CN109182376B

CN109182376B - 分化多能性干细胞的制造方法

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Publication number: CN109182376B
Application number: CN201811123541.8A
Authority: CN
Inventors: 加藤英政; 森山阳介; 平木启子; 奥田晶彦
Original assignee: Rui Weng Co ltd; Saitama Medical University
Current assignee: Rui Weng Co ltd; Saitama Medical University
Priority date: 2012-10-29
Filing date: 2013-10-29
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2033-10-29
Also published as: US10851342B2; EP2913396B1; EP2913396A1; US20150275171A1; JPWO2014069479A1; KR20150079913A; US20180094239A1; US9868934B2; JP5987063B2; CN104955942A; KR102116794B1; CN109182376A; EP2913396A4; CN104955942B; WO2014069479A1

Abstract

通过将TET1蛋白质的从氨基末端起第2位的氨基酸置换为不同的氨基酸等，能够使TET1蛋白质在人分化多能性干细胞中比此前稳定地表达。并且，通过将所述变异型TET1蛋白质导入分化多能性干细胞，能够使分化诱导的抑制因子NANOG等的表达迅速消失，促进分化诱导相关因子的表达。提供分化能力提高了的分化多能性干细胞的制造方法、以及在该制造方法中有用的物质。

Description

分化多能性干细胞的制造方法

本申请是下述申请的分案申请：

发明名称：分化多能性干细胞的制造方法

国际申请日：2013年10月29日

国际申请号：PCT/JP2013/079311

国家申请号：201380068995.9

技术领域

本发明涉及分化多能性干细胞的制造方法，更详细而言，涉及分化能力提高了的分化多能性干细胞的制造方法。此外，本发明还涉及在该制造方法中所使用的蛋白质。

背景技术

分化多能性干细胞被定义为：具备能够转变为与自身不同的多系统种类的细胞的能力(分化多能性)、和能够创造出即使经过细胞分裂也具有与自身相同的能力的细胞来作为子代细胞的能力(自我复制能力)的细胞，通常认为胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能性干细胞(iPS细胞)等为符合该定义的细胞。并且，由于ES细胞、iPS细胞等具有所述能力，因此非常期待它们在再生医疗、新药开发领域中发挥重要作用。

但是最近报告了：小鼠分化多能性干细胞和人分化多能性干细胞的基本性质不同，关于该分化能力，人分化多能性干细胞要逊色于小鼠分化多能性干细胞。

关于小鼠分化多能性干细胞，可以通过实验较准确地对分化多能性进行评价。例如，在将小鼠ES细胞注入胚泡的腔内时，有时内部细胞块和细胞彼此发生混合，来自ES细胞的细胞在胚内呈现正常的发生，将这种情况称为形成嵌合体。对于小鼠ES细胞而言，是否能够像这样与发生时期相同的内部细胞块同期进行发生是分化多能性是否良好的指标。还已知的是，此时若发生继续进行，则这些ES细胞的一部分将被动员为生殖细胞系。该生殖细胞传递(germ line transmission)的发生意味着来自ES细胞的遗传信息传递至下一代，该意义上，能够显示出作为广义上的正常细胞的适合性。此外，还存在也可以说是“最后”的分化多能性的证明方法。在暂时抑制小鼠受精卵的细胞分裂后，将其在培养皿中培养，则形成4倍体(tetraploid)的胚泡。该4倍体胚泡中包含的内部细胞块乍一看性质是正常的，但却不会继续进行此后的胚发生。因此，即使将该4倍体胚泡返送到以该状态假妊娠的母小鼠的子宮内也无法获得个体。但是，若将具有分化多能性的干细胞注入该4倍体胚泡，使其形成前述的嵌合体，则此时仅所注入的细胞具有正常的核型，有助于发生。由此，以单一世代产生完全来自于注入的分化多能性干细胞的个体。该方法通常称为4倍体补偿(tetraploid－complementation)分析，此时出生的小鼠与注入的来源细胞有关，称为all－iPSC小鼠。还能够如此地对小鼠中分化多能性进行多重检验，截至目前，大量证据显示小鼠iPS细胞在严格意义上具有分化多能性。

另一方面，关于人分化多能性干细胞，从伦理观点出发当然不能将上述的检验法用于人。作为其代用法通常使用的是畸胎瘤形成。将干细胞移植到裸小鼠的皮下，受到宿主小鼠的血行支持，移植的细胞“随机”分化、组织化。使该肿瘤片生长，从其病理标本寻找外·中·内胚层，由此显示出大致的分化多能性。但是，利用畸胎瘤形成法评价分化多能性存在较大的问题。问题在于，在本法中，例如即使原干细胞的分化效率差，在能够确认向三胚层分化的组织的阶段也判断为具有分化多能性。这是由于，即使肿瘤内残留有完全未继续发生的未分化细胞，大多情况下也无视该细胞地进行分化多能性的评价。畸胎瘤形成中，若在原干细胞团中存在数个真正的分化多能性细胞，则对其它细胞完全置之不理，评价方法完全不具有定量性。例如，在小鼠iPS细胞中，使用c－Myc制作的iPS细胞在畸胎瘤形成中能确认到三胚层分化能力，但进行嵌合体形成时，几乎都形成了来自iPS细胞的自然发生的肿瘤。作为次优选的策略，还考虑了实际中分别分化诱导为三胚层，对其进行评价的方法。该方法受分化方案影响，预期仍然难以进行定量实验。

进而，关于人分化多能性干细胞还存在更深层的问题。这就是不存在具有均等地分化为全部细胞系谱的潜在能力的理想化人分化多能性干细胞。根据长船等的报告，人ES细胞并不存在在基因表达水平完全相同的两个细胞，受其影响，各个ES细胞株偏向于向某个特定的胚层的分化诱导性，进而暗示了人ES细胞在定量方面并不具有充分的“分化多能性”(非专利文献1)。

此外，从小鼠ES细胞的建立起至人ES细胞的建立，经过了17年的时间。这是由于通过小鼠ES细胞的建立方法不能建立人ES细胞，无他。小鼠ES细胞的自我复制培养中需要白血病抑制因子(以下也称为“LIF”)，但人ES细胞在LIF添加培养基中不能进行自我复制。Thomson等发现，人ES细胞的维持所必须的是FGF和活化素(Activin)/Nodal(非专利文献2)。进而明确了，小鼠ES细胞借助于JAK/STAT信号，而人ES/iPS细胞中借助于SMAD2/3信号，双方借助于不同的信号系进行各自的分化多能性干细胞的自我复制。此外，普遍的看法是，在人分化多能性干细胞中，借助于SMAD2/3的细胞内信号与NANOG的表达上升有关。另一方面，SMAD2/3信号为哺乳类的发生中中内胚层分化所必须的信号传导通路，实际上，为了以这些细胞系谱为目标进行分化诱导使用了高浓度的活化素A。因此虽然目的不同，但现状是较多使用的人分化多能性干细胞的自我复制信号与该细胞向中内胚层系的分化信号是重复的。

人ES细胞和小鼠ES细胞在由胚泡建立这点上是共通的。但是，或许是由于前述的培养条件的差异，它们的性质并不相同。综合迄今为止的见解，弄清了小鼠ES细胞沿袭了胚泡的内部细胞块的基因表达谱，而人ES细胞的性质则与胚泡稍发达后形成的上胚层内的原始外胚层最相似。然后，利用与人ES细胞同样的培养条件由小鼠上胚层直接建立了上胚层干细胞(EpiSC)(非专利文献3及4)，并认为分化多能性大致可以分为两种。一种是以小鼠ES细胞、小鼠iPS细胞为代表的具有胚泡型分化多能性的干细胞，另一种是人ES细胞、人iPS细胞、小鼠EpiSC等上胚层型干细胞，前者的性质被称为原始态(naive)、后者的性质被称为起始态(primed)(非专利文献5)。

如上，原始态型分化多能性干细胞和起始态型分化多能性干细胞在均具有向三胚层分化的能力、若移植到裸小鼠中则形成畸胎瘤的方面是共通的。但是，原始态型的分化多能性干细胞反映了在发生阶段中接近受精卵的早期状态(胚泡)的性质，因此容易建立等，进而，具有能产生完全来自于该细胞的个体程度的完全的分化多能性。另一方面，起始态型分化多能性干细胞有时还反映了比胚泡的发生阶段前进的上胚层的性质，不容易建立等。此外，如上所述，还明确了该细胞中存在分化多能性偏倚(非专利文献1)。进而还明确了，起始态型分化多能性干细胞不具有生殖细胞传递能力、嵌合体形成能力，在包括分化多能性在内的分化能力方面，具有起始态型性质的人分化多能性干细胞等比具有原始态型性质的小鼠分化多能性干细胞差。

在再生医疗的实用化、新药开发中，要求该人分化多能性干细胞具有能够提供多种多样的细胞、组织、脏器等程度的高分化能力。因此，强烈需要提高具有起始态型性质的人分化多能性干细胞等的分化能力的方法，但现状是目前尚未开发出所述方法。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Osafune，K.等、Nat Biotechnol、2008年、26卷3号、313～315页

非专利文献2：Thomson，J.A.等、Science、1998年、282卷、5391号、1145～7页

非专利文献3：Brons，I.等、Nature、2007年、448卷、7150号、191～195页

非专利文献4：Tesar，P.J.Nature、2007年、448卷、7150号、196～199页

非专利文献5：Nichols，J.等、Cell Stem Cell、2009年、4卷、6号、487～492页

发明内容

发明所要解决的问题

本发明是鉴于前述现有技术所具有的问题而作出的，目的在于提供一种分化能力提高了的分化多能性干细胞的制造方法、以及在该制造方法中有用的物质。

用于解决问题的手段

本发明者们为了实现前述目的，对小鼠分化多能性干细胞和人分化多能性干细胞的性质差异进行了深入研究。

小鼠分化多能性干细胞具有接近于着床前的胚泡的内部细胞块的性质。另一方面，人分化多能性干细胞的性质则与着床后的上胚层内的原始外胚层最相似。并且，猜测由于该发生阶段的差异，人分化多能性干细胞在分化多能性方面也比小鼠分化多能性干细胞差。

此外，通常认为在发生过程中早期化存在2种类型。为从刚受精后至着床早期中发生的“早期胚中的早期化”、和着床后在生殖细胞形成过程中发生的“胚系中的早期化”。鉴于该点，本发明者们仔细调查了为了消去从着床前的胚泡至着床后的上胚层的记忆而在“胚系中的早期化”中表达的多种因子，并着眼于其中的TET1。

已经明确了TET1蛋白质为具有将5-甲基化胞嘧啶的甲基羟基化而将其变换为5-羟甲基胞嘧啶的作用的酶。此外，近年来，关于该蛋白质，还推测发生由前述5-羟甲基胞嘧啶进一步生成胞嘧啶、即去甲基化。此外，还猜测TET1蛋白质通过竞争性地阻碍DNMT1、DNMT3a、DNMT3b等DNA甲基化酶与DNA甲基化位点的结合，来维持DNA的低甲基化状态。因此强烈暗示了TET1蛋白质与DNA的去甲基化或低甲基化状态的维持机制有关。此外，就TET1蛋白质而言，在小鼠中，在从受精卵直至胚泡的早期胚的发生过程以及由原始生殖细胞、胚泡建立的ES细胞等中都确认到TET1蛋白质的表达。因此，与前述DNA的去甲基化等综合起来，还强烈暗示了TET1蛋白质与细胞的“早期化”有关。但是，尚未对人类中的TET1蛋白质的表达进行过解析。

因此，在转录水平及翻译水平对人iPS细胞中的TET1的表达进行了调查。其结果是，与小鼠ES细胞等同样地，在人iPS细胞中也确认到TET1mRNA的丰富表达。此外，此时在人iPS细胞中检测出的2种TET1mRNA(cDNA)的序列在部分外显子的有无方面均与此前已知的序列不同，因此本发明者们成功地发现了新的TET1的剪接变体。

但是，其另一方面令人惊讶的是，与小鼠ES细胞等不同的是，在人iPS细胞中未检测到TET1蛋白质的表达。并且，猜测该TET1蛋白质的表达的有无使得小鼠分化多能性干细胞和人分化多能性干细胞的分化能力产生差异，对于使该TET1蛋白质在人分化多能性干细胞中表达的方法进行了深入研究。其结果是，发现通过在天然型的TET1蛋白质的氨基末端(N末端)添加肽标签可使该蛋白质在人分化多能性干细胞中稳定地表达。此外，还惊奇地发现，即使仅将从N末端起的第2位氨基酸置换为不同的氨基酸，也使该蛋白质的表达稳定化。

然后，在使这样的能够在人分化多能性干细胞中稳定地表达的变异型TET1蛋白质(改变TET1蛋白质)在人iPS细胞中表达时，发现此前已经确认在人分化多能性干细胞中表达的、显示向中内胚层分化的倾向的T、SOX17的表达消失。因此，明确了利用改变TET1蛋白质能够消除人iPS细胞中的这类分化诱导的偏倚(分化诱导的偏向性)。

此外明确了：在将导入有改变TET1蛋白质的人iPS细胞分化诱导为神经系统(外胚层)时，分化诱导的抑制因子即OCT3/4及NANOG的表达迅速消失。特别是已知NANOG的表达是向几乎所有细胞种类的分化诱导的抑制要因，因此还明确了：通过导入改变TET1蛋白质，能够消除分化多能性干细胞中的由该因子引起的对分化诱导的抵抗性，切实发挥该细胞的分化多能性。另一方面还明确了：通过导入改变TET1蛋白质，作为神经发生的必需因子的SOX2、SOX1等神经标志物的表达在向神经系统的分化诱导过程中是亢进的。特别是，SOX1的表达量与在未导入TET1蛋白质的情况下制作的现有iPS细胞的分化诱导过程相比，上升约60倍，因此猜测通过导入该蛋白质，分化多能性干细胞向神经系统分化的能力也提高约60倍。

并且还发现，正如反映了这些转录因子的增减那样，即使在仅确认到现有的未表达TET1蛋白质的人iPS细胞微量地向神经细胞分化的分化诱导条件下，在导入了改变TET1蛋白质的人iPS细胞中，几乎100％的细胞能够分化为神经细胞。此外还确认了：通过改变TET1蛋白质的导入，不仅是向所述外胚层系分化的能力提高，分化多能性干细胞向内胚层系的分化能力也提高。

此外，令人惊讶的是，还明确了利用将从N末端起第2位的氨基酸置换为不同的氨基酸、并且使双加氧酶区域缺失的改变TET1蛋白质也可实现这样的分化能力的提高。即，表明在所述分化能力的提高中，双加氧酶区域所承担的去甲基化活性并非必需，只要维持了TET1蛋白质的DNA结合能力就足够了。

此外还明确了：通过将前述的改变TET1蛋白质与所谓的重编程(reprogramming)因子(Oct3/4、Sox2、Klf4及c－Myc)一起导入体细胞，不仅能够提高所获得的iPS细胞的分化能力，而且还能够提高该iPS细胞的诱导效率(制造效率)。

此外发现，未导入TET1蛋白质而制作的现有的iPS细胞中，癌相关标志物(GPC4、GAGE2B及GAGE7)高度表达，另一方面导入TET1蛋白质而制作的iPS细胞中，这些癌相关标志物的表达被抑制，从而还明确了通过导入TET1蛋白质从而获得的iPS细胞，不仅能够提高分化能力及该iPS细胞的诱导效率(制造效率)，而且能够提高其安全性。

本发明是基于以上的见解而完成的，提供分化能力提高了的分化多能性干细胞的制造方法。此外，本发明提供在该制造方法中有用的变异型TET1蛋白质及成为该变异型蛋白质的材料的新的TET1蛋白质、以及编码这些蛋白质的核酸。更详细而言，本发明提供以下方案。

＜1＞一种分化多能性干细胞的制造方法，其包含将选自下述(a)～(c)中的至少一种分子导入分化多能性干细胞或用于诱导为该细胞的体细胞的工序，

(a)TET1蛋白质

(b)编码TET1蛋白质的核酸

(c)插入有编码TET1蛋白质的核酸的载体。

＜2＞根据＜1＞所述的制造方法，所述TET1蛋白质为变异型TET1蛋白质，是与正常型TET1蛋白质相比稳定性提高了的蛋白质。

＜3＞根据＜2＞所述的制造方法，所述变异型TET1蛋白质为从其氨基末端起第2位的氨基酸残基与正常型TET1蛋白质的从氨基末端起第2位的氨基酸残基不同的TET1蛋白质。

＜4＞根据＜2＞或＜3＞所述的制造方法，所述变异型TET1蛋白质为进一步缺失了双加氧酶区域的TET1蛋白质。

＜5＞根据＜1＞所述的制造方法，所述TET1蛋白质为包含序列号：2、4或6中记载的氨基酸序列的蛋白质。

＜6＞一种蛋白质，其为变异型TET1蛋白质，与正常型TET1蛋白质相比稳定性提高。

＜7＞根据＜6＞所述的蛋白质，从氨基末端起第2位的氨基酸残基与正常型TET1蛋白质的从氨基末端起第2位的氨基酸残基不同。

＜8＞根据＜7＞所述的蛋白质，进一步缺失了双加氧酶区域。

＜9＞一种蛋白质，包含序列号：4或6中记载的氨基酸序列。

＜10＞一种核酸，编码＜6＞～＜9＞中任一项所述的蛋白质。

＜11＞一种载体，其插入有＜10＞所述的核酸。

＜12＞一种分化多能性干细胞或用于诱导为该细胞的体细胞，导入有选自下述(a)～(c)中的至少一种分子，

(a)TET1蛋白质

(b)编码TET1蛋白质的核酸

(c)插入有编码TET1蛋白质的核酸的载体。

发明的效果

根据本发明，能够提高分化多能性干细胞的分化能力。此外，能够高效率地制造iPS细胞。此外，还能够制造肿瘤形成能力被抑制、安全性高的分化多能性干细胞。

附图说明

图1为表示在蛋白质酶体抑制剂(MG132)存在下或非存在下利用蛋白质印迹法对人iPS细胞株(#58、#237及#105)中的TET1蛋白质的表达量进行分析的结果的照片。

图2为表示在MG132存在下或非存在下利用定量RT－PCR法对人iPS细胞株(#58、#237及#105)中的TET1mRNA的表达量进行分析的结果的图表。需要说明的是，图中纵轴表示对同一样品进行3个反应、求出其平均值并以GAPDH基因为内标进行标准化而得的相对值。此外，各个柱中的误差棒表示标准误差(图5、8～23中也相同)。

图3为表示在人iPS细胞中表达的3种TET1基因产物的结构的概略图。上段示出作为Refseq而公知的TET1基因的编码区域(CDS)及该CDS所编码的蛋白质的结构。中段及下段示出本发明人等此次新发现的2种TET1基因剪接变体的CDS及该CDS所编码的蛋白质的结构。

图4为表示利用蛋白质印迹法对强制表达在N末端配置有FLAG标签的TET1的人iPS细胞株(NFLAG TET1OE)、强制表达在C末端配置有FLAG标签的TET1的细胞株(CFLAGTET1OE)、以及仅表达载体的对照人iPS细胞株(pCAG－IP)中的TET1蛋白质的表达量进行分析的结果的照片。

图5为表示利用定量RT－PCR法对NFLAG TET1OE、CFLAG TET1OE、以及pCAG－IP中的TET1mRNA的表达量进行分析的结果的图表。

图6为表示为了分析改变TET1蛋白质的改变位点与稳定性的相关性而使用的、改变TET1蛋白质的结构的概略图。图中，从上方起的第一段示出人TET1基因(变体2)的CDS及该CDS所编码的蛋白质的结构。从上方起的第二段表示使人TET1蛋白质的N末端部分(包含670氨基酸的蛋白质)和GFP标签融合了的蛋白质(#93)的结构。从上方起的第三段表示使从N末端起第2位的位置的丝氨酸残基被置换为甘氨酸残基的人TET1蛋白质的N末端部分(包含670氨基酸的蛋白质)和GFP标签融合了的蛋白质(#94)的结构。从上方起的第四段表示使在N末端添加有FLAG标签的人TET1蛋白质的N末端部分(包含670氨基酸的蛋白质)和GFP标签融合了的蛋白质(#95)的结构。

图7为表示利用FACS对分别导入了具有图6所示的结构的GFP融合TET1蛋白质(#93、#94及#95)的人iPS细胞进行分析的结果的直方图。需要说明的是，图中以“人iPS细胞”表示的直方图为表示对作为阴性对照的未表达GFP的iPS细胞进行分析的结果。

图8为表示使人iPS细胞(图中“hiPSC”)、和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞(图中“TET1o/e－hiPSC”)分化诱导为神经细胞时的、TET1 mRNA的表达量的经时变化的图表。图中的横轴表示开始向神经细胞的分化诱导起的天数(图9～23中也同样)。

图9为表示使人iPS细胞、和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞分化诱导为神经细胞时的、DNMT3A mRNA的表达量的经时变化的图表。

图10为表示使人iPS细胞、和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞分化诱导为神经细胞时的、DNMT3B mRNA的表达量的经时变化的图表。

图11为表示使人iPS细胞、和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞分化诱导为神经细胞时的、NANOG mRNA的表达量的经时变化的图表。

图12为表示使人iPS细胞、和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞分化诱导为神经细胞时的、OCT3/4 mRNA的表达量的经时变化的图表。

图13为表示使人iPS细胞、和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞分化诱导为神经细胞时的、SOX2 mRNA的表达量的经时变化的图表。

图14为表示使人iPS细胞、和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞分化诱导为神经细胞时的、SOX1 mRNA的表达量的经时变化的图表。

图15为表示使人iPS细胞、和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞分化诱导为神经细胞时的、NEUROGENIN1 mRNA的表达量的经时变化的图表。

图16为表示使人iPS细胞、和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞分化诱导为神经细胞时的、NEUROGENIN2 mRNA的表达量的经时变化的图表。

图17为表示使人iPS细胞、和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞分化诱导为神经细胞时的、NEUROD1 mRNA的表达量的经时变化的图表。

图18为表示使人iPS细胞、和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞分化诱导为神经细胞时的、ASCL1 mRNA的表达量的经时变化的图表。

图19为表示使人iPS细胞、和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞分化诱导为神经细胞时的、PAX6 mRNA的表达量的经时变化的图表。

图20为表示使人iPS细胞、和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞分化诱导为神经细胞时的、ZNF521 mRNA的表达量的经时变化的图表。

图21为表示使人iPS细胞、和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞分化诱导为神经细胞时的、OTX2 mRNA的表达量的经时变化的图表。

图22为表示使人iPS细胞、和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞分化诱导为神经细胞时的、T mRNA的表达量的经时变化的图表。

图23为表示使人iPS细胞、和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞分化诱导为神经细胞时的、SOX17 mRNA的表达量的经时变化的图表。

图24为表示将人iPS细胞历时12天分化诱导为神经细胞后，对将其重新播种到涂敷有层粘连蛋白质的培养皿中再培养14天的细胞进行观察的结果的显微镜照片。图中的箭头表示确认到神经细胞的细胞体的团块的位置。

图25为表示将强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞历时12天分化诱导为神经细胞后，对将其重新播种到涂敷有层粘连蛋白质的培养皿中再培养14天的细胞进行观察的结果的显微镜照片。

图26为表示使人iPS细胞(图中“hiPSC”)、和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞(图中“TET1o/e－hiPSC”)分化诱导为内胚层系时的、NANOG mRNA的表达量的经时变化的图表。图中的纵轴表示将人iPS细胞的分化诱导前的状态的表达量设为1时的相对量，横轴表示开始向内胚层系的分化诱导起的天数(图27～29中也同样)。

图27为表示使人iPS细胞、和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞分化诱导为内胚层系时的、SOX17 mRNA的表达量的经时变化的图表。

图28为表示使人iPS细胞、和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞分化诱导为内胚层系时的、HNF4A mRNA的表达量的经时变化的图表。

图29为表示使人iPS细胞、和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞分化诱导为内胚层系时的、FOXA2 mRNA的表达量的经时变化的图表。

图30为表示将下述细胞分别分化诱导为神经细胞时的NANOG mRNA的表达量的经时变化的图表，所述细胞为：导入了空载体的人iPS细胞(图中“pCAG－IP”)、强制表达使人TET1蛋白质的N末端部分(包含670氨基酸的蛋白质)与GFP标签融合了的蛋白质的人iPS细胞(图中“#93”)、强制表达使位于从N末端起第2位的丝氨酸残基被置换为甘氨酸残基的人TET1蛋白质的N末端部分(包含670氨基酸的蛋白质)与GFP标签融合了的蛋白质的人iPS细胞(图中“#94”)、及强制表达在N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质(全长)的人iPS细胞(图中“TET1o/e”)。图中的纵轴表示将pCAGIP的分化前的值设为1时的相对值(图32中也同样)。图中的横轴表示从开始向神经细胞的分化诱导起的天数(图31及32中也同样)。

图31为表示将下述细胞分别分化诱导为神经细胞时的SOX1 mRNA的表达量的经时变化的图表，所述细胞为：导入了空载体的人iPS细胞、强制表达使人TET1蛋白质的N末端部分(包含670氨基酸的蛋白质)与GFP标签融合了的蛋白质的人iPS细胞、强制表达使位于从N末端起第2位的丝氨酸残基被置换为甘氨酸残基的人TET1蛋白质的N末端部分(包含670氨基酸的蛋白质)与GFP标签融合了的蛋白质的人iPS细胞、及强制表达在N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质(全长)的人iPS细胞。关于图中的纵轴，由于导入了空载体的人iPS细胞(pCAGIP)的分化前的值为测定灵敏度以下，因此表示任意的相对值。

图32为表示将下述细胞分别分化诱导为神经细胞时的OTX2 mRNA的表达量的经时变化的图表，所述细胞为：导入了空载体的人iPS细胞、强制表达使人TET1蛋白质的N末端部分(包含670氨基酸的蛋白质)与GFP标签融合了的蛋白质的人iPS细胞、强制表达使位于从N末端起第2位的丝氨酸残基被置换为甘氨酸残基的人TET1蛋白质的N末端部分(包含670氨基酸的蛋白质)与GFP标签融合了的蛋白质的人iPS细胞、及强制表达在N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质(全长)的人iPS细胞。

图33为表示由良质iPS细胞构成的集落(图中“Frcs”)及由恶质iPS细胞构成的集落(图中“Prcs”)的外观的例子的显微镜照片。

图34为表示导入了模拟载体的人iPS细胞(也称为“mv－iPSC”，图35及36中也同样)和强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的人iPS细胞(也称为“TET1－iPSC”，图35及36中也同样)的细胞增殖曲线的图表。图中，横轴表示天数。

图35为表示利用FACS对mv－iPSC及TET1－iPSC的细胞周期进行解析而得的结果的直方图。图中，各直方图的下方还一并记载了G1、S及G2期中的细胞数的比率。

图36为表示在DNA微阵列解析中在mv－iPSC中的表达和在TET1－iPSC中的表达不同的基因的散布图。DNA微阵列解析使用Agilent公司制SurePrint G3 Human GE 8x60K v21彩色斑点方式(カラープラットフォーム)，通过75％位移(75パーセンタイルシフト)方法进行。

图37为表示小鼠ES细胞从原始态阶段向起始态阶段的移行过程的概略图。即为表示如下过程的概略图：在原始态阶段，在除去白血病抑制因子(LIF)及促进向原始态阶段的移行的其它物质的培养基中维持小鼠ES细胞，通过将该细胞转移到添加了FGF2及活化素A(TGFβ/Nodal信号转导的激动剂)的培养基中而诱导向起始态阶段的移行。

图38为表示在利用qPCR得到的解析结果中，在从原始态阶段向起始态阶段的移行过程中上胚层标志物的表达亢进的图表。图中，表示各标志物的表达的棒状图中，从左侧起依次表示开始诱导向起始态阶段的移行起0小时、24小时、48小时后的结果(关于时间的表记，在图40～54中也同样)。

图39为表示从Tet1敲除(Tet1－KD)小鼠ES细胞至上胚层样干细胞(EpiLC)的过程的概略图。Tet1－KD小鼠ES细胞是通过导入Tet1 shRNA并以嘌呤霉素耐性为指标进行筛选而建立的(参照K.Williams etal.，Nature 473，343(May 19，2011))。

图40为表示利用定量RT－PCR对在小鼠ES细胞从原始态阶段向起始态阶段的移行过程中Tet1敲除所产生的影响进行解析的结果的图表。图中，“Tet1KD”表示敲除了Tet1的小鼠ES细胞的结果。“GFPKD”表示作为Tet1KD细胞的对照的、导入了以GFP为靶标的shRNA的小鼠ES细胞的结果。“ICM”表示对ICM/原始态型标志物的转录水平进行解析的结果。

图41为表示利用qPCR对在从原始态阶段向起始态阶段的移行过程中Tet1－KD小鼠ES细胞(Tet1KD)及其对照(GFP－KD)中的Tet1、上胚层标志物(Epi)及原始内胚层标志物(PE)的转录水平进行解析的结果的图表。

图42为表示利用蛋白质印迹对Tet1－KD小鼠ES细胞(Tet1KD)及GFP－KD小鼠ES细胞(GFP－KD)中的Tet1、Tet2、ICM标志物及上胚层标志物的蛋白质表达水平进行解析的结果的照片。需要说明的是，原始态型因子(特别是Nanog、Esrrb、Tbx3及Stat3)的蛋白质水平的表达在Tet1－KD EpiLC中被维持。

图43为表示利用蛋白质印迹对JAK抑制剂的存在下(JAKi+)或非存在下(JAKi－)的、在从原始态阶段向起始态阶段的移行过程中Stat3、Dnmt3a及Dnmt3b的蛋白质表达水平进行解析的结果的照片。作为JAK抑制剂，使用了JAK抑制剂I(Calbiochem公司制，在培养基中的添加浓度：1μM)。此外，关于Dnmt3a，利用蛋白质印迹检测到2个变体(v1及v2)。

图44为利用qPCR对JAK抑制剂的存在下(JAKi+)或非存在下(JAKi－)的、在从原始态阶段向起始态阶段的移行过程中Gata6转录水平进行解析的结果的图表。

图45为表示MG132存在下(MG132+)或非存在下(MG132－)的、在从原始态阶段向起始态阶段的移行过程中小鼠ES细胞的Tet1 mRNA的表达水平的图表。

图46为表示利用蛋白质印迹对MG132存在下(MG132+)或非存在下(MG132－)的、在从原始态阶段向起始态阶段的移行过程中小鼠ES细胞的Tet1蛋白质的表达水平进行解析的结果的照片。图中的数值表示以肌动蛋白的表达量为基准修正后的Tet1蛋白质的表达量。

图47为表示利用全基因组甲基化测序对从原始态阶段向起始态阶段的移行过程中的Tcl1的甲基化可变区域(DMR)进行解析的结果的图。图中，黑色圆表示甲基化(羟甲基化)的CpG位点，白色圆表示非甲基化CpG位点。全基因组甲基化测序参照H.Wu etal.，Nature 473，389(May 19，2011)中的记载来进行。

图48为表示Tet1/Prdm14双敲除小鼠ES细胞的、从原始态阶段至起始态阶段的移行过程的概略图。

图49为表示利用定量RT－PCR对从原始态阶段向起始态阶段的移行过程中的Tet1/Prdm14双敲除小鼠ES细胞的Otx2mRNA表达水平进行解析的结果的图表。“GFPKDGFPKD”表示导入以GFP为靶标的shRNA而建立的细胞株(对照)的结果，“GFPKD P14KD#1～3”表示导入了以GFP为靶标的shRNA及以Prdm14为靶标的shRNA而建立的各细胞株的结果，“Tet1KD GFPKD”表示导入了以GFP为靶标的shRNA及以Tet1为靶标的shRNA而建立的细胞株的结果，“Tet1KD P14KD#1～3”表示导入了以Tet1为靶标的shRNA及以Prdm14为靶标的shRNA而建立的各细胞株的结果(关于图中的细胞株表记，图50～52中也同样)。

