CN109134431B - 作为囊性纤维化跨膜传导调节因子抑制剂的氨基咪唑偶联吡啶酮衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及式I所示的氨基咪唑偶联吡啶酮类化合物和/或它们的可药用盐及其制备方法，它们可用于治疗和/或预防由于囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)基因突变造成的囊性纤维化(CF)相关遗传性疾病，以及含有所述化合物的药物组合物。

其中，R为C₄或C₅或C₆或C₇或C₈环烷基、C₃或C₄或C₅或C₆或C₇或C₈氮杂环烷基、C₃或C₄或C₅或C₆或C₇或C₈氧杂环烷基、吗啉基、氮被直链或支链C1或C2或C3或C4或C5烷基取代的哌嗪基。

Description

作为囊性纤维化跨膜传导调节因子抑制剂的氨基咪唑偶联吡 啶酮衍生物

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及到权利要求中所述的一种氨基咪唑偶联吡啶酮类化合物及其生理上可接受的盐，它们的制备以及它们在治疗和/或预防与囊性纤维化、异常增加的肠分泌、分泌性腹泻、多囊肾脏疾病、慢性阻塞性肺病、慢性支气管炎、黏多糖症以及先天性双侧输精管缺失(CBAVA)导致的男性不育症相关的疾病中的用途。

技术背景

囊性纤维化跨膜传导调节因子(英文为cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator，简写为CFTR)属于ATP结合盒(英文为ATPbindingcassette，简写为ABC)转运蛋白超家族的成员，而ABC转运蛋白具有诸如吸收营养物质、排除毒素、介导真核生物和细菌的细胞间通讯等多种重要的生物功能。更具体的讲，CFTR是一种cAMP激活的ATP门控性上皮氯离子通道，表达于哺乳动物气道、消化道(肠、胰腺等)和生殖道上皮细胞的顶部质膜中，这为氯离子跨顶端膜运动提供了途径和关键位点，参与多个器官(包括肺)中负责盐和流体运输的蛋白激酶A(PKA)的活化，并因此来调节跨上皮的盐和水的转运比例，所以，在上皮细胞中，CFTR的正常功能对于维持包括呼吸和消化组织在内的整个身体的电解质转运是非常关键的。诸如β-肾上腺素激动剂的激素、霍乱毒素等可导致 cAMP的增加，而cAMP依赖蛋白激酶的活化以及所述CFTR氯离子通道的磷酸化并由此引起氯离子通道的开放。CFTR氯离子通道功能与很多疾病相关，包括囊性纤维化(CF)、异常增加的肠分泌、分泌性腹泻、多囊肾脏疾病、慢性阻塞性肺病、慢性支气管炎、黏多糖症以及先天性双侧输精管缺失(CBAVA)导致的男性不育症等。

CFTR由约1480个氨基酸构成。这些氨基酸编码形成跨膜区的串联重复体，并进而组成蛋白质，每个重复体包含6个跨膜螺旋和1个核苷酸结合域。2个跨膜区通过一个具有多个磷酸化位点的大的带极性且可调节的(R)-域相连，所述磷酸化位点负责调节通道活性和细胞运输。

囊性纤维化(英文为cysticfibrosis，简写为CF)是一种致命的常染色体隐性疾病，是人体中最常见的遗传性疾病之一，由CFTR基因突变造成。大部分CF 突变表现为细胞表面CFTR通道数量的减少或者通道功能(比如门控或者电导突变)的损害，或者两种情况同时发生。在美国，大约有两千五百分之一的儿童以及上千万的成人患有CF相关疾病，在欧洲也有差不多相同数量的这种隐性遗传疾病患者。CF患者的呼吸道上皮细胞中内源性表达的CFTR突变导致顶膜的阴离子分泌减少，使离子和液体转运失衡。阴离子转运的减少使CF患者的肺粘液蓄积增加并伴随最终可导致人死亡的微生物感染。除了患有呼吸道方面的疾病，CF 患者一般还会患有典型的胃肠问题以及胰功能不全，如果不及时治疗，也会导致死亡。此外，大部分男性CF患者都不能生育，女性CF患者的生育力会降低。

