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CN108893459A - 一种MOFs固载酶，其制备方法及应用 - Google Patents

一种MOFs固载酶，其制备方法及应用 Download PDF

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CN108893459A
CN108893459A CN201810578402.8A CN201810578402A CN108893459A CN 108893459 A CN108893459 A CN 108893459A CN 201810578402 A CN201810578402 A CN 201810578402A CN 108893459 A CN108893459 A CN 108893459A
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hkust
mofs
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毕淑娴
刘万毅
刘欢欢
詹海娟
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Ningxia University
Original Assignee
Ningxia University
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Abstract

本发明提出了一种MOFs固载酶，该固载酶的制备方法以及其在降解含酚废水中的应用。所述固载酶通过将海藻酸盐、磁性颗粒与MOFs结合形成复合载体并固定辣根过氧化物酶得到。将该固载酶用于降解苯酚，对苯酚的去除率可达到95％以上。该方法还可以应用于固定化酶对其它多种有机废水的处理。

Description

一种MOFs固载酶，其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及有机化学领域，具体涉及一种MOFs固载酶，该固载酶的制备 方法，以及该固载酶在降解含酚废水中的应用。
背景技术
金属有机骨架材料(Metal-Organic Frameworks，简称MOFs)又被称为金 属-有机配位聚合物，是一种以金属离子为连接点，有机配体为支撑，通过金属 离子和有机配体之间的配位键所形成的具有二维或三维晶体结构。通常通过芳 香类的二元或三元酸与锌、酮、铬、铝、锆及其它金属离子制备得到。MOFs 具有高多孔性、比表面积大(高达几千m2g-1)、形态结构及孔径大小可调的 特点，可进行功能化修饰或者通过引入含功能基团的有机配体使材料具备某种 特定的功能基团。金属有机框架化合物HKUST-1是由铜离子和多齿型有机配体 均苯三酸通过配位反应制备得到的，具有面心立方晶体结构的配位聚合物。包 含轮桨式次级结构单元[Cu2(O2CR)4]，R为芳环。化学式为Cu3(C9H3O6)2或 Cu3(TMA)2，TMA-H3为均苯三酸。由于HKUST-1具有大的比表面积和高孔隙 率等性质，成为MOFs家族中的标志性化合物，并在合成及应用方面得到广泛 的研究。然而传统MOFs的小孔径阻碍了大分子的传递与扩散，大分子无法到 达MOFs孔道内部的活性位点，导致MOFs在许多涉及到大分子的应用中受到 局限，因此需要研究出新的复合材料，进而进行后功能化修饰，使其成为固载 酶的优良载体。
含酚废水的处理方法是随着对含酚废水危害性的认识和水处理技术的不断 发展而逐渐发展起来的。目前已有很多关于含酚废水的处理方法，而且随着技 术的不断发展，各种处理方法间还进行着相互的渗透组合，以达到更好的治理 目的。MacDonald等人利用活性炭对含酚废水进行了吸附动力学与热力学研究， 最终得出吸附模型。吴慧英等人以活性炭为吸附剂和吸波载体，对微波再生法 和直接微波法去除水中的苯酚进行了去除效果及其效能的对比试验研究。冯臻 在微波场中用溴化十六烷基三甲基按对膨润土进行有机化，吸附污染水中的苯 酚，研究了吸附机理，去除率可达80％。然而，传统的吸附材料吸附效率比较 低，材料后处理工艺复杂，回收困难，重复使用率低，并且不具有选择性。目 前，聚合物树脂的合成越来越受到人们的重视。