图50为表示利用定量RT－PCR对从原始态阶段向起始态阶段的移行过程中的Tet1/Prdm14双敲除小鼠ES细胞的Dnmt3a mRNA表达水平进行解析的结果的图表。

图51为表示利用定量RT－PCR对从原始态阶段向起始态阶段的移行过程中的Tet1/Prdm14双敲除小鼠ES细胞的Dnmt3b mRNA表达水平进行解析的结果的图表。

图52为利用定量RT－PCR对从原始态阶段向起始态阶段的移行过程中的Tet1/Prdm14双敲除小鼠ES细胞的Gata6 mRNA表达水平进行解析的结果的图表。

图53为表示利用定量RT－PCR对从原始态阶段向起始态阶段的移行过程中的Dnmt3a1过表达小鼠ES细胞(3a1OE)、Dnmt3a2过表达小鼠ES细胞(3a2OE)及Dnmt3b过表达小鼠ES细胞(3bOE)的Otx2 mRNA表达水平进行解析的结果的图表。“GFPKD pCAG－IH”表示导入了模拟载体(pCAG－IH)及以GFP为靶标的shRNA而建立的细胞株(对照)的结果，“GFPKD3a1OE”表示导入了以GFP为靶标的shRNA和编码Dnmt3a1的pCAG－IH载体而建立的各细胞株的结果，“GFPKD 3a2OE”表示导入了以GFP为靶标的shRNA和编码Dnmt3a2的pCAG－IH载体而建立的各细胞株的结果，“GFPKD 3bOE”表示导入了以GFP为靶标的shRNA和编码Dnmt3b的pCAG－IH载体而建立的各细胞株的结果。此外，“Tet1KD pCAG－IH”表示导入了模拟载体及以Tet1为靶标的shRNA而建立的细胞株(对照)的结果，“Tet1KD 3a1OE”表示导入了以Tet1为靶标的shRNA和编码Dnmt3a1的pCAG－IH载体而建立的各细胞株的结果，“Tet1KD 3a2OE”表示导入了以Tet1为靶标的shRNA和编码Dnmt3a2的pCAG－IH载体而建立的各细胞株的结果，“Tet1KD 3bOE”表示导入了以Tet1为靶标的shRNA和编码Dnmt3b的pCAG－IH载体而建立的各细胞株的结果(关于图中的细胞株表记，图54中也同样)

图54是表示利用定量RT－PCR对从原始态阶段向起始态阶段的移行过程中的Dnmt3a1过表达小鼠ES细胞(3a1OE)、Dnmt3a2过表达小鼠ES细胞(3a2OE)及Dnmt3b过表达小鼠ES细胞(3bOE)的Gata6mRNA表达水平进行解析的结果的图表。

具体实施方式

＜本发明的分化多能性干细胞的制造方法＞

本发明提供一种分化多能性干细胞的制造方法，其包含将选自下述(a)～(c)中的至少一种分子导入分化多能性干细胞或用于诱导为该细胞的体细胞的工序，

(a)TET1蛋白质

(b)编码TET1蛋白质的核酸

(c)插入有编码TET1蛋白质的核酸的载体。

并且，根据该制造方法，能够制造分化能力提高了的分化多能性干细胞。此外，根据前述制造方法，通过将TET1蛋白质等导入前述体细胞，还能够高效制造诱导多能性干细胞(iPS细胞)。进而，根据前述制造方法，还能够制造肿瘤形成能力被抑制、安全性高的分化多能性干细胞。

本发明中，“分化多能性干细胞”是指：具备能够转变为与自身不同的多系统种类的细胞的能力(分化多能性)、和能够创造出即使经过细胞分裂也具有与自身相同的能力的细胞来作为子代细胞的能力(自我复制能力)的细胞。

本发明中，“分化能力”是指能够转变为与自身不同种类的细胞的能力。此外，“分化能力提高”的含义不仅仅是促进单纯的分化诱导，而且包含了导致分化诱导偏倚的因子(例如，向外胚层系分化诱导时的T及SOX17)的衰减(分化偏向性的消除)以及NANOG等抑制分化诱导的因子的衰减(消除分化抵抗性)，其中单纯的分化诱导例如为诱导向不同种类细胞分化的因子(例如，向神经细胞的诱导中的SOX2)、不同种类的细胞的分化标志物(例如，神经细胞中的SOX1、NEUROGENIN1、NEUROGENIN2、NEUROD1、ASCL1、PAX6、ZNF521及OTX2)的表达亢进。如后述的实施例所示，分化多能性干细胞的分化多能性通常由于分化偏向性、分化抵抗性而被抑制。与此相对，根据本发明，通过消除所述分化偏向性及分化抵抗性，能够切实发挥该细胞的分化多能性。因此，本发明中的“分化能力提高”也包含了分化多能性的改善。

作为通过本发明而提高了分化能力的“分化多能性干细胞”，可以列举例如ES细胞、上胚层干细胞(EpiS细胞)、胚胎癌性细胞(EC细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、多能性生殖细胞(mGS细胞)、MUSE细胞(参照Kuroda Y.等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、2010年、107卷、19号、8639～8643页)等可由生物体获取的细胞。进而，该细胞还包含iPS细胞等之类的、按照人为地使由生物体获取的体细胞具有分化多能性等的方式诱导而得的细胞。

此外，对于作为这些细胞的来源的生物体，没有特别限制，可以列举人及非人动物(小鼠、大鼠、牛、马、猪、羊、猴、狗、猫、鸟等)的身体。

此外，分化多能性干细胞可以分为反映了在发生阶段中接近受精卵的早期状态(胚泡)的性质的原始态型分化多能性干细胞、以及反映了与胚泡相比发生阶段靠后的上胚层性质的起始态型分化多能性干细胞，已经明确了后者比前者的分化能力差。因此，本发明的制造方法对于起始态型分化多能性干细胞更有效，作为所述具有起始态型性质的分化多能性干细胞，可以列举例如来自于人、猴、猪、羊、狗或牛的ES细胞及iPS细胞、以及来自于人及前述非人动物细胞的上胚层干细胞。

本发明的制造方法中，作为导入到这样的分化多能性干细胞或后述的用于诱导为分化多能性干细胞的体细胞中的“TET1蛋白质”，优选变异型TET1蛋白质。

本发明中，“变异型TET1蛋白质”只要具有通过导入到分化多能性干细胞中而使该细胞的分化能力提高的功能即可，可以是后述的在正常型TET1蛋白质中人为地导入变异的蛋白质，也可以是后述的正常型TET1蛋白质在自然界中(即，非人为)产生了变异的蛋白质。关于是否具有提高分化能力的功能可以如后所述地进行判断，例如将TET1蛋白质等导入分化多能性干细胞等中，在由该细胞向不同细胞的分化诱导过程中，测定诱导向不同种类的细胞的分化的因子、分化标志物、导致分化诱导偏倚的因子、抑制分化诱导的因子的表达量，由此进行判断。

作为变异型TET1蛋白质，优选在起始态型分化多能性干细胞中与正常型TET1蛋白质相比稳定性提高了的蛋白质。关于蛋白质与正常型TET1蛋白质相比稳定性是否提高，可以如后述实施例所示那样，使用本领域技术人员公知的蛋白质印迹等蛋白质检测法来进行评价。

作为“与正常型TET1蛋白质相比稳定性提高了的变异型蛋白质”的优选例子，可以列举从其氨基末端起第2位的氨基酸残基与正常型TET1蛋白质的从氨基末端起第2位的氨基酸残基不同的TET1蛋白质。

从N末端起第2位的氨基酸与正常型TET1蛋白质的从N末端起第2位的氨基酸残基不同的TET1蛋白质，可以如下所述地通过在正常型TET1蛋白质中人为导入变异而获得。此外，还可以以在自然界中发生了同样的变异的变异蛋白质形式来获得。

关于TET1蛋白质的氨基酸置换体，可以列举例如将正常型TET1蛋白质的从N末端起第2位的氨基酸残基(人源TET1蛋白质时，为丝氨酸残基)置换为不同氨基酸(例如，甘氨酸残基)而得的TET1蛋白质。作为对正常型TET1蛋白质的从N末端起第2位的氨基酸残基进行置换的方法，没有特别限制，可以列举例如定点诱变(site－directed mutagenesis)法(Kramer，W.&Fritz，HJ.，Methods Enzymol，1987，154，350.)。

关于TET1蛋白质的氨基酸插入体及氨基酸添加体，可以列举在正常型TET1蛋白质的从N末端起的第1位和第2位的氨基酸残基之间插入有1个或多个氨基酸的TET1蛋白质、在正常型TET1蛋白质的N末端直接添加了1个或多个氨基酸的TET1蛋白质。此时，对多个氨基酸没有特别限制，可以列举例如2～100个氨基酸(优选2～50个氨基酸、2～10个氨基酸)。对进行所述氨基酸的插入、添加的方法没有特别限制，可以列举例如后述实施例所示那样的、使用了含有编码所插入或所添加的氨基酸或多肽的寡核苷酸的引物的聚合酶链反应(PCR)。

关于TET1蛋白质的氨基酸缺失体，可以列举在正常型TET1蛋白质的N末端部分缺失了1个或多个氨基酸的TET1蛋白质。此时，从不损害前述DNA结合域、TET1蛋白质的功能能够维持的观点出发，优选在正常型TET1蛋白质的从N末端起的1～584位的区域中缺失1个或多个氨基酸。此外，对TET1蛋白质的氨基酸缺失体中的多个氨基酸没有特别限制，可以列举例如2～100个氨基酸(优选2～50个氨基酸、2～10个氨基酸)。对进行所述氨基酸的缺失的方法没有特别限制，可以列举例如利用PCR对编码所述缺失区域的TET1蛋白质的DNA进行扩增的方法。

此外，如后述的实施例9所示，TET1蛋白质中，去甲基化酶活性并非必需，只要维持了DNA结合能力则能够提高分化多能性干细胞的分化能力。因此，变异型TET1蛋白质可以是缺失了比DNA结合域(CXXC结构域)更靠近羧基末端侧(C末端侧)的区域的蛋白质，可以列举例如缺失了双加氧酶区域的变异型TET1蛋白质、富半胱氨酸区域及双加氧酶区域均缺失的变异型TET1蛋白质。

本发明中，作为TET1蛋白质的DNA结合域，例如为人TET1蛋白质(包含序列号：2、4或6中记载的氨基酸序列的蛋白质)中的第585位的赖氨酸至第613位的赖氨酸的氨基酸序列构成的结构域。作为双加氧酶区域，例如为序列号：2中记载的氨基酸序列中的第1611～2074位的氨基酸构成的区域，序列号：4中记载的氨基酸序列中的第1640～2103位的氨基酸构成的区域，序列号：6中记载的氨基酸序列中的第809～1272位的氨基酸构成的区域。此外，作为富半胱氨酸区域，例如为序列号：2中记载的氨基酸序列中的第1418～1610位的氨基酸构成的区域，序列号：4中记载的氨基酸序列中的第1418～1608位的氨基酸及第1638～1639位的氨基酸构成的区域，序列号：6中记载的氨基酸序列中的第657～777位的氨基酸及第807～808位的氨基酸构成的区域。

以上对本发明的变异型蛋白质的优选例子进行了说明，但只要具有通过导入分化多能性干细胞而使该细胞的分化能力提高的功能即可，也可以是在正常型TET1蛋白质中导入了其它变异的TET1蛋白质。从与该酶的活性为同等的观点出发，可以列举例如：在TET1蛋白质和TET2蛋白质或TET3蛋白质中，在酶活性位点(双加氧酶区域)导入了TET2蛋白质或TET3蛋白质的双加氧酶区域以代替TET1蛋白质的双加氧酶区域的蛋白质；使包含TET1蛋白质的DNA结合域的蛋白质与TET2蛋白质或TET3蛋白质的双加氧酶区域间接或直接结合而成的蛋白质。

本发明的制造方法中，还可以考虑利用正常型TET1蛋白质作为导入分化多能性干细胞等中的TET1蛋白质。“正常型TET1蛋白质”是指：典型地为包含序列号：2、4或6中记载的氨基酸序列的蛋白质，或者为该蛋白质的天然同系物且在起始态型分化多能性干细胞中被分解的蛋白质。在利用正常型TET1蛋白质时，优选在该细胞中导入超过了分化多能性干细胞等中的蛋白质分解能力那样的过剩量。此外，从在分化多能性干细胞等中抑制这些蛋白质的分解的观点出发，还优选进一步导入TET1蛋白质的诱饵。作为诱饵，可以列举例如正常型TET1蛋白质的N末端部分的多肽。

如后述的实施例所示，为了提高分化多能性干细胞的分化能力，必须维持包含序列号：2、4或6中记载的氨基酸序列的蛋白质的DNA结合域的功能。因此，作为包含序列号：2、4或6中记载的氨基酸序列的蛋白质的天然同系物，优选与该蛋白质的DNA结合域(CXXC基序)的氨基酸序列具有70％以上(例如，75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％以上)的同源性的天然蛋白质。作为所述天然蛋白质，可以列举由XP＿003359270、XP＿004777901、XP＿005602635、XP_002805756、XP_003928828、XP_002735044、XP_005168673、CG43444等登录号规定的氨基酸序列构成的蛋白质。

本发明中的“氨基酸序列的同源性”是指在进行比较的氨基酸序列间完全一致的氨基酸、及碱性·酸性等物理化学性质方面一致的氨基酸(类似氨基酸)的比率(％)，可以利用BLASTP程序(Altschul et al.J.Mol.Biol.，215：403－410，1990)等来确定。该程序基于Karlin及Altschul所提出的BLAST算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：2264－2268，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873－5877，1993)。更具体而言，可以在NCBI的BLAST同源性检索页(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中，使用这些缺省参数对“蛋白质blast”或“blastx”等程序进行解析，由此确定同源性。这些解析方法的具体方法是公知的。

予以说明，即使本发明的变异型TET1蛋白质为在起始态型分化多能性干细胞中被分解的蛋白质，也与正常型TET1蛋白质同样地可以通过导入过剩量或通过进而导入诱饵而用于本发明的制造方法。

关于变异型TET1蛋白质的制备方法，可以列举改变编码上述正常型TET1蛋白质的核酸的方法。并且，本领域技术人员可以通过例如将编码前述变异型TET1蛋白质的核酸介由杆状病毒导入Sf9细胞等昆虫细胞中，从而制备本发明的变异型TET1蛋白质。此外，除了所述基因水平的改变以外，本发明的变异型TET1蛋白质还可以基于其氨基酸序列利用市售的多肽合成仪进行化学合成。

此外，关于正常型TET1蛋白质的制备方法，本领域技术人员可以利用公知的杂交技术从由表达TET1蛋白质的人或人以外的动物的组织等制备的cDNA文库或基因组DNA文库分离编码正常型TET1蛋白质的核酸，并与前述的变异型TET1蛋白质的制备同样操作，将所分离的核酸导入昆虫细胞等，从而制备。此外，基于序列号：2中记载的氨基酸序列等信息，利用市售的多肽合成仪进行化学合成，由此也可以制备正常型TET1蛋白质。

对将编码前述TET1蛋白质的核酸导入分化多能性干细胞或后述的用于诱导为分化多能性干细胞的体细胞的方法没有特别限制，可以利用例如将编码TET1蛋白质的核酸(例如，cDNA)插入到包含了在各细胞中起作用的启动子的适当表达载体中，利用感染、脂质体转染法、脂质体法、电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、显微注射法将该表达载体导入到细胞。

作为这样的表达载体，可以列举例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺随伴病毒、疱疹病毒、仙台病毒等病毒载体，Episomal载体、PiggyBac转座子载体等动物细胞表达质粒。这些中，从编码TET1蛋白质的核酸不插入到被导入的细胞的基因组中的观点出发，优选使用Episomal载体或仙台病毒。此外，从前述核酸虽然暂时插入前述基因组但能够通过转座酶将该核酸从该基因组除去的观点出发，优选使用PiggyBac转座子载体。

作为所述表达载体中使用的启动子，可以列举例如CAG启动子、SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV启动子、RSV启动子、HSV－TK启动子等。此外，所述启动子还可以通过药剂(例如，四环素)的有无等来控制被插入到该启动子下游的基因的表达。表达载体中除了启动子以外还可以含有增强子、聚A添加信号、选择标志物基因(例如，嘌呤霉素耐性基因、新霉素耐性基因)、SV40复制起点等。

此外，作为利用上述方法导入到分化多能性干细胞等中的核酸所编码的TET1蛋白质的表达，既可以是瞬时的表达，也可以是诱导性表达，还可以是恒常表达，从使作为分化诱导抑制因子的NANOG等的表达消失的观点，此外从使利用本发明的方法制造的分化多能性干细胞分化为其它细胞的过程中若TET1蛋白质使得所谓早期化的信号残存会妨碍该分化的观点出发，优选瞬时表达或诱导性表达。作为所述表达的期间，优选使利用本发明的方法制造的分化多能性干细胞向其它细胞的分化诱导开始前一天至从该分化诱导开始起的4天以内。

在将TET1蛋白质导入各细胞时，可以列举使用蛋白质导入试剂的方法、使用将蛋白质导入结构域(PTD)添加到该改变蛋白质而得的融合蛋白质的方法、电穿孔法、显微注射法。

此外，对将TET1蛋白质、编码该蛋白质的核酸或插入有该核酸的载体导入细胞时、或此后的培养条件没有特别限制，本领域技术人员可以根据导入核酸等的细胞适当设定培养基的组成、培养温度、培养湿度、二氧化碳及氧气等的浓度。此外，从高效率地进行基于TET1蛋白质的羟基化反应的观点出发，培养基中还可以含有铁、α－酮戊二酸盐或抗坏血酸(维生素C)。

本发明的制造方法中，对被导入TET1蛋白质等的“用于诱导为分化多能性干细胞的体细胞”没有特别限制，可以列举例如成纤维细胞、上皮细胞、血球系细胞、来自动物被检体的任意细胞。此外，由所述体细胞向分化多能性干细胞(特别是iPS细胞)的诱导通常可以通过在体细胞中导入能够消去体细胞的细胞记忆的“重编程因子”而进行。

作为所述“重编程因子”，只要是通过导入到体细胞而能够单独或与其它重编程因子协同地对该体细胞赋予分化多能性的因子即可，没有特别限制，优选为选自OCT3/4、c－MYC、L－MYC、N－MYC、SOX2、KLF4、KLF5、KLF2、LIN28、NANOG、ECAT1、ESG1、FBX15、ERAS、ECAT7、ECAT8、GDF3、SOX15、ECAT15－1、ECAT15－2、Fthl17、SALL1、SALL4、REX1、UTF1、TCL1、STELLA、β－连环蛋白、ESRRB、PRDM14、TBX3、STAT3、GATA3及GRB2等蛋白质以及miR－199a－3p、miR－291－3p、miR－294、miR－295(miR－290簇)及miR－302簇等微小RNA中的至少一种因子。进而，这些因子中，从较少因子即能够高效地建立iPS细胞的观点出发，更优选将OCT3/4、c－MYC、SOX2及KLF4(所谓山中4因子)导入体细胞。此外，从抑制所获得的分化多能性干细胞的癌化风险的观点出发，理想的是将L－MYC导入体细胞以代替前述4因子中的c－MYC或将OCT3/4、SOX2及KLF4(3因子)导入体细胞。进而，从分化多能性干细胞的诱导效率方面出发，理想的是将OCT3/4、L－MYC、SOX2、KLF4及LIN28、以及后述的抑制p53的功能的化合物或核酸、或抑制p21的功能的化合物或核酸导入体细胞。此外，作为“重编程因子”，也可以不是前述的蛋白质等，而是代替这些蛋白质的功能的、或诱导这些蛋白质的表达的低分子化合物。作为所述低分子化合物，可以列举例如丙戊酸(VPA)等组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、CHIR99021等GSK－3β抑制剂、616452等TGF－β1型受体抑制剂、反苯环丙胺(Tranylcypromine)等组蛋白去甲基化酶抑制剂、毛喉素(Forskolin)等cAMP产生促进剂、3－去氮腺嘌呤(DZNep)等组蛋白甲基化酶抑制剂、及这些的组合。

本发明中，对将重编程因子导入体细胞的方法没有特别限制，可以与前述TET1蛋白质等同样地适当选择公知的手法，在其为蛋白质时以蛋白质的形态或编码该蛋白质的核酸的形态导入体细胞，此外在其为微小RNA时以核酸的形态导入体细胞，若重编程因子残留在所制作的分化多能性干细胞中时，该细胞对向其它细胞的分化诱导显示出抵抗性，新的细胞记忆难以固定，从该观点出发，优选使用Episomal载体、仙台病毒、PiggyBac转座子载体将编码重编程因子的核酸导入体细胞的方法。

所述重编程因子的导入可以在导入TET1蛋白质或编码该蛋白质的核酸之前，也可以与导入同时，还可以是导入之后。

此外，对导入了重编程因子后的体细胞的培养方法没有特别限制，本领域技术人员可以适当选择利用公知的培养方法。作为所述公知的培养方法，可以列举例如在饲养细胞上最初以适合于体细胞培养的培养基进行培养并逐渐更换为适合于分化多能性干细胞的培养基的培养方法。

作为“饲养细胞”，只要是能够用于分化多能性干细胞的增殖和维持的细胞即可，可以列举例如MEF(小鼠胎仔成纤维细胞)、OP－9细胞、PA6细胞、NIH3T3细胞、M15细胞、10T/2细胞、STO细胞、SNL细胞。此外，就这些细胞而言，理想的是利用抗生素处理(利用丝裂霉素C等进行的处理)、放射线处理等抑制了细胞增殖。

作为“适合于体细胞培养的培养基”，本领域技术人员可以基于公知的信息根据体细胞的种类适当制备。例如，作为基础培养基，可以列举洛斯维帕克纪念研究所(RPMI)1640培养基、最小必需培养基(α－MEM)、杜尔贝克改变伊戈尔培养基(DMEM)、F12培养基，可以在该基础培养基中适当添加人血清、细胞因子、培养中必需的氨基酸(例如，L－谷氨酰胺)、抗生素(例如，链霉素、青霉素、嘌呤霉素)而制备“适合于体细胞培养的培养基”。

作为“适合于分化多能性干细胞的培养基”，根据作为来源的动物的种类从公知的培养基中适当选择使用即可，例如，作为适合于人源分化多能性干细胞的培养的培养基，可以列举含有敲除血清代替物(KSR)、L－谷氨酰胺、非必需氨基酸、2－巯基乙醇、FGF2等的DMEM/F12培养基。

从容易维持未分化状态的观点出发，以上那样的、利用与饲养细胞共培养的向分化多能性干细胞的诱导以及此后的维持培养法是优选的。但是，从提高使分化多能性干细胞分化诱导为神经系统等外胚层系的效率的观点出发，以及从除了进行分化诱导外还容易控制为所需的细胞密度的观点出发，不使用饲养细胞的分散培养法对于本发明所述的分化多能性干细胞是优选的。所述不使用饲养细胞的分散培养例如可以利用以下所示的方法来进行。

首先，将导入了重编程因子的体细胞用Thomson等提出的E8培养基(Chen，G.等NatMethods、2011年、8卷、5号、424～429页)培养。然后，在该培养中能够确认集落形成的阶段，使该集落的分化多能性干细胞分散在含有KSR、FGF2、活化素A、ROCK抑制剂及纤连蛋白的培养基中后，将其重新播种到涂敷I型胶原的培养皿中，由此可以进行不使用饲养细胞的分散培养。

所述分散培养中使用的培养基中，作为添加了KSR、FGF2及活化素A等的基础培养基，可以列举例如DMEM/F12培养基、CDM培养基。此外，作为添加在所述基础培养基中的KSR、FGF2及活化素A的浓度，分别优选15～25％、4～100ng/ml及0.01～20ng/ml，特别优选为20％、15ng/ml及10ng/ml。此外，除了上述KSR等以外，还可以适当添加其它成分，例如L－谷氨酰胺、非必需氨基酸、抗生素(例如，链霉素、青霉素、嘌呤霉素)。

此外，为了进一步提高向分化多能性干细胞的诱导效率，不论是否使用饲养细胞，在上述培养方法中，均优选在将重编程因子导入体细胞时或导入后在培养基添加抑制HDAC的功能的化合物(VPA、曲古抑菌素A、丁酸钠、MC1293、M344等低分子抑制剂等)、抑制G9a组蛋白甲基转移酶的功能的化合物(BIX－01294等低分子抑制剂等)、抑制p53的功能的化合物(Pifithrin－α(PFT－α)等低分子抑制剂等)、抑制p21的功能的化合物、抑制let－7簇、miR－17－92、miR－21、miR－29a、miR－106a－363或miR－106b－25这些微小RNA的功能的化合物。此外，从与前述同样的、通过抑制各因子的功能而进一步提高向分化多能性干细胞的诱导效率的观点出发，还可以利用公知的基因导入手法将抑制HDAC、G9a、p53、p21或let－7簇等微小RNA的功能的核酸(siRNA、shRNA、反义体、适体等)导入前述体细胞。

进而，上述培养方法中，此外的培养条件(培养温度、氧气及二氧化碳的浓度等)可以由本领域技术人员适当设定，从提高向分化多能性干细胞的诱导效率的观点出发，优选在低氧(氧浓度：5％)条件下的培养。

以上对本发明的分化多能性干细胞的制造方法进行了说明，关于通过所述制法制作的分化多能性干细胞与未导入TET1蛋白质的分化多能性干细胞相比分化能力是否提高，可以如后述的实施例7中记载那样，以向期望的细胞的分化诱导效率(例如，分化诱导后的期望的细胞数/分化诱导前的分化多能性干细胞)为指标来判断。此外，例如还可以如后述的实施例5及6中记载那样，测定向期望的细胞的分化诱导过程中的、分化标志物(例如，神经细胞中的SOX1、NEUROGENIN1、NEUROGENIN2、NEUROD1、ASCL1、PAX6、ZNF521及OTX2)、诱导向不同种类的细胞分化的因子(例如，向神经细胞的诱导中的SOX2)、导致分化诱导偏倚的因子(例如，向外胚层系的分化诱导时的T及SOX17)、抑制分化诱导的因子(例如，NANOG、OCT3/4)的表达量，将获得的表达量作为前述分化能力是否提高的1个指标。进而，如后述的实施例11所示，未导入TET1蛋白质的现有的人iPS细胞中，FOXA2、LHX1、LIM2、SOX17、EOMES及T等分化标志物以及GPC4、GAGE2B及GAGE7等未分化标志物也高度表达。因此，这些标志物的表达量也可以作为前述分化能力是否提高的1个指标来使用。

予以说明，还已知这些标志物中的GPC4、GAGE2B及GAGE7为癌相关标志物，因此，本发明还能够提供一种以选自GPC4、GAGE2B及GAGE7中的至少1个癌相关标志物的表达为指标来评价分化多能性干细胞的安全性(肿瘤形成能力的有无)的方法。

＜本发明的蛋白质、核酸、载体及细胞＞

如上所述，在本发明的分化多能性干细胞的制造方法中，在起始态型分化多能性干细胞中不被分解的TET1蛋白质是有用的。因此，本发明提供一种变异型TET1蛋白质，其为与正常型TET1蛋白质相比稳定性提高了的蛋白质，还提供一种TET1蛋白质，其优选为变异型TET1蛋白质，其的从氨基末端起第2位的氨基酸残基与正常型TET1蛋白质的从氨基末端起第2位的氨基酸残基不同。

此外，包含序列号：4或6中记载的氨基酸序列的TET1蛋白质是本发明人等首次发现的TET1蛋白质，能以正常型TET1蛋白质形式用于本发明的制造方法，此外在前述的变异型TET1蛋白质的制备中也有用。当然，本发明也提供这些TET1蛋白质。

进而，如前所述，为了使与正常型TET1蛋白质相比稳定性提高了的变异型TET1蛋白质在分化多能性干细胞中表达，编码该蛋白质的核酸也是有用的。此外，从制备该变异型TET1蛋白质及编码该蛋白质的核酸方面出发，以及从在本发明的制造方法中利用编码正常型TET1蛋白质的核酸的方面出发，编码包含序列号：4或6中记载的氨基酸序列的TET1蛋白质的核酸也是有用的。因此，本发明还提供这些核酸。

此外，除了如前所述地将核酸导入体细胞等，还优选该核酸被插入到载体中。因此，本发明还提供插入有编码与正常型TET1蛋白质相比稳定性提高了的变异型TET1蛋白质的核酸的载体或插入有编码包含序列号：4或6中记载的氨基酸序列的TET1蛋白质的核酸的载体。

进而，如前所述，根据本发明的制造方法，能够获得分化能力提高了的分化多能性干细胞。因此，本发明还提供一种导入了选自下述(a)～(c)中的至少一种分子的、分化多能性干细胞或用于诱导为该细胞的体细胞，

(a)TET1蛋白质

(b)编码TET1蛋白质的核酸

(c)插入有编码TET1蛋白质的核酸的载体。

实施例

以下基于实施例对本发明进行更具体的说明，本发明不受以下实施例限定。此外，本实施例中使用的实验方法如下。

＜使用EpisomalDNA载体制作人iPS细胞＞

本实施例中使用的人iPS细胞是按照“Okita，K.等、Nat Methods、2011年、8卷、5号、409～412页”中记载的方法制作的。即，利用针对p53的短发夹RNA(shp53)及POU5F1(OCT3/4)、SOX2及KLF4、L－MYC及LIN28、这3种组合将shRNA或编码各蛋白质的DNA插入到Episomal载体pCXLE中，制备了3种载体DNA。

予以说明，在所述iPS细胞的制作过程中，通常用于消去体细胞的细胞记忆的“重编程”是通过使体细胞强制表达所谓的山中4因子(OCT3/4、SOX2、KLF4及c－Myc)来进行的。本实施例中，从抑制iPS细胞的肿瘤化的观点出发，用了肿瘤原性低的重编程因子L－MYC来代替这些重编程因子中的c－MYC。此外，除了这些因子以外，还将作为使人iPS细胞的诱导效率提高的因子而已知的LIN28也导入了体细胞。进而，p53对重编程有抑制作用，因此使体细胞中产生基于shp53的RNA干扰(RNAi)来抑制p53的表达，由此提高了人iPS细胞的诱导效率。

此外，在所述iPS细胞的制作过程中，若重编程因子的表达残留在所制作的iPS细胞中，则担心该iPS细胞对于向神经细胞等其它细胞的分化诱导显示出抵抗性(分化抵抗性)，新的细胞记忆难以固定。因此，就本实施例而言，本实施例中选择了使用将重编程因子插入到细胞的基因组DNA、向iPS细胞的诱导结束后重编程因子不会持续表达的Episomal载体的基因导入法。

