CN108913690B

CN108913690B - Pd-1特异性干扰序列、质粒、减毒沙门氏菌及在抗肿瘤的应用

Info

Publication number: CN108913690B
Application number: CN201810758334.3A
Authority: CN
Inventors: 冯志伟; 赵铁锁; 贾慧婕; 钟加滕; 郭胜; 徐德启; 魏甜
Original assignee: Xinxiang Medical University
Current assignee: Xinxiang Medical University
Priority date: 2018-07-11
Filing date: 2018-07-11
Publication date: 2020-01-14
Anticipated expiration: 2038-07-11
Also published as: CN108913690A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种PD‑1特异性干扰序列、质粒、减毒沙门氏菌及在抗肿瘤的应用。所述PD‑1特异性干扰序列为序列1、序列2或者序列3；其中序列1的正义链如SEQ ID NO.1所示，反义链如SEQ ID NO.2所示，序列2的正义链如SEQ ID NO.3所示，反义链如SEQ ID NO.4所示，序列3的正义链如SEQ ID NO.5所示，反义链如SEQ ID NO.6所示。所述PD‑1特异性干扰质粒是将PD‑1特异性干扰序列连接入pGCSilencer neo2.0‑U6质粒后制得的。利用构建的减毒沙门氏菌运载PD‑1特异性干扰质粒来治疗肿瘤，将为临床上肿瘤的治疗提供新的策略及制剂，并产生极大市场经济效益。

Description

PD-1特异性干扰序列、质粒、减毒沙门氏菌及在抗肿瘤的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种PD-1特异性干扰序列、质粒、减毒沙门氏菌及在抗肿瘤的应用。

背景技术

据《中国肿瘤登记年报》报告显示，每年新发病例为312万人，死亡近200万，过去30年中国癌症死亡率增加80％，成为中国城市居民的第一位死因和农村居民的第二位死因。美国2014年的统计显示，世界范围内男性发病位居前两位的分别是前列腺癌和肺癌，女性发病位居前两位的分别是乳腺癌和肺癌。而随着现代环境的变化，特别是雾霾的增加，肺癌的发病率呈现明显的上升趋势。癌症不仅成为危害中国居民健康最重要的疾病之一，其带来的经济负担和对社会发展的不良影响日益突显。我国现每年用于癌症治疗的医疗费用多达数千亿元，且呈现逐年上升趋势。然而，即使花费了大量的财力，中晚期的肿瘤病人依然很难治愈。

PD-1/PD-L在肿瘤免疫检查点治疗肿瘤方面取得了重大的进展，1992年，陈列平提出了肿瘤微环境中存在“免疫逃逸关键分子”的假设。PD-1(programmed death 1)程序性死亡受体1，是一种重要的免疫抑制分子。PD-1主要在激活的T细胞和B细胞中表达，肿瘤细胞会高表达PD-1的配体：PD-L1和PD-L2，受体和配体结合时导致对免疫细胞激活的抑制。肿瘤微环境会诱导浸润的T细胞高表达PD-1分子，导致肿瘤微环境中PD-1通路持续激活，T细胞功能被抑制，无法杀伤肿瘤细胞。抗人PD-1单克隆抗体可以阻断这一通路，恢复T细胞的功能，使这些细胞能够继续杀伤肿瘤细胞。1999年至2002年间，他发明了用抗体封闭PD-1/PD-L1结合来增强免疫反应，并在动物实验证明了该抗体能够成功的治疗肿瘤。这些发现为目前抗肿瘤免疫逃逸提供了新的治疗方法，从而奠定了单克隆抗体治疗肿瘤的理论基础。基于这个原理设计的用于阻断PD-1和PD-L1结合的抗体治疗(简称抗PD-1治疗)已经在成千上万的癌症病人身上使用，并证实在十余种晚期癌症，包括肺癌、肾癌、黑色素瘤、头颈癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、脑胶质瘤、结肠癌、何杰金氏淋巴瘤等有显著疗效，PD-1治疗是目前最有效的免疫治疗方法。