现在己经合成了很多种树脂， 利用树脂中含有的官能基团与酚类质之间的相互作用对含酚废水进行吸附处 理。人合成树脂虽然能有效地吸附水溶液中的酚类化合物，但再生问题不解决， 重复利用率低，选择性不明显。膜分离法是利用膜的选择通过性来除去酚类， 常用的膜是醋酸纤维膜。而萃取法主要是利用煤油、乙酞苯等萃取剂来分离苯 酚，主要用于高浓度苯酚废水的预处理和酚类物质的回收。化学方法有氧化法 (包括湿式催化氧化、光化学氧化.超临界水氧化等)和电催化等。生化方法包括 厌氧好氧处理法、活性污泥法等。曾有学者对这些处理方法的使用范围及优缺点进行了详细的阐述，总体来说，这些方法效果良好，甚至有些方法是实际操 作中切实可行，但是各个方法存在有一些缺陷，如成本高、技术要求复杂、处 理不彻底等。因而，寻找一种高效、快速、廉价、无产生毒副产物的含酚废水 处理方法十分必要。在20世纪80年代初，Klibanov等人尝试首次利用过氧化 酶来催化氧化除去废水中的酚类及胺类化合物，考察了酶催化反应条件对去除 效率的影响，发现对于某些酚类物质的去除效率可达99％，而且反应条件温和 易操作。其后利用酶的生物催化效应来处理含酚类或胺类的废水受到了人们越 来越多的关注。
虽然游离酶处理含酚废水的效果非常好，但是将其用于工业化规模的处理 工艺仍具有一定的局限性。目前研究的重点逐渐由游离酶处理废水转移到固定 化酶处理废水。需要解决的主要问题是如何改进固定化方法，使酶与载体能够 更好地结合，并且在传统方法的基础上引入新的改性剂，使得载体与酶能更好 结合的同时还依然能具有较高的活性。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种MOFs固载酶。
本发明的第二目的在于提供上述固载酶的制备方法。
本发明的第三目的在于提供上述固载酶在降解含酚废水中的应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明涉及一种MOFs固载酶，其通过将海藻酸盐、磁性颗粒与MOFs结 合形成复合载体并固定辣根过氧化物酶得到。
优选地，所述MOFs为HKUST-1。
优选地，所述磁性颗粒为Fe3O4，粒径为纳米级。
本发明还涉及所述固载酶的制备方法，包括：
步骤一、将海藻酸盐溶解于含有磁性颗粒的磁流体溶液中，得到磁性海藻 酸盐溶液；
步骤二、向所述磁性海藻酸盐溶液中加入铜盐和均苯三甲酸，反应得到磁 性Alg-HKUST-1复合材料；
步骤三、加入戊二醛，使所述磁性Alg-HKUST-1复合材料交联，得到复合 载体；
步骤四、向所述复合载体中加入辣根过氧化物酶，振荡后得到所述固载酶。
优选地，所述海藻酸盐与所述磁流体溶液中的磁性颗粒的质量比为1: (1～5)，优选1:2。
优选地，所述磁性海藻酸盐、铜盐和均苯三甲酸的质量比为1:(10～20): (10～20)，优选1:15:15。
优选地，所述戊二醛与所述磁性Alg-HKUST-1复合材料的质量比为(1～5)： 1，优选3:2。
优选地，所述复合载体与所述辣根过氧化物酶的质量比为(50～200)：3， 优选100:3。
优选地，步骤四中，将所述复合载体分散于磷酸盐缓冲液中，加入辣根过 氧化物酶溶液，冰浴振荡3～5h，离心分离后得到所述固载酶。
本发明还涉及所述固载酶在降解含酚废水中的应用。
优选地，所述含酚废水为含苯酚、邻苯二酚、间苯二酚或2,4-二氯苯酚的 废水。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种MOFs固载酶，其通过将海藻酸盐、磁性颗粒与MOFs 通过自组装技术形成复合载体，然后固定辣根过氧化物酶得到。将该固载酶用 于降解苯酚，对苯酚的去除率可达到95％以上。该方法还可以应用于固定化酶 对其它多种有机废水的处理。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施 例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述 中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付 出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为交联前后的磁性Alg-HKUST-1复合材料的红外光谱图。