然后，使用基因导入试剂(人皮肤成纤维细胞用核转染仪试剂盒)及基因导入装置(核转染仪：注册商标)(均为Lonza公司制)将前述3种载体DNA各1μg分别导入1.0x10⁵个来自于人新生儿的成纤维细胞。然后，通过显示为不使用饲养细胞也能够诱导iPS细胞的、由Thomson等提出的E8培养基(Chen，G.等、Nat Methods、2011年、8卷、5号、424～429页)培养前述载体DNA导入后的细胞。此时，在导入前述载体DNA后5～10天，为了促进成纤维细胞的增殖，以100nM的浓度添加氢化可的松，以后通过未添加氢化可的松并且还除去了TGFβ的E8培养基进行向iPS细胞的诱导。此外，1～2天进行一次培养基更换，进而，该诱导中使用低氧培养装置，在氧浓度5％、二氧化碳浓度5％下进行细胞的培养。

并且，通过所述培养，在导入前述载体DNA后25～30天左右确认到多个iPS细胞集落的出现。然后，使用如后所述的添加了敲除血清代替物(KSR)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、活化素A、ROCK抑制剂及纤连蛋白等的培养基，将其逐个播种到涂敷了I型胶原的培养皿中并进行培养，由此获得了iPS细胞株。具体而言，获得了分别命名为YMhiPSC058、YMhiPSC105及YMhiPSC237等的、能够稳定培养的人iPS细胞株。

进而，由这些细胞株获得亚克隆，以它们的分化能力为指标进行了评价，结果未进行图示，但发现这些iPS亚克隆各自的性质不同，明确了通过前述那样的方法建立的iPS细胞株至少在分化能力方面未能维持“均质性”。示出了本实施例中获得的细胞株中的、目前判断为分化能力偏倚最小的YMhiPSC058sbc6亚株的解析结果。

＜不使用饲养细胞的、人iPS细胞的分散培养方法＞

在本实施例中，人iPS细胞的培养是使用添加了20％KSR(Invitrogen公司制)、15ng/ml人FGF2(Peprotech公司制)、10ng/ml活化素A(R&D Systems公司制)、1ng/ml硫酸肝素(SIGMA公司制)、0.03％L－谷氨酰胺(MP Biochemicals公司制)、1x非必需氨基酸(Invitrogen公司制)、1x青霉素(Invitrogen公司制)及1x链霉素(Invitrogen公司制)的DMEM/F12培养基(kohjin-bio公司制)(以下也将该组成的培养基称为“KFA培养基”)进行的，不使用饲养细胞。

此外，传代时使用0.01％胰蛋白酶/0.1mM EDTA使人iPS细胞打散为单个细胞，将其分散在还添加了2μM ROCK抑制剂(チアゾゾビン、WAKO公司制)及5μg/ml人纤连蛋白(BDBiosciences公司制)的KFA培养基后，播种到涂敷I型胶原的培养皿中。

予以说明，所述人iPS细胞的非饲养细胞·分散培养体系是本发明人等此次首次建立的。即，本发明人等在本实施例之前首先对在所述非饲养细胞·分散培养体系中的人iPS细胞的最佳条件进行了研究。进行所述研究的理由在于，现在使用最为广泛的人ES细胞及人iPS细胞的培养方法、即使用小鼠饲养细胞的培养法，虽然较容易维持未分化状态，但是，本发明人等独立地发现，此后的分化、特别是向神经外胚层系的分化受到抑制。此外，理由还在于，目前的难点、即传代时的分散操作对于准确地进行分化诱导、以及控制为必要的细胞密度而言不可或缺的手技。

然后，使用了通过反转录病毒使人皮肤成纤维细胞强制表达重编程因子(POU5F1、SOX2、KLF4及c－MYC)而制作的人iPS细胞株(rvhiPSC08)，主要对以下的2个项目进行了研究。

(1)加入到培养液中的增殖因子的种类及其浓度、

(2)在使用胰蛋白酶传代时，所使用的信号抑制剂、细胞外基质的组合。

作为迄今为止的标准的人分化多能性干细胞(PSC)的培养方法，大多是在小鼠胎仔成纤维细胞(MEF)上，在以Invitrogen公司制的KSR为主要添加物的基础培养基中添加4～5ng/ml的人FGF2，用该培养基进行培养。此时，鉴于各种文献和我们自身的研究成果(未发表数据)，我们认为MEF发挥的作用首先是提供细胞外基质、促进PSC的固定，并且部分地补充生物体内的FGF2及NODAL的活性。因此，对于培养液中所添加的添加物，本发明人等除了对KSR进行研究以外，还将范围限缩至具有FGF2和NODAL样活性的活化素A并进行了研究。此时，除了显示出人iPS细胞的未分化状态的POU5F1、SOX2、NANOG的表达量以外，还以在分化细胞中能够确认到的中内胚层系的基因标志物T(BRACHYURY)、神经外胚层的标志物SOX1等为指标，对FGF2和活化素A的浓度进行检验。结果发现，在所述培养体系中，FGF2的终浓度为15ng/ml、活化素A的终浓度为10ng/ml左右时，细胞更稳定地增殖，本发明人等使用前述的KFA培养基成功地实现了简便地、不使用饲养细胞地培养人iPS细胞。

并且，人iPS细胞通常是通过轻柔的酶处理将集落剥离，以物理上数十个左右的细胞块形式进行传代，从上述观点出发，尝试了将其分散为单个细胞进行培养。关于所述分散倍培养，已经存在通过使用ROCK抑制剂能够将人ES细胞分散培养的报告(Watanabe，K.等、Nat Biotechnol、2007年、25卷、6号、681～686页、Lin，T.等、Nat Methods、2009年、6卷、11号、805～808页)。但是，这些文献等中公开的培养方法中，要求用MatriGel等人工细胞外基质涂敷培养皿，使用方面未必方便。此外，还发现了如下报道：在基于其他见解而将细胞外基质之一的纤连蛋白添加到培养液中进行传代时，有助于基于ROCK抑制剂的分散培养(Kitajima，H.等、Biochem Biophys Res Commun、2010年、396卷、4号、933～938页)。并且，通过综合这些见解，在传代时将用胰蛋白酶分散的细胞悬浮在KFA+ROCK抑制剂+纤连蛋白培养基并播种到涂敷I型胶原的培养皿中，从而建立了良好的人iPS细胞的非饲养细胞·分散培养体系。

＜定量RT－PCR法＞

使用RNeasy迷你试剂盒(QIAGEN公司制)进行RNA提取。为了防止基因组DNA的混入，还利用无RNase DNase试剂盒(QIAGEN公司制)进行了DNase处理。以1μg所提取的总RNA为模板使用寡dT引物(TOYOBO公司制)及Revertra Ace(TOYOBO公司制)进行逆转录(RT)反应，制备cDNA。将如此制备的cDNA稀释20倍，使用ABI仪器、Fast SYBR Green Master Mix(ABI公司制)及表1中记载的引物进行qPCR。此外，对同一样品进行3个反应，求出其平均值，将以GAPDH基因为内标分别标准化后的值进行图表化(参照图2、5、8～23)。

[表1]

＜蛋白质印迹法＞

为了再现性良好地通过蛋白质印迹检测TET1蛋白质，首先对其提取方法进行了预备研究。结果阐明了Tet1分子与DNA牢固结合，通过对核进行分级、用NER溶液(PIERCE公司制)进行洗脱能够定量检测TET1蛋白质。予以说明，已知TET1蛋白质与DNA牢固地结合，因此这样的特别的提取方法是必要的。

在蛋白质印迹法中，首先，将如此提取的蛋白质用SDS－PAGE分级，进而将凝胶中的分级后的蛋白质转印到PVDF膜。此外，将抗人TET1抗体(SIGMA公司制)及抗人β－肌动蛋白抗体(SANTA CRUZ公司制)用添加了0.3％Triton－X100、3％BSA及1％正常羊血清的PBS(－)(抗体稀释液)稀释1000倍。然后，使如此获得的膜和前述第一抗体在4℃反应一晚，洗涤后，使该膜和HRP标记第二抗体在室温下反应1小时。然后，在洗涤后使该膜上的HRP和ECL(GE Healthcare公司制)反应，显色，进行膜显影。

＜人iPS细胞的神经分化诱导法＞

由人iPS细胞向神经细胞的分化诱导，是对本发明人等以前发现的由小鼠ES细胞高效地分化诱导神经细胞的方案(Bouhon，I.等、Brain Res Bull、2005年、68卷(1－2)、62～75页)进行改良后而实施的。具体如下。

(1)适应培养

首先，对于通过KFA培养基不使用饲养细胞地培养的人iPS细胞，在即将供于分化诱导前暂时用以CDM培养基为基础的培养基同样地进行传代，进行适应培养。该适应培养中使用的CFA培养基是以CDM培养基为基础的、含有40ng/ml的人重组FGF2及2ng/ml的人重组活化素A的新培养基，是本发明人等为了将人分化多能性干细胞由维持培养切换到向神经细胞的分化诱导而开发的培养基。关于CDM培养基的组成，可参照Bouhon，I.等、Brain ResBull、2005年、68卷(1－2)、62～75页。此外，在该使用CFA培养基的培养中，细胞无法充分耐受空气中含有的氧所产生的氧化应激，因此该适应培养在低氧CO₂培养箱内进行(低氧培养：氧浓度5％)。

(2)由人iPS细胞向神经前体细胞的分化诱导

将该使用CFA培养基的培养中达到汇合的人iPS细胞与前述同样地通过胰蛋白酶处理使细胞打散，将其再悬浮于CDM培养基后，用添加了10μM Y27632(ROCK抑制剂)的CDM培养基稀释使其达到5x10⁴细胞/ml，播种到低粘附培养皿(细菌培养用的培养皿)中。

播种4天后，将细胞彼此粘附而成的细胞块(以下也称为“球体”)回收，通过Accutase(BD Biosciences公司制)使该球体再次打散成单个细胞。然后，将如此地打散后的细胞再悬浮于神经诱导培养基(添加了10μM SB431542、30nM IWR－1endo及10μM Y27632的CDM培养基)，与前述同样地播种于培养皿。然后，在4天后实施同样的悬浮操作，播种到添加了10μM SB431542及10μM Y27632的CDM培养基中。

予以说明，考虑到小鼠ES细胞和人分化多能性干细胞的分化多能性的差异，而在CDM培养基中添加SB431542及IWR－1endo来进行人iPS细胞的培养。即，由被判断为

的小鼠ES细胞能够诱导原始内胚层细胞，在本发明人等的以前的报告中已经明确了：该原始内胚层在神经诱导过程中是瞬时“登场”的，并表达拮抗对神经诱导有抑制的TGFβ/Nodal、WNT等的信号转导的抑制因子。另一方面，人分化多能性干细胞通常不存在向该原始内胚层分化的能力，因此猜测即使将小鼠ES细胞的方案直接用于人分化多能性干细胞也不会引起向神经的分化诱导。因此，本实施例中，将已知抑制TGFβ/Nodal信号转导的低分子化合物SB431542、已知抑制WNT信号转导的低分子化合物IWR－1endo添加到CDM培养基中来进行人iPS细胞的培养。

并且，在添加了SB431542及Y27632的CDM培养基中的培养以后也以同样的间隔供于在添加了10μM Y27632的CDM培养基中的传代、或后面所示的神经细胞的成熟方案。予以说明，在CDM培养基中的传代培养中，神经细胞并不成熟，基本以能够增殖的神经前体细胞形式进行传代。

(3)神经细胞的成熟

神经细胞为不再发生细胞分裂的分裂期后(post－mitotic)细胞。前述的神经分化诱导方案中，从人分化多能性干细胞诱导出神经前体细胞。为了由该状态进一步诱导为具有神经突起、发挥功能的post－mitotic的神经细胞，需要由前述那样的球体状态变为各个细胞粘附在培养皿的底面等的基质上并维持(将在该培养皿内人为诱导神经细胞的过程也称为“神经细胞成熟培养”)。

神经细胞成熟培养中，具体而言为了使神经细胞容易粘附，将用于播种的培养皿由前述的培养皿变更为涂敷了IV型胶原(IWAKI公司制)的培养皿。并且，在培养中使用将该培养皿的底面进一步用多鸟氨酸(Sigma公司制)及重组层粘连蛋白质(BD Biosciences公司制)涂敷了一定时间后的培养皿。此外，播种时细胞从球体的打散按照前述那样通过Accutase而进行。进而，该成熟培养利用添加了3μM CHIR99021、10μM DAPT及10μMforskolin的CDM培养基来进行。并且，在该培养条件下2天更换一次培养基，由此在约一周内观察到出现了具有明显的神经突起的神经细胞。

(实施例1)

＜人分化多能性干细胞中的内源性TET1的动态＞

小鼠分化多能性干细胞具有接近于着床前的胚泡的内部细胞块的性质。而人分化多能性干细胞的性质则与着床后的上胚层内的原始外胚层最相似。并且，猜测由于该发生阶段的差异，人分化多能性干细胞在分化多能性方面也比小鼠分化多能性干细胞差。因此，本发明人等为了提高人分化多能性干细胞的分化多能性，尝试了使该细胞从上胚层(起始态)的状态脱分化(早期化)为胚泡(原始态)的状态。

通常认为在发生过程中早期化存在2种类型。为从刚受精后至着床早期中发生的“早期胚中的早期化”、和着床后在生殖细胞形成过程中发生的“胚系中的早期化”。鉴于该点，本发明人等仔细调查了为了消去从着床前的胚泡至着床后的上胚层的记忆而在“胚系中的早期化”中表达的多种因子，并着眼于其中的TET1。

关于哺乳类动物中的Tet1/TET1的表达样式，仅报告了小鼠的表达样式。根据该报告获知，在早期发生中从受精卵至胚泡，小鼠Tet1均存在于细胞核中(Ito，S.等、Nature、2010年、466卷、7310号、1129～1133页)。此外，在其它报告中，确认了本因子的表达仅限于规定为生殖细胞的原始生殖细胞中(Hajkova，P.、Science、2010年、329卷、5987号、78～82页)。进而，由Tet1的表达得以认可的胚泡建立的小鼠ES细胞中也确认到该蛋白质的丰富的表达。但是，迄今为止对于人的TET1的表达动态则一无所知。

因此，本发明人等对人iPS细胞中的TET1mRNA及蛋白质的表达进行了调查。特别是关于Tet1蛋白质的表达，如前所述，根据使用了小鼠ES细胞的预备实验的结果阐明了TET1蛋白质与DNA牢固结合，通过利用我们自己独创的蛋白质提取方法首次成功地利用蛋白质印迹法定量地对其进行了检测。获得的结果如图1及2所示。

由图1及2所示的结果可知，TET1不论在人iPS细胞中是否充分转录，通常都无法检测到该蛋白质，与小鼠ES细胞中的状况不同。

因此，利用蛋白质酶体抑制剂(低分子化合物：MG132)暂时抑制了蛋白质分解主要通路中的蛋白质酶体的功能，并尝试利用蛋白质印迹法进行检测。即，按照常规方法培养利用KFA培养基培养的各人iPS细胞株(#58、#237及#105)后，在回收之前的7小时添加5μM溶解于0.1％DMSO中的MG132，对回收的核提取物进行蛋白质印迹。此外，作为对照，对仅添加了0.1％DMSO而回收的核提取物也进行了蛋白质印迹通路。

其结果如图1及2所示，弄清了：TET1虽然在人iPS细胞中积极地进行了转录，但该蛋白质迅速被蛋白质酶体系分解。予以说明，添加MG132时，虽然TET1的转录水平也上升若干，但显然并不能支撑图1所示的蛋白质水平的上升。由此明确，以通常条件进行维持的人分化多能性干细胞中TET1在蛋白质水平下不存在，或者其存在为蛋白质印迹法的检测灵敏度以下。

(实施例2)

＜人TET1基因结构的确定＞

如实施例1中所述，弄清了在人分化多能性干细胞中TET1蛋白质并非稳定地存在。进而，若考虑到人的iPS细胞诱导，则很难认为在能够稳定地表达TET1的胚泡、与胚系相似的环境内经历了充分的时间，作为其结果可以想象到在其生成过程中TET1的活性没有充分作用于基因组。进而猜测，通过该TET1蛋白质对基因组有无作用，而使具有原始态型性质的小鼠分化多能性干细胞和具有起始态型性质的人分化多能性干细胞的分化能力产生差异。

因此，在人分化多能性干细胞中，为了对强制表达TET1蛋白质的编码区域的全长进行扩增，利用RT－PCR尝试获得人TET1的cDNA序列。即，通过使用了PrimeSTAR Max DNA聚合酶(宝生物公司制)的RT－PCR法由人iPS细胞株(rvhiPSC08)扩增TET1cDNA。此时，基于所报告的TET1cDNA的序列(Refseq：NM＿030625)，按照能够以在N末端或C末端添加有FLAG标签的形式表达TET1蛋白质的方式设计了具有以下所示序列的引物，并将其用于RT－PCR。

(N末端FLAG标签引物)

XhoI－Flag－hTet1－S：

GCAAGAATTCCTCGAGCCACCATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGTCTCGATCCCGCCATGCAAG(序列号：7)

XhoI－hTet1－AS：

GAGTGAATTCCTCGATCAGACCCAATGGTTATAGGGCC(序列号：8)

(C末端FLAG标签引物)

XhoI－hTet1－S：

GCAAGAATTCCTCGAGCCACCATGTCTCGATCCCGCCATGC(序列号：9)

XhoI－hTet1－Flag－AS：

GAGTGAATTCCTCGATTACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGACCCAATGG(序列号：10)。

其结果如图3所示，获得了2个PCR产物，均为TET1的变体，但不同于Refseq的序列(人TET1，变体1)，是在分化多能性干细胞中首次明确的变体。

较长的变体(人TET1，变体2)与Refseq中登录的序列相比，在第7外显子和第8外显子之间进而具有87碱基对的序列，通过与基因组的比较明确了该序列相当于单一外显子。此外，该位点为位于通过晶体结构解析所预测的本分子的活性位点(双加氧酶)的N末侧的区域。颇有意味的是，在小鼠的Tet1序列中确认到了与该外显子相当的序列。

关于另一较短的变体(人TET1、变体3)，颇显著味的是第3外显子～第5外显子发生了缺失。第3～5外显子由2493碱基对构成，因此猜测该缺失为结构内(in－frame)缺失。在该变体3中缺失的部分中，已知在变体1及2中存在2个核移行信号。

此外，虽然图中未示出，但通过RT－PCR分析对这些变体在人iPS细胞中的转录水平进行评价的结果是，确认了变体2丰富的表达，而变体1虽然为少量但也确认了其的表达。此外，明确了变体3的表达量低。进而，虽然图中未示出，但在小鼠中也确认了与这3个变体相当的mRNA的表达。

予以说明，序列表中，人TET1的变体1的碱基序列示于序列号：1，该变体所编码的氨基酸序列示于序列号：2。人TET1的变体2的碱基序列示于序列号：3，该变体所编码的氨基酸序列示于序列号：4。人TET1的变体3的碱基序列示于序列号：5，该变体所编码的氨基酸序列示于序列号：6。

(实施例3)

＜改变TET1蛋白质的表达1＞

将实施例2中扩增出的人TET1(变体2)利用以下所示的方法导入人分化多能性干细胞中，尝试在该细胞中表达TET1蛋白质。

首先，如前所述地以人iPS细胞的cDNA为模板，利用RT－PCR对编码在N末端或C末端添加有FLAG标签的TET1蛋白质的cDNA进行扩增。然后使用in fusion HD克隆试剂盒(Takara公司制)将如此制备的2种改变型TET1cDNA分别插入哺乳类细胞表达载体(pCAG－IRES－Puro，由理研CDB丹羽研究室惠赠)的XhoI中。

然后，使用核转染仪将这些载体分别转染前述人iPS细胞株(YMhiPSC058sbc6亚株)中。在该转染中，用人干细胞核转染仪试剂盒1(Lonza公司制)将iPS细胞悬浮，利用对人iPS细胞显示出最高基因导入效率的核转染仪的程序：B－016施以电脉冲。

将如此地导入了前述载体的人iPS细胞边用嘌呤霉素(1μg/ml)筛选边进行培养，由此分别获得数个克隆的强制表达N末端－FLAG标签、C末端－FLAG标签的TET1的稳定株。并且，对这些强制表达改变TET1蛋白质的人iPS细胞株中的、TET1mRNA及蛋白质的表达进行了调查。获得的结果如图4及5所示。

由图4及5所示的结果可知，在任一末端配置了标签的强制表达株中，TET1的转录量均显著上升(图5)。但是，颇具意味的是，只有在N末端配置了FLAG的TET1稳定表达株在蛋白质印迹中可见清晰的TET1蛋白质表达(图4)。因此暗示了在TET1蛋白质的情况下，N末端部分的序列中存在使本蛋白质不稳定的序列。

(实施例4)

＜改变TET1蛋白质的表达2＞

基于实施例3所示的结果，为了鉴定使TET1蛋白质不稳定的序列，利用以下所示的方法对改变TET1蛋白质的稳定性进行了评价。

首先，制备在TET1蛋白质的N末端部分(670氨基酸)的C末端侧融合了GFP蛋白质的改变TET1蛋白质，与前述同样地使用核转染仪使其在人iPS细胞中强制表达。予以说明，这里使用的GFP蛋白质(Tag－GFP、evrogen公司制)与通常的GFP蛋白质相比，从翻译到显色的时间缩短，能够实时观测融合的目标蛋白质的表达及消失。

具体而言，如图6所示，分别制作了在野生型TET1蛋白质的N末端部分融合了Tag－GFP的蛋白质(#93)、在试验性地将从N末端起第2位的氨基酸(S：丝氨酸)置换为G：甘氨酸的TET1蛋白质的N末端部分融合了Tag－GFP的蛋白质(#94)、在如实施例3中记载的能够稳定地表达的TET1蛋白质的、N末端添加有FLAG标签的TET1蛋白质的N末端部分融合了Tag－GFP的蛋白质(#95)，并使其分别在iPS细胞中表达。予以说明，在这些细胞中，包含导入的各改变TET1蛋白质和Tag－GFP的融合蛋白质所发出的荧光已确认局限于细胞的核内。并且，为了在单个细胞水平对该荧光信号进行定量解析，对强制表达各改变TET1蛋白质的人iPS细胞进行了FACS解析。获得的结果如图7所示。

由图7所示的结果可知，对作为阴性对照的不表达GFP的iPS细胞测定自身荧光的信号值，结果是几何平均值为7.2。此外，对导入有在野生型TET1蛋白质的N末端部分融合了GFP标签的蛋白质(#93)的iPS细胞进行解析的结果是，其值为26.3。与此相对，颇具意味的是，仅将第2位的氨基酸由丝氨酸变换为甘氨酸，荧光强度显著上升(荧光强度：31.6、参照图6的#94)。进而，如由实施例3的结果可以预测那样，在使TET1蛋白质的第1甲硫氨酸缺失、在其N末端侧添加FLAG标签时，值也显著上升(荧光强度：37.7、参照图6的#95)。

由此明确了TET1蛋白质的从氨基末端起第2位的氨基酸：丝氨酸对于规定该蛋白质的稳定性而言是必需的。此外，基于该结果还明确了：实施例3及4所示的在N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质的稳定性可通过将从N末端起第2位的氨基酸由丝氨酸变更为FLAG标签的从N末端起第2位的氨基酸即天冬氨酸而获得(参照表示FLAG标签的氨基酸序列的序列号：46)。

(实施例5)

＜强制表达改变TET1蛋白质的人iPS细胞株(TET1－hiPSC)的未分化状态的研究＞

如实施例1所示，保持所谓的相当于上胚层状态的人的分化多能性干细胞中通常几乎不存在TET1蛋白质。因此我们认为，实施例3中制作的、强制表达改变TET1蛋白质的人iPS细胞株(TET1－hiPSC)很可能是并不存在于发生过程中的细胞状态。

但是，奇妙的是，虽然未进行图示，但TET1－hiPSC在使用KFA培养基以未分化状态进行维持期间，其形态和增殖速度等与通常的不表达改变TET1蛋白质的人iPS细胞并没有任何区别。因此，对于TET1－hiPSC，利用定量RT－PCR对通常认为与分化多能性干细胞的性质强烈相关的设定转录因子的mRNA水平的表达进行了评价。获得的结果如图8～23的天数：0所示。

由图8所示的结果可知，分化诱导前(天数：0)的TET1－hiPSC中的TET1mRNA的表达与作为对照使用的仅表达pCAG－IP载体的hiPSC相比，强约4倍，判断为通常状态的约3倍的表达为强制表达。基于该结果可以判断：在未分化状态下，分化多能性干细胞的与自我复制能力相关的诸因子OCT3/4、NANOG及SOX2的mRNA表达水平在有无TET1强制表达下没有大的差异(参照图11～13的天数：0)。

已知与上胚层相当的具有起始态型性质的分化多能性干细胞具有此后向外胚层或中内胚样分化的能力。关于这一点，颇具意味的是，已经明确了表示向外胚层的分化倾向的标志物(神经细胞的标志物：SOX1、NEUROGENIN1、NEUROGENIN2、NEUROD1、ASCL1、PAX6、ZNF521及OTX2)几乎不受TET1强制表达的影响(参照图14～21的天数：0)。

进而，表示向中内胚层的分化倾向的标志物：T及SOX17的表达状况在有无TET1强制表达时差异较大。即，不强制表达改变TET1蛋白质的hiPSC中，确认到这些标志物的表达，但即使在相同培养基中进行维持培养，在TET1－iPSC中这些标志物的表达也被抑制为较低(参照图22及23的天数：0)。

通常，T、SOX17被视为表示已经发生分化的标志物，原则上不应该在未分化的干细胞中表达。这暗示了：按照常规方法制作的现有的人iPS细胞，与培养基中所包含的、与对于向中内胚层的诱导所必需的NODAL作用机制相同的活化素A过度反应，省略了未分化状态而向中内胚层分化。换言之，现有的人分化多能性干细胞为一定程度上向中内胚层分化了的细胞，严格意义上可能并不是“未分化”。

(实施例6)

＜TET1－hiPSC的神经分化诱导性的检验1＞

已知在脊椎动物的早期发生中广泛保守的现象中，分化诱导成神经系统的细胞是缺省的(default neurogenesis)(Levine，A.J.等、Dev Biol、2007年、308卷、2号、247～256页)。即，若将早期胚的细胞分离且不给予其它诱导刺激时，该细胞将分化为神经系统。到目前为止，还报告了小鼠ES细胞也遵循该default neurogenesis(Smukler，S.R.等、J CellBiol、2006年、172卷、1号、79～90页)。此外，本发明人等在以前提出能够由小鼠ES细胞诱导神经细胞的方案时，主要着于在该缺省通路中“装载”ES细胞(Bouhon，I.A.等、Brain ResBull、2005年、68(1－2)、62～75页)。但是，至今没有关于使用人的分化多能性干细胞时的缺省将会如何的报告。

因此，作为检验TET1－hiPSC的分化能力的一例，对在小鼠ES细胞中发生defaultneurogenesis的状况进行模拟，观察人iPS细胞的缺省分化。即，将如前述那样在KFA中进行维持培养的TET1－hiPSC或hiPSC，为了发生分化而在中性的CDM培养基中维持4天，然后将其供于抑制了对神经诱导有利的条件即活化素A/Nodal的状况。然后，在所述向神经系统的缺省分化诱导开始后的12天内，每4天对上述人iPS细胞中的转录因子的mRNA表达进行分析。获得的结果如图8～23所示。

已经明确，在神经被诱导时，OCT3/4和NANOG的表达必须迅速减弱(Zheng Wnag等、Cell Stem Cell、2012年、10卷、440～454页)。关于该点，由图11及12所示的结果可知，在开始分化诱导后最初的4天内，TET1的强制表达对OCT3/4及NANOG的表达已经发挥强烈影响。特别是关于NANOG的表达性，在TET1－hiPSC中，在4天内其表达减少至百分之一以下。与此相对，确认到在现有的人iPS细胞(hiPSC)中，缺省状态下这些因子的表达不但不会减少，反而会上升。进而，虽未进行图示，在这些现有的人iPS细胞中，OCT3/4及NANOG的表达在此后经过约1个月也仅逐渐变为早期值的十分之一左右。

此外，如图13所示，明确了TET1－hiPSC中的SOX2的表达在开始分化诱导后经时地上升。已知SOX2为在未分化的分化多能性干细胞中表达的转录因子之一，同时也是神经的发生所必需的因子。因此我们认为，在使TET1－iPSC分化为神经系统时，SOX2的表达不减少是转向此后表现出的高效神经分化的原因之一。另一方面，现有的人iPS细胞(hiPSC)中，SOX2的转录量相反地显示出减少的倾向。

此外，由图14～21所示的结果可知，在TET1－iPSC中确认到神经分化标志物(SOX1、NEUROGENIN1、NEUROGENIN2、NEUROD1、ASCL1、PAX6、ZNF521及OTX2)的顕著的表达诱导。另一方面，现有的人iPS细胞(hiPSC)中，这些神经分化标志物的表达几乎不被诱导。此外，特别是开始分化诱导后第12天，TET1－hiPSC中的SOX1的表达量为不表达TET1蛋白质的人iPS细胞(hiPSC)中该因子的约60倍。由此类推，这表示通过TET1蛋白质的强制表达，人iPS细胞60倍地容易分化成神经细胞。

此外，已知在default neurogenesis中诱导的神经细胞具有前脑(forebrain)的性质。关于该点，如图21所示，明确了作为前脑的标志物的OTX2通过TET1蛋白质的强制表达而被显著地诱导表达。因此，这表示通过导入TET1蛋白质在缺省下能够诱导成前脑型的神经细胞。

进而，如前所述已明确：通过TET1蛋白质的强制表达，NANOG的表达迅速消失。已知NANOG的抑制不仅是在前述的向神经系统的分化中需要，而且在向几乎全部的细胞种类分化时都必须抑制该因子。因此，虽然实施例6中以向神经系统(外胚层系)的分化诱导为例明确了TET1蛋白质的有效性，但如后述的实施例8所示，通过本发明的方法或蛋白质获得的效果并非仅限于外胚层系的分化。即，通过TET1蛋白质的强制表达，引起NANOG的表达迅速消失，消除了分化诱导的抑制要因，由此提高了全能性干细胞的分化多能性。

(实施例7)

＜TET1－hiPSC的神经分化诱导性的检验2＞

将实施例6中进行分化诱导而获得的神经前体细胞按照前述那样重新播种在涂敷了层粘连蛋白质的培养皿中，观察神经突起的形成等成熟过程。获得的结果如图24及25所示。

由图25所示的结果可知，在由TET1－hiPSC进行分化诱导时，完全未见神经细胞以外的细胞，确认了几乎100％的TET1－hiPSC分化成了神经细胞。与此相对，由现有的人iPS细胞(hiPSC)进行分化诱导时，虽然在图24中的箭头所示的位置确认到神经细胞的细胞体的块，但其以外均为增殖性的非神经细胞，神经细胞所占的比率极其有限(参照图24)。

(实施例8)

＜TET1－hiPSC向内胚层系的分化诱导性的检验＞

哺乳类的早期发生简单而言是二选一，即，分化为神经系统、皮肤等外胚层系的细胞系谱还是分化为此外的、作为中胚层(血液、肌肉、骨格系)和内胚层(肺、消化器系脏器)等的共同的祖细胞系谱即中内胚层系的细胞系谱。因此，除了前述已经验证的TET1蛋白质使向外胚层系的分化诱导性提高以外，还利用以下所示的方法对TET1蛋白质使向内胚层系的分化诱导性也提高进行了确认。

＜人iPS细胞的内胚层系分化诱导法＞

内胚层系的脏器中包括与糖尿病发病相关的胰脏、作为代谢·解毒的中枢脏器的肝脏，因此向这些细胞系谱的分化诱导的方案的开发有一些进展。因此，此次改进了向胰脏的产胰岛素细胞、即β细胞的分化方案，即改进了Kevin A D’Amour等、Nat Biotech.、2006年、24卷、1392～1401页中记载的方案，实施了分化为内胚层的决定。