虽然在过去的几十年中，现代医学的努力在治疗CF方面取得了进展，已经使CF患者的寿命大大延长，但迄今为止尚未发现安全又有效的直接靶向与CFTR 的治疗方法。对CFTR基因的破译有助于人们进一步了解囊性纤维化的发病机制，同时为该疾病的诊断提供新的线索。而增加CFTR通道开放可能性的小分子药物是治疗CF的一种潜在治疗策略，多开发此类药物将有助于CF问题的解决。

发明概述

ZL201510111497.9中阐述了我们初期研发氨基咪唑偶联吡啶酮类囊性纤维化跨膜传导调节因子抑制剂的部分研究成果。最初我们只对咪唑4位上的基团 (主要是取代苯基)以及5位上吡啶酮氮原子上的取代基(主要是直链或直链烷基)进行了合成和筛选。活性测定显示，咪唑4位为氟代苯基以及5位吡啶酮氮原子上为异丙基时，生物活性较高，所以后续工作，我们开始针对咪唑2位上与酰胺基碳原子相连的基团进行合成和筛选，而且目前工作只考虑筛选3-8元的脂环族基团，同时包括部分氮杂以及氧杂脂环族基团。具体如下所述。

本发明描述了式I化合物，和/或它们的可药用盐

其中，R为C₃或C₄或C₅或C₆或C₇或C₈环烷基、C₃或C₄或C₅或C₆或C₇或C₈氮杂环烷基、C₃或C₄或C₅或C₆或C₇或C₈氧杂环烷基、吗啉基、哌嗪基、氮被直链或支链C1或C2或C3或C4或C5烷基取代的哌嗪基。

即对于R取代基来说，代表性的结构式如下，

星号(*)表示该键与咪唑环2位上的酰胺基碳原子相连。

本发明还涉及用作药物(或药剂)的式I化合物和/或其可药用盐在制备预防和 /或治疗下列疾病的药物中的用途，即囊性纤维化、异常增加的肠分泌、分泌性腹泻、多囊肾脏疾病、慢性阻塞性肺病、慢性支气管炎、黏多糖症以及先天性双侧输精管缺失(CBAVA)导致的男性不育症。

本发明还涉及药物制剂(或药物组合物)，其含有有效量的至少一种式I化合物和/或其可药用盐、生理学耐受的赋形剂和载体，以及在适当时还有其他添加剂和/或其他活性成分。药物可以口服施用，例如以丸剂、片剂、喷涂片(lacquered tablets)、包衣片、颗粒剂、硬和软明胶胶囊、溶液、糖浆、乳剂、混悬剂或气雾混合物形式。但是，施用也可以如下进行：经直肠给药，例如以栓剂形式；或胃肠外给药，例如经静脉内、肌内或皮下以注射溶液或输注溶液、微囊、植入剂或植入棒的形式；或经皮或局部给药，例如以软膏剂、溶液或酊剂形式；或以其他途径给药、例如以气雾剂或鼻喷雾剂形式。

本发明的药物制剂以本身已知并且为本领域技术人员所熟悉的方式制备，除了式I化合物和/或它们的可药用盐和/或它们的前药外，使用可药用的惰性无机和/或有机载体物质和/或添加剂。对于丸剂、片剂、包衣片和硬明胶胶囊的制备而言，可能使用例如乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其盐等。软明胶胶囊和栓剂的载体物质有例如脂肪、蜡、半固体和液体多元醇、天然或硬化油等。适合于制备溶液、例如注射溶液或乳剂或糖浆剂的载体物质有例如水、盐水、醇、甘油、多元醇、蔗糖、转化糖、葡萄糖、植物油等。适合用于微囊、植入剂或植入棒的载体物质，例如羟乙酸和乳酸的共聚物。药物制剂通常含有约0.5至约90％重量的式I化合物和/或它们的可药用盐和/或它们的前药。药物制剂中的活性成分式I化合物和/或它们的可药用盐和/或它们的前药的量通常约0.5至约 1000mg、优选约1至约500mg。