图2为交联前后的磁性Alg-HKUST-1复合材料的扫描电镜图，其中：
图2a为交联前的磁性Alg-HKUST-1复合材料的扫描电镜图。
图2b为图2a的局部放大图。
图2c为图2b的局部放大图。
图2d为图2c的局部放大图。
图2e为交联后的磁性Alg-HKUST-1复合材料的扫描电镜图。
图2f为图2e的局部放大图。
图2g为图2f的局部放大图。
图2h为图2g的局部放大图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方 案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不 是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创 造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明涉及一种MOFs固载酶，其通过将海藻酸盐、磁性颗粒与MOFs结 合形成复合载体并固定辣根过氧化物酶得到。
在本发明的一个实施例中，优选海藻酸盐为海藻酸钠，MOFs为HKUST-1。 海藻酸钠(NaAlg)是无毒、生物相容性好、有凝胶特性的天然高分子材料， 可包裹HKUST-1形成凝胶微球。当HKUST-1具备磁性时，通过其制备的固定 化酶易从反应体系中分离和回收，操作简便；并且利用外部磁场可以控制磁性 材料固定化酶的运动方式和方向，替代传统的机械搅拌方式，提高固定化酶的 催化效率。
在本发明的一个实施例中，磁性颗粒为Fe3O4或钕铁硼，粒径为纳米级。
本发明还涉及固载酶的制备方法，包括：
步骤一、将海藻酸盐溶解于含有磁性颗粒的磁流体溶液中，得到磁性海藻 酸盐溶液；
步骤二、向磁性海藻酸盐溶液中加入铜盐和均苯三甲酸，反应得到磁性 Alg-HKUST-1复合材料；
步骤三、加入戊二醛，使磁性Alg-HKUST-1复合材料交联，得到复合载体；
步骤四、向复合载体中加入辣根过氧化物酶，振荡后得到固载酶。
在本发明的一个实施例中，海藻酸盐与磁流体溶液中的磁性颗粒的质量比 为1:(1～5)，优选1:2。
在本发明的一个实施例中，磁性海藻酸盐、铜盐和均苯三甲酸的质量比为 1:(10～20):(10～20)，优选1:15:15。优选用注射器将磁性海藻酸盐溶液加入 到铜盐溶液中，搅拌反应生成磁性凝胶球，然后转入均苯三甲酸的乙醇溶液进 行反应，得到磁性Alg-HKUST-1复合材料。
在本发明的一个实施例中，戊二醛与磁性Alg-HKUST-1复合材料的质量比 为(1～5)：1，优选3:2。交联在机械搅拌下进行，时间为10～15h。交联的作 用是在磁性Alg-HKUST-1复合材料表面连接固定酶的官能团，同时增强固载酶 的稳定性，复合载体的粒径为毫米级。
在本发明的一个实施例中，复合载体与辣根过氧化物酶的质量比为 (50～200)：3，优选100:3。
在本发明的一个实施例中，步骤四中，将复合载体分散于磷酸盐缓冲液中， 加入辣根过氧化物酶溶液，冰浴振荡3～5h，离心分离后得到固载酶。
本发明还涉及固载酶在降解含酚废水中的应用。
在本发明的一个实施例中，含酚废水为含苯酚、邻苯二酚、间苯二酚或2,4- 二氯苯酚的废水。
实施例1
1、制备复合载体
(1)配制溶液
30mg/mL三水合硝酸铜溶液：称取0.45g三水合硝酸铜晶体溶解于15mL 蒸馏水中。
30mg/mL均苯三甲酸乙醇溶液：分别量取5mL DMF，5mL无水乙醇，5 mL蒸馏水于烧杯中混匀，称取0.45g均苯三甲酸溶解于上述溶液中。
Fe3O4磁流体溶液：将5mL 0.2mol/L的FeCl3·6H2O溶液与5mL 0.1mol/L 的FeCl2·4H2O溶液混合均匀后加入到50mL 1％的氨水溶液中，保持通N2， 80℃反应30分钟。收集磁性颗粒，用水洗3次，制得质量分数为2％的磁流体 溶液。
(2)制备磁性Alg-HKUST-1复合材料
称取0.03g海藻酸钠溶解于3mLFe3O4磁流体溶液中，得到磁性海藻酸钠 溶液。用注射器以液滴的形式，将磁性海藻酸钠溶液加入到15mL 30mg/mL 的硝酸铜溶液中，搅拌18h，然后用水和乙醇各洗两遍以除去多余的Cu2+，离 心得到磁性凝胶球。将制得的磁性凝胶球转入15mL 30mg/mL的均苯三甲酸 乙醇溶液中，85℃反应18h，将产物用乙醇和热乙醇各洗两遍，80℃干燥，即 得磁性Alg-HKUST-1复合材料。