予以说明，方案的改进部分为：将该论文中记载的方案所使用的基本培养基RPMI置换为本发明人等在神经诱导等中使用的前述CDM培养基，作为诱导物质不再使用Wnt3a蛋白质而是使用对细胞具有同样活性、即发挥同一信号转导机制的低分子化合物CHIR99021，不使用用于诱导内胚层系细胞中的细胞、特别是胰脏细胞的Cyclopamine(Hedgehog信号转导的抑制剂)。此外，猜测通过所述改进，人iPS细胞会向接近肝脏的细胞种类分化。

以下按照步骤对本分化诱导方法进行说明。

步骤1：向内胚层系细胞的确定(4天)

将用KFA培养基等维持为未分化状态的人iPS细胞(实施例3中制作的强制表达改变TET1蛋白质的人iPS细胞株(TET1－hiPSC)或YMhiPSC058sbc6亚株)按照常规方法用胰蛋白酶溶液打散。即，使胰蛋白酶作用足够长的时间后，用胰蛋白酶抑制剂使该酶反应终止。然后，将其悬浮在向CDM培养基中添加了ActivinA(100ng/ml)、CHIR99021(3μM)及ROCK抑制剂(Y27632；10μM)的分化培养基中，并播种到低粘附培养皿中，由此形成平均约2000个细胞块。48小时后，将形成的细胞块回收，使细胞块再次悬浮在添加了ActivinA(100ng/ml)的CDM培养基中。进一步培养48小时，由此进行细胞向内胚层系的确定，猜测形成了definitive endoderm(胚体内胚层、标志物：SOX17)。

步骤2：原始肠管的形成(4天)

将按照前述方法使细胞命运暂时固定为内胚层的细胞供于此后的分化培养，该分化培养的目标是作为消化器系脏器的原始形态即肠管。即，对于由步骤1回收的细胞块，置换为添加了FGF10(50ng/ml)的CDM培养基，使其在该状态下持续分化4天。其结果是，猜测细胞分化为称为原始肠管的细胞(标志物：HNF4A)。

步骤3：前肠的形成(4天)

原始肠管的细胞，在近头部的位置向甲状腺、肺等脏器分化，在其后部向消化器系脏器分化。其中，消化器系脏器共同的祖细胞为前肠。

对于由步骤2回收的细胞块，置换为添加了FGF10(50ng/ml)及全反式视黄酸(2μM)的CDM培养基，使其在该状态下持续分化4天。其结果是，猜测细胞呈现前肠细胞(标志物：FOXA2)的性质。

在以上记载的分化诱导方法中，利用现有的人iPS细胞、和TET1－iPSC，每4天对来自各细胞的样品取样，提取RNA。并且，以该RNA为模板进行qPCR，对表示各分化步骤的前述标志物基因的表达量进行定量。此外，对NANOG的表达量进行定量，作为表示细胞的未分化性的指标。获得的结果如图26～29所示。

如图26～29所示，按照常规方法制作的现有的人iPS细胞即使不导入TET1，在该细胞株中也确认到某种程度的内胚层分化诱导。另一方面，导入了TET1蛋白质的人iPS细胞株中，在确认到NANOG的表达抑制的同时，还确认到内胚层系分化标志物基因(SOX17、HNF4A及FOXA2)的显著表达诱导。即，这些标志物基因的表达量表明，TET1－hiPSC与现有的iPS细胞株相比，向内胚层系的诱导效率在所有步骤中均亢进约3倍。因此确认了，与前述的向外胚层系的分化能力同样地，通过导入TET1蛋白质，分化多能性干细胞向内胚层系的分化能力也亢进。

(实施例9)

＜关于改变TET1蛋白质的检验＞

如上所述，使用在TET1蛋白质(全长)的N末端添加了FLAG标签的蛋白质作为本发明的变异型TET1蛋白质，并对其效果进行了检验。因此，对于本发明的变异型TET1蛋白质的其它形态(图6所示的、使位于从N末端起第2位的丝氨酸残基被置换为甘氨酸残基的人TET1蛋白质的N末端部分(包含670氨基酸的蛋白质)和GFP标签融合而得的蛋白质(#94))，也利用以下所示的方法确认了其能够提高分化多能性干细胞的分化能力。

首先，制备下述4种人iPS细胞。

TET1o/e：强制表达N末端添加了FLAG标签的TET1蛋白质(全长)的YMhiPSC058sbc6亚株(实施例3中制作的强制表达改变TET1蛋白质的人iPS细胞株)、

#93：强制表达图6所示的使人TET1蛋白质的N末端部分(包含670氨基酸的蛋白质)和GFP标签融合而得的蛋白质的YMhiPSC058sbc6亚株、

#94：强制表达图6所示的将位于从N末端起第2位的丝氨酸残基置换为甘氨酸残基的人TET1蛋白质的N末端部分(包含670氨基酸的蛋白质)的YMhiPSC058sbc6亚株、及

pCAG－IP：导入了pCAG－IP(空载体)的仅具有耐药性的YMhiPSC058sbc6亚株(对照细胞株)。

予以说明，关于#93、#94或pCAG－IP，按照与实施例3中记载的方法同样的方法制作编码各改变TET1蛋白质的pCAG－IP载体或pCAG－IP(空载体)，然后利用核转染仪将获得的载体导入YMhiPSC058sbc6亚株，通过耐药性进行筛选、培养，由此来制备。

然后，将这些人iPS细胞供于前述的神经分化诱导，沿用前述方法对该分化诱导过程(8天)中的各标志物基因的表达量进行解析。获得的结果如图30～32所示。

由图30～32所示的结果可以明确，可确认与在TET1蛋白质(全长)的N末端添加了FLAG标签的蛋白质(TET1o/e)同样地，通过导入本发明的变异型蛋白质的其它形态、即使位于从N末端起第2位的丝氨酸残基被置换为甘氨酸残基的人TET1蛋白质的N末端部分和GFP标签融合而成的蛋白质(#94)，也能够提高人iPS细胞的神经分化诱导能力。因此表明，在利用TET1蛋白质的导入提高分化多能性干细胞的分化能力时，TET1蛋白质的C末端部分的双加氧酶所承担的去甲基化活性并非必须，只要维持了包含DNA结合域的TET1蛋白质的N末端部分所承担的DNA结合能力即以足矣。

(实施例10)

＜利用改变TET1蛋白质提高iPS细胞的生产效率的检验＞

向iPS细胞的诱导、特别是向人iPS细胞的诱导为效率极差的过程。因此，良质iPS细胞、即形成在显微镜下边缘光滑的集落的iPS细胞较难获得。予以说明，通过经验获知，形成这样的形态良好的集落的iPS细胞中，承担分化多能性的转录因子(OCT3/4、SOX2)的表达高、且在此后的增殖中细胞的性质也稳定。

因此，通过以下所示的方法，对在将所谓重编程因子导入用于诱导为iPS细胞的体细胞时一起导入本发明的变异型TET1蛋白质是否能提高iPS细胞的生产效率进行了解析。

即，除了使用沖田等开发的Episomal载体系以外，与前述同样地导入6因子(OCT3/4、SOX2、KLF4、L－MYC、LIN28及shp53)，进行iPS诱导。此时，另外制作了将N末端配置有Flag标签的全长TET1插入相同载体中的产物，通过其的有和无来诱导iPS细胞。

然后，观察所获得的iPS细胞集落并对它们的数量进行计测。获得的结果如表2所示。表2中记载的“6因子”表示利用前述6因子的导入而诱导iPS细胞的结果，“6因子+Flag－TET1”表示利用前述6因子和本发明的变异型TET1蛋白质的导入诱导iPS细胞的结果。“Frcs”表示由良质iPS细胞构成的集落数，“Prcs”表示由恶质iPS细胞构成的集落数。“Frcs”及“Prcs”的外观的例子如图33所示。

[表2]

载体	Frcs	Prcs
			6因子	10	12
6因子+Flag-TET1	40	7

如表2所示，明确了与现有的不导入TET1蛋白质的iPS细胞诱导法相比，通过本发明的导入TET1蛋白质的iPS细胞诱导法可以提高iPS细胞集落的出现率(集落数由22个提高到47个)。进而还明确了，在现有的iPS细胞诱导法中，Frcs和Prcs以几乎同等的程度出现，而本发明的iPS细胞诱导法能够提高Frcs的出现率(Frcs的出现率由10/22提高至40/47)。

因此明确了，根据本发明的导入TET1蛋白质的分化多能性干细胞的制造方法，不仅能够提高获得的分化多能性干细胞的分化能力，而且还能够高效率地制造该分化多能性干细胞。

(实施例11)

<强制表达改变TET1蛋白质的人iPS细胞株(TET1-hiPSC)的未分化状态的研究2＞

从增殖性、包罗性基因表达的观点，对实施例3制作的强制表达改变TET1蛋白质的人iPS细胞株(TET1-hiPSC)的未分化状态的性状进行了进一步解析。

关于TET1-hiPSC的增殖性，虽未进行图示，但明确了建立后能够传代20次，该细胞是稳定的。此外还明确了与模拟载体表达系统(mv-iPSC)相比，增殖速度慢(图34)。进而，关于细胞周期，与mv-iPSC相比的结果是，TET1-iPS细胞在G2期中的时间短，在S期中的时间变长(图35)。由此，TET1-iPS细胞的细胞周期使人联想到在S期中的细胞存在比率高、G1/G2/M低的典型的干细胞样细胞周期。

此外，关于TET1-hiPSC的转录物组，使用微阵列进行总括解析的结果显示，该细胞的转录谱与其说是原始态型不如说是起始态型(图36)。例如，TET1-hiPSC中，虽然原始态型因子的表达不亢进，但可确定起始态型因子DNMT3B及OTX2的表达亢进。此外，若排除SOX2的表达亢进及NANOG的些微的表达低下，则与多能性相关的基因的表达未发生大变化。进而，虽未进行图示，但即使利用LIF对TET1－hiPSC进行处理，也没有回归原始态阶段。

此外，整体来看，可明确TET1－hiPSC中的基因的总括表达谱与作为对照的mv－iPSC中的总括表达谱相比为未分化。即，通过TET1的表达，NODAL、其直接调控对象(LEFTY1及LEFTY2)、以及中内胚层标志物(T、SOX17、MIXL1、EOMES、LHX1、LIM2及FOXA2)的表达显著下调。此外，通过TET1的导入，NODAL的表达急剧地下降为四十五分之一左右，如上所述，未导入TET1的现有的人iPS细胞已确认显示出向中内胚层系统的分化倾向。予以说明，虽未进行图示，但利用定量RT－PCR确认了TET1－hiPSC中的DNMT3B的表达亢进及中内胚层标志物的显著低表达。此外，与TET1－hiPSC相比，癌相关标志物(GPC4、GAGE2B及GAGE7)在mv－iPSC中高度表达，这暗示未导入TET1蛋白质的现有的人iPS细胞具有肿瘤形成能力(图36)。此外，TET1－hiPSC及mv－iPSC两者中，神经外胚层标志物SOX1均不表达，TET1－iPSC中，DNMT3B、SOX2及OTX2的表达亢进，这暗示该细胞的神经分化能力增强。

(实施例12)

＜Tet1敲除小鼠ES细胞向起始态阶段的移行性的检验＞

如上所述，通过导入TET1蛋白质能够提高人iPS细胞的分化能力。因此，使用小鼠中的由原始态型多能性阶段向起始态型多能性阶段的体外移行模型对TET1的该功能进行了解析。即，通过按照“K.Hayashi，H.Ohta，K.Kurimoto，S.Aramaki，M.Saitou，Cell 146，519(Aug19，2011)”及“G.Guo et al.，Development 136，1063(Apr，2009)”的记载来切换培养条件，由此使用能够在48小时以内将处于原始态型多能性阶段的小鼠ES细胞诱导为处于起始态型多能性阶段的上胚层样细胞(EpiLCs)的体外模型(图37)。实际上，如此地诱导而得的EpiLCs显示出Fgf5、Dnmt3a及Dnmt3b的表达亢进这样的原始外胚层细胞的特性(图38)，一系列的原始态型因子的表达消失(图40)。

并且，为了探索在多能性的确立中Tet1的作用，使用以所有的Tet1转录产物为对象的短发夹RNA(shRNA)，在前述体外模型系中使Tet1的表达下降(参照图39、K.Williamset al.，Nature473，343(May19，2011))。

虽未进行图示，Tet1敲除(KD)小鼠ES细胞中，多能性标志物Oct3/4(Pou5f1)、Sox2及Nanog的表达水平未发生变化。此外可以确认，关于细胞周期，也与上述同样地显示典型的干细胞样细胞周期，如此前报告那样，Tet1在小鼠ES细胞的自复制中并不重要(参照K.Williams et al.，Nature473，343(May 19，2011)、K.P.Koh et al.，Cell Stem Cell 8，200(Feb 4，2011)、G.Ficz et al.，Nature 473，398(May 19，2011)、M.M.Dawlaty et al.，Cell Stem Cell 9，166(Aug 5，2011)及M.M.Dawlaty et al.，Dev Cell 24，310(Feb 11，2013))。

但是，Tet1－KD小鼠ES细胞与未处理的细胞同样地未变化成处于起始态型多能性阶段的EpiLCs。而已知在上胚层阶段中高度表达的基因、特别是de novo DNA甲基转移酶(Dnmt3a及Dnmt3b)的表达水平在Tet1－KD EpiLCs中变为非常低(图41～43)。

进而，原始态型因子(Nanog、Prdm14、Esrrb、Rex1/Zfp42、Tcl1、Tbx3、Klf2、Klf4及Stat3)的表达在Tet1－KD EpiLCs中被维持(图42及图40)。

概而言之，明确了蛋白质组及转录物组中的Tet1－KDEpiLCs显示出早期的多能性阶段的表达谱，此外，小鼠ES细胞在不表达Tet1时不能在48小时以内达到起始态型多能性阶段。

进而，在Tet1－KD EpiLCs中确认到原始内胚层细胞中的典型转录因子信号(Gata6及Sox17的表达)。该信号在来自于着床前的胚泡ICM的原始态型细胞的原始内胚层中被确认。此外，即使尝试对参与原始态阶段状态的维持的JAK信号进行抑制、更积极地将Tet1－KD EpiLCs诱导为上胚层(起始态阶段)，实施该诱导后48小时后的Tet1－KD EpiLCs中，向(上胚层型)原始外胚层的分化能力仍然受损(图44)。

(实施例13)

＜起始态型多能性中的TET1的分解＞

对从原始态型向起始态型移行过程中的Tet1的表达谱进行解析，结果如“S.Itoet al.，Nature466，1129(Aug26，2010)”中报告那样，Tet1在未分化的小鼠ES细胞中高度表达(图45、图46及图41)。但是，在向起始态阶段移行时，即使Tet1的mRNA水平得以维持，它们的蛋白质水平也显著降低(图45、图46、图41及图42)。另一方面，通过用蛋白质酶体抑制剂MG132抑制EpiLCs中的蛋白质分解，可以恢复Tet1蛋白质的表达水平(图46)。另一方面，在原始态型的未分化ES细胞中，Tet1的蛋白质水平则未观察到蛋白质酶体抑制处理带来的这种影响。

予以说明，如上所述，TET1蛋白质在人iPS细胞中几乎检测不到，我们认为其处于与在表达型上为起始态型小鼠EpiLCs内同样的蛋白质动态调控下。此外，人iPS细胞中的TET1蛋白质的表达水平由于MG132处理而显著亢进(图1)。

因此，明确了起始态型分化多能性干细胞不能与原始态型的分化多能性干细胞同程度地使TET1蛋白质稳定化。此外暗示了，在体外模型中从原始态阶段向起始态阶段移行中Tet1蛋白质的表达下降反映了在从胚泡向上胚层的体内移行阶段中Tet1蛋白质的表达受到调控从而发生性地下降。

(实施例14)

＜利用Tet1调控Dnmt3的表达的检验＞

可以预测，Tet1由于促进去甲基化从而使Tet1－KD小鼠ES细胞或EpiLC的基因组处于高甲基化状态。

但是，对于原始态型因子Tcl1的甲基化可变区域(DMR)进行解析的结果是，Tet1的丧失并不影响小鼠ES细胞中的Tcl1的DMR的甲基化状态。予以说明，根据报告，Tcl1的DMR为从着床后的胚泡向上胚层移行过程中的基因组广泛甲基化的一环，为显著导入de novo的甲基化的区域(参照J.Borgel et al.，Nat Genet 42，1093(Dec，2010))。此外，对照的Tcl1DMR虽然在向EpiLCs移行的过程中开始甲基化，但Tet1－KD EpiLCs中维持低甲基化的状态(图47)。

因此我们认为，Tet1并不通过去甲基化活性直接影响Tcl1DMR的甲基化，但在Tet1仍然高度表达的原始态阶段中，通过调控已知在基因组的总括再甲基化中很重要的denovo DNA甲基转移酶(Dnmt3a及Dnmt3b)的表达而间接施加影响。实际上，如图41所示，在Tet1－KD EpiLCs中，这些DNA甲基转移酶的表达水平极低。

因此，接着调查了在Tet1－KD EpiLCs中观察到的、总括的低甲基化状态及Dnmt3a/b的调节异常是否能够通过Dnmt3b启动子中的异常甲基化状态来解释。即，通过全基因组甲基化测序对Dnmt3b的全部推定DMR的甲基化状态进行解析的结果，虽未进行图示，但明确了位于自转录起始位点起－866～－576之间的位置的一个区域在Tet1－KD小鼠ES细胞中为高甲基化，该高甲基化状态似乎与Tet1的去甲基化活性的丧失一致。

但是，该甲基化状态的差异微弱，因此对用于解释Dnmt3a/b的异常调节的脱氧酶非依赖性分子机制进行了调查。

已知原始态型因子Prdm14通过抑制Dnmt3b的表达而部分性参与小鼠ES细胞中的多能性的确保(参照Z.Ma，T.Swigut，A.Valouev，A.Rada－Iglesias，J.Wysocka，NatStruct Mol Biol 18，120(Feb，2011)及M.Yamaji et al.，Cell Stem Cell 12，368(Mar7，2013))。因此，对该Prdm14在从原始态阶段向起始态阶段的移行过程中的表达进行了解析。

其结果是，从原始态阶段向起始态阶段的移行过程中，Prdm14 mRNA的表达水平在小鼠ES细胞中高，在EpiLCs中低。但是明确了通过敲除Tet1，EpiLC中的Prdm14表达抑制可解除(图40)。由此暗示了Tet1承担Prdm14的表达抑制，结果有助于由小鼠ES细胞分化为EpiLC时的Dnmt3a/b的表达亢进，进而，该表达抑制也与Tet1－KD EpiLC中的Dnmt3a/b的表达抑制一致。

然后，通过将Prdm14及Tet1一起敲除(Tet1/Prdm14－double KD)调查了Tet1丧失是否使EpiLC中的Dnmt3b的表达下降变为无效(图48)。

与Tet1－KD相比，在Tet1/Prdm14－double KD EpiLC中，确定起始态阶段的因子Otx2、Dnmt3a及Dnmt3b的表达增强，(胚体外)原始内胚层标志物Gata6的表达被抑制(图49～52)。

上述结果暗示了Tet1－KD在从原始态阶段向起始态阶段移行过程中的Dnmt3a及Dnmt3b的表达下降的诱导、以及Tet1－KD EpiLC中的低甲基化状态的维持不仅有Tet1脱氧酶依赖性机制的参与，而且有非依赖性机制的参与。

然后，为了分别解析在从原始态阶段向起始态阶段的移行中Dnmt3同工型的作用，在Tet1－KD细胞中分别导入了Dnmt3的各种同工型。

其结果是，Tet1－KD中的Otx2的表达由于Dnmt3a2的异位表达而恢复至与野生型的Otx2相同的水平(图53)。另一方面，Tet1－KD中的Gata6的表达亢进由于Dnmt3b的异位表达而无效(图54)。

因此暗示，Tet1通过调控Dnmt3a/b而积极地使小鼠ES细胞由原始态阶段向起始态型多能性阶段过渡。

以上通过实施例1～9及11所示而明确了：将在从氨基末端起第2位的位置具有不同于天然TET1蛋白质的从氨基末端起第2位的氨基酸残基的氨基酸残基的变异型TET1蛋白质导入人分化多能性干细胞，由此能够显著提高其分化能力。进而明确了，若能够使通常积极分解TET1蛋白质的人分化多能性干细胞等表达该蛋白质，则能够显著提高该细胞的分化能力。进而还明确了，通过所述分化能力的提高，能够消除现有的人iPS细胞中可见的分化诱导偏倚(例如，实施例5中观察到的向中内胚层的若干分化)。进而还明确了，所述分化能力的提高还能够通过将从N末端起第2位的氨基酸置换为不同的氨基酸、双加氧酶区域缺失的变异型TET1蛋白质来实现。即还显示，分化能力的提高中，双加氧酶区域所承担的去甲基化活性并非必需，只要维持了TET1蛋白质的DNA结合能力即以足矣。

此外还明确了，如实施例10所示，根据本发明不仅能够提高所获得的分化多能性干细胞的分化能力，还能够提高iPS细胞的诱导效率(制造效率)。

此外，如前所述，已知TET1蛋白质在由受精卵至胚泡的原始态状态下表达。将该点与本实施例中明确的在人分化多能性干细胞(起始态状态)中TET1蛋白质不表达、以及导入TET1蛋白质则分化能力提高一并考虑，我们认为：在早期发生中，为了顺利地发生从胚泡(原始态)向上胚层(起始态)、进而向各胚层分化，TET1蛋白质发挥作用。实际上本发明已明确，如实施例12～14所示，TET1蛋白质通过调控Dnmt3a/b的表达，积极地将小鼠ES细胞从原始态阶段向起始态型多能性阶段引导。

因此强烈暗示了：具有作为使向所述各细胞种类的分化诱导迅速进行的润滑油作用、换言之具有赋予发生进行中的强健性(robustness)作用的是TET1蛋白质，本实施例中明确的、利用TET1蛋白质可提高分化多能性干细胞中的分化能力是通过在该分化诱导中增强robustness而产生的。

[产业上的利用可能性]

如以上说明那样，根据本发明，通过使通常积极分解TET1蛋白质的人分化多能性干细胞等稳定地表达该蛋白质，使分化诱导的抑制因子NANOG等的表达迅速消失。此外，另一方面，能够通过促进分化诱导相关因子的表达来提高分化多能性干细胞的分化能力。

因此，本发明的TET1蛋白质等及利用该蛋白质等的分化多能性干细胞的制造方法能够消除该细胞中的、NANOG等的表达所引起的对分化诱导的抵抗、和中内胚层标志物T及SOX17等的表达所引起的分化诱导偏倚，进而能够以极高的效率仅获得目标细胞，本发明在这些方面是优异的。因此，本发明在极其需要提供多种细胞、组织、脏器等的再生医疗、新药开发以及生殖医疗等中有用。

[序列表自由文本]

序列号：7～44

＜223＞人工合成的引物序列

序列号：45及46

＜223＞FLAG标签的序列

[序列表]IBPF13-542WO-(seq)fin.txt

序列表

<110> 埼玉医科大学

Saitama Medical University

<120> 分化多能性干细胞的制造方法

METHOD FOR PRODUCING PLURIPOTENT STEM CELL

<130> IBPF13-542WO

<150> JP2012/237734

<151> 2012-10-29

<160> 46

<170> PatentIn版本3.1

<210> 1

<211> 9601

<212> DNA

<213> 人类

<220>

<221> CDS

<222> (506)..(6916)

<223>

<400> 1

agacactgct gctccggggg gctgacctgg cggggagtgg ccgcgcagtc tgctccggcg 60

ccgctttgtg cgcgcagccg ctggcccctc tactcccggg tctgcccccc gggacacccc 120

tctgcctcgc ccaagtcatg cagccctacc tgcctctcca ctgtggacct ttgggaaccg 180

actcctcacc tcgggggctc gggccttgac tgtgctggga gccggtaggc gtcctccgcg 240

acccgcccgc gcccctcgcg cccgccgggg ccccgggctc caaagttgtg gggaccggcg 300

cgagttggaa agtttgcccg agggctggtg caggcttgga gctgggggcc gtgcgctgcc 360

ctgggaatgt gacccggcca gcgaccaaaa ccttgtgtga ctgagctgaa gagcagtgca 420

tccagattct cctcagaagt gagactttcc aaaggaccaa tgactctgtt tcctgcgccc 480

tttcattttt tcctactctg tagct atg tct cga tcc cgc cat gca agg cct 532

Met Ser Arg Ser Arg His Ala Arg Pro

1 5

tcc aga tta gtc agg aag gaa gat gta aac aaa aaa aag aaa aac agc 580

Ser Arg Leu Val Arg Lys Glu Asp Val Asn Lys Lys Lys Lys Asn Ser

10 15 20 25

caa cta cga aag aca acc aag gga gcc aac aaa aat gtg gca tca gtc 628

Gln Leu Arg Lys Thr Thr Lys Gly Ala Asn Lys Asn Val Ala Ser Val

30 35 40

aag act tta agc cct gga aaa tta aag caa tta att caa gaa aga gat 676

Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Leu Lys Gln Leu Ile Gln Glu Arg Asp

45 50 55

gtt aag aaa aaa aca gaa cct aaa cca ccc gtg cca gtc aga agc ctt 724

Val Lys Lys Lys Thr Glu Pro Lys Pro Pro Val Pro Val Arg Ser Leu

60 65 70

ctg aca aga gct gga gca gca cgc atg aat ttg gat agg act gag gtt 772

Leu Thr Arg Ala Gly Ala Ala Arg Met Asn Leu Asp Arg Thr Glu Val

75 80 85

ctt ttt cag aac cca gag tcc tta acc tgc aat ggg ttt aca atg gcg 820

Leu Phe Gln Asn Pro Glu Ser Leu Thr Cys Asn Gly Phe Thr Met Ala

90 95 100 105

cta cga agc acc tct ctt agc agg cga ctc tcc caa ccc cca ctg gtc 868

Leu Arg Ser Thr Ser Leu Ser Arg Arg Leu Ser Gln Pro Pro Leu Val

110 115 120

gta gcc aaa tcc aaa aag gtt cca ctt tct aag ggt tta gaa aag caa 916

Val Ala Lys Ser Lys Lys Val Pro Leu Ser Lys Gly Leu Glu Lys Gln

125 130 135

cat gat tgt gat tat aag ata ctc cct gct ttg gga gta aag cac tca 964

His Asp Cys Asp Tyr Lys Ile Leu Pro Ala Leu Gly Val Lys His Ser

140 145 150

gaa aat gat tcg gtt cca atg caa gac acc caa gtc ctt cct gat ata 1012

Glu Asn Asp Ser Val Pro Met Gln Asp Thr Gln Val Leu Pro Asp Ile

155 160 165

gag act cta att ggt gta caa aat ccc tct tta ctt aaa ggt aag agc 1060

Glu Thr Leu Ile Gly Val Gln Asn Pro Ser Leu Leu Lys Gly Lys Ser

170 175 180 185

caa gag aca act cag ttt tgg tcc caa aga gtt gag gat tcc aag atc 1108

Gln Glu Thr Thr Gln Phe Trp Ser Gln Arg Val Glu Asp Ser Lys Ile

190 195 200

aat atc cct acc cac agt ggc cct gca gct gag atc ctt cct ggg cca 1156

Asn Ile Pro Thr His Ser Gly Pro Ala Ala Glu Ile Leu Pro Gly Pro

205 210 215

ctg gaa ggg aca cgc tgt ggt gaa gga cta ttc tct gaa gag aca ttg 1204

Leu Glu Gly Thr Arg Cys Gly Glu Gly Leu Phe Ser Glu Glu Thr Leu

220 225 230

aat gat acc agt ggt tcc cca aaa atg ttt gct cag gac aca gtg tgt 1252

Asn Asp Thr Ser Gly Ser Pro Lys Met Phe Ala Gln Asp Thr Val Cys

235 240 245

gct cct ttt ccc caa aga gca acc ccc aaa gtt acc tct caa gga aac 1300

Ala Pro Phe Pro Gln Arg Ala Thr Pro Lys Val Thr Ser Gln Gly Asn

250 255 260 265

ccc agc att cag tta gaa gag ttg ggt tca cga gta gaa tct ctt aag 1348

Pro Ser Ile Gln Leu Glu Glu Leu Gly Ser Arg Val Glu Ser Leu Lys

270 275 280

tta tct gat tct tac ctg gat ccc att aaa agt gaa cat gat tgc tac 1396

Leu Ser Asp Ser Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Ser Glu His Asp Cys Tyr

