CN109136361A - P2x7受体在诊断和治疗类风湿关节炎方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，公开了P2X7受体在诊断和治疗类风湿关节炎诊断方面的应用。本发明首先鉴定发现了P2X7受体在类风湿关节炎病中异常高表达，P2X7受体与类风湿关节炎炎症因子水平呈正比，靶向抑制P2X7受体可抑制类风湿关节炎炎症反应作用，因此可用于类风湿关节炎的诊断和治疗，克服了现有类风湿关节炎诊断标志物特异性不高、灵敏度不够的缺点，对于类风湿关节炎的诊断价值好、检测快速方便、准确率高、特异性强、灵敏度高，可以实现对类风湿关节炎的准确诊断，在医疗行业类风湿关节炎的辅助诊断和治疗方面具有广泛的应用前景。

Description

P2X7受体在诊断和治疗类风湿关节炎方面的应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域。更具体地，涉及P2X7受体作为类风湿关节炎的诊断标志物的应用及其在类风湿关节炎炎症反应中的治疗作用。

背景技术

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种自身免疫性疾病，其病理特征为炎症反应和炎症细胞因子分泌增多，临床表现为长期慢性炎症浸润、关节疼痛、关节肿大和关节畸形，对人类健康和生活带来极大伤害。流行病学研究发现世界女性类风湿关节炎发病率约为1.16％，男性为0.44％，类风湿关节炎已成为亟待解决的公共卫生问题，也是临床研究的热点。

类风湿关节炎发病机制主要有炎症细胞因子学说、T细胞学说、Th17细胞学说等，但其详细的发病机制尚不清楚。炎症反应是类风湿关节炎最重要的致病机制，研究表明采用敲除IL-1、抗体阻断IL-6或拮抗TNF-α等方法均可阻断类风湿关节炎的炎症反应，一定程度上改善类风湿关节炎疾病状态，但仍有一部分病人没有得到缓解，给社会和家庭带来极大伤害，因此寻找新的靶点来抑制炎症细胞因子分泌和炎症反应对治疗类风湿关节炎至关重要。

P2X7受体是嘌呤受体中的一个亚型，为ATP控制的离子通道，在单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞中高等表达，其被ATP激活后导致K⁺外流和Ca²⁺内流、形成非选择性膜孔，启动一系列信号途径如NF-κB信号通路，同时促进炎症细胞因子转录。研究表明：P2X7受体在真菌感染、支气管哮喘、慢性阻塞性肺病、脊髓损伤、炎症性神经痛、高血压、糖尿病等多种炎症相关疾病中扮演重要角色。然而，P2X7受体在作为类风湿关节炎诊断标志物及其在类风湿关节炎病中的治疗作用尚无文献报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现在类风湿关节炎病诊断标志物特异性不好、灵敏度不高的缺陷和不足，提供一种新的类风湿关节炎的诊断标志物，即P2X7受体。

本发明的目的是提供P2X7受体在作为类风湿关节炎诊断标记物方面的应用。

本发明的另一目的是提供一种检测P2X7受体基因转录水平的荧光定量PCR引物对。

本发明的再一目的是提供一种类风湿关节炎诊断试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明利用RT-PCR法检测骨关节置换病人和类风湿关节炎患者P2X7受体表达时意外发现，类风湿关节炎患者P2X7受体水平明显高于骨关节置换手术患者。随后利用ROC曲线对P2X7受体进行分析，结果显示其AUC面积为0.884，诊断价值较好，P2X7受体对类风湿关节炎诊断敏感性和特异性分别为80％和92％，具有特异性好、灵敏度高的特点。另外，本发明人利用ELISA法检测类风湿关节炎患者血清中RF、L-1β、IL-6、IL-8水平，并且进行相关性分析，结果显示P2X7受体水平与类风湿关节炎患者血清中炎症细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8呈正相关，利用小分子干扰RNA特异性沉默P2X7受体后抑制了类风湿关节炎的炎症反应。因此，P2X7受体可以作为类风湿关节炎的诊断标记物，以及作为类风湿关节炎的治疗靶点。

基于上述发现成果，以下应用均应在本发明的保护范围之内：

本发明请求保护P2X7受体在作为类风湿关节炎诊断标记物方面的应用。

本发明还请求保护P2X7受体在制备类风湿关节炎诊断试剂或试剂盒中的应用。

同时，本发明还请求保护一种检测P2X7受体基因转录水平的荧光定量PCR引物对，也即为诊断类风湿关节炎的荧光定量PCR引物对，包括RT-PCR正向引物、反向引物，核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～2所示。