目前，抑制PD-1通路已经成为了肿瘤免疫治疗中一个非常重要的免疫检查点。应用单克隆抗体抑制PD-1通路能够有效的治疗包括黑色素瘤在内的多种肿瘤，但众所周知，信号通路的抑制除了应用单克隆抗体外，也可以直接干扰其基因的表达。RNAi已成为遗传学领域和基因治疗学领域中的重要核心课题。其方法是通过长度为21-25nt的双链小干扰RNA以碱基互补配对方式，特异地降解靶目标RNA(mRNA)，从而消除该靶标RNA的功能，阻断其调控作用或阻断其对应蛋白的合成。RNA干扰现象的发现，极大激发了核酸生物制药技术的研究热度。但是，目前尚未发现可以抑制PD-1通路的小干扰RNA序列。

发明内容

本发明提供的一种PD-1特异性干扰序列、质粒、减毒沙门氏菌及在抗肿瘤的应用，开发了一种可以抑制PD-1通路的小干扰RNA序列。

本发明提供了一种PD-1特异性干扰序列，所述PD-1特异性干扰序列为序列1、序列2或者序列3；其中序列1的正义链如SEQ ID NO.1所示，反义链如SEQ ID NO.2所示，序列2的正义链如SEQ ID NO.3所示，反义链如SEQ ID NO.4所示，序列3的正义链如SEQ ID NO.5所示，反义链如SEQ ID NO.6所示。

优选的，在合成PD-1特异性干扰序列之前先设计合成siRNA链，设计原则如下：

(1)siRNA链在PD-1基因启动子100个碱基后选择；

(2)在PD-1基因上选出的5’-AA(N 19)TT-3’的siRNA链，作为siRNA正义链；siRNA反义链序列为其正义链的互补序列；

(3)如果找不出5’-AA(N 19)TT-3’，则用5’-AA(N 21)-3’补足；

(4)如果找不出5’-AA(N 21)-3’，则用5’-NA(N 21)-3’补足；(1)-(3)中N是任何碱基均可，N 19表示有19个碱基、N 21表示有21个碱基；

(5)在所选定的siRNA链中，其GC比在35-55％；

(6)如果找不出满足(1)-(5)要求的siRNA链，则将GC比放宽至30-70％，直至选出满足(1)-(5)要求的siRNA链；

选好siRNA链后，在每个siRNA链两端分别加入BamHⅠ及HindⅢ序列，然后再合成PD-1特异性干扰序列。

本发明还提供了一种携带权利要求1所述的PD-1特异性干扰序列的PD-1特异性干扰质粒，所述PD-1特异性干扰质粒是将PD-1特异性干扰序列连接入pGCSilencer neo2.0-U6质粒后制得的。

优选的，上述携带权利要求1所述的PD-1特异性干扰序列的PD-1特异性干扰质粒中，所述PD-1特异性干扰质粒是由以下方法制备得到的：

S1，合成PD-1特异性干扰序列：

所述PD-1特异性干扰序列为序列1、序列2或者序列3；其中序列1的正义链如SEQID NO.1所示，反义链如SEQ ID NO.2所示，序列2的正义链如SEQ ID NO.3所示，反义链如SEQ ID NO.4所示，序列3的正义链如SEQ ID NO.5所示，反义链如SEQ ID NO.6所示；

S2，制备PD-1特异性干扰质粒；

S2步骤以序列1为例说明PD-1特异性干扰质粒的制备方法，

S21，配制正义链稀释液和反义链稀释液；

S22，正义链稀释液和反义链稀释液退火，制备PD1-siRNA双链；

S23，质粒载体线性化及构建PD-1特异性干扰质粒：

将pGCSilencer neo2.0-U6质粒用Bam H I和Hand III双酶切后，琼脂糖凝胶回收线性化质粒DNA片段，将S22所得PD1-siRNA-1双链连接到线性化质粒DNA片段上得到PD-1特异性干扰质粒pH1Si-PD-1；

利用序列2和序列3制备PD-1特异性干扰质粒的方法与利用序列1制备PD-1特异性干扰质粒的方法相同，区别在于序列1、序列2和序列3的正义链和反义链核苷酸序列不同。