285 290 295

ccc acc tcc agt ctt aat aag gtt ata cct gac ttg aac ctt aga aac 1444

Pro Thr Ser Ser Leu Asn Lys Val Ile Pro Asp Leu Asn Leu Arg Asn

300 305 310

tgc ttg gct ctt ggt ggg tct acg tct cct acc tct gta ata aaa ttc 1492

Cys Leu Ala Leu Gly Gly Ser Thr Ser Pro Thr Ser Val Ile Lys Phe

315 320 325

ctc ttg gca ggc tca aaa caa gcg acc ctt ggt gct aaa cca gat cat 1540

Leu Leu Ala Gly Ser Lys Gln Ala Thr Leu Gly Ala Lys Pro Asp His

330 335 340 345

caa gag gcc ttc gaa gct act gca aat caa cag gaa gtt tct gat acc 1588

Gln Glu Ala Phe Glu Ala Thr Ala Asn Gln Gln Glu Val Ser Asp Thr

350 355 360

acc tct ttc cta gga cag gcc ttt ggt gct atc cca cat caa tgg gaa 1636

Thr Ser Phe Leu Gly Gln Ala Phe Gly Ala Ile Pro His Gln Trp Glu

365 370 375

ctt cct ggt gct gac cca gtt cat ggt gag gcc ctg ggt gag acc cca 1684

Leu Pro Gly Ala Asp Pro Val His Gly Glu Ala Leu Gly Glu Thr Pro

380 385 390

gat cta cca gag att cct ggt gct att cca gtc caa gga gag gtc ttt 1732

Asp Leu Pro Glu Ile Pro Gly Ala Ile Pro Val Gln Gly Glu Val Phe

395 400 405

ggt act att tta gac caa caa gaa act ctt ggt atg agt ggg agt gtt 1780

Gly Thr Ile Leu Asp Gln Gln Glu Thr Leu Gly Met Ser Gly Ser Val

410 415 420 425

gtc cca gac ttg cct gtc ttc ctt cct gtt cct cca aat cca att gct 1828

Val Pro Asp Leu Pro Val Phe Leu Pro Val Pro Pro Asn Pro Ile Ala

430 435 440

acc ttt aat gct cct tcc aaa tgg cct gag ccc caa agc act gtc tca 1876

Thr Phe Asn Ala Pro Ser Lys Trp Pro Glu Pro Gln Ser Thr Val Ser

445 450 455

tat gga ctt gca gtc cag ggt gct ata cag att ttg cct ttg ggc tca 1924

Tyr Gly Leu Ala Val Gln Gly Ala Ile Gln Ile Leu Pro Leu Gly Ser

460 465 470

gga cac act cct caa tca tca tca aac tca gag aaa aat tca tta cct 1972

Gly His Thr Pro Gln Ser Ser Ser Asn Ser Glu Lys Asn Ser Leu Pro

475 480 485

cca gta atg gct ata agc aat gta gaa aat gag aag cag gtt cat ata 2020

Pro Val Met Ala Ile Ser Asn Val Glu Asn Glu Lys Gln Val His Ile

490 495 500 505

agc ttc ctg cca gct aac act cag ggg ttc cca tta gcc cct gag aga 2068

Ser Phe Leu Pro Ala Asn Thr Gln Gly Phe Pro Leu Ala Pro Glu Arg

510 515 520

gga ctc ttc cat gct tca ctg ggt ata gcc caa ctc tct cag gct ggt 2116

Gly Leu Phe His Ala Ser Leu Gly Ile Ala Gln Leu Ser Gln Ala Gly

525 530 535

cct agc aaa tca gac aga ggg agc tcc cag gtc agt gta acc agc aca 2164

Pro Ser Lys Ser Asp Arg Gly Ser Ser Gln Val Ser Val Thr Ser Thr

540 545 550

gtt cat gtt gtc aac acc aca gtg gtg act atg cca gtg cca atg gtc 2212

Val His Val Val Asn Thr Thr Val Val Thr Met Pro Val Pro Met Val

555 560 565

agt acc tcc tct tct tcc tat acc act ttg cta ccg act ttg gaa aag 2260

Ser Thr Ser Ser Ser Ser Tyr Thr Thr Leu Leu Pro Thr Leu Glu Lys

570 575 580 585

aag aaa aga aag cga tgt ggg gtc tgt gaa ccc tgc cag cag aag acc 2308

Lys Lys Arg Lys Arg Cys Gly Val Cys Glu Pro Cys Gln Gln Lys Thr

590 595 600

aac tgt ggt gaa tgc act tac tgc aag aac aga aag aac agc cat cag 2356

Asn Cys Gly Glu Cys Thr Tyr Cys Lys Asn Arg Lys Asn Ser His Gln

605 610 615

atc tgt aag aaa aga aaa tgt gag gag ctg aaa aag aaa cca tct gtt 2404

Ile Cys Lys Lys Arg Lys Cys Glu Glu Leu Lys Lys Lys Pro Ser Val

620 625 630

gtt gtg cct ctg gag gtt ata aag gaa aac aag agg ccc cag agg gaa 2452

Val Val Pro Leu Glu Val Ile Lys Glu Asn Lys Arg Pro Gln Arg Glu

635 640 645

aag aag ccc aaa gtt tta aag gca gat ttt gac aac aaa cca gta aat 2500

Lys Lys Pro Lys Val Leu Lys Ala Asp Phe Asp Asn Lys Pro Val Asn

650 655 660 665

ggc ccc aag tca gaa tcc atg gac tac agt aga tgt ggt cat ggg gaa 2548

Gly Pro Lys Ser Glu Ser Met Asp Tyr Ser Arg Cys Gly His Gly Glu

670 675 680

gaa caa aaa ttg gaa ttg aac cca cat act gtt gaa aat gta act aaa 2596

Glu Gln Lys Leu Glu Leu Asn Pro His Thr Val Glu Asn Val Thr Lys

685 690 695

aat gaa gac agc atg aca ggc atc gag gtg gag aag tgg aca caa aac 2644

Asn Glu Asp Ser Met Thr Gly Ile Glu Val Glu Lys Trp Thr Gln Asn

700 705 710

aag aaa tca cag tta act gat cac gtg aaa gga gat ttt agt gct aat 2692

Lys Lys Ser Gln Leu Thr Asp His Val Lys Gly Asp Phe Ser Ala Asn

715 720 725

gtc cca gaa gct gaa aaa tcg aaa aac tct gaa gtt gac aag aaa cga 2740

Val Pro Glu Ala Glu Lys Ser Lys Asn Ser Glu Val Asp Lys Lys Arg

730 735 740 745

acc aaa tct cca aaa ttg ttt gta caa acc gta aga aat ggc att aaa 2788

Thr Lys Ser Pro Lys Leu Phe Val Gln Thr Val Arg Asn Gly Ile Lys

750 755 760

cat gta cac tgt tta cca gct gaa aca aat gtt tca ttt aaa aaa ttc 2836

His Val His Cys Leu Pro Ala Glu Thr Asn Val Ser Phe Lys Lys Phe

765 770 775

aat att gaa gaa ttc ggc aag aca ttg gaa aac aat tct tat aaa ttc 2884

Asn Ile Glu Glu Phe Gly Lys Thr Leu Glu Asn Asn Ser Tyr Lys Phe

780 785 790

cta aaa gac act gca aac cat aaa aac gct atg agc tct gtt gct act 2932

Leu Lys Asp Thr Ala Asn His Lys Asn Ala Met Ser Ser Val Ala Thr

795 800 805

gat atg agt tgt gat cat ctc aag ggg aga agt aac gtt tta gta ttc 2980

Asp Met Ser Cys Asp His Leu Lys Gly Arg Ser Asn Val Leu Val Phe

810 815 820 825

cag cag cct ggc ttt aac tgc agt tcc att cca cat tct tca cac tcc 3028

Gln Gln Pro Gly Phe Asn Cys Ser Ser Ile Pro His Ser Ser His Ser

830 835 840

atc ata aat cat cat gct agt ata cac aat gaa ggt gat caa cca aaa 3076

Ile Ile Asn His His Ala Ser Ile His Asn Glu Gly Asp Gln Pro Lys

845 850 855

act cct gag aat ata cca agt aaa gaa cca aaa gat gga tct ccc gtt 3124

Thr Pro Glu Asn Ile Pro Ser Lys Glu Pro Lys Asp Gly Ser Pro Val

860 865 870

caa cca agt ctc tta tcg tta atg aaa gat agg aga tta aca ttg gag 3172

Gln Pro Ser Leu Leu Ser Leu Met Lys Asp Arg Arg Leu Thr Leu Glu

875 880 885

caa gtg gta gcc ata gag gcc ctg act caa ctc tca gaa gcc cca tca 3220

Gln Val Val Ala Ile Glu Ala Leu Thr Gln Leu Ser Glu Ala Pro Ser

890 895 900 905

gag aat tcc tcc cca tca aag tca gag aag gat gag gaa tca gag cag 3268

Glu Asn Ser Ser Pro Ser Lys Ser Glu Lys Asp Glu Glu Ser Glu Gln

910 915 920

aga aca gcc agt ttg ctt aat agc tgc aaa gct atc ctc tac act gta 3316

Arg Thr Ala Ser Leu Leu Asn Ser Cys Lys Ala Ile Leu Tyr Thr Val

925 930 935

aga aaa gac ctc caa gac cca aac tta cag gga gag cca cca aaa ctt 3364

Arg Lys Asp Leu Gln Asp Pro Asn Leu Gln Gly Glu Pro Pro Lys Leu

940 945 950

aat cac tgt cca tct ttg gaa aaa caa agt tca tgc aac acg gtg gtt 3412

Asn His Cys Pro Ser Leu Glu Lys Gln Ser Ser Cys Asn Thr Val Val

955 960 965

ttc aat ggg caa act act acc ctt tcc aac tca cat atc aac tca gct 3460

Phe Asn Gly Gln Thr Thr Thr Leu Ser Asn Ser His Ile Asn Ser Ala

970 975 980 985

act aac caa gca tcc aca aag tca cat gaa tat tca aaa gtc aca aat 3508

Thr Asn Gln Ala Ser Thr Lys Ser His Glu Tyr Ser Lys Val Thr Asn

990 995 1000

tca tta tct ctt ttt ata cca aaa tca aat tca tcc aag att gac 3553

Ser Leu Ser Leu Phe Ile Pro Lys Ser Asn Ser Ser Lys Ile Asp

1005 1010 1015

acc aat aaa agt att gct caa ggg ata att act ctt gac aat tgt 3598

Thr Asn Lys Ser Ile Ala Gln Gly Ile Ile Thr Leu Asp Asn Cys

1020 1025 1030

tcc aat gat ttg cat cag ttg cca cca aga aat aat gaa gtg gag 3643

Ser Asn Asp Leu His Gln Leu Pro Pro Arg Asn Asn Glu Val Glu

1035 1040 1045

tat tgc aac cag tta ctg gac agc agc aaa aaa ttg gac tca gat 3688

Tyr Cys Asn Gln Leu Leu Asp Ser Ser Lys Lys Leu Asp Ser Asp

1050 1055 1060

gat cta tca tgt cag gat gca acc cat acc caa att gag gaa gat 3733

Asp Leu Ser Cys Gln Asp Ala Thr His Thr Gln Ile Glu Glu Asp

1065 1070 1075

gtt gca aca cag ttg aca caa ctt gct tcg ata att aag atc aat 3778

Val Ala Thr Gln Leu Thr Gln Leu Ala Ser Ile Ile Lys Ile Asn

1080 1085 1090

tat ata aaa cca gag gac aaa aaa gtt gaa agt aca cca aca agc 3823

Tyr Ile Lys Pro Glu Asp Lys Lys Val Glu Ser Thr Pro Thr Ser

1095 1100 1105

ctt gtc aca tgt aat gta cag caa aaa tac aat cag gag aag ggc 3868

Leu Val Thr Cys Asn Val Gln Gln Lys Tyr Asn Gln Glu Lys Gly

1110 1115 1120

aca ata caa cag aaa cca cct tca agt gta cac aat aat cat ggt 3913

Thr Ile Gln Gln Lys Pro Pro Ser Ser Val His Asn Asn His Gly

1125 1130 1135

tca tca tta aca aaa caa aag aac cca acc cag aaa aag aca aaa 3958

Ser Ser Leu Thr Lys Gln Lys Asn Pro Thr Gln Lys Lys Thr Lys

1140 1145 1150

tcc acc cca tca aga gat cgg cgg aaa aag aag ccc aca gtt gta 4003

Ser Thr Pro Ser Arg Asp Arg Arg Lys Lys Lys Pro Thr Val Val

1155 1160 1165

agt tat caa gaa aat gat cgg cag aag tgg gaa aag ttg tcc tat 4048

Ser Tyr Gln Glu Asn Asp Arg Gln Lys Trp Glu Lys Leu Ser Tyr

1170 1175 1180

atg tat ggc aca ata tgc gac att tgg ata gca tcg aaa ttt caa 4093

Met Tyr Gly Thr Ile Cys Asp Ile Trp Ile Ala Ser Lys Phe Gln

1185 1190 1195

aat ttt ggg caa ttt tgt cca cat gat ttt cct act gta ttt ggg 4138

Asn Phe Gly Gln Phe Cys Pro His Asp Phe Pro Thr Val Phe Gly

1200 1205 1210

aaa att tct tcc tcg acc aaa ata tgg aaa cca ctg gct caa acg 4183

Lys Ile Ser Ser Ser Thr Lys Ile Trp Lys Pro Leu Ala Gln Thr

1215 1220 1225

agg tcc att atg caa ccc aaa aca gta ttt cca cca ctc act cag 4228

Arg Ser Ile Met Gln Pro Lys Thr Val Phe Pro Pro Leu Thr Gln

1230 1235 1240

ata aaa tta cag aga tat cct gaa tca gca gag gaa aag gtg aag 4273

Ile Lys Leu Gln Arg Tyr Pro Glu Ser Ala Glu Glu Lys Val Lys

1245 1250 1255

gtt gaa cca ttg gat tca ctc agc tta ttt cat ctt aaa acg gaa 4318

Val Glu Pro Leu Asp Ser Leu Ser Leu Phe His Leu Lys Thr Glu

1260 1265 1270

tcc aac ggg aag gca ttc act gat aaa gct tat aat tct cag gta 4363

Ser Asn Gly Lys Ala Phe Thr Asp Lys Ala Tyr Asn Ser Gln Val

1275 1280 1285

cag tta acg gtg aat gcc aat cag aaa gcc cat cct ttg acc cag 4408

Gln Leu Thr Val Asn Ala Asn Gln Lys Ala His Pro Leu Thr Gln

1290 1295 1300

ccc tcc tct cca cct aac cag tgt gct aac gtg atg gca ggc gat 4453

Pro Ser Ser Pro Pro Asn Gln Cys Ala Asn Val Met Ala Gly Asp

1305 1310 1315

gac caa ata cgg ttt cag cag gtt gtt aag gag caa ctc atg cat 4498

Asp Gln Ile Arg Phe Gln Gln Val Val Lys Glu Gln Leu Met His

1320 1325 1330

cag aga ctg cca aca ttg cct ggt atc tct cat gaa aca ccc tta 4543

Gln Arg Leu Pro Thr Leu Pro Gly Ile Ser His Glu Thr Pro Leu

1335 1340 1345

ccg gag tca gca cta act ctc agg aat gta aat gta gtg tgt tca 4588

Pro Glu Ser Ala Leu Thr Leu Arg Asn Val Asn Val Val Cys Ser

1350 1355 1360

ggt gga att aca gtg gtt tct acc aaa agt gaa gag gaa gtc tgt 4633

Gly Gly Ile Thr Val Val Ser Thr Lys Ser Glu Glu Glu Val Cys

1365 1370 1375

tca tcc agt ttt gga aca tca gaa ttt tcc aca gtg gac agt gca 4678

Ser Ser Ser Phe Gly Thr Ser Glu Phe Ser Thr Val Asp Ser Ala

1380 1385 1390

cag aaa aat ttt aat gat tat gcc atg aac ttc ttt act aac cct 4723

Gln Lys Asn Phe Asn Asp Tyr Ala Met Asn Phe Phe Thr Asn Pro

1395 1400 1405

aca aaa aac cta gtg tct ata act aaa gat tct gaa ctg ccc acc 4768

Thr Lys Asn Leu Val Ser Ile Thr Lys Asp Ser Glu Leu Pro Thr

1410 1415 1420

tgc agc tgt ctt gat cga gtt ata caa aaa gac aaa ggc cca tat 4813

Cys Ser Cys Leu Asp Arg Val Ile Gln Lys Asp Lys Gly Pro Tyr

1425 1430 1435

tat aca cac ctt ggg gca gga cca agt gtt gct gct gtc agg gaa 4858

Tyr Thr His Leu Gly Ala Gly Pro Ser Val Ala Ala Val Arg Glu

1440 1445 1450

atc atg gag aat agg tat ggt caa aaa gga aac gca ata agg ata 4903

Ile Met Glu Asn Arg Tyr Gly Gln Lys Gly Asn Ala Ile Arg Ile

1455 1460 1465

gaa ata gta gtg tac acc ggt aaa gaa ggg aaa agc tct cat ggg 4948

Glu Ile Val Val Tyr Thr Gly Lys Glu Gly Lys Ser Ser His Gly

1470 1475 1480

tgt cca att gct aag tgg gtt tta aga aga agc agt gat gaa gaa 4993

Cys Pro Ile Ala Lys Trp Val Leu Arg Arg Ser Ser Asp Glu Glu

1485 1490 1495

aaa gtt ctt tgt ttg gtc cgg cag cgt aca ggc cac cac tgt cca 5038

Lys Val Leu Cys Leu Val Arg Gln Arg Thr Gly His His Cys Pro

1500 1505 1510

act gct gtg atg gtg gtg ctc atc atg gtg tgg gat ggc atc cct 5083

Thr Ala Val Met Val Val Leu Ile Met Val Trp Asp Gly Ile Pro

1515 1520 1525

ctt cca atg gcc gac cgg cta tac aca gag ctc aca gag aat cta 5128

Leu Pro Met Ala Asp Arg Leu Tyr Thr Glu Leu Thr Glu Asn Leu

1530 1535 1540

aag tca tac aat ggg cac cct acc gac aga aga tgc acc ctc aat 5173

Lys Ser Tyr Asn Gly His Pro Thr Asp Arg Arg Cys Thr Leu Asn

1545 1550 1555

gaa aat cgt acc tgt aca tgt caa gga att gat cca gag act tgt 5218

Glu Asn Arg Thr Cys Thr Cys Gln Gly Ile Asp Pro Glu Thr Cys

1560 1565 1570

gga gct tca ttc tct ttt ggc tgt tca tgg agt atg tac ttt aat 5263

Gly Ala Ser Phe Ser Phe Gly Cys Ser Trp Ser Met Tyr Phe Asn

1575 1580 1585

ggc tgt aag ttt ggt aga agc cca agc ccc aga aga ttt aga att 5308

Gly Cys Lys Phe Gly Arg Ser Pro Ser Pro Arg Arg Phe Arg Ile

1590 1595 1600

gat cca agc tct ccc tta cat gaa aaa aac ctt gaa gat aac tta 5353

Asp Pro Ser Ser Pro Leu His Glu Lys Asn Leu Glu Asp Asn Leu

1605 1610 1615

cag agt ttg gct aca cga tta gct cca att tat aag cag tat gct 5398

Gln Ser Leu Ala Thr Arg Leu Ala Pro Ile Tyr Lys Gln Tyr Ala

1620 1625 1630

cca gta gct tac caa aat cag gtg gaa tat gaa aat gtt gcc cga 5443

Pro Val Ala Tyr Gln Asn Gln Val Glu Tyr Glu Asn Val Ala Arg

1635 1640 1645

gaa tgt cgg ctt ggc agc aag gaa ggt cgt ccc ttc tct ggg gtc 5488

Glu Cys Arg Leu Gly Ser Lys Glu Gly Arg Pro Phe Ser Gly Val

1650 1655 1660

act gct tgc ctg gac ttc tgt gct cat ccc cac agg gac att cac 5533

Thr Ala Cys Leu Asp Phe Cys Ala His Pro His Arg Asp Ile His

1665 1670 1675

aac atg aat aat gga agc act gtg gtt tgt acc tta act cga gaa 5578

Asn Met Asn Asn Gly Ser Thr Val Val Cys Thr Leu Thr Arg Glu

1680 1685 1690

gat aac cgc tct ttg ggt gtt att cct caa gat gag cag ctc cat 5623

Asp Asn Arg Ser Leu Gly Val Ile Pro Gln Asp Glu Gln Leu His

1695 1700 1705

gtg cta cct ctt tat aag ctt tca gac aca gat gag ttt ggc tcc 5668

Val Leu Pro Leu Tyr Lys Leu Ser Asp Thr Asp Glu Phe Gly Ser

1710 1715 1720

aag gaa gga atg gaa gcc aag atc aaa tct ggg gcc atc gag gtc 5713

Lys Glu Gly Met Glu Ala Lys Ile Lys Ser Gly Ala Ile Glu Val

1725 1730 1735

ctg gca ccc cgc cgc aaa aaa aga acg tgt ttc act cag cct gtt 5758

Leu Ala Pro Arg Arg Lys Lys Arg Thr Cys Phe Thr Gln Pro Val

1740 1745 1750

ccc cgt tct gga aag aag agg gct gcg atg atg aca gag gtt ctt 5803

Pro Arg Ser Gly Lys Lys Arg Ala Ala Met Met Thr Glu Val Leu

1755 1760 1765

gca cat aag ata agg gca gtg gaa aag aaa cct att ccc cga atc 5848

Ala His Lys Ile Arg Ala Val Glu Lys Lys Pro Ile Pro Arg Ile

1770 1775 1780

aag cgg aag aat aac tca aca aca aca aac aac agt aag cct tcg 5893

Lys Arg Lys Asn Asn Ser Thr Thr Thr Asn Asn Ser Lys Pro Ser

1785 1790 1795

tca ctg cca acc tta ggg agt aac act gag acc gtg caa cct gaa 5938

Ser Leu Pro Thr Leu Gly Ser Asn Thr Glu Thr Val Gln Pro Glu

1800 1805 1810

gta aaa agt gaa acc gaa ccc cat ttt atc tta aaa agt tca gac 5983

Val Lys Ser Glu Thr Glu Pro His Phe Ile Leu Lys Ser Ser Asp

1815 1820 1825

aac act aaa act tat tcg ctg atg cca tcc gct cct cac cca gtg 6028

Asn Thr Lys Thr Tyr Ser Leu Met Pro Ser Ala Pro His Pro Val

1830 1835 1840

aaa gag gca tct cca ggc ttc tcc tgg tcc ccg aag act gct tca 6073

Lys Glu Ala Ser Pro Gly Phe Ser Trp Ser Pro Lys Thr Ala Ser

1845 1850 1855

gcc aca cca gct cca ctg aag aat gac gca aca gcc tca tgc ggg 6118

Ala Thr Pro Ala Pro Leu Lys Asn Asp Ala Thr Ala Ser Cys Gly

1860 1865 1870

ttt tca gaa aga agc agc act ccc cac tgt acg atg cct tcg gga 6163

Phe Ser Glu Arg Ser Ser Thr Pro His Cys Thr Met Pro Ser Gly

1875 1880 1885

aga ctc agt ggt gcc aat gca gct gct gct gat ggc cct ggc att 6208

Arg Leu Ser Gly Ala Asn Ala Ala Ala Ala Asp Gly Pro Gly Ile

1890 1895 1900

tca cag ctt ggc gaa gtg gct cct ctc ccc acc ctg tct gct cct 6253

Ser Gln Leu Gly Glu Val Ala Pro Leu Pro Thr Leu Ser Ala Pro

1905 1910 1915

gtg atg gag ccc ctc att aat tct gag cct tcc act ggt gtg act 6298

Val Met Glu Pro Leu Ile Asn Ser Glu Pro Ser Thr Gly Val Thr

1920 1925 1930

gag ccg cta acg cct cat cag cca aac cac cag ccc tcc ttc ctc 6343

Glu Pro Leu Thr Pro His Gln Pro Asn His Gln Pro Ser Phe Leu

1935 1940 1945

acc tct cct caa gac ctt gcc tct tct cca atg gaa gaa gat gag 6388

Thr Ser Pro Gln Asp Leu Ala Ser Ser Pro Met Glu Glu Asp Glu

1950 1955 1960

cag cat tct gaa gca gat gag cct cca tca gac gaa ccc cta tct 6433

Gln His Ser Glu Ala Asp Glu Pro Pro Ser Asp Glu Pro Leu Ser

1965 1970 1975

gat gac ccc ctg tca cct gct gag gag aaa ttg ccc cac att gat 6478

Asp Asp Pro Leu Ser Pro Ala Glu Glu Lys Leu Pro His Ile Asp

1980 1985 1990

gag tat tgg tca gac agt gag cac atc ttt ttg gat gca aat att 6523

Glu Tyr Trp Ser Asp Ser Glu His Ile Phe Leu Asp Ala Asn Ile

1995 2000 2005

ggt ggg gtg gcc atc gca cct gct cac ggc tcg gtt ttg att gag 6568

Gly Gly Val Ala Ile Ala Pro Ala His Gly Ser Val Leu Ile Glu

2010 2015 2020

tgt gcc cgg cga gag ctg cac gct acc act cct gtt gag cac ccc 6613

Cys Ala Arg Arg Glu Leu His Ala Thr Thr Pro Val Glu His Pro

2025 2030 2035

aac cgt aat cat cca acc cgc ctc tcc ctt gtc ttt tac cag cac 6658

Asn Arg Asn His Pro Thr Arg Leu Ser Leu Val Phe Tyr Gln His

2040 2045 2050

aaa aac cta aat aag ccc caa cat ggt ttt gaa cta aac aag att 6703

Lys Asn Leu Asn Lys Pro Gln His Gly Phe Glu Leu Asn Lys Ile

2055 2060 2065

aag ttt gag gct aaa gaa gct aag aat aag aaa atg aag gcc tca 6748

Lys Phe Glu Ala Lys Glu Ala Lys Asn Lys Lys Met Lys Ala Ser

2070 2075 2080

gag caa aaa gac cag gca gct aat gaa ggt cca gaa cag tcc tct 6793

Glu Gln Lys Asp Gln Ala Ala Asn Glu Gly Pro Glu Gln Ser Ser

2085 2090 2095

gaa gta aat gaa ttg aac caa att cct tct cat aaa gca tta aca 6838

Glu Val Asn Glu Leu Asn Gln Ile Pro Ser His Lys Ala Leu Thr

2100 2105 2110

tta acc cat gac aat gtt gtc acc gtg tcc cct tat gct ctc aca 6883

Leu Thr His Asp Asn Val Val Thr Val Ser Pro Tyr Ala Leu Thr

2115 2120 2125

cac gtt gcg ggg ccc tat aac cat tgg gtc tga aggcttttct 6926

His Val Ala Gly Pro Tyr Asn His Trp Val

2130 2135

ccccctctta atgcctttgc tagtgcagtg tattttttca aggtgctgtt aaaagaaagt 6986

catgttgtcg tttactatct tcatctcacc catttcaagt ctgaggtaaa aaaataataa 7046

tgataacaaa acggggtggg tattcttaac tgtgactata ttttgacaat tggtagaagg 7106

tgcacatttt aagcaaaaat aaaagtttta tagttttaaa tacataaaga aatgtttcag 7166

ttaggcatta accttgatag aatcactcag tttggtgctt taaattaagt ctgtttacta 7226

tgaaacaaga gtcattttta gaggatttta acaggttcat gttctatgat gtaaaatcaa 7286

gacacacagt gttaactcta cacagcttct ggtgcttaac cacatccaca cagttaaaaa 7346

taagctgaat tattatttca tggtgccatt gttccaacat cttccaatca ttgctagaaa 7406

attggcatat tcctttgaaa taaacttatg aaatgttttc tctcttaaaa tatttctcct 7466

gtgtaaaata aatcattgtt gttagtaatg gttggaggct gttcataaat tgtaaatata 7526

tattttaaaa gcactttcta tttttaaaag taacttgaaa taatatagta taagaatcct 7586

attgtctatt gtttgtgcat atttgcatac aagagaaatc atttatcctt gctgtgtaga 7646

gttccatctt gttaactgca gtatgtattc taatcatgta tatggtttgt gttcttttac 7706

tgtgtcctct cacattcaag tattagcaac ttgcagtata taaaatagtt agataatgag 7766

aagttgttaa ttatctctaa aattggaatt aggaagcata tcaccaatac tgattaacat 7826

tctctttgga actaggtaag agtggtctct tcttattgaa caacctcaat ttagtttcat 7886

cccacctttc tcagtataat ccatgagagg tgtttccaaa aggagatgag ggaacaggat 7946

aggtttcaga agagtcaaat gcttctaatg tctcaaggtg ataaaataca aaaactaagt 8006

agacagatat ttgtactgaa gtctgataca gaattagaaa aaaaaaattc ttgttgaaat 8066

attttgaaaa caaattccct actatcatca catgcctccc caaccccaag tcaaaaacaa 8126

gaggaatggt actacaaaca tggctttgtc cattaagagc taattcattt gtttatctta 8186

gcatactaga tttgggaaaa tgataactca tcttttctga taattgccta tgttctaggt 8246

aacaggaaaa caggcattaa gtttatttta gtcttcccat tttcttccta ttactttatt 8306

gactcatttt attgcaaaac aaaaaggatt acccaaacaa catgtttcga acaaggagaa 8366

ttttcaatga aatacttgat tctgttaaaa tgcagaggtg ctataacatt caaagtgtca 8426

gattccttgg gagtatggaa aacctaatgg tgcttctccc ttggaaatgc cataggaagc 8486

ccacaaccgc taacacttac aattttggtg caaaagcaaa cagttccagc aggctctcta 8546

aagaaaaact cattgtaact tattaaaata atatctggtg caaagtatct gttttgagct 8606

tttgactaat ccaagtaaag gaatatgaag ggattgtaaa aaacaaaatg tccattgata 8666

gaccatcgtg tacaagtaga tttctgcttg ttgaatatgt aaaatagggt aattcattga 8726

cttgttttag tattttgtgt gccttagatt tccgttttaa gacatgtata tttttgtgag 8786

cctaaggttt cttatataca tataagtata taaataagtg attgtttatt gcttcagctg 8846

cttcaacaag atatttacta gtattagact atcaggaata cacccttgcg agattatgtt 8906

ttagatttta ggccttagct cccactagaa attatttctt caccagattt aatggataaa 8966

gttttatggc tctttatgca tccactcatc tactcattct tcgagtctac acttattgaa 9026

tgcctgcaaa atctaagtat cacttttatt tttctttgga tcaccaccta tgacatagta 9086

aacttgaaga ataaaaacta ccctcagaaa tatttttaaa agaagtagca aattatcttc 9146

agtataatcc atggtaatgt atgcagtaat tcaaattgat ctctctctca ataggtttct 9206

taacaatcta aacttgaaac atcaatgtta atttttggaa ctattgggat ttgtgacgct 9266

tgttgcagtt taccaaaaca agtatttgaa aatatatagt atcaactgaa atgtttccat 9326

tccgttgttg tagttaacat catgaatgga cttcttaagc tgattacccc actgtgggaa 9386

ccaaattgga ttcctacttt gttggactct ctttcctgat tttaacaatt taccatccca 9446

ttctctgccc tgtgattttt tttaaaagct tattcaatgt tctgcagcat tgtgattgta 9506

tgctggctac actgctttta gaatgctctt tctcatgaag caaggaaata aatttgtttg 9566

aaatgacatt ttctctcaaa aaaaaaaaaa aaaaa 9601

<210> 2

<211> 2136

<212> PRT

<213> 人类

<400> 2

Met Ser Arg Ser Arg His Ala Arg Pro Ser Arg Leu Val Arg Lys Glu

1 5 10 15

Asp Val Asn Lys Lys Lys Lys Asn Ser Gln Leu Arg Lys Thr Thr Lys

20 25 30

Gly Ala Asn Lys Asn Val Ala Ser Val Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys

35 40 45

Leu Lys Gln Leu Ile Gln Glu Arg Asp Val Lys Lys Lys Thr Glu Pro

50 55 60

Lys Pro Pro Val Pro Val Arg Ser Leu Leu Thr Arg Ala Gly Ala Ala

65 70 75 80

Arg Met Asn Leu Asp Arg Thr Glu Val Leu Phe Gln Asn Pro Glu Ser

85 90 95

Leu Thr Cys Asn Gly Phe Thr Met Ala Leu Arg Ser Thr Ser Leu Ser

100 105 110

Arg Arg Leu Ser Gln Pro Pro Leu Val Val Ala Lys Ser Lys Lys Val

115 120 125

Pro Leu Ser Lys Gly Leu Glu Lys Gln His Asp Cys Asp Tyr Lys Ile

130 135 140

Leu Pro Ala Leu Gly Val Lys His Ser Glu Asn Asp Ser Val Pro Met

145 150 155 160

Gln Asp Thr Gln Val Leu Pro Asp Ile Glu Thr Leu Ile Gly Val Gln

165 170 175

Asn Pro Ser Leu Leu Lys Gly Lys Ser Gln Glu Thr Thr Gln Phe Trp

180 185 190

Ser Gln Arg Val Glu Asp Ser Lys Ile Asn Ile Pro Thr His Ser Gly

195 200 205

Pro Ala Ala Glu Ile Leu Pro Gly Pro Leu Glu Gly Thr Arg Cys Gly

210 215 220

Glu Gly Leu Phe Ser Glu Glu Thr Leu Asn Asp Thr Ser Gly Ser Pro

225 230 235 240

Lys Met Phe Ala Gln Asp Thr Val Cys Ala Pro Phe Pro Gln Arg Ala

245 250 255

Thr Pro Lys Val Thr Ser Gln Gly Asn Pro Ser Ile Gln Leu Glu Glu

260 265 270

Leu Gly Ser Arg Val Glu Ser Leu Lys Leu Ser Asp Ser Tyr Leu Asp

275 280 285

Pro Ile Lys Ser Glu His Asp Cys Tyr Pro Thr Ser Ser Leu Asn Lys

290 295 300

Val Ile Pro Asp Leu Asn Leu Arg Asn Cys Leu Ala Leu Gly Gly Ser

305 310 315 320

Thr Ser Pro Thr Ser Val Ile Lys Phe Leu Leu Ala Gly Ser Lys Gln

325 330 335

Ala Thr Leu Gly Ala Lys Pro Asp His Gln Glu Ala Phe Glu Ala Thr

340 345 350

Ala Asn Gln Gln Glu Val Ser Asp Thr Thr Ser Phe Leu Gly Gln Ala

355 360 365

Phe Gly Ala Ile Pro His Gln Trp Glu Leu Pro Gly Ala Asp Pro Val

370 375 380

His Gly Glu Ala Leu Gly Glu Thr Pro Asp Leu Pro Glu Ile Pro Gly

385 390 395 400

Ala Ile Pro Val Gln Gly Glu Val Phe Gly Thr Ile Leu Asp Gln Gln

405 410 415

Glu Thr Leu Gly Met Ser Gly Ser Val Val Pro Asp Leu Pro Val Phe

420 425 430

Leu Pro Val Pro Pro Asn Pro Ile Ala Thr Phe Asn Ala Pro Ser Lys

435 440 445

Trp Pro Glu Pro Gln Ser Thr Val Ser Tyr Gly Leu Ala Val Gln Gly

450 455 460

Ala Ile Gln Ile Leu Pro Leu Gly Ser Gly His Thr Pro Gln Ser Ser

465 470 475 480

Ser Asn Ser Glu Lys Asn Ser Leu Pro Pro Val Met Ala Ile Ser Asn

485 490 495

Val Glu Asn Glu Lys Gln Val His Ile Ser Phe Leu Pro Ala Asn Thr

500 505 510

Gln Gly Phe Pro Leu Ala Pro Glu Arg Gly Leu Phe His Ala Ser Leu

515 520 525

Gly Ile Ala Gln Leu Ser Gln Ala Gly Pro Ser Lys Ser Asp Arg Gly

530 535 540

Ser Ser Gln Val Ser Val Thr Ser Thr Val His Val Val Asn Thr Thr

545 550 555 560

Val Val Thr Met Pro Val Pro Met Val Ser Thr Ser Ser Ser Ser Tyr

565 570 575

Thr Thr Leu Leu Pro Thr Leu Glu Lys Lys Lys Arg Lys Arg Cys Gly

580 585 590

Val Cys Glu Pro Cys Gln Gln Lys Thr Asn Cys Gly Glu Cys Thr Tyr

595 600 605

Cys Lys Asn Arg Lys Asn Ser His Gln Ile Cys Lys Lys Arg Lys Cys

610 615 620

Glu Glu Leu Lys Lys Lys Pro Ser Val Val Val Pro Leu Glu Val Ile

625 630 635 640

Lys Glu Asn Lys Arg Pro Gln Arg Glu Lys Lys Pro Lys Val Leu Lys

645 650 655

Ala Asp Phe Asp Asn Lys Pro Val Asn Gly Pro Lys Ser Glu Ser Met

660 665 670

Asp Tyr Ser Arg Cys Gly His Gly Glu Glu Gln Lys Leu Glu Leu Asn

675 680 685

Pro His Thr Val Glu Asn Val Thr Lys Asn Glu Asp Ser Met Thr Gly

690 695 700

Ile Glu Val Glu Lys Trp Thr Gln Asn Lys Lys Ser Gln Leu Thr Asp

705 710 715 720

His Val Lys Gly Asp Phe Ser Ala Asn Val Pro Glu Ala Glu Lys Ser

725 730 735

Lys Asn Ser Glu Val Asp Lys Lys Arg Thr Lys Ser Pro Lys Leu Phe

740 745 750

Val Gln Thr Val Arg Asn Gly Ile Lys His Val His Cys Leu Pro Ala

755 760 765

Glu Thr Asn Val Ser Phe Lys Lys Phe Asn Ile Glu Glu Phe Gly Lys

770 775 780

Thr Leu Glu Asn Asn Ser Tyr Lys Phe Leu Lys Asp Thr Ala Asn His

785 790 795 800

Lys Asn Ala Met Ser Ser Val Ala Thr Asp Met Ser Cys Asp His Leu

805 810 815

Lys Gly Arg Ser Asn Val Leu Val Phe Gln Gln Pro Gly Phe Asn Cys

820 825 830

Ser Ser Ile Pro His Ser Ser His Ser Ile Ile Asn His His Ala Ser

835 840 845

Ile His Asn Glu Gly Asp Gln Pro Lys Thr Pro Glu Asn Ile Pro Ser

850 855 860

Lys Glu Pro Lys Asp Gly Ser Pro Val Gln Pro Ser Leu Leu Ser Leu

865 870 875 880

Met Lys Asp Arg Arg Leu Thr Leu Glu Gln Val Val Ala Ile Glu Ala

885 890 895

Leu Thr Gln Leu Ser Glu Ala Pro Ser Glu Asn Ser Ser Pro Ser Lys

900 905 910

Ser Glu Lys Asp Glu Glu Ser Glu Gln Arg Thr Ala Ser Leu Leu Asn

915 920 925

Ser Cys Lys Ala Ile Leu Tyr Thr Val Arg Lys Asp Leu Gln Asp Pro

930 935 940

Asn Leu Gln Gly Glu Pro Pro Lys Leu Asn His Cys Pro Ser Leu Glu

945 950 955 960

Lys Gln Ser Ser Cys Asn Thr Val Val Phe Asn Gly Gln Thr Thr Thr

965 970 975

Leu Ser Asn Ser His Ile Asn Ser Ala Thr Asn Gln Ala Ser Thr Lys

980 985 990

Ser His Glu Tyr Ser Lys Val Thr Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ile Pro

995 1000 1005

Lys Ser Asn Ser Ser Lys Ile Asp Thr Asn Lys Ser Ile Ala Gln

1010 1015 1020

Gly Ile Ile Thr Leu Asp Asn Cys Ser Asn Asp Leu His Gln Leu

1025 1030 1035

Pro Pro Arg Asn Asn Glu Val Glu Tyr Cys Asn Gln Leu Leu Asp

1040 1045 1050

Ser Ser Lys Lys Leu Asp Ser Asp Asp Leu Ser Cys Gln Asp Ala

1055 1060 1065

Thr His Thr Gln Ile Glu Glu Asp Val Ala Thr Gln Leu Thr Gln

1070 1075 1080

Leu Ala Ser Ile Ile Lys Ile Asn Tyr Ile Lys Pro Glu Asp Lys

1085 1090 1095

Lys Val Glu Ser Thr Pro Thr Ser Leu Val Thr Cys Asn Val Gln

1100 1105 1110

Gln Lys Tyr Asn Gln Glu Lys Gly Thr Ile Gln Gln Lys Pro Pro

1115 1120 1125

Ser Ser Val His Asn Asn His Gly Ser Ser Leu Thr Lys Gln Lys

1130 1135 1140

Asn Pro Thr Gln Lys Lys Thr Lys Ser Thr Pro Ser Arg Asp Arg

1145 1150 1155

Arg Lys Lys Lys Pro Thr Val Val Ser Tyr Gln Glu Asn Asp Arg

1160 1165 1170

Gln Lys Trp Glu Lys Leu Ser Tyr Met Tyr Gly Thr Ile Cys Asp

1175 1180 1185

Ile Trp Ile Ala Ser Lys Phe Gln Asn Phe Gly Gln Phe Cys Pro

1190 1195 1200

His Asp Phe Pro Thr Val Phe Gly Lys Ile Ser Ser Ser Thr Lys

1205 1210 1215

Ile Trp Lys Pro Leu Ala Gln Thr Arg Ser Ile Met Gln Pro Lys

1220 1225 1230

Thr Val Phe Pro Pro Leu Thr Gln Ile Lys Leu Gln Arg Tyr Pro

1235 1240 1245

Glu Ser Ala Glu Glu Lys Val Lys Val Glu Pro Leu Asp Ser Leu

1250 1255 1260

Ser Leu Phe His Leu Lys Thr Glu Ser Asn Gly Lys Ala Phe Thr

1265 1270 1275

Asp Lys Ala Tyr Asn Ser Gln Val Gln Leu Thr Val Asn Ala Asn

1280 1285 1290

Gln Lys Ala His Pro Leu Thr Gln Pro Ser Ser Pro Pro Asn Gln

1295 1300 1305

Cys Ala Asn Val Met Ala Gly Asp Asp Gln Ile Arg Phe Gln Gln

1310 1315 1320

Val Val Lys Glu Gln Leu Met His Gln Arg Leu Pro Thr Leu Pro

1325 1330 1335

Gly Ile Ser His Glu Thr Pro Leu Pro Glu Ser Ala Leu Thr Leu

1340 1345 1350

Arg Asn Val Asn Val Val Cys Ser Gly Gly Ile Thr Val Val Ser

1355 1360 1365

Thr Lys Ser Glu Glu Glu Val Cys Ser Ser Ser Phe Gly Thr Ser

1370 1375 1380

Glu Phe Ser Thr Val Asp Ser Ala Gln Lys Asn Phe Asn Asp Tyr

1385 1390 1395

Ala Met Asn Phe Phe Thr Asn Pro Thr Lys Asn Leu Val Ser Ile

1400 1405 1410

Thr Lys Asp Ser Glu Leu Pro Thr Cys Ser Cys Leu Asp Arg Val

1415 1420 1425

Ile Gln Lys Asp Lys Gly Pro Tyr Tyr Thr His Leu Gly Ala Gly

1430 1435 1440

Pro Ser Val Ala Ala Val Arg Glu Ile Met Glu Asn Arg Tyr Gly

1445 1450 1455

Gln Lys Gly Asn Ala Ile Arg Ile Glu Ile Val Val Tyr Thr Gly

1460 1465 1470

Lys Glu Gly Lys Ser Ser His Gly Cys Pro Ile Ala Lys Trp Val

1475 1480 1485

Leu Arg Arg Ser Ser Asp Glu Glu Lys Val Leu Cys Leu Val Arg

1490 1495 1500

Gln Arg Thr Gly His His Cys Pro Thr Ala Val Met Val Val Leu

1505 1510 1515

Ile Met Val Trp Asp Gly Ile Pro Leu Pro Met Ala Asp Arg Leu

1520 1525 1530

Tyr Thr Glu Leu Thr Glu Asn Leu Lys Ser Tyr Asn Gly His Pro

1535 1540 1545

Thr Asp Arg Arg Cys Thr Leu Asn Glu Asn Arg Thr Cys Thr Cys

1550 1555 1560

Gln Gly Ile Asp Pro Glu Thr Cys Gly Ala Ser Phe Ser Phe Gly

1565 1570 1575

Cys Ser Trp Ser Met Tyr Phe Asn Gly Cys Lys Phe Gly Arg Ser

1580 1585 1590

Pro Ser Pro Arg Arg Phe Arg Ile Asp Pro Ser Ser Pro Leu His

1595 1600 1605

Glu Lys Asn Leu Glu Asp Asn Leu Gln Ser Leu Ala Thr Arg Leu

1610 1615 1620

Ala Pro Ile Tyr Lys Gln Tyr Ala Pro Val Ala Tyr Gln Asn Gln

1625 1630 1635

Val Glu Tyr Glu Asn Val Ala Arg Glu Cys Arg Leu Gly Ser Lys

1640 1645 1650

Glu Gly Arg Pro Phe Ser Gly Val Thr Ala Cys Leu Asp Phe Cys

1655 1660 1665

Ala His Pro His Arg Asp Ile His Asn Met Asn Asn Gly Ser Thr

1670 1675 1680

Val Val Cys Thr Leu Thr Arg Glu Asp Asn Arg Ser Leu Gly Val

1685 1690 1695

Ile Pro Gln Asp Glu Gln Leu His Val Leu Pro Leu Tyr Lys Leu

1700 1705 1710

Ser Asp Thr Asp Glu Phe Gly Ser Lys Glu Gly Met Glu Ala Lys

1715 1720 1725

Ile Lys Ser Gly Ala Ile Glu Val Leu Ala Pro Arg Arg Lys Lys

1730 1735 1740

Arg Thr Cys Phe Thr Gln Pro Val Pro Arg Ser Gly Lys Lys Arg

1745 1750 1755

Ala Ala Met Met Thr Glu Val Leu Ala His Lys Ile Arg Ala Val

1760 1765 1770

Glu Lys Lys Pro Ile Pro Arg Ile Lys Arg Lys Asn Asn Ser Thr

1775 1780 1785

Thr Thr Asn Asn Ser Lys Pro Ser Ser Leu Pro Thr Leu Gly Ser

1790 1795 1800

Asn Thr Glu Thr Val Gln Pro Glu Val Lys Ser Glu Thr Glu Pro

1805 1810 1815

His Phe Ile Leu Lys Ser Ser Asp Asn Thr Lys Thr Tyr Ser Leu

1820 1825 1830

Met Pro Ser Ala Pro His Pro Val Lys Glu Ala Ser Pro Gly Phe

1835 1840 1845

Ser Trp Ser Pro Lys Thr Ala Ser Ala Thr Pro Ala Pro Leu Lys

1850 1855 1860

Asn Asp Ala Thr Ala Ser Cys Gly Phe Ser Glu Arg Ser Ser Thr

1865 1870 1875

Pro His Cys Thr Met Pro Ser Gly Arg Leu Ser Gly Ala Asn Ala

1880 1885 1890

Ala Ala Ala Asp Gly Pro Gly Ile Ser Gln Leu Gly Glu Val Ala

1895 1900 1905

Pro Leu Pro Thr Leu Ser Ala Pro Val Met Glu Pro Leu Ile Asn

1910 1915 1920

Ser Glu Pro Ser Thr Gly Val Thr Glu Pro Leu Thr Pro His Gln

1925 1930 1935

Pro Asn His Gln Pro Ser Phe Leu Thr Ser Pro Gln Asp Leu Ala

1940 1945 1950

Ser Ser Pro Met Glu Glu Asp Glu Gln His Ser Glu Ala Asp Glu

1955 1960 1965

Pro Pro Ser Asp Glu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Leu Ser Pro Ala

1970 1975 1980

Glu Glu Lys Leu Pro His Ile Asp Glu Tyr Trp Ser Asp Ser Glu

1985 1990 1995

His Ile Phe Leu Asp Ala Asn Ile Gly Gly Val Ala Ile Ala Pro

2000 2005 2010

Ala His Gly Ser Val Leu Ile Glu Cys Ala Arg Arg Glu Leu His

2015 2020 2025

Ala Thr Thr Pro Val Glu His Pro Asn Arg Asn His Pro Thr Arg

2030 2035 2040

Leu Ser Leu Val Phe Tyr Gln His Lys Asn Leu Asn Lys Pro Gln

2045 2050 2055

His Gly Phe Glu Leu Asn Lys Ile Lys Phe Glu Ala Lys Glu Ala

2060 2065 2070

Lys Asn Lys Lys Met Lys Ala Ser Glu Gln Lys Asp Gln Ala Ala

2075 2080 2085

Asn Glu Gly Pro Glu Gln Ser Ser Glu Val Asn Glu Leu Asn Gln

2090 2095 2100

Ile Pro Ser His Lys Ala Leu Thr Leu Thr His Asp Asn Val Val

2105 2110 2115

Thr Val Ser Pro Tyr Ala Leu Thr His Val Ala Gly Pro Tyr Asn

2120 2125 2130

His Trp Val

2135

<210> 3

<211> 6498

<212> DNA

<213> 人类

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(6498)

<223>

<400> 3

atg tct cga tcc cgc cat gca agg cct tcc aga tta gtc agg aag gaa 48

Met Ser Arg Ser Arg His Ala Arg Pro Ser Arg Leu Val Arg Lys Glu

1 5 10 15

gat gta aac aaa aaa aag aaa aac agc caa cta cga aag aca acc aag 96

Asp Val Asn Lys Lys Lys Lys Asn Ser Gln Leu Arg Lys Thr Thr Lys

20 25 30

gga gcc aac aaa aat gtg gca tca gtc aag act tta agc cct gga aaa 144

Gly Ala Asn Lys Asn Val Ala Ser Val Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys

35 40 45

tta aag caa tta att caa gaa aga gat gtt aag aaa aaa aca gaa cct 192

Leu Lys Gln Leu Ile Gln Glu Arg Asp Val Lys Lys Lys Thr Glu Pro

50 55 60

aaa cca ccc gtg cca gtc aga agc ctt ctg aca aga gct gga gca gca 240

Lys Pro Pro Val Pro Val Arg Ser Leu Leu Thr Arg Ala Gly Ala Ala

65 70 75 80

cgc atg aat ttg gat agg act gag gtt ctt ttt cag aac cca gag tcc 288

Arg Met Asn Leu Asp Arg Thr Glu Val Leu Phe Gln Asn Pro Glu Ser

85 90 95

tta acc tgc aat ggg ttt aca atg gcg cta cga agc acc tct ctt agc 336

Leu Thr Cys Asn Gly Phe Thr Met Ala Leu Arg Ser Thr Ser Leu Ser

100 105 110

agg cga ctc tcc caa ccc cca ctg gtc gta gcc aaa tcc aaa aag gtt 384

Arg Arg Leu Ser Gln Pro Pro Leu Val Val Ala Lys Ser Lys Lys Val

115 120 125

cca ctt tct aag ggt tta gaa aag caa cat gat tgt gat tat aag ata 432

Pro Leu Ser Lys Gly Leu Glu Lys Gln His Asp Cys Asp Tyr Lys Ile

130 135 140

ctc cct gct ttg gga gta aag cac tca gaa aat gat tcg gtt cca atg 480

Leu Pro Ala Leu Gly Val Lys His Ser Glu Asn Asp Ser Val Pro Met

145 150 155 160

caa ggc acc caa gtc ctt cct gat ata gag act cta att ggt gta caa 528

Gln Gly Thr Gln Val Leu Pro Asp Ile Glu Thr Leu Ile Gly Val Gln

165 170 175

aat ccc tct tta ctt aaa ggt aag agc caa gag aca act cag ttt tgg 576

Asn Pro Ser Leu Leu Lys Gly Lys Ser Gln Glu Thr Thr Gln Phe Trp

180 185 190

tcc caa aga gtt gag gat tcc aag atc aat atc cct acc cac agt ggc 624

Ser Gln Arg Val Glu Asp Ser Lys Ile Asn Ile Pro Thr His Ser Gly

195 200 205

cct gca gct gag atc ctt cct ggg cca ctg gaa ggg aca cgc tgt ggt 672

Pro Ala Ala Glu Ile Leu Pro Gly Pro Leu Glu Gly Thr Arg Cys Gly

210 215 220

gaa gga cta ttc tct gaa gag aca ttg aat gat acc agt ggt tcc cca 720

Glu Gly Leu Phe Ser Glu Glu Thr Leu Asn Asp Thr Ser Gly Ser Pro

225 230 235 240

aaa atg ttt gct cag gac aca gtg tgt gct cct ttt ccc caa aga gca 768

Lys Met Phe Ala Gln Asp Thr Val Cys Ala Pro Phe Pro Gln Arg Ala

245 250 255

acc ccc aaa gtt acc tct caa gga aac ccc agc att cag tta gaa gag 816

Thr Pro Lys Val Thr Ser Gln Gly Asn Pro Ser Ile Gln Leu Glu Glu

260 265 270

ttg ggt tca cga gta gaa tct ctt aag tta tct gat tct tac ctg gat 864

Leu Gly Ser Arg Val Glu Ser Leu Lys Leu Ser Asp Ser Tyr Leu Asp

275 280 285

ccc att aaa agt gaa cat gat tgc tac ccc acc tcc agt ctt aat aag 912

Pro Ile Lys Ser Glu His Asp Cys Tyr Pro Thr Ser Ser Leu Asn Lys

290 295 300

gtt ata cct gac ttg aac ctt aga aac tgc ttg gct ctt ggt ggg tct 960

Val Ile Pro Asp Leu Asn Leu Arg Asn Cys Leu Ala Leu Gly Gly Ser

305 310 315 320

acg tct cct acc tct gta ata aaa ttc ctc ttg gca ggc tca aaa caa 1008

Thr Ser Pro Thr Ser Val Ile Lys Phe Leu Leu Ala Gly Ser Lys Gln

325 330 335

gcg acc ctt ggt gct aaa cca gat cat caa gag gcc ttc gaa gct act 1056

Ala Thr Leu Gly Ala Lys Pro Asp His Gln Glu Ala Phe Glu Ala Thr

340 345 350

gca aat caa cag gaa gtt tct gat acc acc tct ttc cta gga cag gcc 1104

Ala Asn Gln Gln Glu Val Ser Asp Thr Thr Ser Phe Leu Gly Gln Ala

355 360 365

ttt ggt gct atc cca cat caa tgg gaa ctt cct ggt gct gac cca gtt 1152

Phe Gly Ala Ile Pro His Gln Trp Glu Leu Pro Gly Ala Asp Pro Val

370 375 380

cat ggt gag gcc ctg ggt gag acc cca gat cta cca gag att cct ggt 1200

His Gly Glu Ala Leu Gly Glu Thr Pro Asp Leu Pro Glu Ile Pro Gly

385 390 395 400

gct att cca gtc caa gga gag gtc ttt ggt act att tta gac caa caa 1248

Ala Ile Pro Val Gln Gly Glu Val Phe Gly Thr Ile Leu Asp Gln Gln

405 410 415

gaa act ctt ggt atg agt ggg agt gtt gtc cca gac ttg cct gtc ttc 1296

Glu Thr Leu Gly Met Ser Gly Ser Val Val Pro Asp Leu Pro Val Phe

420 425 430

ctt cct gtt cct cca aat cca att gct acc ttt aat gct cct tcc aaa 1344

Leu Pro Val Pro Pro Asn Pro Ile Ala Thr Phe Asn Ala Pro Ser Lys

435 440 445

tgg cct gag ccc caa agc act gtc tca tat gga ctt gca gtc cag ggt 1392

Trp Pro Glu Pro Gln Ser Thr Val Ser Tyr Gly Leu Ala Val Gln Gly

450 455 460

gct ata cag att ttg cct ttg ggc tca gga cac act cct caa tca tca 1440

Ala Ile Gln Ile Leu Pro Leu Gly Ser Gly His Thr Pro Gln Ser Ser

465 470 475 480

tca aac tca gag aaa aat tca tta cct cca gta atg gct ata agc aat 1488

Ser Asn Ser Glu Lys Asn Ser Leu Pro Pro Val Met Ala Ile Ser Asn

485 490 495

gta gaa aat gag aag cag gtt cat ata agc ttc ctg cca gct aac act 1536

Val Glu Asn Glu Lys Gln Val His Ile Ser Phe Leu Pro Ala Asn Thr

500 505 510

cag ggg ttc cca tta gcc cct gag aga gga ctc ttc cat gct tca ctg 1584

Gln Gly Phe Pro Leu Ala Pro Glu Arg Gly Leu Phe His Ala Ser Leu

515 520 525

ggt ata gcc caa ctc tct cag gct ggt cct agc aaa tca gac aga ggg 1632

Gly Ile Ala Gln Leu Ser Gln Ala Gly Pro Ser Lys Ser Asp Arg Gly

530 535 540

agc tcc cag gtc agt gta acc agc aca gtt cat gtt gtc aac acc aca 1680

Ser Ser Gln Val Ser Val Thr Ser Thr Val His Val Val Asn Thr Thr

545 550 555 560

gtg gtg act atg cca gtg cca atg gtc agt acc tcc tct tct tcc tat 1728

Val Val Thr Met Pro Val Pro Met Val Ser Thr Ser Ser Ser Ser Tyr

565 570 575

acc act ttg cta ccg act ttg gaa aag aag aaa aga aag cga tgt ggg 1776

Thr Thr Leu Leu Pro Thr Leu Glu Lys Lys Lys Arg Lys Arg Cys Gly

580 585 590

gtc tgt gaa ccc tgc cag cag aag acc aac tgt ggt gaa tgc act tac 1824

Val Cys Glu Pro Cys Gln Gln Lys Thr Asn Cys Gly Glu Cys Thr Tyr

595 600 605

tgc aag aac aga aag aac agc cat cag atc tgt aag aaa aga aaa tgt 1872

Cys Lys Asn Arg Lys Asn Ser His Gln Ile Cys Lys Lys Arg Lys Cys

610 615 620

gag gag ctg aaa aag aaa cca tct gtt gtt gtg cct ctg gag gtt ata 1920

Glu Glu Leu Lys Lys Lys Pro Ser Val Val Val Pro Leu Glu Val Ile

625 630 635 640

aag gaa aac aag agg ccc cag agg gaa aag aag ccc aaa gtt tta aag 1968

Lys Glu Asn Lys Arg Pro Gln Arg Glu Lys Lys Pro Lys Val Leu Lys

645 650 655

gca gat ttt gac aac aaa cca gta aat ggc ccc aag tca gaa tcc atg 2016

Ala Asp Phe Asp Asn Lys Pro Val Asn Gly Pro Lys Ser Glu Ser Met

660 665 670

gac tac agt aga tgt ggt cat ggg gaa gaa caa aaa ttg gaa ttg aac 2064

Asp Tyr Ser Arg Cys Gly His Gly Glu Glu Gln Lys Leu Glu Leu Asn

675 680 685

cca cat act gtt gaa aat gta act aaa aat gaa gac agc atg aca ggc 2112

Pro His Thr Val Glu Asn Val Thr Lys Asn Glu Asp Ser Met Thr Gly

690 695 700

atc gag gtg gag aag tgg aca caa aac aag aaa tca cag tta act gat 2160

Ile Glu Val Glu Lys Trp Thr Gln Asn Lys Lys Ser Gln Leu Thr Asp

705 710 715 720

cac gtg aaa gga gat ttt agt gct aat gtc cca gaa gct gaa aaa tcg 2208

His Val Lys Gly Asp Phe Ser Ala Asn Val Pro Glu Ala Glu Lys Ser

725 730 735

aaa aac tct gaa gtt gac aag aaa cga acc aaa tct cca aaa ttg ttt 2256

Lys Asn Ser Glu Val Asp Lys Lys Arg Thr Lys Ser Pro Lys Leu Phe

740 745 750

gta caa acc gta aga aat ggc att aaa cat gta cac tgt tta cca gct 2304

Val Gln Thr Val Arg Asn Gly Ile Lys His Val His Cys Leu Pro Ala

755 760 765

gaa aca aat gtt tca ttt aaa aaa ttc aat att gaa gaa ttc ggc aag 2352

Glu Thr Asn Val Ser Phe Lys Lys Phe Asn Ile Glu Glu Phe Gly Lys

770 775 780

aca ttg gaa aac aat tct tat aaa ttc cta aaa gac act gca aac cat 2400

Thr Leu Glu Asn Asn Ser Tyr Lys Phe Leu Lys Asp Thr Ala Asn His

785 790 795 800

aaa aac gct atg agc tct gtt gct act gat atg agt tgt gat cat ctc 2448

Lys Asn Ala Met Ser Ser Val Ala Thr Asp Met Ser Cys Asp His Leu

805 810 815

aag ggg aga agt aac gtt tta gta ttc cag cag cct ggc ttt aac tgc 2496

Lys Gly Arg Ser Asn Val Leu Val Phe Gln Gln Pro Gly Phe Asn Cys

820 825 830

agt tcc att cca cat tct tca cac tcc atc ata aat cat cat gct agt 2544

Ser Ser Ile Pro His Ser Ser His Ser Ile Ile Asn His His Ala Ser

835 840 845

ata cac aat gaa ggt gat caa cca aaa act cct gag aat ata cca agt 2592

Ile His Asn Glu Gly Asp Gln Pro Lys Thr Pro Glu Asn Ile Pro Ser

850 855 860

aaa gaa cca aaa gat gga tct ccc gtt caa cca agt ctc tta tcg tta 2640

Lys Glu Pro Lys Asp Gly Ser Pro Val Gln Pro Ser Leu Leu Ser Leu

865 870 875 880

atg aaa gat agg aga tta aca ttg gag caa gtg gta gcc ata gag gcc 2688

Met Lys Asp Arg Arg Leu Thr Leu Glu Gln Val Val Ala Ile Glu Ala

885 890 895

ctg act caa ctc tca gaa gcc cca tca gag aat tcc tcc cca tca aag 2736

Leu Thr Gln Leu Ser Glu Ala Pro Ser Glu Asn Ser Ser Pro Ser Lys

900 905 910

tca gag aag gat gag gaa tca gag cag aga aca gcc agt ttg ctt aat 2784

Ser Glu Lys Asp Glu Glu Ser Glu Gln Arg Thr Ala Ser Leu Leu Asn

915 920 925

agc tgc aaa gct atc ctc tac act gta aga aaa gac ctc caa gac cca 2832

Ser Cys Lys Ala Ile Leu Tyr Thr Val Arg Lys Asp Leu Gln Asp Pro

930 935 940

aac tta cag gga gag cca cca aaa ctt aat cac tgt cca tct ttg gaa 2880

Asn Leu Gln Gly Glu Pro Pro Lys Leu Asn His Cys Pro Ser Leu Glu

945 950 955 960

aaa caa agt tca tgc aac acg gtg gtt ttc aat ggg caa act act acc 2928

Lys Gln Ser Ser Cys Asn Thr Val Val Phe Asn Gly Gln Thr Thr Thr

965 970 975

ctt tcc aac tca cat atc aac tca gct act aac caa gca tcc aca aag 2976

Leu Ser Asn Ser His Ile Asn Ser Ala Thr Asn Gln Ala Ser Thr Lys

980 985 990

tca cat gaa tat tca aaa gtc aca aat tca tta tct ctt ttt ata cca 3024

Ser His Glu Tyr Ser Lys Val Thr Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ile Pro