P2X7-F(SEQ ID NO:1)：ACGTTTGCTTTGCTCTGGTG；

P2X7-R(SEQ ID NO:2)：ACCTTGGTGTGCACAGAACT。

另外，所述引物对在制备类风湿关节炎诊断试剂和/或试剂盒中的应用也是本发明请求保护的范围。

本发明还请求保护一种类风湿关节炎的诊断试剂盒，所述试剂盒包含检测P2X7基因表达水平或血清中P2X7受体蛋白含量的试剂。

优选地，所述试剂包括所述的引物对。

更优选地，所述试剂盒还包含内参基因β-actin，包括正向引物和反向引物，核苷酸序列依次如SEQ ID NO:3～4所示。

β-actin-F(SEQ ID NO:3)：5’-ACTTTTCCAGCCTTCCTTC-3’；

β-actin-R(SEQ ID NO:4)：5’-ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3’。

更优选地，所述试剂盒是荧光定量PCR检测试剂盒，其反应体系包括：Premix Ex Taq 10.0μL，10μmol/LPCR上游引物0.4μL，10μmol/L PCR下游引物0.4μL，cDNA模板2.0μL，加dH₂O至总体积20.0μL。

优选地，所述的试剂盒是荧光定量PCR检测试剂盒，其反应条件为：96℃30s，1个循环；PCR反应，96℃5s，60℃15s，45个循环；溶解，96℃15s，65℃20s，96℃15s，1个循环。

另外，P2X7受体在作为类风湿关节炎治疗靶点方面的应用，也应在本发明的保护范围之内。

因此可提供一种治疗类风湿关节炎的药物，其含有可抑制P2X7受体表达的试剂。

具体地作为一种可选择的方案，所述可抑制P2X7受体表达的试剂可以是抑制P2X7受体表达的siRNA。

优选地，特异性干扰、沉默P2X7受体表达的siRNA序列如SEQ ID NO:5～6所示：

Sense(SEQ ID NO:5)：5’-GGAUCCAGAGCAUGAAUUAUU-3’；

Antisense(SEQ ID NO:6)：5’-UAAUUCAUGCUCUGGAUCCUU-3’。

更优选地，siRNA抑制P2X7受体表达的步骤：培养细胞至融合度为60％～80％左右，用Lipo2000转染试剂转染siRNA片段，培养24h或48h后收集细胞，提取RNA，进行实时荧光定量PCR检测其抑制效果。

本发明具有以下有益效果：

本发明首先鉴定发现了P2X7受体在类风湿关节炎病中高表达，P2X7受体与类风湿关节炎炎症因子水平呈正比，靶向抑制P2X7受体可抑制类风湿关节炎炎症反应作用，因此可以用于类风湿关节炎的诊断和治疗，克服了现有类风湿关节炎诊断标志物特异性不高、灵敏度不够的缺点，对于类风湿关节炎的诊断价值好、检测快速方便、准确率高、特异性强、灵敏度高，可以实现对类风湿关节炎的准确诊断，能广泛应用于医疗行业类风湿关节炎的辅助诊断和治疗。

基于上述发现，本发明构建了类风湿关节炎诊断试剂盒，以P2X7受体为靶点，设计新的药物，可有效抑制类风湿关节炎炎症反应，提高类风湿关节炎的治疗效果。

附图说明

图1为类风湿关节炎患者和骨关节置换患者中P2X7受体相对表达水平对比。(A)类风湿关节炎病人和骨关节置换患者滑膜组织中P2X7受体相对表达水平，***p<0.001。

图2为ROC曲线分析P2X7受体对类风湿关节炎诊断价值和相关指标。(A)ROC曲线分析P2X7受体对类风湿关节炎的诊断价值；(B)ROC曲线分析P2X7受体对类风湿关节炎诊断的相关指标。

图3为类风湿关节炎患者滑膜组织P2X7受体水平和血清中炎症因子水平相关性分析。(A)类风湿关节炎患者滑膜组织P2X7受体水平和血清IL-1β呈正相关，***p<0.001；(B)类风湿关节炎患者滑膜组织P2X7受体水平和血清IL-6呈正相关，***p<0.001；(C)类风湿关节炎患者滑膜组织P2X7受体水平和血清IL-8呈正相关，***p<0.001。

图4为MH7A关节滑膜细胞中沉默P2X7受体后炎症因子的表达和分泌。(A)沉默P2X7受体后细胞因子L-1β和IL-6的相对表达，***p<0.01；(B)沉默P2X7受体后MH7A细胞上清中L-1β和IL-6分泌，***p<0.01。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 RT-PCR检测类风湿关节炎患者中P2X7受体水平