优选的，本发明还提供了一种所述的运载PD-1特异性干扰质粒的减毒沙门氏菌。

优选的，本发明还提供了一种所述的PD-1特异性干扰序列在抗黑色素瘤中的应用。

优选的，本发明还提供了一种所述的PD-1特异性干扰质粒在抗黑色素瘤中的应用。

优选的，本发明还提供了一种所述的减毒沙门氏菌在抗黑色素瘤中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的PD-1特异性干扰序列、质粒、减毒沙门氏菌及在抗肿瘤的应用，具有以下有益效果：

我们利用RNAi技术从基因表达源头上进行阻断PD-1/PD-L1通路，发展siRNA来克服背景技术中提出的问题。沙门氏菌做为PD-1特异性干扰序列运载具有如下优点：

(1)沙门菌具有在肿瘤组织中聚集的特性：与正常组织相比较，在瘤组织内可高出5000到10000倍；

(2)沙门菌的细胞内侵袭特性使其可在巨噬细胞内存活：这与其在血液和体液内的转移和运输稳定性和对实体肿瘤的靶向性密切相关；

(3)沙门菌为兼性厌氧菌使其即可在高度缺氧的较大实体肿瘤内生长：又可在有氧的较小的转移瘤内存活；

因此，利用构建的减毒沙门氏菌运载PD-1siRNA来治疗肿瘤，将为临床上肿瘤的治疗提供新的策略及制剂，并产生极大市场经济效益。

附图说明

图1是Western blot检测PD-1的表达24h及48h的结果图；

图1中左侧上下两个图为24h细胞蛋白的鉴定结果，右侧上下两个图为48h细胞蛋白的鉴定结果，内参为Tubulin，1-1、1-2泳道为pH1Si-PD-1验证结果，2-1、2-2泳道为pH2Si-PD-1验证结果，3-1、3-2泳道为pH3Si-PD-1验证结果，Control为对照组结果；

图2是小鼠动物实验各组肿瘤组织照片；

图2中左侧图为PBS组、中间图为Scramble组、右侧图为PD-1-siRNA组；

图3是小鼠动物实验各组对CD8分子的表达的western blot检测图；

图4是小鼠动物实验各组对PD-1分子的表达的western blot检测图；

图5是小鼠动物实验各组对Cyclin D1分子的表达的western blot检测图；

图6是小鼠动物实验各组脾细胞中CD⁸⁺及CD⁴⁺T的细胞比率；

图7是小鼠动物实验各组脾脏中NK细胞比率；

图6和图7的左侧图为PBS组，中间图为Scramble组，右侧图为PD-1siRNA组。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。

本发明提供的一种PD-1特异性干扰序列，所述PD-1特异性干扰序列为序列1、序列2或者序列3；其中序列1的正义链如SEQ ID NO.1所示，反义链如SEQ ID NO.2所示，序列2的正义链如SEQ ID NO.3所示，反义链如SEQ ID NO.4所示，序列3的正义链如SEQ ID NO.5所示，反义链如SEQ ID NO.6所示；所述PD-1特异性干扰序列能够抗肿瘤，尤其能够抗黑色素瘤。

我们从NCBI中查找到PD-1基因序列，在合成PD-1特异性干扰序列之前先设计合成siRNA链，设计原则如下：

(1)siRNA链在PD-1基因启动子100个碱基后选择；

(2)在PD-1基因上选出的5’-AA(N 19)TT-3’的siRNA链，作为siRNA正义链；siRNA正义链序列与选出的序列相同，siRNA反义链序列为其正义链的互补序列。

(3)如果找不出5’-AA(N 19)TT-3’，则用5’-AA(N 21)-3’补足；

(5)在所选定的siRNA链中，其GC比在35-55％；

(6)如果找不出满足(1)-(5)要求的siRNA链，则将GC比放宽至30-70％，直至选出满足(1)-(4)要求的siRNA链；

需要说明的是，在本发明实施例中，为了提高效率，我们至少选择三个满足(1)-(5)要求，或者满足(1)-(4)及(6)要求的siRNA链，分别作为不同的siRNA正义链，进而合成相应的反义链。