除了式I的活性成分和/或它们的可药用盐以及载体物质外，药物制剂可含有一种或多种添加剂，如填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、稳定剂、乳化剂、防腐剂、甜味剂、着色剂、矫味剂、芳香剂、增稠剂、稀释剂、缓冲物质、溶剂、增溶剂、获得储库效果的试剂、改变渗透压的盐、包衣剂或抗氧化剂。它们也可以含有两种或多种式I化合物和/或它们的可药用盐。在药物组合物含有两种或更多种式I化合物时，对个别化合物的选择可依据药物制剂的特定总体药理学性质。例如，作用持续时间较短的高度强效化合物可以与功效较低的长效化合物组合。就式I化合物中取代基选择而言所允许的灵活性使得能够对化合物的生物学和物理化学性质进行众多控制，由此能够选择这类所需化合物。此外，除了至少一种式I化合物和/或其可药用盐外，药物制剂还可含有一种或多种其他治疗性或预防性的活性成分。

当使用式I化合物时，剂量可在宽限度内并且按照常规的和医生已知的而变化，剂量应适合于每种个例的个体情况。其取决于例如所应用的具体化合物、所治疗疾病的性质和严重程度、施用方式和方案或所治疗的是急性还是慢性病症或是否进行预防。适合的剂量可利用医学领域已知的临床方法建立。一般而言，在重约75kg的成人中获得所需结果的日剂量是约0.01至约100mg/kg、优选约0.1 至约50mg/kg、特别约0.1至约10mg/kg(在每种情况下以mg/kg体重计)。特别在施用相对大量的情况下，日剂量可以分为若干部分，例如2、3或4部分施用。通常，根据个体行为，可能有必要向上或向下偏离所述的日剂量。

此外，式I化合物可用作制备其他化合物、特别是其他药物活性成分的合成中间体，其可由式I化合物例如通过引入取代基或修饰官能团获得。

在大多数情况下，对含有式I的最终化合物或中间体的反应混合物进行后处理，如果有必要，将产物通过本领域技术人员已知的常规方法纯化。例如，所合成的化合物可利用熟知的方法如结晶、色谱或反相高效液相色谱法(RP-HPLC)或基于例如化合物大小、电荷或疏水性的其他分离方法进行纯化。类似地，熟知的方法如氨基酸序列分析、NMR、IR和质谱法(MS)可以用于表征本发明化合物。

因此，以下实施例是本发明的一部分，用于阐明而非限制本发明。

应当指明的是，未实质性影响本发明各种实施方案活性的修饰包括在本文所公开的本发明范围内。

具体实施方式

实施例：4-仲丁基-N-(4-(2,4-二氟苯基)-5-(1-异丙基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-1H- 咪唑-2-基)哌嗪-1-甲酰胺(化合物编号1)的制备

第一步：2-溴-1-(2,4-二氟苯基)乙酮

将溴化铜(28.6g，128.0mmol)加入1-(2,4-二氟苯基)乙酮(10.0g，64.0mmol) 的氯仿(100mL)和乙醇(80mL)混合溶液中。油浴加热到80℃，并保温反应约10小时。过滤除去不溶物，加入乙酸乙酯(200mL)，所得混合溶液依次用饱和食盐水(200mL*2)以及饱和亚硫酸钠溶液(200mL*2)洗涤。有机相经无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂，得13.2g黄色油状物，即为2-溴-1-(2,4- 二氟苯基)乙酮，收率87.8％。MS:m/z＝235.0、237.0(M+H⁺)。

第二步：2-(2,4-二氟苯基)咪唑并[1,2-a]嘧啶

将吡啶-2-胺(9.5g，0.1mol)加入2-溴-1-(2,4-二氟苯基)乙酮(23.5g，0.1mol)的乙二醇二甲醚(200mL)溶液中。将反应液加热至100℃反应约8小时后，减压蒸除溶剂。所得粗品经甲醇与甲基叔丁基醚的混合溶剂(甲醇:甲基叔丁基醚＝1:10)重结晶，析出、过滤并真空干燥得19.7g白色固体，即为2-(2,4-二氟苯基)咪唑并[1,2-a]嘧啶，收率85.2％。MS:m/z＝232.1(M+H⁺)。