1、实验方法

(1)制备cDNA

类风湿关节炎患者和骨关节置换病人的滑膜组织来源于广州医科大学附属第三医院和广州市增城区新塘医院。关节滑膜组织采用无菌收集，手术后取关节滑膜组织于干净无菌的50mL离心管中，置于冰上，于无菌操作台剥除脂肪组织、骨头、血管等后，用PBS洗3遍；提取RNA，逆转录制备cDNA。

(2)PCR引物

P2X7-F(SEQ ID NO:1)：ACGTTTGCTTTGCTCTGGTG；

P2X7-R(SEQ ID NO:2)：ACCTTGGTGTGCACAGAACT。

以制备的cDNA为模板，用SYBER green试剂盒进行实时荧光PCR实验，其PCR反应体系如下表1所示。

表1荧光定量PCR反应体系

PCR反应条件为：96℃30s，1个循环；96℃5s，60℃15s，45个循环；溶解，96℃15s，65℃20s，96℃15s，1个循环。

以上实验重复三次，以β-actin为内对照，通过2-△△CT法计算各组之间目标基因P2X7受体表达水平的差异；按照下列公式计算样本的相对表达量：其中△△Ct＝△Ct处理组-△Ct对照组；△Ct＝CtP2X7受体-Ctβ-actin。

2、实验结果

如图1所示，从图1可以看出与骨关节置换手术患者相比，类风湿关节炎患者滑膜中P2X7受体水平明显高于骨关节置换手术患者。

实施例2 ROC曲线分析P2X7受体在类风湿关节炎患者中诊断价值

1、实验方法

采用SPSS17.0软件对P2X7受体在类风湿关节炎患者中的诊断价值进行分析。

2、实验结果

实验结果如图2所示，ROC曲线分析结果显示AUC面积为0.884，表明P2X7受体对RA的诊断具有较好价值；同时ROC曲线分析表明P2X7受体对RA诊断敏感性和特异性分别为80％和92％，95％置信区间为0.780～0.998。

实施例3 P2X7受体水平与类风湿关节炎患者血清中炎症细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8的相关性分析

1、实验方法

类风湿关节炎患者血清中炎症细胞因子L-1β、IL-6、IL-8水平采用酶联免疫法检测。收集类风湿关节炎患者的新鲜血清，采用酶联免疫法检测。试剂盒采用GeneStar公司产品。具体步骤：制备标准品稀释液，收集类风湿关节炎病人血清，按照酶联免疫试剂盒说明书进行操作，最后利用酶标仪检测光密度(即OD值)。根据标准吸光值及对应的浓度技术标准曲线，根据标准曲线计算类风湿关节炎患者血清中细胞因子L-1β、IL-6、IL-8含量，采用SPSS17.0软件进行相关性分析。

2、实验结果

如图3所示，通过P2X7受体水平与类风湿关节炎患者血清中炎症细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8的相关性分析发现，P2X7受体水平与类风湿关节炎患者血清中炎症细胞因子IL-1β、IL-6和IL-8呈正相关。

实施例4以P2X7受体为靶点采用小分子干扰片段沉默P2X7受体后抑制MH7A关节滑膜细胞中炎症细胞因子的表达和分泌

1、实验方法

(1)MH7A关节滑膜细胞的培养

MH7A细胞为永生化的RA关节滑膜细胞，购自广州吉妮欧公司。用高糖DMEM+10％胎牛血清于5％CO₂中，37℃的培养箱培养。购买时为第3代，培养3代后用于后续实验研究。

(2)P2X7受体干扰实验

特异性敲低P2X7受体的siRNA小分子干扰片段购自锐博公司。P2X7受体干扰实验具体方法如下：MH7A细胞种植于六孔板中，待其融合度为40％～70％，换上无双抗的培养液，按照Lipo 2000转染试剂说明书，每孔转染特异性敲低P2X7受体的siRNA小分子干扰片段100pmol，转染6h后，撤掉旧培养液，换上含有双抗的培养液进行培养，继续培养2d后收集MH7A细胞RNA和培养上清，检测炎症细胞因子IL-1β、IL-6转录和分泌水平。

(3)细胞因子IL-1β、IL-6转录

IL-1β、IL-6的转录水平检测采用RT-PCR法。提取MH7A关节滑膜细胞的RNA，逆转录后，用SYBER green试剂盒进行实时荧光PCR实验。PCR条件为：96℃30s，1个循环；PCR反应，96℃5s，60℃15s，45个循环；溶解，96℃15s，65℃20s，96℃15s，1个循环。以上实验重复三次，以β-actin为内对照，通过2-△△CT法计算各组之间目标基因IL-1β、IL-6表达水平的差异；按照下列公式计算样本的相对表达量：其中△△Ct＝△Ct处理组-△Ct对照组；△Ct＝Ct IL-1β或IL-6-Ctβ-actin。