基于同一种发明构思，本发明提供的一种携带所述的PD-1特异性干扰序列的PD-1特异性干扰质粒，所述PD-1特异性干扰质粒是将PD-1特异性干扰序列连接入pGCSilencerneo2.0-U6质粒后制得的，具体制备方法如下：

S1，合成PD-1特异性干扰序列：

本发明具体实施方式所合成的PD-1特异性干扰序列如下：

序列1：

正义链：

5’-GATCCGGGTTTGAGCCAACCCGTCCAGTTCAAGAGACTGGACGGGTTGGCTCAAACCTTTTTTGGAAA-3’，如SEQ ID NO.1所示；

反义链:

5’-AGCTTTTCCAAAAAAGGTTTGAGCCAACCCGTCCAGTCTCTTGAACTGGACGGGTTGGCTCAAACCCG-3’，如SEQ ID NO.2所示；

序列2：

正义链：

5’-GATCCGGCCGGTTTCAAGGCATGGTCATTCAAGAGATGACCATGCCTTGAAACCGGCTTTTTTGGAAA-3’，如SEQ ID NO.3所示；

反义链:

5’-AGCTTTTCCAAAAAAGCCGGTTTCAAGGCATGGTCATCTCTTGAATGACCATGCCTTGAAACCGGCCG-3’，如SEQ ID NO.4所示；

序列3：

正义链：

5’-GATCCGGACATGAGGATGGACATTGTTTTCAAGAGAAACAATGTCCATCCTCATGTCTTTTTTGGAAA-3’，如SEQ ID NO.5所示；

反义链:

5’-AGCTTTTCCAAAAAAGACATGAGGATGGACATTGTTTCTCTTGAAAACAATGTCCATCCTCATGTCCG-3’，如SEQ ID NO.6所示；

S2，制备PD-1特异性干扰质粒

S2步骤以序列1为例说明PD-1特异性干扰质粒的制备方法。

S21，配制正义链稀释液和反义链稀释液：

将S1中合成的siRNA(序列1)的正义链和反义链分别溶解后，且分别稀释至100μM，得到2个寡核苷酸溶液，之后将2个寡核苷酸溶液分别稀释至终浓度为1μg/μl，分别得到正义链稀释液和反义链稀释液。

S22，正义链稀释液和反义链稀释液退火，制备PD1-siRNA双链：

1)反应体系：1×退火缓冲液23μl，正义链稀释液1μl，反义链稀释液1μl；

2)反应条件：在90℃加热3min后，37℃孵化1h，最终够得到1个PD1-siRNA双链，命名为PD1-siRNA-1，-20℃保存；

S23，质粒载体线性化及构建PD-1特异性干扰质粒：

将pGCSilencer neo2.0-U6质粒(上海吉凯基因化学有限公司)用Bam H I和HandIII双酶切后，琼脂糖凝胶回收线性化质粒DNA片段(即电泳中的大片段)，将S22所得PD1-siRNA-1双链连接到线性化质粒DNA片段上得到PD-1特异性干扰质粒pH1Si-PD-1。

1)双酶切体系如下：

37℃孵育30min，得到线性化质粒DNA片段，进行琼脂糖电泳。

2)使用DNA胶回收试剂盒回收线性化质粒DNA片段(电泳中较大的一个片段)；

3)将S22所得PD1-siRNA-1双链连接到线性化质粒DNA片段上得到PD-1特异性干扰质粒pH1Si-PD-1。

本步骤依据购自Takara的DNA连接酶的说明书进行连接反应，设计反应体系如下：

在温度4℃条件下过夜(连接反应时间12h以上)进行连接，得到的连接产物为PD-1特异性pH1Si-PD-1。

S24，将上述PD-1特异性干扰质粒转化入大肠杆菌中保存备用，具体步骤如下：

取S23的连接产物5μl，加入到100μl大肠杆菌JM109感受态细胞中，轻轻弹击管底，混匀，放置冰上30min；加入1ml无抗性LB培养基，220rpm，培养1h后，8000rpm离心1min，弃上清，剩余大约100μl重悬菌体后，涂至含有100μg/ml氨苄的LB平板上，37℃孵育14-16h，获得单克隆，备用。