第三步：3-溴-2-(2,4-二氟苯基)咪唑并[1,2-a]嘧啶

将N-溴代丁二酰亚胺(11.6g，64.9mol)加入2-(2,4-二氟苯基)咪唑并[1,2-a] 吡啶(15.0g，64.9mmol)的氯仿(200mL)溶液中。将反应液加热至80℃反应约3小时后，冷却至室温，加入二氯甲烷(200mL)。所得反应液用饱和碳酸氢钠溶液洗涤(200mL*3)。有机相经无水硫酸钠干燥后，过滤，减压蒸除溶剂，得18.9g白色固体，即为3-溴-2-(2,4-二氟苯基)咪唑并[1,2-a]嘧啶，收率93.9％。 MS:m/z＝310.0、312.0(M+H⁺)。

第四步：5-(2-(2,4-二氟苯基)咪唑并[1,2-a]嘧啶-3-基)-1-异丙基吡啶-2(1H)-酮

将碳酸钠(21.2g，0.20mol)、1-异丙基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)吡啶-2(1H)-酮(14.5g，0.055mol)、四三苯基膦钯(2.9g，2.5mmol) 依次加入3-溴-2-(2,4-二氟苯基)咪唑并[1,2-a]嘧啶(15.5g，0.05mol)的四氢呋喃 (200mL)溶液中。将反应液加热至85℃反应约10小时后，冷却至室温。用乙酸乙酯(200mL)稀释反应液。所得混合物用饱和食盐水洗涤(200mL*3)。合并有机相，经无水硫酸钠干燥后，过滤，减压蒸除溶剂，剩余物经硅胶柱层析纯化(梯度洗脱，洗脱液为石油醚:乙酸乙酯＝40:1至4:1)得12.7g黄色固体，即为5-(2-(2,4-二氟苯基)咪唑并[1,2-a]嘧啶-3-基)-1-异丙基吡啶-2(1H)-酮，收率 69.3％。MS:m/z＝367.1(M+H⁺)。

第五步：5-(2-氨基-4-(2,4-二氟苯基)-1H-咪唑-5-基)-1异丙基吡啶-2(1H)-酮

将水合肼(55％水溶液，9.8g，0.1mol)加入5-(2-(2,4-二氟苯基)咪唑并[1,2-a]嘧啶-3-基)-1-异丙基吡啶-2(1H)-酮(7.3g，20.0mmol)的乙醇(100mL)溶液中。将反应液油浴加热至回流并反应约10小时后，冷却至室温。减压蒸除溶剂，剩余物用乙酸乙酯(150mL)溶解，所得溶液用饱和食盐水洗涤(100mL*2)。有机相经无水硫酸钠干燥后，过滤，减压蒸除溶剂，剩余物经硅胶柱层析纯化(洗脱液为二氯甲烷:甲醇＝40:1)得5.5g黄色固体，即为5-(2-氨基-4-(2,4-二氟苯基)-1H-咪唑-5-基)-1-异丙基吡啶-2(1H)-酮，收率83.2％。MS:m/z＝331.1(M+H⁺)。第六步：4-仲丁基-N-(4-(2,4-二氟苯基)-5-(1-异丙基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-基)-1H- 咪唑-2-基)哌嗪-1-甲酰胺(化合物编号1)

在5-(2-氨基-4-(2,4-二氟苯基)-1H-咪唑-5-基)-1-异丙基吡啶-2(1H)-酮(3.8g， 11.6mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(60mL)溶液中，先后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(即EDCI·HCl，4.45g，23.2mmol)、N,N-二甲基吡啶-4-胺(即DMAP，0.71g，5.8mmol)、无水碳酸钾(3.2g，23.2mmol)和4- 仲丁基哌嗪-1-甲酸(3.2g，17.4mmol)。室温下反应过夜，TLC监控(石油醚: 乙酸乙酯＝1:1)直至反应完全。用乙酸乙酯(200mL)稀释反应液。所得混合物用饱和食盐水洗涤(100mL*3)。有机相经无水硫酸钠干燥后，过滤，减压蒸除溶剂，剩余物经硅胶柱层析纯化(梯度洗脱，洗脱液为二氯甲烷:甲醇＝50:1 至5:1)得3.1g黄色固体，即为4-仲丁基-N-(4-(2,4-二氟苯基)-5-(1-异丙基-6-氧代 -1,6-二氢吡啶-3-基)-1H-咪唑-2-基)哌嗪-1-甲酰胺，收率53.6％。MS:m/z＝499.3 (M+H⁺)。

¹HNMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:10.06(s,1H),8.76(s,1H),7.78(d,1H),7.19(d,1H),7.05(d,1H),6.92(s,1H),6.51(d,1H),4.49-4.43(m,1H),3.33-3.24(m,4H),2.94-2.85(m,4H),2.69-2.63(m,1H),1.52-1.44(m,8H),1.11(d,3H),0.89(t,3H).