(4)细胞因子IL-1β、IL-6分泌水平检测

IL-1β、IL-6分泌水平采用酶联免疫法。具体步骤：制备标准品稀释液，收集MH7A关节滑膜细胞培养上清，按照酶联免疫试剂盒说明书进行操作，最后利用酶标仪检测光密度(即OD值)。根据标准吸光值及对应的浓度技术标准曲线，计算MH7A关节滑膜细胞培养上清中细胞因子L-1β、IL-6、IL-8含量。

2、实验结果

如图4所示，沉默P2X7受体后，关节滑膜细胞MH7A的炎症细胞因子L-1β和IL-6表达水平明显下调，与此对应的是，关节滑膜细胞MH7A培养上清中L-1β和IL-6含量也明显下调。

该结果表明P2X7受体在类风湿关节炎病中异常高表达，P2X7受体与类风湿关节炎炎症因子水平呈正比，靶向抑制P2X7受体可抑制类风湿关节炎炎症反应作用。

实施例5类风湿关节炎诊断试剂盒

1、一种类风湿关节炎诊断试剂盒，包括以下组分：

(1)P2X7基因检测引物对：RT-PCR正向引物、反向引物，核苷酸序列依次如SEQ IDNO:1～2所示。

P2X7-F(SEQ ID NO:1)：ACGTTTGCTTTGCTCTGGTG；

P2X7-R(SEQ ID NO:2)：ACCTTGGTGTGCACAGAACT。

(2)内参基因β-actin为检测引物对：包括正向引物和反向引物，核苷酸序列依次如SEQ ID NO:3～4所示。

β-actin-F(SEQ ID NO:3)：5’-ACTTTTCCAGCCTTCCTTC-3’；

β-actin-R(SEQ ID NO:4)：5’-ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3’。

(3)反应所需试剂： Premix Ex Taq，10μmol/LPCR上游引物，10μmol/LPCR下游引物，cDNA模板，dH₂O。

2、该试剂盒的使用方法如下：

提取待测样本DNA，以所述引物对进行荧光定量PCR检测。

反应体系如上表1所示。

反应条件为：96℃30s，1个循环；96℃5s，60℃15s，45个循环；溶解，96℃15s，65℃20s，96℃15s，1个循环。

该试剂盒可以实现对类风湿关节炎的准确诊断，检测快速方便、准确率高、特异性好、灵敏度高，能广泛应用于医疗行业类风湿关节炎的辅助诊断和治疗。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广州医科大学附属第三医院(广州重症孕产妇救治中心、广州柔济医院)

<120> P2X7受体在诊断和治疗类风湿关节炎方面的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> P2X7-F(P2X7-F)

<400> 1

acgtttgctt tgctctggtg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> P2X7-R(P2X7-R)

<400> 2

accttggtgt gcacagaact 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> β-actin-F(β-actin-F)

<400> 3

acttttccag ccttccttc 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> β-actin-R(β-actin-R)

<400> 4

atctccttct gcatcctgtc 20

<210> 5

<211> 15

<212> DNA

<213> Sense(Sense)

<400> 5

ggaccagagc agaaa 15

<210> 6

<211> 12

<212> DNA

<213> Antisense(Antisense)

<400> 6

aacagccgga cc 12

Claims (10)

1.P2X7受体在作为类风湿关节炎诊断标记物方面的应用。

2.P2X7受体在制备类风湿关节炎诊断试剂或试剂盒中的应用。

3.一种诊断类风湿关节炎的荧光定量PCR引物对，其特征在于，包括RT-PCR正向引物、反向引物，核苷酸序列依次如SEQ ID NO:1～2所示。

4.权利要求3所述引物对在制备类风湿关节炎诊断制剂和/或试剂盒中的应用。

5.一种类风湿关节炎诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测P2X7基因表达水平或P2X7受体蛋白含量的试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括权利要求3所述的引物对。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是荧光定量PCR检测试剂盒，其反应体系包括：2×SYBR® Premix Ex Taq 10.0 μL，10 μmol/L PCR上游引物0.4 μL，10μmol/L PCR下游引物0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，加dH₂O至总体积20.0 μL。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，荧光定量PCR的反应条件为：96℃ 30s，1个循环；PCR反应，96℃ 5s，60℃ 15s，45个循环；溶解，96℃ 15s，65℃ 20s，96℃ 15s，1个循环。

9.P2X7受体在作为类风湿关节炎治疗靶点方面的应用。

10.一种治疗类风湿关节炎的药物，其特征在于，含有可抑制P2X7受体表达的试剂。