S25，阳性克隆的筛选与鉴定：

1)分别挑取6个单克隆，接种于含有100μg/ml的Amp 10ml LB液体培养基中；

2)37℃摇床150rpm，培养过夜；

3)调至摇床转数为220rpm，至测定OD₆₀₀值为0.6-0.8之间，保留菌种。

4)继续培养大约3h后，离心，收集细菌，提取质粒，进行酶切鉴定。酶切体系如下：

37℃孵育30min，进行琼脂糖电泳鉴定，证实siPD-1序列已经与载体连接到了一起。

S26，PD-1特异性干扰质粒干扰功能验证

培养含有PD-1特异性干扰质粒的大肠杆菌JM-109感受态细胞(即鉴定为阳性的单克隆)，待OD₆₀₀值达到1.5时提取质粒，并测定浓度。铺制T淋巴细胞板，按照lipo3000试剂盒说明书将PD-1特异性干扰质粒(PD1-siRNA-1)转染铺制的T细胞，24h后收集细胞，提取蛋白，应用western blot检测PD-1蛋白的表达，结果显示PD-1特异性干扰质粒PD1-siRNA-1对T细胞有一定的干扰效果。

利用序列2和序列3制备PD-1特异性干扰质粒的方法与利用序列1制备PD-1特异性干扰质粒的方法相同，区别在于序列1、序列2和序列3的正义链和反义链核苷酸序列不同。我们参考PD-1特异性干扰质粒pH1Si-PD-1的制备方法，分别以S1中涉及的序列2和序列3的正、反义链为原料，分别合成了相应的PD-1特异性干扰质粒pH2Si-PD-1(由S1中序列2合成PD1-siRNA-2，进而制成pH2Si-PD-1)、pH3Si-PD-1(由S1中序列3合成PD1-siRNA-3，进而制成pH3Si-PD-1)；经S26的干扰功能验证，pH2Si-PD-1、pH3Si-PD-1也对T细胞有一定的干扰效果，但pH1Si-PD-1效果最佳。

基于同一种发明构思，本发明还提供了一种运载所述PD-1特异性干扰质粒的减毒沙门氏菌，该菌体的制备方法如下：

A1，制备用于电转化的phoP/phoQ减毒沙门氏菌(该phoP/phoQ减毒沙门氏菌由吉林大学动物中心提供)感受态细胞；感受态细胞的制备方法参照常规分子生物学实验进行，本申请不予赘述。

A2，通过电转化的方式将述PD-1特异性干扰质粒转化入phoP/phoQ减毒沙门氏菌感受态细胞，即获得运载PD-1特异性干扰质粒的减毒沙门氏菌。

为了进一步验证本发明提供的PD-1特异性干扰质粒和运载该质粒的减毒沙门氏菌的效果，我们进行了如下试验：

1、细胞水平干扰验证

分别验证pH1Si-PD-1、pH2Si-PD-1、pH3Si-PD-1对T淋巴细胞EL4细胞的影响：将状态最佳的EL4细胞按照3×10⁵/孔的密度铺制6孔板，培养14h-16h之后分别加入pH1Si-PD-1、pH2Si-PD-1、pH3Si-PD-1，以去离子水作为对照组，分别提取24h及48h的细胞蛋白。应用Western blot检测PD-1的表达。图1是Western blot检测PD-1的表达24h及48h的结果图；其中，图1中左侧上下两个图为24h细胞蛋白的鉴定结果，右侧上下两个图为48h细胞蛋白的鉴定结果，内参为Tubulin，1-1、1-2泳道为pH1Si-PD-1验证结果，2-1、2-2泳道为pH2Si-PD-1验证结果，3-1、3-2泳道为pH3Si-PD-1验证结果，Control为对照组结果，由图1的结果可以看出，本发明的PD-1特异性pH1Si-PD-1、pH2Si-PD-1、pH3Si-PD-1均能有效抑制T细胞表面的PD-1分子的表达，且pH1Si-PD-1的抑制效果最明显。