(3)制备复合材料交联载体
称取0.3g磁性Alg-HKUST-1复合材料，加入5mL 4％的戊二醛溶液，机 械搅拌12h后静置。洗涤3～5次以除去多余的戊二醛，过滤，自然晾干，即得 复合载体。
图1为磁性Alg-HKUST-1复合材料交联前后的红外光谱(FT-IR)图。其 中a线代表交联前的磁性Alg-HKUST-1复合材料的谱线，b线代表交联后的磁 性Alg-HKUST-1复合材料的谱线。由图可知：3595cm-1处为海藻酸钠的-OH 伸缩振动吸收峰，1615cm-1处为海藻酸钠的-COOH伸缩振动吸收峰，1021cm-1和1093cm-1处为海藻酸钠的-CO伸缩振动吸收峰，说明海藻酸钠成功与MOFs 结合；939cm-1处为Fe-O键的伸缩振动吸收峰，1232cm-1和1374cm-1处为有 机配体均苯三酸中苯环的骨架振动吸收峰，1615cm-1和1737cm-1处为均苯三 酸羧基中C＝O的伸缩振动吸收峰，说明HKUST-1成功生长在Fe3O4表面。上 述特征峰为谱线a和谱线b共有的。特别地，对于谱线b，在1562cm-1处出现 了羟醛缩合C＝O伸展特征吸收峰，说明磁性Alg-HKUST-1复合材料与交联剂 戊二醛交联成功。
图2a-图2d为交联前磁性Alg-HKUST-1复合材料的扫描电镜图；图2e-图 2h为交联后磁性Alg-HKUST-1复合材料的扫描电镜图。由图可知，磁性 Alg-HKUST-1复合材料在宏观上呈圆球状，交联前复合材料表面呈凹凸不平的 形态，并存在形态各异的沟槽；交联后的复合材料表面结构变得疏松，海藻酸 钠的纤维结构清晰可见，复合材料表面有大小不同的孔道出现，更有利于载体 材料与酶的紧密结合。
本发明将磁性海藻酸钠溶液以液滴的形式加入硝酸铜溶液中，搅拌反应形 成金属离子海藻酸钠凝胶，将其与均苯三酸的乙醇溶液反应，得到磁性Alg-HKUST-1复合材料，并用戊二醛进行交联活化得到复合载体。通过上述表 征分析手段，从FT-IR谱图可以看出复合材料具有明显的官能团特征峰，表明 丰富的官能团较好的键合在复合材料表面；从SEM图可知，复合材料作为载体 具有凹凸不平的表面形态和孔道结构，有利于下一步与酶的紧密结合。
2、制备固载酶
(1)溶液配制
0.1mol/L磷酸盐缓冲液：分别称量8.954g磷酸氢二钠固体，3.900g磷酸 二氢钠固体溶于蒸馏水中，在250mL的容量瓶中配制，并放于冰箱中保存， 使用时按相应比例混合并测量pH值。
0.8mol/L苯酚：准确称量3.765g苯酚于烧杯内，加入12.5mL无水乙醇 充分溶解，用玻璃棒引流转移至50mL的棕色容量瓶中，用0.1mol/LpH值为 7.0的磷酸盐缓冲液稀释到标线，于阴暗处保存。
39.4mmol/L4-氨基安替比林：准确称量0.399g 4-氨基安替比林于烧杯内， 加入蒸馏水充分溶解，然后用玻璃棒引流转移至50mL的棕色容量瓶中，稀释 到标线，4℃冰箱可保存一周。
30mmol/L过氧化氢：取30％过氧化氢155μL于50mL棕色容量瓶中， 蒸馏水稀释至标线，4℃冰箱可保存一周。
1mg/mL辣根过氧化物酶溶液：准确称取10mg辣根过氧化物酶溶解于10 mL0.1mol/LpH值为7.0磷酸盐缓冲液中，置于冰箱冻存，使用时稀释至所需 浓度。
(2)固载酶的制备
对磁性Alg-HKUST-1复合材料进行HRP的固定，步骤如下：
(i)称取复合载体0.02g/份于离心管中，使用pH＝7的磷酸盐缓冲液洗涤 载体，离心备用。
(ii)将洗涤过的载体分散于990μL相应pH值的磷酸盐缓冲液中，将离 心管置于冰中冷藏备用。
(iii)在离心管中加入60μL 1mg/mL的游离酶(HRP)液，用密封袋密 封后埋入冰中，固定在水浴恒温振荡器上振荡4h，离心分离后保存在冰箱中， 即得固载酶。
3、固载酶对苯酚降解性能测定
(1)溶液配制
0.1mol/L磷酸盐缓冲液：分别称量8.9535g磷酸氢二钠固体，3.9003g磷 酸二氢钠固体溶于蒸馏水中，在250mL容量瓶中定容，放于冰箱中保存，使 用时按相应比例混合并测量pH值。
0.08mol/L苯酚：准确量取5mL 0.8mol/L苯酚于50mL容量瓶中，用0.1 mol/LpH7.0磷酸盐缓冲液稀释至标刻线，于阴暗处保存。