995 1000 1005

aaa tca aat tca tcc aag att gac acc aat aaa agt att gct caa 3069

Lys Ser Asn Ser Ser Lys Ile Asp Thr Asn Lys Ser Ile Ala Gln

1010 1015 1020

ggg ata att act ctt gac aat tgt tcc aat gat ttg cat cag ttg 3114

Gly Ile Ile Thr Leu Asp Asn Cys Ser Asn Asp Leu His Gln Leu

1025 1030 1035

cca cca aga aat aat gaa gtg gag tat tgc aac cag tta ctg gac 3159

Pro Pro Arg Asn Asn Glu Val Glu Tyr Cys Asn Gln Leu Leu Asp

1040 1045 1050

agc agc aaa aaa ttg gac tca gat gat cta tca tgt cag gat gca 3204

Ser Ser Lys Lys Leu Asp Ser Asp Asp Leu Ser Cys Gln Asp Ala

1055 1060 1065

acc cat acc caa att gag gaa gat gtt gca aca cag ttg aca caa 3249

Thr His Thr Gln Ile Glu Glu Asp Val Ala Thr Gln Leu Thr Gln

1070 1075 1080

ctt gct tcg ata att aag atc aat tat ata aaa cca gag gac aaa 3294

Leu Ala Ser Ile Ile Lys Ile Asn Tyr Ile Lys Pro Glu Asp Lys

1085 1090 1095

aaa gtt gaa agt aca cca aca agc ctt gtc aca tgt aat gta cag 3339

Lys Val Glu Ser Thr Pro Thr Ser Leu Val Thr Cys Asn Val Gln

1100 1105 1110

caa aaa tac aat cag gag aag ggc aca atg caa cag aaa cca cct 3384

Gln Lys Tyr Asn Gln Glu Lys Gly Thr Met Gln Gln Lys Pro Pro

1115 1120 1125

tca agt gta cac aat aat cat ggt tca tca tta aca aaa caa aag 3429

Ser Ser Val His Asn Asn His Gly Ser Ser Leu Thr Lys Gln Lys

1130 1135 1140

aac cca acc cag aaa aag aca aaa tcc acc cca tca aga gat cgg 3474

Asn Pro Thr Gln Lys Lys Thr Lys Ser Thr Pro Ser Arg Asp Arg

1145 1150 1155

cgg aaa aag aag ccc aca gtt gta agt tat caa gaa aat gat cgg 3519

Arg Lys Lys Lys Pro Thr Val Val Ser Tyr Gln Glu Asn Asp Arg

1160 1165 1170

cag aag tgg gaa aag ttg tcc tat atg tat ggc aca ata tgc gac 3564

Gln Lys Trp Glu Lys Leu Ser Tyr Met Tyr Gly Thr Ile Cys Asp

1175 1180 1185

att tgg ata gca tcg aaa ttt caa aat ttt ggg caa ttt tgt cca 3609

Ile Trp Ile Ala Ser Lys Phe Gln Asn Phe Gly Gln Phe Cys Pro

1190 1195 1200

cat gat ttt cct act gta ttt ggg aaa att tct tcc tcg acc aaa 3654

His Asp Phe Pro Thr Val Phe Gly Lys Ile Ser Ser Ser Thr Lys

1205 1210 1215

ata tgg aaa cca ctg gct caa acg agg tcc att atg caa ccc aaa 3699

Ile Trp Lys Pro Leu Ala Gln Thr Arg Ser Ile Met Gln Pro Lys

1220 1225 1230

aca gta ttt cca cca ctc act cag ata aaa tta cag aga tat cct 3744

Thr Val Phe Pro Pro Leu Thr Gln Ile Lys Leu Gln Arg Tyr Pro

1235 1240 1245

gaa tca gca gag gaa aag gtg aag gtt gaa cca ttg gat tca ctc 3789

Glu Ser Ala Glu Glu Lys Val Lys Val Glu Pro Leu Asp Ser Leu

1250 1255 1260

agc tta ttt cat ctt aaa acg gaa tcc aac ggg aag gca ttc act 3834

Ser Leu Phe His Leu Lys Thr Glu Ser Asn Gly Lys Ala Phe Thr

1265 1270 1275

gat aaa gct tat aat tct cag gta cag tta acg gtg aat gcc aat 3879

Asp Lys Ala Tyr Asn Ser Gln Val Gln Leu Thr Val Asn Ala Asn

1280 1285 1290

cag aaa gcc cat cct ttg acc cag ccc tcc tct cca cct aac cag 3924

Gln Lys Ala His Pro Leu Thr Gln Pro Ser Ser Pro Pro Asn Gln

1295 1300 1305

tgt gct aac gtg atg gca ggc gat gac caa ata cgg ttt cag cag 3969

Cys Ala Asn Val Met Ala Gly Asp Asp Gln Ile Arg Phe Gln Gln

1310 1315 1320

gtt gtt aag gag caa ctc atg cat cag aga ctg cca aca ttg cct 4014

Val Val Lys Glu Gln Leu Met His Gln Arg Leu Pro Thr Leu Pro

1325 1330 1335

ggt atc tct cat gaa aca ccc tta ccg gag tca gca cta act ctc 4059

Gly Ile Ser His Glu Thr Pro Leu Pro Glu Ser Ala Leu Thr Leu

1340 1345 1350

agg aat gta aat gta gtg tgt tca ggt gga att aca gtg gtt tct 4104

Arg Asn Val Asn Val Val Cys Ser Gly Gly Ile Thr Val Val Ser

1355 1360 1365

acc aaa agt gaa gag gaa gtc tgt tca tcc agt ttt gga aca tca 4149

Thr Lys Ser Glu Glu Glu Val Cys Ser Ser Ser Phe Gly Thr Ser

1370 1375 1380

gaa ttt tcc aca gtg gac agt gca cag aaa aat ttt aat gat tat 4194

Glu Phe Ser Thr Val Asp Ser Ala Gln Lys Asn Phe Asn Asp Tyr

1385 1390 1395

gcc atg aac ttc ttt act aac cct aca aaa aac cta gtg tct ata 4239

Ala Met Asn Phe Phe Thr Asn Pro Thr Lys Asn Leu Val Ser Ile

1400 1405 1410

act aaa gat tct gaa ctg ccc acc tgc agc tgt ctt gat cga gtt 4284

Thr Lys Asp Ser Glu Leu Pro Thr Cys Ser Cys Leu Asp Arg Val

1415 1420 1425

ata caa aaa gac aaa ggc cca tat tat aca cac ctt ggg gca gga 4329

Ile Gln Lys Asp Lys Gly Pro Tyr Tyr Thr His Leu Gly Ala Gly

1430 1435 1440

cca agt gtt gct gct gtc agg gaa atc atg gag aat agg tat ggt 4374

Pro Ser Val Ala Ala Val Arg Glu Ile Met Glu Asn Arg Tyr Gly

1445 1450 1455

caa aaa gga aac gca ata agg ata gaa ata gta gtg tac acc ggt 4419

Gln Lys Gly Asn Ala Ile Arg Ile Glu Ile Val Val Tyr Thr Gly

1460 1465 1470

aaa gaa ggg aaa agc tct cat ggg tgt cca att gct aag tgg gtt 4464

Lys Glu Gly Lys Ser Ser His Gly Cys Pro Ile Ala Lys Trp Val

1475 1480 1485

tta aga aga agc agt gat gaa gaa aaa gtt ctt tgt ttg gtc cgg 4509

Leu Arg Arg Ser Ser Asp Glu Glu Lys Val Leu Cys Leu Val Arg

1490 1495 1500

cag cgt aca ggc cac cac tgt cca act gct gtg atg gtg gtg ctc 4554

Gln Arg Thr Gly His His Cys Pro Thr Ala Val Met Val Val Leu

1505 1510 1515

atc atg gtg tgg gat ggc atc cct ctt cca atg gcc gac cgg cta 4599

Ile Met Val Trp Asp Gly Ile Pro Leu Pro Met Ala Asp Arg Leu

1520 1525 1530

tac aca gag ctc aca gag aat cta aag tca tac aat ggg cac cct 4644

Tyr Thr Glu Leu Thr Glu Asn Leu Lys Ser Tyr Asn Gly His Pro

1535 1540 1545

acc gac aga aga tgc acc ctc aat gaa aat cgt acc tgt aca tgt 4689

Thr Asp Arg Arg Cys Thr Leu Asn Glu Asn Arg Thr Cys Thr Cys

1550 1555 1560

caa gga att gat cca gag act tgt gga gct tca ttc tct ttt ggc 4734

Gln Gly Ile Asp Pro Glu Thr Cys Gly Ala Ser Phe Ser Phe Gly

1565 1570 1575

tgt tca tgg agt atg tac ttt aat ggc tgt aag ttt ggt aga agc 4779

Cys Ser Trp Ser Met Tyr Phe Asn Gly Cys Lys Phe Gly Arg Ser

1580 1585 1590

cca agc ccc aga aga ttt aga att gat cca agc tct ccc tta cat 4824

Pro Ser Pro Arg Arg Phe Arg Ile Asp Pro Ser Ser Pro Leu His

1595 1600 1605

acc tac tat gaa aga att act aaa gga cgt aat cca gaa aga aga 4869

Thr Tyr Tyr Glu Arg Ile Thr Lys Gly Arg Asn Pro Glu Arg Arg

1610 1615 1620

tat atg aaa ccg gaa cga atc agt ccg gga cac gag gcc atg gaa 4914

Tyr Met Lys Pro Glu Arg Ile Ser Pro Gly His Glu Ala Met Glu

1625 1630 1635

aaa aac ctt gaa gat aac tta cag agt ttg gct aca cga tta gct 4959

Lys Asn Leu Glu Asp Asn Leu Gln Ser Leu Ala Thr Arg Leu Ala

1640 1645 1650

cca att tat aag cag tat gct cca gta gct tac caa aat cag gtg 5004

Pro Ile Tyr Lys Gln Tyr Ala Pro Val Ala Tyr Gln Asn Gln Val

1655 1660 1665

gaa tat gaa aat gtt gcc cga gaa tgt cgg ctt ggc agc aag gaa 5049

Glu Tyr Glu Asn Val Ala Arg Glu Cys Arg Leu Gly Ser Lys Glu

1670 1675 1680

ggt cgt ccc ttc tct ggg gtc act gct tgc ctg gac ttc tgt gct 5094

Gly Arg Pro Phe Ser Gly Val Thr Ala Cys Leu Asp Phe Cys Ala

1685 1690 1695

cat ccc cac agg gac att cac aac atg aat aat gga agc act gtg 5139

His Pro His Arg Asp Ile His Asn Met Asn Asn Gly Ser Thr Val

1700 1705 1710

gtt tgt acc tta act cga gaa gat aac cgc tct ttg ggt gtt att 5184

Val Cys Thr Leu Thr Arg Glu Asp Asn Arg Ser Leu Gly Val Ile

1715 1720 1725

cct caa gat gag cag ctc cat gtg cta cct ctt tat aag ctt tca 5229

Pro Gln Asp Glu Gln Leu His Val Leu Pro Leu Tyr Lys Leu Ser

1730 1735 1740

gac aca gat gag ttt ggc tcc aag gaa gga atg gaa gcc aag atc 5274

Asp Thr Asp Glu Phe Gly Ser Lys Glu Gly Met Glu Ala Lys Ile

1745 1750 1755

aaa tct ggg gcc atc gag gtc ctg gca ccc cgc cgc aaa aaa aga 5319

Lys Ser Gly Ala Ile Glu Val Leu Ala Pro Arg Arg Lys Lys Arg

1760 1765 1770

acg tgt ttc act cag cct gtt ccc cgt tct gga aag aag agg gct 5364

Thr Cys Phe Thr Gln Pro Val Pro Arg Ser Gly Lys Lys Arg Ala

1775 1780 1785

gcg atg atg aca gag gtt ctt gca cat aag ata agg gca gtg gaa 5409

Ala Met Met Thr Glu Val Leu Ala His Lys Ile Arg Ala Val Glu

1790 1795 1800

aag aaa cct att ccc cga atc aag cgg aag aat aac tca aca aca 5454

Lys Lys Pro Ile Pro Arg Ile Lys Arg Lys Asn Asn Ser Thr Thr

1805 1810 1815

aca aac aac agt aag cct tcg tca ctg cca acc tta ggg agt aac 5499

Thr Asn Asn Ser Lys Pro Ser Ser Leu Pro Thr Leu Gly Ser Asn

1820 1825 1830

act gag acc gtg caa cct gaa gta aaa agt gaa acc gaa ccc cat 5544

Thr Glu Thr Val Gln Pro Glu Val Lys Ser Glu Thr Glu Pro His

1835 1840 1845

ttt atc tta aaa agt tca gac aac act aaa act tat tcg ctg atg 5589

Phe Ile Leu Lys Ser Ser Asp Asn Thr Lys Thr Tyr Ser Leu Met

1850 1855 1860

cca tcc gct cct cac cca gtg aaa gag gca tct cca ggc ttc tcc 5634

Pro Ser Ala Pro His Pro Val Lys Glu Ala Ser Pro Gly Phe Ser

1865 1870 1875

tgg tcc ccg aag act gct tca gcc aca cca gct cca ctg aag aat 5679

Trp Ser Pro Lys Thr Ala Ser Ala Thr Pro Ala Pro Leu Lys Asn

1880 1885 1890

gac gca aca gcc tca tgc ggg ttt tca gaa aga agc agc act ccc 5724

Asp Ala Thr Ala Ser Cys Gly Phe Ser Glu Arg Ser Ser Thr Pro

1895 1900 1905

cac tgt acg atg cct tcg gga aga ctc agt ggt gcc aat gca gct 5769

His Cys Thr Met Pro Ser Gly Arg Leu Ser Gly Ala Asn Ala Ala

1910 1915 1920

gct gct gat ggc cct ggc att tca cag ctt ggc gaa gtg gct cct 5814

Ala Ala Asp Gly Pro Gly Ile Ser Gln Leu Gly Glu Val Ala Pro

1925 1930 1935

ctc ccc acc ctg tct gct cct gtg atg gag ccc ctc att aat tct 5859

Leu Pro Thr Leu Ser Ala Pro Val Met Glu Pro Leu Ile Asn Ser

1940 1945 1950

gag cct tcc act ggt gtg act gag ccg cta acg cct cat cag cca 5904

Glu Pro Ser Thr Gly Val Thr Glu Pro Leu Thr Pro His Gln Pro

1955 1960 1965

aac cac cag ccc tcc ttc ctc acc tct cct caa gac ctt gcc tct 5949

Asn His Gln Pro Ser Phe Leu Thr Ser Pro Gln Asp Leu Ala Ser

1970 1975 1980

tct cca atg gaa gaa gat gag cag cat tct gaa gca gat gag cct 5994

Ser Pro Met Glu Glu Asp Glu Gln His Ser Glu Ala Asp Glu Pro

1985 1990 1995

cca tca gac gaa ccc cta tct gat gac ccc ctg tca cct gct gag 6039

Pro Ser Asp Glu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Leu Ser Pro Ala Glu

2000 2005 2010

gag aaa ttg ccc cac att gat gag tat tgg tca gac agt gag cac 6084

Glu Lys Leu Pro His Ile Asp Glu Tyr Trp Ser Asp Ser Glu His

2015 2020 2025

atc ttt ttg gat gca aat att ggt ggg gtg gcc atc gca cct gct 6129

Ile Phe Leu Asp Ala Asn Ile Gly Gly Val Ala Ile Ala Pro Ala

2030 2035 2040

cac ggc tcg gtt ttg att gag tgt gcc cgg cga gag ctg cac gct 6174

His Gly Ser Val Leu Ile Glu Cys Ala Arg Arg Glu Leu His Ala

2045 2050 2055

acc act cct gtt gag cac ccc aac cgt aat cat cca acc cgc ctc 6219

Thr Thr Pro Val Glu His Pro Asn Arg Asn His Pro Thr Arg Leu

2060 2065 2070

tcc ctt gtc ttt tac cag cac aaa aac cta aat aag ccc caa cat 6264

Ser Leu Val Phe Tyr Gln His Lys Asn Leu Asn Lys Pro Gln His

2075 2080 2085

ggt ttt gaa cta aac aag att aag ttt gag gct aaa gaa gct aag 6309

Gly Phe Glu Leu Asn Lys Ile Lys Phe Glu Ala Lys Glu Ala Lys

2090 2095 2100

aat aag aaa atg aag gcc tca gag caa aaa gac cag gca gct aat 6354

Asn Lys Lys Met Lys Ala Ser Glu Gln Lys Asp Gln Ala Ala Asn

2105 2110 2115

gaa ggt cca gaa cag tcc tct gaa gta aat gaa ttg aac caa att 6399

Glu Gly Pro Glu Gln Ser Ser Glu Val Asn Glu Leu Asn Gln Ile

2120 2125 2130

cct tct cat aaa gca tta aca tta acc cat gac aat gtt gtc acc 6444

Pro Ser His Lys Ala Leu Thr Leu Thr His Asp Asn Val Val Thr

2135 2140 2145

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Val Ser Pro Tyr Ala Leu Thr His Val Ala Gly Pro Tyr Asn His

2150 2155 2160

tgg gtc tga 6498

Trp Val

2165

<210> 4

<211> 2165

<212> PRT

<213> 人类

<400> 4

Met Ser Arg Ser Arg His Ala Arg Pro Ser Arg Leu Val Arg Lys Glu

1 5 10 15

Asp Val Asn Lys Lys Lys Lys Asn Ser Gln Leu Arg Lys Thr Thr Lys

20 25 30

Gly Ala Asn Lys Asn Val Ala Ser Val Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys

35 40 45

Leu Lys Gln Leu Ile Gln Glu Arg Asp Val Lys Lys Lys Thr Glu Pro

50 55 60

Lys Pro Pro Val Pro Val Arg Ser Leu Leu Thr Arg Ala Gly Ala Ala

65 70 75 80

Arg Met Asn Leu Asp Arg Thr Glu Val Leu Phe Gln Asn Pro Glu Ser

85 90 95

Leu Thr Cys Asn Gly Phe Thr Met Ala Leu Arg Ser Thr Ser Leu Ser

100 105 110

Arg Arg Leu Ser Gln Pro Pro Leu Val Val Ala Lys Ser Lys Lys Val

115 120 125

Pro Leu Ser Lys Gly Leu Glu Lys Gln His Asp Cys Asp Tyr Lys Ile

130 135 140

Leu Pro Ala Leu Gly Val Lys His Ser Glu Asn Asp Ser Val Pro Met

145 150 155 160

Gln Gly Thr Gln Val Leu Pro Asp Ile Glu Thr Leu Ile Gly Val Gln

165 170 175

Asn Pro Ser Leu Leu Lys Gly Lys Ser Gln Glu Thr Thr Gln Phe Trp

180 185 190

Ser Gln Arg Val Glu Asp Ser Lys Ile Asn Ile Pro Thr His Ser Gly

195 200 205

Pro Ala Ala Glu Ile Leu Pro Gly Pro Leu Glu Gly Thr Arg Cys Gly

210 215 220

Glu Gly Leu Phe Ser Glu Glu Thr Leu Asn Asp Thr Ser Gly Ser Pro

225 230 235 240

Lys Met Phe Ala Gln Asp Thr Val Cys Ala Pro Phe Pro Gln Arg Ala

245 250 255

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260 265 270

Leu Gly Ser Arg Val Glu Ser Leu Lys Leu Ser Asp Ser Tyr Leu Asp

275 280 285

Pro Ile Lys Ser Glu His Asp Cys Tyr Pro Thr Ser Ser Leu Asn Lys

290 295 300

Val Ile Pro Asp Leu Asn Leu Arg Asn Cys Leu Ala Leu Gly Gly Ser

305 310 315 320

Thr Ser Pro Thr Ser Val Ile Lys Phe Leu Leu Ala Gly Ser Lys Gln

325 330 335

Ala Thr Leu Gly Ala Lys Pro Asp His Gln Glu Ala Phe Glu Ala Thr

340 345 350

Ala Asn Gln Gln Glu Val Ser Asp Thr Thr Ser Phe Leu Gly Gln Ala

355 360 365

Phe Gly Ala Ile Pro His Gln Trp Glu Leu Pro Gly Ala Asp Pro Val

370 375 380

His Gly Glu Ala Leu Gly Glu Thr Pro Asp Leu Pro Glu Ile Pro Gly

385 390 395 400

Ala Ile Pro Val Gln Gly Glu Val Phe Gly Thr Ile Leu Asp Gln Gln

405 410 415

Glu Thr Leu Gly Met Ser Gly Ser Val Val Pro Asp Leu Pro Val Phe

420 425 430

Leu Pro Val Pro Pro Asn Pro Ile Ala Thr Phe Asn Ala Pro Ser Lys

435 440 445

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450 455 460

Ala Ile Gln Ile Leu Pro Leu Gly Ser Gly His Thr Pro Gln Ser Ser

465 470 475 480

Ser Asn Ser Glu Lys Asn Ser Leu Pro Pro Val Met Ala Ile Ser Asn

485 490 495

Val Glu Asn Glu Lys Gln Val His Ile Ser Phe Leu Pro Ala Asn Thr

500 505 510

Gln Gly Phe Pro Leu Ala Pro Glu Arg Gly Leu Phe His Ala Ser Leu

515 520 525

Gly Ile Ala Gln Leu Ser Gln Ala Gly Pro Ser Lys Ser Asp Arg Gly

530 535 540

Ser Ser Gln Val Ser Val Thr Ser Thr Val His Val Val Asn Thr Thr

545 550 555 560

Val Val Thr Met Pro Val Pro Met Val Ser Thr Ser Ser Ser Ser Tyr

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Cys Lys Asn Arg Lys Asn Ser His Gln Ile Cys Lys Lys Arg Lys Cys

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625 630 635 640

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725 730 735

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885 890 895

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Ser Glu Lys Asp Glu Glu Ser Glu Gln Arg Thr Ala Ser Leu Leu Asn

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Leu Ser Asn Ser His Ile Asn Ser Ala Thr Asn Gln Ala Ser Thr Lys

980 985 990

Ser His Glu Tyr Ser Lys Val Thr Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ile Pro

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Lys Ser Asn Ser Ser Lys Ile Asp Thr Asn Lys Ser Ile Ala Gln

1010 1015 1020

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1025 1030 1035

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1130 1135 1140

Asn Pro Thr Gln Lys Lys Thr Lys Ser Thr Pro Ser Arg Asp Arg

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Ile Trp Lys Pro Leu Ala Gln Thr Arg Ser Ile Met Gln Pro Lys

1220 1225 1230

Thr Val Phe Pro Pro Leu Thr Gln Ile Lys Leu Gln Arg Tyr Pro

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Glu Ser Ala Glu Glu Lys Val Lys Val Glu Pro Leu Asp Ser Leu

1250 1255 1260

Ser Leu Phe His Leu Lys Thr Glu Ser Asn Gly Lys Ala Phe Thr

1265 1270 1275

Asp Lys Ala Tyr Asn Ser Gln Val Gln Leu Thr Val Asn Ala Asn

1280 1285 1290

Gln Lys Ala His Pro Leu Thr Gln Pro Ser Ser Pro Pro Asn Gln

1295 1300 1305

Cys Ala Asn Val Met Ala Gly Asp Asp Gln Ile Arg Phe Gln Gln

1310 1315 1320

Val Val Lys Glu Gln Leu Met His Gln Arg Leu Pro Thr Leu Pro

1325 1330 1335

Gly Ile Ser His Glu Thr Pro Leu Pro Glu Ser Ala Leu Thr Leu

1340 1345 1350

Arg Asn Val Asn Val Val Cys Ser Gly Gly Ile Thr Val Val Ser

1355 1360 1365

Thr Lys Ser Glu Glu Glu Val Cys Ser Ser Ser Phe Gly Thr Ser

1370 1375 1380

Glu Phe Ser Thr Val Asp Ser Ala Gln Lys Asn Phe Asn Asp Tyr

1385 1390 1395

Ala Met Asn Phe Phe Thr Asn Pro Thr Lys Asn Leu Val Ser Ile

1400 1405 1410

Thr Lys Asp Ser Glu Leu Pro Thr Cys Ser Cys Leu Asp Arg Val

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Ile Gln Lys Asp Lys Gly Pro Tyr Tyr Thr His Leu Gly Ala Gly

1430 1435 1440

Pro Ser Val Ala Ala Val Arg Glu Ile Met Glu Asn Arg Tyr Gly

1445 1450 1455

Gln Lys Gly Asn Ala Ile Arg Ile Glu Ile Val Val Tyr Thr Gly

1460 1465 1470

Lys Glu Gly Lys Ser Ser His Gly Cys Pro Ile Ala Lys Trp Val

1475 1480 1485

Leu Arg Arg Ser Ser Asp Glu Glu Lys Val Leu Cys Leu Val Arg

1490 1495 1500

Gln Arg Thr Gly His His Cys Pro Thr Ala Val Met Val Val Leu

1505 1510 1515

Ile Met Val Trp Asp Gly Ile Pro Leu Pro Met Ala Asp Arg Leu

1520 1525 1530

Tyr Thr Glu Leu Thr Glu Asn Leu Lys Ser Tyr Asn Gly His Pro

1535 1540 1545

Thr Asp Arg Arg Cys Thr Leu Asn Glu Asn Arg Thr Cys Thr Cys

1550 1555 1560

Gln Gly Ile Asp Pro Glu Thr Cys Gly Ala Ser Phe Ser Phe Gly

1565 1570 1575

Cys Ser Trp Ser Met Tyr Phe Asn Gly Cys Lys Phe Gly Arg Ser

1580 1585 1590

Pro Ser Pro Arg Arg Phe Arg Ile Asp Pro Ser Ser Pro Leu His

1595 1600 1605

Thr Tyr Tyr Glu Arg Ile Thr Lys Gly Arg Asn Pro Glu Arg Arg

1610 1615 1620

Tyr Met Lys Pro Glu Arg Ile Ser Pro Gly His Glu Ala Met Glu

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Lys Asn Leu Glu Asp Asn Leu Gln Ser Leu Ala Thr Arg Leu Ala

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Pro Ile Tyr Lys Gln Tyr Ala Pro Val Ala Tyr Gln Asn Gln Val

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Glu Tyr Glu Asn Val Ala Arg Glu Cys Arg Leu Gly Ser Lys Glu

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Gly Arg Pro Phe Ser Gly Val Thr Ala Cys Leu Asp Phe Cys Ala

1685 1690 1695

His Pro His Arg Asp Ile His Asn Met Asn Asn Gly Ser Thr Val

1700 1705 1710

Val Cys Thr Leu Thr Arg Glu Asp Asn Arg Ser Leu Gly Val Ile

1715 1720 1725

Pro Gln Asp Glu Gln Leu His Val Leu Pro Leu Tyr Lys Leu Ser

1730 1735 1740

Asp Thr Asp Glu Phe Gly Ser Lys Glu Gly Met Glu Ala Lys Ile

1745 1750 1755

Lys Ser Gly Ala Ile Glu Val Leu Ala Pro Arg Arg Lys Lys Arg

1760 1765 1770

Thr Cys Phe Thr Gln Pro Val Pro Arg Ser Gly Lys Lys Arg Ala

1775 1780 1785

Ala Met Met Thr Glu Val Leu Ala His Lys Ile Arg Ala Val Glu

1790 1795 1800

Lys Lys Pro Ile Pro Arg Ile Lys Arg Lys Asn Asn Ser Thr Thr

1805 1810 1815

Thr Asn Asn Ser Lys Pro Ser Ser Leu Pro Thr Leu Gly Ser Asn

1820 1825 1830

Thr Glu Thr Val Gln Pro Glu Val Lys Ser Glu Thr Glu Pro His

1835 1840 1845

Phe Ile Leu Lys Ser Ser Asp Asn Thr Lys Thr Tyr Ser Leu Met

1850 1855 1860

Pro Ser Ala Pro His Pro Val Lys Glu Ala Ser Pro Gly Phe Ser

1865 1870 1875

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1880 1885 1890

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1895 1900 1905

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1910 1915 1920

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1925 1930 1935

Leu Pro Thr Leu Ser Ala Pro Val Met Glu Pro Leu Ile Asn Ser

1940 1945 1950

Glu Pro Ser Thr Gly Val Thr Glu Pro Leu Thr Pro His Gln Pro

1955 1960 1965

Asn His Gln Pro Ser Phe Leu Thr Ser Pro Gln Asp Leu Ala Ser

1970 1975 1980

Ser Pro Met Glu Glu Asp Glu Gln His Ser Glu Ala Asp Glu Pro

1985 1990 1995

Pro Ser Asp Glu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Leu Ser Pro Ala Glu

2000 2005 2010

Glu Lys Leu Pro His Ile Asp Glu Tyr Trp Ser Asp Ser Glu His

2015 2020 2025

Ile Phe Leu Asp Ala Asn Ile Gly Gly Val Ala Ile Ala Pro Ala

2030 2035 2040

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2045 2050 2055

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2060 2065 2070

Ser Leu Val Phe Tyr Gln His Lys Asn Leu Asn Lys Pro Gln His

2075 2080 2085

Gly Phe Glu Leu Asn Lys Ile Lys Phe Glu Ala Lys Glu Ala Lys

2090 2095 2100

Asn Lys Lys Met Lys Ala Ser Glu Gln Lys Asp Gln Ala Ala Asn

2105 2110 2115

Glu Gly Pro Glu Gln Ser Ser Glu Val Asn Glu Leu Asn Gln Ile

2120 2125 2130

Pro Ser His Lys Ala Leu Thr Leu Thr His Asp Asn Val Val Thr

2135 2140 2145

Val Ser Pro Tyr Ala Leu Thr His Val Ala Gly Pro Tyr Asn His

2150 2155 2160

Trp Val

2165

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<212> DNA

<213> 人类

<220>

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<223>

<400> 5

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1 5 10 15

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Gly Ala Asn Lys Asn Val Ala Ser Val Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys

35 40 45

tta aag caa tta att caa gaa aga gat gtt aag aaa aaa aca gaa cct 192

Leu Lys Gln Leu Ile Gln Glu Arg Asp Val Lys Lys Lys Thr Glu Pro

50 55 60

aaa cca ccc gtg cca gtc aga agc ctt ctg aca aga gct gga gca gca 240

Lys Pro Pro Val Pro Val Arg Ser Leu Leu Thr Arg Ala Gly Ala Ala

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cgc atg aat ttg gat agg act gag gtt ctt ttt cag aac cca gag tcc 288

