基因ATG7的realtime PCR检测结果图；

图7为小鼠自噬相关基因Beclin1的realtime PCR检测结果图；

图8为小鼠自噬相关基因ULK1的realtime PCR检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施方式。下述实施例中的实验操作，如无特殊说明，均为常规操作；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从公开商业途径获得。

实施例1

将C57BL/6小鼠和DB/db小鼠Db/Db(leptin receptor(Lepr)mutant)腹腔原代巨噬细胞以1*10⁵个/孔接种于48孔细胞培养板中，约2h待细胞贴壁后，移去完全培养基1640，然后加入新鲜的完全培养基培养过夜。第二天，在感染前1h换上新鲜的不含双抗而含10％血清的1640，感染结核菌前分别用DMSO和化合物BPTES(150nM)处理细胞1小时，然后以MOI＝5的剂量感染结核菌(H37Rv)。感染2-3h后，弃去上清，接着，用含有阿米卡星的培养基培养细胞2h，再弃去上清并换上不含双抗而含有10％血清的1640继续于37℃，5％CO₂培养箱中培养细胞24h。弃去上清，并用PBS洗涤细胞，然后用含有1％triton-100的PBS裂解细胞，取细胞裂解液涂于含有两性霉素B的MiddleBook 7H10琼脂培养板上，置于37℃培养箱内培养2-3周，然后进行菌落计数。

计数结果如图1所示，实验结果表明，化合物BPTES(即C₂₄H₂₄N₆O₂S₃)能够显著抑制结核菌感染Db/db小鼠巨噬细胞后的胞内存活。

实施例2

将C57BL/6小鼠分为两组，并且将Db/db小鼠分为两组，每组各6只，分别滴鼻感染结核菌(H37Rv)，剂量为200CFU/只小鼠，感染1周后，按5mg/kg/天剂量的化合物BPTES连续给药3周，纯水作为阴性对照。脱颈椎处死小鼠，取出肺脏中的一叶，用4％多聚甲醛固定，石蜡切片后，实施H&E染色，观察肺部病理损伤情况。

参见图2，可见给予了化合物BPTES处理的小鼠肺部病理损伤明显减轻；因此，本实施例的实验结果表明，化合物BPTES(即C₂₄H₂₄N₆O₂S₃)能够有效减轻小鼠肺部的病理损伤。

实施例3

将实施例2中感染后给药一个月的小鼠肺组织取其三分之一，并用1ml含1％triton-100的PBS研磨处理，梯度稀释，分别取10^-3、10^-4的组织混悬液100ml均匀涂布于含有两性霉素B的MiddleBook 7H10琼脂培养板上，然后置于37℃培养箱中培养2-3周，并完成菌落计数，结果如图3所示。

本实施例的实验结果表明，化合物BPTES(即C₂₄H₂₄N₆O₂S₃)显著降低了小鼠肺内结核菌的荷菌量。

实施例4

细胞RNA的提取：将正常未感染的小鼠巨噬细胞分别用DMSO、α-KG、BPTES及α-KG+BPTES处理，然后用MOI＝5的结核菌感染0，3h和6h，弃去上清，加入1ml trizol，并加入200ul氯仿，颠倒混匀静置10分钟，4℃，12000rpm离心15分钟，取上清至新的RNase free EP管中；接着，加入等体积的异丙醇，-20℃放置10分钟，并于4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清，加入1ml冷的75％乙醇洗涤沉淀，再于4℃，7500rpm离心10分钟，弃去上清，干燥RNA沉淀。

cDNA的合成：取1ugRNA，加入RNase free水至14ul，于65℃作用5分钟后，向RNA中加入1ul primer，4ul 5*RT buffer，1ul酶，总体积20ul，将反应液置于37℃作用15分钟，最后置于95℃酶失活5分钟，即合成cDNA。

自噬相关基因的检测：realtime PCR检测自噬相关基因LC3b、ATG5、ATG7、Beclin1和ULK1的mRNA的表达水平，其检测结果依次如图4、图5、图6、图7和图8所示。

本实施例的实验结果表明，α-KG能够显著抑制巨噬细胞自噬相关基因的表达，从而抑制巨噬细胞的自噬功能；而化合物BPTES能够回补α-KG抑制巨噬细胞自噬相关基因的表达，使得巨噬细胞的自噬功能得以恢复，从而有效抑制结核菌在巨噬细胞中的存活。

综合分析以上实施例可知，C₂₄H₂₄N₆O₂S₃能够有效抑制结核菌的感染，从而有利于结核病的临床治疗。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (4)

1.C₂₄H₂₄N₆O₂S₃在制备抗结核菌药物中的用途；其中，C₂₄H₂₄N₆O₂S₃的结构式如下：

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，C₂₄H₂₄N₆O₂S₃与第二抗结核菌药物联合使用。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述第二抗结核菌药物选自以下任一种或多种的组合：异烟肼，利福平，利福喷汀，吡嗪酰胺，乙胺丁醇，对氨基水杨酸，卷曲霉素，氨硫脲，乙硫异烟胺，加替沙星，莫西沙星，环丙沙星，左氧氟沙星。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗结核菌药物的剂型选自以下任一种：片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、口服液、经皮吸收制剂、气雾剂和注射剂。

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