2、小鼠动物实验

我们选择干扰序列1的正义链：

5’-GATCCGGGTTTGAGCCAACCCGTCCAGTTCAAGAGACTGGACGGGTTGGCTCAAACCTTTTTTGGAAA-3’

反义链:

5’-AGCTTTTCCAAAAAAGGTTTGAGCCAACCCGTCCAGTCTCTTGAACTGGACGGGTTGGCTCAAACCCG-3’

进行动物实验。

2.1、构建小鼠黑色素瘤模型

将黑色素瘤细胞B16消化、重悬后计数，并计算活细胞的比率，低于98％视为细胞消化失败，不能使用。将符合条件的细胞用无血清培养基制成细胞悬液，浓度为1×10⁶个细胞/ml，置于冰上，于老鼠右侧背下部靠近尾根部约0.7cm处皮下注射0.2ml(2×10⁵个细胞)。接种部位，每个小鼠深浅应一致，且注射肿瘤细胞后应观察到注射局部有直径6-8mm的皮丘，若无皮丘视为接种失败。

2.2、实验过程

小鼠接种B16细胞后7天，随机将小鼠分为三组：PBS组、Scramble组、PD-1-siRNA组。PBS组：通过尾静脉注射PBS(0.1mol/L、pH7.2)，每隔1周注射1次，共注射2次；Scramble组：尾静脉注射浓度5×10⁵个细胞/ml且运载Scramble siRNA的减毒沙门氏菌，每周注射1次，共2次；PD1-siRNA组：尾静脉注射浓度5×10⁵且运载pH1Si-PD-1的减毒沙门氏菌，每周注射1次，共2次。

(1)最后一次注射后14天，分离小鼠的黑色素瘤组织，分别提取组织中的蛋白，通过Western blot方法检测肿瘤组织中PD-1分子的表达。

(2)记录各组小鼠每天的存活数及实验结束点肿瘤大小，观察减毒沙门氏菌运载pH1Si-PD-1对黑色素荷瘤小鼠生存期及肿瘤生长的影响。

(3)不同时间点分离小鼠肿瘤组织、脾脏及血清，应用免疫组化技术检测减毒沙门氏菌运载pH1Si-PD-1对肿瘤组织内CD⁴⁺、CD⁸⁺T细胞的表达；应用FACS检测其对荷瘤小鼠脾脏中CD⁴⁺、CD⁸⁺及NK等各淋巴细胞亚群的影响。

2.3、实验结果

2.3.1、减毒沙门氏菌运载pH1Si-PD-1有效抑制黑色素瘤的生长

最后一次治疗后14天处死小鼠，分离小鼠的肿瘤组织，各组肿瘤组织结果图2是小鼠动物实验各组肿瘤组织照片，图2中左侧图为PBS组、中间图为Scramble组、右侧图为PD-1-siRNA组。由图2可以看出PD-1-siRNA组的肿瘤组织最小，结果显示应用减毒沙门氏菌运载pH1Si-PD-1能够有效黑色素瘤的生长。

2.3.2、减毒沙门氏菌运载pH1Si-PD-1有效增加了肿瘤组织中CD8蛋白的表达

最后一次治疗后14天处死小鼠，分离小鼠的肿瘤组织，提取肿瘤组织蛋白，进行western blot检测，图3是小鼠动物实验各组对CD8分子的表达的western blot检测图，结果显示应用减毒沙门氏菌运载pH1Si-PD-1能够有效增加黑色素肿瘤组织中CD8分子的表达，揭示增加了CD⁸⁺T细胞的浸润。

2.3.3、减毒沙门氏菌运载pH1Si-PD-1有效抑制了肿瘤组织中PD-1蛋白的表达

最后一次治疗后14天处死小鼠，分离小鼠的肿瘤组织，提取肿瘤组织蛋白，进行western blot检测，图4是小鼠动物实验各组对PD-1分子的表达的western blot检测图，结果显示应用减毒沙门氏菌运载pH1Si-PD-1能够有效抑制黑色素肿瘤组织中PD-1分子的表达，提示增强了T淋巴细胞的抗肿瘤功能。