Arg Met Asn Leu Asp Arg Thr Glu Val Leu Phe Gln Asn Pro Glu Ser

85 90 95

tta acc tgc aat ggg ttt aca atg gcg cta cga agc acc tct ctt agc 336

Leu Thr Cys Asn Gly Phe Thr Met Ala Leu Arg Ser Thr Ser Leu Ser

100 105 110

agg cga ctc tcc caa ccc cca ctg gtc gta gcc aaa tcc aaa aag gtt 384

Arg Arg Leu Ser Gln Pro Pro Leu Val Val Ala Lys Ser Lys Lys Val

115 120 125

cca ctt tct aag ggt tta gaa aag caa cat gat tgt gat tat aag ata 432

Pro Leu Ser Lys Gly Leu Glu Lys Gln His Asp Cys Asp Tyr Lys Ile

130 135 140

ctc cct gct ttg gga gta aag cac tca gaa aat gat tcg gtt cca atg 480

Leu Pro Ala Leu Gly Val Lys His Ser Glu Asn Asp Ser Val Pro Met

145 150 155 160

caa ggc acc caa gtc ctt cct gat ata gag act cta att ggt gta caa 528

Gln Gly Thr Gln Val Leu Pro Asp Ile Glu Thr Leu Ile Gly Val Gln

165 170 175

aat ccc tct tta ctt aaa ggt aag agc caa gag aca act cag ttt tgg 576

Asn Pro Ser Leu Leu Lys Gly Lys Ser Gln Glu Thr Thr Gln Phe Trp

180 185 190

tcc caa aga gtt gag gat tcc aag atc aat atc cct acc cac agt ggc 624

Ser Gln Arg Val Glu Asp Ser Lys Ile Asn Ile Pro Thr His Ser Gly

195 200 205

cct gca gct gag atc ctt cct ggg cca ctg gaa ggg aca cgc tgt ggt 672

Pro Ala Ala Glu Ile Leu Pro Gly Pro Leu Glu Gly Thr Arg Cys Gly

210 215 220

gaa gga cta ttc tct gaa gag aca ttg aat gat acc agt ggt tcc cca 720

Glu Gly Leu Phe Ser Glu Glu Thr Leu Asn Asp Thr Ser Gly Ser Pro

225 230 235 240

aaa atg ttt gct cag gac aca gtg tgt gct cct ttt ccc caa aga gca 768

Lys Met Phe Ala Gln Asp Thr Val Cys Ala Pro Phe Pro Gln Arg Ala

245 250 255

acc ccc aaa gtt acc tct caa gga aac ccc agc att cag tta gaa gag 816

Thr Pro Lys Val Thr Ser Gln Gly Asn Pro Ser Ile Gln Leu Glu Glu

260 265 270

ttg ggt tca cga gta gaa tct ctt aag tta tct gat tct tac ctg gat 864

Leu Gly Ser Arg Val Glu Ser Leu Lys Leu Ser Asp Ser Tyr Leu Asp

275 280 285

ccc att aaa agt gaa cat gat tgc tac ccc acc tcc agt ctt aat aag 912

Pro Ile Lys Ser Glu His Asp Cys Tyr Pro Thr Ser Ser Leu Asn Lys

290 295 300

gtt ata cct gac ttg aac ctt aga aac tgc ttg gct ctt ggt ggg tct 960

Val Ile Pro Asp Leu Asn Leu Arg Asn Cys Leu Ala Leu Gly Gly Ser

305 310 315 320

acg tct cct acc tct gta ata aaa ttc ctc ttg gca ggc tca aaa caa 1008

Thr Ser Pro Thr Ser Val Ile Lys Phe Leu Leu Ala Gly Ser Lys Gln

325 330 335

gcg acc ctt ggt gct aaa cca gat cat caa gag gcc ttc gaa gct act 1056

Ala Thr Leu Gly Ala Lys Pro Asp His Gln Glu Ala Phe Glu Ala Thr

340 345 350

gca aat caa cag gaa gtt tct gat acc acc tct ttc cta gga cag gcc 1104

Ala Asn Gln Gln Glu Val Ser Asp Thr Thr Ser Phe Leu Gly Gln Ala

355 360 365

ttt ggt gct atc cca cat caa tgg gaa ctt cct ggt gct gac cca gtt 1152

Phe Gly Ala Ile Pro His Gln Trp Glu Leu Pro Gly Ala Asp Pro Val

370 375 380

cat ggt gag gcc ctg ggt gag acc cca gat cta cca gag att cct ggt 1200

His Gly Glu Ala Leu Gly Glu Thr Pro Asp Leu Pro Glu Ile Pro Gly

385 390 395 400

gct att cca gtc caa gga gag gtc ttt ggt act att tta gac caa caa 1248

Ala Ile Pro Val Gln Gly Glu Val Phe Gly Thr Ile Leu Asp Gln Gln

405 410 415

gaa act ctt ggt atg agt ggg agt gtt gtc cca gac ttg cct gtc ttc 1296

Glu Thr Leu Gly Met Ser Gly Ser Val Val Pro Asp Leu Pro Val Phe

420 425 430

ctt cct gtt cct cca aat cca att gct acc ttt aat gct cct tcc aaa 1344

Leu Pro Val Pro Pro Asn Pro Ile Ala Thr Phe Asn Ala Pro Ser Lys

435 440 445

tgg cct gag ccc caa agc act gtc tca tat gga ctt gca gtc cag ggt 1392

Trp Pro Glu Pro Gln Ser Thr Val Ser Tyr Gly Leu Ala Val Gln Gly

450 455 460

gct ata cag att ttg cct ttg ggc tca gga cac act cct caa tca tca 1440

Ala Ile Gln Ile Leu Pro Leu Gly Ser Gly His Thr Pro Gln Ser Ser

465 470 475 480

tca aac tca gag aaa aat tca tta cct cca gta atg gct ata agc aat 1488

Ser Asn Ser Glu Lys Asn Ser Leu Pro Pro Val Met Ala Ile Ser Asn

485 490 495

gta gaa aat gag aag cag gtt cat ata agc ttc ctg cca gct aac act 1536

Val Glu Asn Glu Lys Gln Val His Ile Ser Phe Leu Pro Ala Asn Thr

500 505 510

cag ggg ttc cca tta gcc cct gag aga gga ctc ttc cat gct tca ctg 1584

Gln Gly Phe Pro Leu Ala Pro Glu Arg Gly Leu Phe His Ala Ser Leu

515 520 525

ggt ata gcc caa ctc tct cag gct ggt cct agc aaa tca gac aga ggg 1632

Gly Ile Ala Gln Leu Ser Gln Ala Gly Pro Ser Lys Ser Asp Arg Gly

530 535 540

agc tcc cag gtc agt gta acc agc aca gtt cat gtt gtc aac acc aca 1680

Ser Ser Gln Val Ser Val Thr Ser Thr Val His Val Val Asn Thr Thr

545 550 555 560

gtg gtg act atg cca gtg cca atg gtc agt acc tcc tct tct tcc tat 1728

Val Val Thr Met Pro Val Pro Met Val Ser Thr Ser Ser Ser Ser Tyr

565 570 575

acc act ttg cta ccg act ttg gaa aag aag aaa aga aag cga tgt ggg 1776

Thr Thr Leu Leu Pro Thr Leu Glu Lys Lys Lys Arg Lys Arg Cys Gly

580 585 590

gtc tgt gaa ccc tgc cag cag aag acc aac tgt ggt gaa tgc act tac 1824

Val Cys Glu Pro Cys Gln Gln Lys Thr Asn Cys Gly Glu Cys Thr Tyr

595 600 605

tgc aag aac aga aag aac agc cat cag atc tgt aag aaa aga aaa tgt 1872

Cys Lys Asn Arg Lys Asn Ser His Gln Ile Cys Lys Lys Arg Lys Cys

610 615 620

gag gag ctg aaa aag aaa cca tct gtt gtt gtg cct ctg gag gtt ata 1920

Glu Glu Leu Lys Lys Lys Pro Ser Val Val Val Pro Leu Glu Val Ile

625 630 635 640

aag gaa aac aag agg ccc cag agg gaa aag aag ccc aaa gtt tta aag 1968

Lys Glu Asn Lys Arg Pro Gln Arg Glu Lys Lys Pro Lys Val Leu Lys

645 650 655

gtt tta aga aga agc agt gat gaa gaa aaa gtt ctt tgt ttg gtc cgg 2016

Val Leu Arg Arg Ser Ser Asp Glu Glu Lys Val Leu Cys Leu Val Arg

660 665 670

cag cgt aca ggc cac cac tgt cca act gct gtg atg gtg gtg ctc atc 2064

Gln Arg Thr Gly His His Cys Pro Thr Ala Val Met Val Val Leu Ile

675 680 685

atg gtg tgg gat ggc atc cct ctt cca atg gcc gac cgg cta tac aca 2112

Met Val Trp Asp Gly Ile Pro Leu Pro Met Ala Asp Arg Leu Tyr Thr

690 695 700

gag ctc aca gag aat cta aag tca tac aat ggg cac cct acc gac aga 2160

Glu Leu Thr Glu Asn Leu Lys Ser Tyr Asn Gly His Pro Thr Asp Arg

705 710 715 720

aga tgc acc ctc aat gaa aat cgt acc tgt aca tgt caa gga att gat 2208

Arg Cys Thr Leu Asn Glu Asn Arg Thr Cys Thr Cys Gln Gly Ile Asp

725 730 735

cca gag act tgt gga gct tca ttc tct ttt ggc tgt tca tgg agt atg 2256

Pro Glu Thr Cys Gly Ala Ser Phe Ser Phe Gly Cys Ser Trp Ser Met

740 745 750

tac ttt aat ggc tgt aag ttt ggt aga agc cca agc ccc aga aga ttt 2304

Tyr Phe Asn Gly Cys Lys Phe Gly Arg Ser Pro Ser Pro Arg Arg Phe

755 760 765

aga att gat cca agc tct ccc tta cat acc tac tat gaa aga att act 2352

Arg Ile Asp Pro Ser Ser Pro Leu His Thr Tyr Tyr Glu Arg Ile Thr

770 775 780

aaa gga cgt aat cca gaa aga aga tat atg aaa ccg gaa cga atc agt 2400

Lys Gly Arg Asn Pro Glu Arg Arg Tyr Met Lys Pro Glu Arg Ile Ser

785 790 795 800

ccg gga cac gag gcc atg gaa aaa aac ctt gaa gat aac tta cag agt 2448

Pro Gly His Glu Ala Met Glu Lys Asn Leu Glu Asp Asn Leu Gln Ser

805 810 815

ttg gct aca cga tta gct cca att tat aag cag tat gct cca gta gct 2496

Leu Ala Thr Arg Leu Ala Pro Ile Tyr Lys Gln Tyr Ala Pro Val Ala

820 825 830

tac caa aat cag gtg gaa tat gaa aat gtt gcc cga gaa tgt cgg ctt 2544

Tyr Gln Asn Gln Val Glu Tyr Glu Asn Val Ala Arg Glu Cys Arg Leu

835 840 845

ggc agc aag gaa ggt cgt ccc ttc tct ggg gtc act gct tgc ctg gac 2592

Gly Ser Lys Glu Gly Arg Pro Phe Ser Gly Val Thr Ala Cys Leu Asp

850 855 860

ttc tgt gct cat ccc cac agg gac att cac aac atg aat aat gga agc 2640

Phe Cys Ala His Pro His Arg Asp Ile His Asn Met Asn Asn Gly Ser

865 870 875 880

act gtg gtt tgt acc tta act cga gaa gat aac cgc tct ttg ggt gtt 2688

Thr Val Val Cys Thr Leu Thr Arg Glu Asp Asn Arg Ser Leu Gly Val

885 890 895

att cct caa gat gag cag ctc cat gtg cta cct ctt tat aag ctt tca 2736

Ile Pro Gln Asp Glu Gln Leu His Val Leu Pro Leu Tyr Lys Leu Ser

900 905 910

gac aca gat gag ttt ggc tcc aag gaa gga atg gaa gcc aag atc aaa 2784

Asp Thr Asp Glu Phe Gly Ser Lys Glu Gly Met Glu Ala Lys Ile Lys

915 920 925

tct ggg gcc atc gag gtc ctg gca ccc cgc cgc aaa aaa aga acg tgt 2832

Ser Gly Ala Ile Glu Val Leu Ala Pro Arg Arg Lys Lys Arg Thr Cys

930 935 940

ttc act cag cct gtt ccc cgt tct gga aag aag agg gct gcg atg atg 2880

Phe Thr Gln Pro Val Pro Arg Ser Gly Lys Lys Arg Ala Ala Met Met

945 950 955 960

aca gag gtt ctt gca cat aag ata agg gca gtg gaa aag aaa cct att 2928

Thr Glu Val Leu Ala His Lys Ile Arg Ala Val Glu Lys Lys Pro Ile

965 970 975

ccc cga atc aag cgg aag aat aac tca aca aca aca aac aac agt aag 2976

Pro Arg Ile Lys Arg Lys Asn Asn Ser Thr Thr Thr Asn Asn Ser Lys

980 985 990

cct tcg tca ctg cca acc tta ggg agt aac act gag acc gtg caa cct 3024

Pro Ser Ser Leu Pro Thr Leu Gly Ser Asn Thr Glu Thr Val Gln Pro

995 1000 1005

gaa gta aaa agt gaa acc gaa ccc cat ttt atc tta aaa agt tca 3069

Glu Val Lys Ser Glu Thr Glu Pro His Phe Ile Leu Lys Ser Ser

1010 1015 1020

gac aac act aaa act tat tcg ctg atg cca tcc gct cct cac cca 3114

Asp Asn Thr Lys Thr Tyr Ser Leu Met Pro Ser Ala Pro His Pro

1025 1030 1035

gtg aaa gag gca tct cca ggc ttc tcc tgg tcc ccg aag act gct 3159

Val Lys Glu Ala Ser Pro Gly Phe Ser Trp Ser Pro Lys Thr Ala

1040 1045 1050

tca gcc aca cca gct cca ctg aag aat gac gca aca gcc tca tgc 3204

Ser Ala Thr Pro Ala Pro Leu Lys Asn Asp Ala Thr Ala Ser Cys

1055 1060 1065

ggg ttt tca gaa aga agc agc act ccc cac tgt acg atg cct tcg 3249

Gly Phe Ser Glu Arg Ser Ser Thr Pro His Cys Thr Met Pro Ser

1070 1075 1080

gga aga ctc agt ggt gcc aat gca gct gct gct gat ggc cct ggc 3294

Gly Arg Leu Ser Gly Ala Asn Ala Ala Ala Ala Asp Gly Pro Gly

1085 1090 1095

att tca cag ctt ggc gaa gtg gct cct ctc ccc acc ctg tct gct 3339

Ile Ser Gln Leu Gly Glu Val Ala Pro Leu Pro Thr Leu Ser Ala

1100 1105 1110

cct gtg atg gag ccc ctc att aat tct gag cct tcc act ggt gtg 3384

Pro Val Met Glu Pro Leu Ile Asn Ser Glu Pro Ser Thr Gly Val

1115 1120 1125

act gag ccg cta acg cct cat cag cca aac cac cag ccc tcc ttc 3429

Thr Glu Pro Leu Thr Pro His Gln Pro Asn His Gln Pro Ser Phe

1130 1135 1140

ctc acc tct cct caa gac ctt gcc tct tct cca atg gaa gaa gat 3474

Leu Thr Ser Pro Gln Asp Leu Ala Ser Ser Pro Met Glu Glu Asp

1145 1150 1155

gag cag cat tct gaa gca gat gag cct cca tca gac gaa ccc cta 3519

Glu Gln His Ser Glu Ala Asp Glu Pro Pro Ser Asp Glu Pro Leu

1160 1165 1170

tct gat gac ccc ctg tca cct gct gag gag aaa ttg ccc cac att 3564

Ser Asp Asp Pro Leu Ser Pro Ala Glu Glu Lys Leu Pro His Ile

1175 1180 1185

gat gag tat tgg tca gac agt gag cac atc ttt ttg gat gca aat 3609

Asp Glu Tyr Trp Ser Asp Ser Glu His Ile Phe Leu Asp Ala Asn

1190 1195 1200

att ggt ggg gtg gcc atc gca cct gct cac ggc tcg gtt ttg att 3654

Ile Gly Gly Val Ala Ile Ala Pro Ala His Gly Ser Val Leu Ile

1205 1210 1215

gag tgt gcc cgg cga gag ctg cac gct acc act cct gtt gag cac 3699

Glu Cys Ala Arg Arg Glu Leu His Ala Thr Thr Pro Val Glu His

1220 1225 1230

ccc aac cgt aat cat cca acc cgc ctc tcc ctt gtc ttt tac cag 3744

Pro Asn Arg Asn His Pro Thr Arg Leu Ser Leu Val Phe Tyr Gln

1235 1240 1245

cac aaa aac cta aat aag ccc caa cat ggt ttt gaa cta aac aag 3789

His Lys Asn Leu Asn Lys Pro Gln His Gly Phe Glu Leu Asn Lys

1250 1255 1260

att aag ttt gag gct aaa gaa gct aag aat aag aaa atg aag gcc 3834

Ile Lys Phe Glu Ala Lys Glu Ala Lys Asn Lys Lys Met Lys Ala

1265 1270 1275

tca gag caa aaa gac cag gca gct aat gaa ggt cca gaa cag tcc 3879

Ser Glu Gln Lys Asp Gln Ala Ala Asn Glu Gly Pro Glu Gln Ser

1280 1285 1290

tct gaa gta aat gaa ttg aac caa att cct tct cat aaa gca tta 3924

Ser Glu Val Asn Glu Leu Asn Gln Ile Pro Ser His Lys Ala Leu

1295 1300 1305

aca tta acc cat gac aat gtt gtc acc gtg tcc cct tat gct ctc 3969

Thr Leu Thr His Asp Asn Val Val Thr Val Ser Pro Tyr Ala Leu

1310 1315 1320

aca cac gtt gcg ggg ccc tat aac cat tgg gtc tga 4005

Thr His Val Ala Gly Pro Tyr Asn His Trp Val

1325 1330

<210> 6

<211> 1334

<212> PRT

<213> 人类

<400> 6

Met Ser Arg Ser Arg His Ala Arg Pro Ser Arg Leu Val Arg Lys Glu

1 5 10 15

Asp Val Asn Lys Lys Lys Lys Asn Ser Gln Leu Arg Lys Thr Thr Lys

20 25 30

Gly Ala Asn Lys Asn Val Ala Ser Val Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys

35 40 45

Leu Lys Gln Leu Ile Gln Glu Arg Asp Val Lys Lys Lys Thr Glu Pro

50 55 60

Lys Pro Pro Val Pro Val Arg Ser Leu Leu Thr Arg Ala Gly Ala Ala

65 70 75 80

Arg Met Asn Leu Asp Arg Thr Glu Val Leu Phe Gln Asn Pro Glu Ser

85 90 95

Leu Thr Cys Asn Gly Phe Thr Met Ala Leu Arg Ser Thr Ser Leu Ser

100 105 110

Arg Arg Leu Ser Gln Pro Pro Leu Val Val Ala Lys Ser Lys Lys Val

115 120 125

Pro Leu Ser Lys Gly Leu Glu Lys Gln His Asp Cys Asp Tyr Lys Ile

130 135 140

Leu Pro Ala Leu Gly Val Lys His Ser Glu Asn Asp Ser Val Pro Met

145 150 155 160

Gln Gly Thr Gln Val Leu Pro Asp Ile Glu Thr Leu Ile Gly Val Gln

165 170 175

Asn Pro Ser Leu Leu Lys Gly Lys Ser Gln Glu Thr Thr Gln Phe Trp

180 185 190

Ser Gln Arg Val Glu Asp Ser Lys Ile Asn Ile Pro Thr His Ser Gly

195 200 205

Pro Ala Ala Glu Ile Leu Pro Gly Pro Leu Glu Gly Thr Arg Cys Gly

210 215 220

Glu Gly Leu Phe Ser Glu Glu Thr Leu Asn Asp Thr Ser Gly Ser Pro

225 230 235 240

Lys Met Phe Ala Gln Asp Thr Val Cys Ala Pro Phe Pro Gln Arg Ala

245 250 255

Thr Pro Lys Val Thr Ser Gln Gly Asn Pro Ser Ile Gln Leu Glu Glu

260 265 270

Leu Gly Ser Arg Val Glu Ser Leu Lys Leu Ser Asp Ser Tyr Leu Asp

275 280 285

Pro Ile Lys Ser Glu His Asp Cys Tyr Pro Thr Ser Ser Leu Asn Lys

290 295 300

Val Ile Pro Asp Leu Asn Leu Arg Asn Cys Leu Ala Leu Gly Gly Ser

305 310 315 320

Thr Ser Pro Thr Ser Val Ile Lys Phe Leu Leu Ala Gly Ser Lys Gln

325 330 335

Ala Thr Leu Gly Ala Lys Pro Asp His Gln Glu Ala Phe Glu Ala Thr

340 345 350

Ala Asn Gln Gln Glu Val Ser Asp Thr Thr Ser Phe Leu Gly Gln Ala

355 360 365

Phe Gly Ala Ile Pro His Gln Trp Glu Leu Pro Gly Ala Asp Pro Val

370 375 380

His Gly Glu Ala Leu Gly Glu Thr Pro Asp Leu Pro Glu Ile Pro Gly

385 390 395 400

Ala Ile Pro Val Gln Gly Glu Val Phe Gly Thr Ile Leu Asp Gln Gln

405 410 415

Glu Thr Leu Gly Met Ser Gly Ser Val Val Pro Asp Leu Pro Val Phe

420 425 430

Leu Pro Val Pro Pro Asn Pro Ile Ala Thr Phe Asn Ala Pro Ser Lys

435 440 445

Trp Pro Glu Pro Gln Ser Thr Val Ser Tyr Gly Leu Ala Val Gln Gly

450 455 460

Ala Ile Gln Ile Leu Pro Leu Gly Ser Gly His Thr Pro Gln Ser Ser

465 470 475 480

Ser Asn Ser Glu Lys Asn Ser Leu Pro Pro Val Met Ala Ile Ser Asn

485 490 495

Val Glu Asn Glu Lys Gln Val His Ile Ser Phe Leu Pro Ala Asn Thr

500 505 510

Gln Gly Phe Pro Leu Ala Pro Glu Arg Gly Leu Phe His Ala Ser Leu

515 520 525

Gly Ile Ala Gln Leu Ser Gln Ala Gly Pro Ser Lys Ser Asp Arg Gly

530 535 540

Ser Ser Gln Val Ser Val Thr Ser Thr Val His Val Val Asn Thr Thr

545 550 555 560

Val Val Thr Met Pro Val Pro Met Val Ser Thr Ser Ser Ser Ser Tyr

565 570 575

Thr Thr Leu Leu Pro Thr Leu Glu Lys Lys Lys Arg Lys Arg Cys Gly

580 585 590

Val Cys Glu Pro Cys Gln Gln Lys Thr Asn Cys Gly Glu Cys Thr Tyr

595 600 605

Cys Lys Asn Arg Lys Asn Ser His Gln Ile Cys Lys Lys Arg Lys Cys

610 615 620

Glu Glu Leu Lys Lys Lys Pro Ser Val Val Val Pro Leu Glu Val Ile

625 630 635 640

Lys Glu Asn Lys Arg Pro Gln Arg Glu Lys Lys Pro Lys Val Leu Lys

645 650 655

Val Leu Arg Arg Ser Ser Asp Glu Glu Lys Val Leu Cys Leu Val Arg

660 665 670

Gln Arg Thr Gly His His Cys Pro Thr Ala Val Met Val Val Leu Ile

675 680 685

Met Val Trp Asp Gly Ile Pro Leu Pro Met Ala Asp Arg Leu Tyr Thr

690 695 700

Glu Leu Thr Glu Asn Leu Lys Ser Tyr Asn Gly His Pro Thr Asp Arg

705 710 715 720

Arg Cys Thr Leu Asn Glu Asn Arg Thr Cys Thr Cys Gln Gly Ile Asp

725 730 735

Pro Glu Thr Cys Gly Ala Ser Phe Ser Phe Gly Cys Ser Trp Ser Met

740 745 750

Tyr Phe Asn Gly Cys Lys Phe Gly Arg Ser Pro Ser Pro Arg Arg Phe

755 760 765

Arg Ile Asp Pro Ser Ser Pro Leu His Thr Tyr Tyr Glu Arg Ile Thr

770 775 780

Lys Gly Arg Asn Pro Glu Arg Arg Tyr Met Lys Pro Glu Arg Ile Ser

785 790 795 800

Pro Gly His Glu Ala Met Glu Lys Asn Leu Glu Asp Asn Leu Gln Ser

805 810 815

Leu Ala Thr Arg Leu Ala Pro Ile Tyr Lys Gln Tyr Ala Pro Val Ala

820 825 830

Tyr Gln Asn Gln Val Glu Tyr Glu Asn Val Ala Arg Glu Cys Arg Leu

835 840 845

Gly Ser Lys Glu Gly Arg Pro Phe Ser Gly Val Thr Ala Cys Leu Asp

850 855 860

Phe Cys Ala His Pro His Arg Asp Ile His Asn Met Asn Asn Gly Ser

865 870 875 880

Thr Val Val Cys Thr Leu Thr Arg Glu Asp Asn Arg Ser Leu Gly Val

885 890 895

Ile Pro Gln Asp Glu Gln Leu His Val Leu Pro Leu Tyr Lys Leu Ser

900 905 910

Asp Thr Asp Glu Phe Gly Ser Lys Glu Gly Met Glu Ala Lys Ile Lys

915 920 925

Ser Gly Ala Ile Glu Val Leu Ala Pro Arg Arg Lys Lys Arg Thr Cys

930 935 940

Phe Thr Gln Pro Val Pro Arg Ser Gly Lys Lys Arg Ala Ala Met Met

945 950 955 960

Thr Glu Val Leu Ala His Lys Ile Arg Ala Val Glu Lys Lys Pro Ile

965 970 975

Pro Arg Ile Lys Arg Lys Asn Asn Ser Thr Thr Thr Asn Asn Ser Lys

980 985 990

Pro Ser Ser Leu Pro Thr Leu Gly Ser Asn Thr Glu Thr Val Gln Pro

995 1000 1005

Glu Val Lys Ser Glu Thr Glu Pro His Phe Ile Leu Lys Ser Ser

1010 1015 1020

Asp Asn Thr Lys Thr Tyr Ser Leu Met Pro Ser Ala Pro His Pro

1025 1030 1035

Val Lys Glu Ala Ser Pro Gly Phe Ser Trp Ser Pro Lys Thr Ala

1040 1045 1050

Ser Ala Thr Pro Ala Pro Leu Lys Asn Asp Ala Thr Ala Ser Cys

1055 1060 1065

Gly Phe Ser Glu Arg Ser Ser Thr Pro His Cys Thr Met Pro Ser

1070 1075 1080

Gly Arg Leu Ser Gly Ala Asn Ala Ala Ala Ala Asp Gly Pro Gly

1085 1090 1095

Ile Ser Gln Leu Gly Glu Val Ala Pro Leu Pro Thr Leu Ser Ala

1100 1105 1110

Pro Val Met Glu Pro Leu Ile Asn Ser Glu Pro Ser Thr Gly Val

1115 1120 1125

Thr Glu Pro Leu Thr Pro His Gln Pro Asn His Gln Pro Ser Phe

1130 1135 1140

Leu Thr Ser Pro Gln Asp Leu Ala Ser Ser Pro Met Glu Glu Asp

1145 1150 1155

Glu Gln His Ser Glu Ala Asp Glu Pro Pro Ser Asp Glu Pro Leu

1160 1165 1170

Ser Asp Asp Pro Leu Ser Pro Ala Glu Glu Lys Leu Pro His Ile

1175 1180 1185

Asp Glu Tyr Trp Ser Asp Ser Glu His Ile Phe Leu Asp Ala Asn

1190 1195 1200

Ile Gly Gly Val Ala Ile Ala Pro Ala His Gly Ser Val Leu Ile

1205 1210 1215

Glu Cys Ala Arg Arg Glu Leu His Ala Thr Thr Pro Val Glu His

1220 1225 1230

Pro Asn Arg Asn His Pro Thr Arg Leu Ser Leu Val Phe Tyr Gln

1235 1240 1245

His Lys Asn Leu Asn Lys Pro Gln His Gly Phe Glu Leu Asn Lys

1250 1255 1260

Ile Lys Phe Glu Ala Lys Glu Ala Lys Asn Lys Lys Met Lys Ala

1265 1270 1275

Ser Glu Gln Lys Asp Gln Ala Ala Asn Glu Gly Pro Glu Gln Ser

1280 1285 1290

Ser Glu Val Asn Glu Leu Asn Gln Ile Pro Ser His Lys Ala Leu

1295 1300 1305

Thr Leu Thr His Asp Asn Val Val Thr Val Ser Pro Tyr Ala Leu

1310 1315 1320

Thr His Val Ala Gly Pro Tyr Asn His Trp Val

1325 1330

<210> 7

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 7

gcaagaattc ctcgagccac catggactac aaagacgatg acgacaagtc tcgatcccgc 60

catgcaag 68

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 8

gagtgaattc ctcgatcaga cccaatggtt atagggcc 38

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 9

gcaagaattc ctcgagccac catgtctcga tcccgccatg c 41

<210> 10

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 10

gagtgaattc ctcgattact tgtcgtcatc gtctttgtag tcgacccaat gg 52

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 11

agccacatcg ctcagacac 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 12

gcccaatacg accaaatcc 19

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 13

ctttgaggct ctgcagctta g 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 14

tctgctttgc atatctcctg aa 22

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 15

gggggaatgg accttgtata g 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 16

gcaaagctcc taccgtacca 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 17

tctccaacat cctgaacctc a 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 18

ttgctattct tcggccagtt 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 19

gctgtgacag gtacccaacc 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 20

catgcaggtg agttgtcaga a 21

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 21

ggctgagcac cactacgact 20

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 22

gcattataaa atttcccaaa tcatc 25

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 23

atttcccgct ctggttcag 19

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 24

gttttctcca cggatgttgc 20

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 25

acgccgagtt gagcaaga 18

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 26

tctgcctcct ccacgaag 18

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 27

ggtaccccga catccactt 19

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 28

gcctgttctg gaaccatacc t 21

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 29

ccgcttgtta ggtcgccgca 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 30

tgggctgagg gccggagaaa 20

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 31

acacgcacca ccaccacaac a 21

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 32

ccggcgagtt tgccaagagc 20

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 33

cgacttcacc aactggttct g 21

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 34

atgcaggttg tgcgatca 18

<210> 35

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 35

tgggatattc aggttcatgt tg 22

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 36

actggagttt ggcaggagag 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 37

gcggccacga cacgaggaat 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 38

cgcccatcag cccactctcg 20

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 39

ccaagcccca gaagattag 19

<210> 40

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 40

tggagctaat cgtgtag 17

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 41

ggtgcactga aatggaaagg 20

<210> 42

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 42

actggcacgc tccatgac 18

<210> 43

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 43

ggtgcactga gctcgaaag 19

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 人工合成的引物序列

<400> 44

aagaggtgtc ggatgacagg 20

<210> 45

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> FLAG标签的序列

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(27)

<223>

<400> 45

atg gac tac aaa gac gat gac gac aag 27

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 46

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> FLAG标签的序列

<400> 46

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

Claims

1.一种分化能力提高了的分化多能性干细胞的制造方法，其包含将选自下述(a)～(c)中的至少一种分子导入分化多能性干细胞或用于诱导为该细胞的体细胞的工序，

(a)变异型TET1蛋白质，所述变异型TET1蛋白质为在由序列号：4中记载的氨基酸序列组成的正常型TET1蛋白质的N末端直接添加了序列号：46中记载的FLAG标签的变异型TET1蛋白质，是与所述正常型TET1蛋白质相比稳定性提高了的变异型TET1蛋白质

(b)编码所述变异型TET1蛋白质的核酸

(c)插入有编码所述变异型TET1蛋白质的核酸的载体。

2.一种分化能力提高了的分化多能性干细胞的制造方法，其包含将选自下述(a)～(c)中的至少一种分子导入分化多能性干细胞或用于诱导为该细胞的体细胞的工序，

(a)变异型TET1蛋白质，所述变异型TET1蛋白质为在由序列号：4中记载的氨基酸序列组成的正常型TET1蛋白质的N末端直接添加了序列号：46中记载的FLAG标签、缺失了双加氧酶区域的变异型TET1蛋白质，是与所述正常型TET1蛋白质相比稳定性提高了的变异型TET1蛋白质

(b)编码所述变异型TET1蛋白质的核酸

(c)插入有编码所述变异型TET1蛋白质的核酸的载体。

3.根据权利要求2所述的制造方法，所述双加氧酶区域为在序列号：4中记载的氨基酸序列中为第1640～2103位的氨基酸构成的区域。

4.一种蛋白质，其为在由序列号：4中记载的氨基酸序列组成的正常型TET1蛋白质的N末端直接添加了序列号：46中记载的FLAG标签的变异型TET1蛋白质，与所述正常型TET1蛋白质相比稳定性提高。

5.一种蛋白质，其为在由序列号：4中记载的氨基酸序列组成的正常型TET1蛋白质的N末端直接添加了序列号：46中记载的FLAG标签、缺失了双加氧酶区域的变异型TET1蛋白质，与所述正常型TET1蛋白质相比稳定性提高。

6.根据权利要求5所述的蛋白质，所述双加氧酶区域为在序列号：4中记载的氨基酸序列中为第1640～2103位的氨基酸构成的区域。

7.一种核酸，编码权利要求4-6中任一项所述的蛋白质。

8.一种载体，其插入有权利要求7所述的核酸。

9.一种分化多能性干细胞或用于诱导为该细胞的体细胞，导入有选自下述(a)～(c)中的至少一种分子，

(b)编码所述变异型TET1蛋白质的核酸

(c)插入有编码所述变异型TET1蛋白质的核酸的载体。

10.一种分化多能性干细胞或用于诱导为该细胞的体细胞，导入有选自下述(a)～(c)中的至少一种分子，

(b)编码所述变异型TET1蛋白质的核酸

(c)插入有编码所述变异型TET1蛋白质的核酸的载体。

11.根据权利要求10所述的分化多能性干细胞或用于诱导为该细胞的体细胞，所述双加氧酶区域为在序列号：4中记载的氨基酸序列中为第1640～2103位的氨基酸构成的区域。