符合专利权要求的式I化合物均可以采用与上述实施例近似的合成方法得到，只需变更不同的起始物料即可。有代表性的化合物见下表：

更多有代表性的化合物不一一列举。

活性测定

式I化合物和/或它们的可药用盐作为CFTR抑制剂可初步按照光学荧光跨膜电位测定法进行活性测试。

测定原理：跨膜电位测定法的原理是利用带负电荷的荧光电压传感染料(比如FLIPR膜电位染料)，用待测化合物预先处理细胞，然后加载电压传感染料，传感染料在胞外时结合淬灭剂，在细胞去极化后，带负电荷的染料重新分配至胞内隔室，由此从膜非渗透淬灭剂中释放，导致荧光增加。以荧光板读出器测定FLIPR Ⅲ上跨膜电位的改变作为NIH3T3细胞中功能性ΔF508-CFTR门控增加的读出值 (电导)。这种荧光改变与因CFTR活性导致的跨膜电位的改变成正比。可以通过适当配备的荧光检测器如FLIPR(荧光成像板读数器)在96或384-孔微量滴定板中实时监测荧光的改变。通过测量跨膜电位这种方式可定量检测CFTR活性。

细胞培养：用稳定表达ΔF508-CFTR通道的NIH3T3中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行膜电位实验。将细胞于37℃、5％v/vCO₂和100％湿度条件下维持在改良Eagle 培养基(MEM)中。该培养基补充了8％v/v胎牛血清、100μg/mL甲氨蝶呤和 100U/mL青霉素/链霉素。使细胞生长在225cm²组织培养瓶中。为了进行膜电位测定，将细胞以40,000细胞/孔接种在96孔基质胶包被的培养板中，使其粘附，在26℃下培养48小时，用于增强剂测定。

增强剂测定：膜电位筛选测定法利用了含有胞外溶液的低氯离子(5mM)以及双添加HTS测定方案。第一次添加是含有或不含有待测化合物的缓冲液，5分钟后添加弗斯可林(1-20μM)。该方案有利于响应于ΔF508-CFTR活化的最大氯流出。ΔF508-CFTR介导的氯离子流出导致膜去极化，任选FMP染料对其进行监测。溶液：低氯胞外溶液(浓度量级为mM)组成为120葡糖酸钠、1.2CaCl₂、3.3KH₂PO₄、 1.2MgCl₂、10.0D-葡萄糖、20.0HEPES，用NaOH调pH值至7.4。

FMP染料：根据使用说明书制备上述低氯胞外溶液，10倍终浓度，以1mL等分试样贮存于-20℃。

测量结果：部分有代表性的化合物利用上述方法进行活性测定的检测结果(EC₅₀值)如下表所示。

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Claims (5)

1.式I化合物，和/或它们的可药用盐

其中，R为C₃或C₄或C₅或C₆或C₇或C₈氮杂环烷基、C₄或C₅或C₆或C₇或C₈氧杂环烷基、吗啉基、氮被直链或支链C₁或C₂或C₃或C₄或C₅烷基取代的哌嗪基。

2.权利要求1中所述的式I化合物和/或其可药用盐在制备囊性纤维化跨膜传导调节因子抑制剂类药物中的用途。

3.权利要求1中所述的式I化合物和/或其可药用盐在制备预防和/或治疗下列疾病的药物中的用途：囊性纤维化、异常增加的肠分泌、分泌性腹泻、多囊肾脏疾病、慢性阻塞性肺病、慢性支气管炎、黏多糖症以及先天性双侧输精管缺失(CBAVA)导致的男性不育症。

4.权利要求3中所述的用途，所述的式I化合物和/或其可药用盐在制备预防和/或治疗囊性纤维化的药物中的用途。

5.药物，其包含有效量的权利要求1中所述的式I化合物和/或其可药用盐、生理学耐受的赋形剂和载体。