2.3.4、减毒沙门氏菌运载pH1Si-PD-1有效抑制了肿瘤组织中Cyclin D1蛋白的表达

最后一次治疗后14天处死小鼠，分离小鼠的肿瘤组织，提取肿瘤组织蛋白，进行western blot检测，图5是小鼠动物实验各组对Cyclin D1分子的表达的western blot检测图，结果显示应用减毒沙门氏菌运载pH1Si-PD-1能够有效抑制黑色素肿瘤组织中CyclinD1分子的表达，提示抑制了肿瘤细胞的增殖。

2.3.5、减毒沙门氏菌运载pH1Si-PD-1显著增加了脾脏中CD⁸⁺及CD⁴⁺T细胞的比率

最后一次治疗后14天处死小鼠，分离小鼠的脾脏组织，分离脾细胞，检测脾细胞中CD⁸⁺及CD⁴⁺T细胞的表达。图6是小鼠动物实验各组脾细胞中CD⁸⁺及CD⁴⁺T的细胞比率，其中，图6左侧图为PBS组，中间图为Scramble组，右侧图为PD-1siRNA组。结果显示应用减毒沙门氏菌运载pH1Si-PD-1能够有效增加脾脏中CD⁸⁺及CD⁴⁺T细胞的比率。

2.3.6、减毒沙门氏菌运载pH1Si-PD-1显著增加了脾脏中NK细胞的比率

最后一次治疗后14天处死小鼠，分离小鼠的脾脏组织，分离脾细胞，检测脾细胞中NK细胞的表达。图7是小鼠动物实验各组脾脏中NK细胞比率，图7左侧图为PBS组，中间图为Scramble组，右侧图为PD-1siRNA组。结果显示应用减毒沙门氏菌运载pH1Si-PD-1能够有效增加脾脏中NK细胞的比率。

通过上述一些列试验证明，我们自主设计的PD-1的siRNA干扰序列(如SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.6所示)能够有效地抑制T细胞PD-1的表达，具有明显的抑制PD-1表达的作用。

我们将siRNA干扰序列制成PD-1特异性干扰质粒pH1Si-PD-1、pH2Si-PD-1、pH3Si-PD-1，我们利用电转的方法将该重组质粒pH1Si-PD-1转入了减毒沙门氏菌phoP/phoQ突变株中。将运载pH1Si-PD-1的减毒沙门氏菌phoP/phoQ菌接种到100ml的LB培养基(Amp，终浓度为100μg/ml)中，37℃培养过夜(12-16h)。次日早上以1:100再次接种到100ml的LB培养基中，待OD₆₀₀达0.6时，立即放在冰上。此时沙门氏菌的浓度为1-1.2×10⁹CFU/ml。利用倍比稀释法(用0.1mol/L、pH7.2的PBS)将每组的沙门氏菌稀释到2×10⁶CFU/ml，放置于冰上。进行动物实验，动物分为三组：PBS组、scramble组及PD-1siRNA组。小鼠接种肿瘤细胞后7天，scramble组及PD-1siRNA组每只小鼠注射2×10⁵CFU的菌量，PBS组注射100μl PBS(0.1mol/L、pH7.2)。7天后再次加强注射一次。记录小鼠的生存期，并分别在最后一次注射后14天分离小鼠的肿瘤组织、血清。检测小鼠的肿瘤大小，肿瘤组织中PD-1的表达，CD4及CD8分子的表达以及与肿瘤细胞凋亡及转移相关蛋白的表达；血清中细胞银子的表达。结果显示，减毒沙门氏菌运载PD-1siRNA能够显著延长小鼠的生存期，降低肿瘤组织中PD-1的表达，增加CD4及CD8分子的表达，增加了凋亡相关蛋白caspase3的表达，降低了转移相关蛋白MMP2的表达，显著提高了小鼠血清中IFNγ及TNFα的含量。

我们的结果显示应用减毒沙门氏菌运载pH1Si-PD-1能够有效地治疗小鼠乳腺癌，并且在黑色素瘤上也取得了不错的疗效。我们将陆续推出针对肺癌、胃癌、肝癌、黑色素瘤等(PD-1抗体适应的全部靶目标)一系列产品。我们可以看到，目前国内外针对PD-1/PD-L1通路治疗肿瘤的研究开发项目很多，但是暂时没有一项是从转录水平上进行干预及治疗，这是我们抢先进入的最佳时期。

需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<120> PD-1特异性干扰序列、质粒、减毒沙门氏菌及在抗肿瘤的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gatccgggtt tgagccaacc cgtccagttc aagagactgg acgggttggc tcaaaccttt 60

tttggaaa 68

<210> 2

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agcttttcca aaaaaggttt gagccaaccc gtccagtctc ttgaactgga cgggttggct 60

caaacccg 68

<210> 3

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatccggccg gtttcaaggc atggtcattc aagagatgac catgccttga aaccggcttt 60

tttggaaa 68

<210> 4

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agcttttcca aaaaagccgg tttcaaggca tggtcatctc ttgaatgacc atgccttgaa 60

accggccg 68

<210> 5

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gatccggaca tgaggatgga cattgttttc aagagaaaca atgtccatcc tcatgtcttt 60

tttggaaa 68

<210> 6

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agcttttcca aaaaagacat gaggatggac attgtttctc ttgaaaacaa tgtccatcct 60

catgtccg 68

Claims

1.一种PD-1特异性干扰序列，其特征在于，所述PD-1特异性干扰序列为序列1、序列2或者序列3；其中序列1的正义链如SEQ ID NO.1所示，反义链如SEQ ID NO.2所示，序列2的正义链如SEQ ID NO.3所示，反义链如SEQ ID NO.4所示，序列3的正义链如SEQ ID NO.5所示，反义链如SEQ ID NO.6所示；所述的PD-1特异性干扰序列能够用于制备抗黑色素瘤药物。

2.根据权利要求1所述的PD-1特异性干扰序列，其特征在于，在合成PD-1特异性干扰序列之前先设计合成siRNA链，设计原则如下：

(1)siRNA链在PD-1基因启动子100个碱基后选择；

(3)如果找不出5’-AA(N 19)TT-3’，则用5’-AA(N 21)-3’补足；

(5)在所选定的siRNA链中，其GC比在35-55％；

选好siRNA链后，在每个siRNA链两端分别加入BamH Ⅰ及HindⅢ序列，然后再合成PD-1特异性干扰序列。

3.一种携带权利要求1所述的PD-1特异性干扰序列的PD-1特异性干扰质粒，其特征在于，所述PD-1特异性干扰质粒是将PD-1特异性干扰序列连接入pGCSilencer neo2.0-U6质粒后制得的。

4.根据权利要求3所述的PD-1特异性干扰质粒，其特征在于，所述PD-1特异性干扰质粒是由以下方法制备得到的：

S1，合成PD-1特异性干扰序列：

所述PD-1特异性干扰序列为序列1、序列2或者序列3；其中序列1的正义链如SEQ IDNO.1所示，反义链如SEQ ID NO.2所示，序列2的正义链如SEQ ID NO.3所示，反义链如SEQID NO.4所示，序列3的正义链如SEQ ID NO.5所示，反义链如SEQ ID NO.6所示；

S2，制备PD-1特异性干扰质粒：

S2步骤以序列1为例说明PD-1特异性干扰质粒的制备方法，

S21，配制正义链稀释液和反义链稀释液；

S22，正义链稀释液和反义链稀释液退火，制备PD1-siRNA双链；

S23，质粒载体线性化及构建PD-1特异性干扰质粒：

将pGCSilencer neo2.0-U6质粒用Bam H I和Hand III双酶切后，琼脂糖凝胶回收线性化质粒DNA片段，将S22所得PD1-siRNA双链连接到线性化质粒DNA片段上得到PD-1特异性干扰质粒pH1Si-PD-1；

5.一种减毒沙门氏菌，该菌运载了权利要求3所述的PD-1特异性干扰质粒。

6.根据权利要求3所述的PD-1特异性干扰质粒在制备抗黑色素瘤药物中的应用。

7.根据权利要求5所述的减毒沙门氏菌在制备抗黑色素瘤药物中的应用。