0.1mol/L过氧化氢：取30％过氧化氢5mL于50mL棕色容量瓶中，蒸馏 水稀释至标线，4℃冰箱可保存一周。
0.25mol/L碳酸氢钠：准确称量2.1g碳酸氢钠于烧杯内，加入蒸馏水充分 溶解，然后用玻璃棒引流转移至100mL的容量瓶中，稀释到标线。
83.4mmol/L铁氰化钾：准确称量0.6865g铁氰化钾于烧杯内，加入0.25 mol/L碳酸氢钠充分溶解后用玻璃棒引流转移至50mL棕色容量瓶中，稀释至 标线，置冰箱内冷藏，可保存一周。
20.8mmol/L4-氨基安替比林：准确称量0.1058g 4-氨基安替比林于烧杯内， 加入0.25mol/L碳酸氢钠充分溶解后用玻璃棒引流转移至25mL棕色容量瓶 中，稀释至标刻线，置冰箱内冷藏，可保存一周。
1mg/mL辣根过氧化物酶溶液：准确称取10mg辣根过氧化物酶溶解于10 mL0.1mol/LpH 7.0磷酸盐缓冲液中，置于冰箱冻存，使用时稀释至所需浓度。
4％硫酸铝钾25mL：称取1.8575g KAl(SO4)2·12H2O去离子水定容至25 mL。
(2)固载酶催化降解苯酚
向20mg固载酶中分别加入10μL 0.08mol/L苯酚和10μL 0.1mol/L过氧 化氢，然后加入0.1mol/LpH 7.0磷酸盐缓冲液使反应体系为1mL，在相应温 度下反应12h。反应结束后向样品管中加入200μL 4％硫酸铝钾，然后以3000 转/分的转速进行15min的离心。取上清液500μL，加入0.1mol/LpH7.0磷酸 盐缓冲液7.5mL，再加入1mL 83.4mmol/L铁氰化钾，1mL20.8mmol/L 4-氨 基安替比林溶液充分混匀后，密塞静置5min，测定510nm处的吸光度值。根 据已测得的苯酚浓度的标准曲线计算上清液的残留苯酚浓度，计算酶样品对苯 酚的去除效率。游离酶和固载酶在不同条件下的苯酚去除效率见表1。
其中，游离酶的用量为取50μL 0.1mg/mL HRP酶溶液。固载酶’和固载酶” 的制备方法与固载酶基本相同，区别在于复合载体制备过程中，固载酶’未采用 戊二醛进行交联，固载酶”是将海藻酸盐溶解于水中得到海藻酸盐溶液，未使 用磁性颗粒。
表1
根据表1可以看出：
(1)游离酶和固载酶对苯酚的降解效率均随温度升高而增加，40℃时达到 最大降解率，随后降解率随温度升高而下降。但当温度较高时，固载酶对苯酚 的降解率明显高于游离酶，说明固载酶可以在较大的温度范围内发挥作用。
(2)游离酶和固载酶对苯酚的降解率均随pH增大而增大，pH＝9时达到 最大降解效率，固载酶的降解效率要高于游离酶的降解效率，且固载酶对苯酚 的降解率受pH的影响较小。
(3)在本发明的苯酚浓度范围内，游离酶和固载酶对苯酚的去除都有一定 的催化效果。在苯酚浓度较低时，游离酶和固载酶对苯酚的降解效率都很高， 随着苯酚初始浓度增加，酶对苯酚的降解效率逐渐降低。
(4)重复使用8次后，游离酶早已失活，而固载酶仍然保持一定的降解能 力。
(4)对于固载酶’和固载酶”，其降解效率均低于固载酶。原因在于如果不 使用戊二醛对磁性Alg-HKUST-1复合材料进行交联，无法对辣根过氧化物酶进 行固定，也就无法发挥固载酶的特性。如果不使用磁性颗粒，也无法实现良好 的回收再利用，同样对固载酶的降解特性没有明显改善。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于 此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到 变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应 以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种MOFs固载酶，其特征在于，其通过将海藻酸盐、磁性颗粒与MOFs结合形成复合载体并固定辣根过氧化物酶得到。
2.根据权利要求1所述的固载酶，其特征在于，所述MOFs为HKUST-1。
3.根据权利要求1所述的固载酶，其特征在于，所述磁性颗粒为Fe3O4，粒径为纳米级。
4.根据权利要求1至3任一项所述的固载酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤一、将海藻酸盐溶解于含有磁性颗粒的磁流体溶液中，得到磁性海藻酸盐溶液；
步骤二、向所述磁性海藻酸盐溶液中加入铜盐和均苯三甲酸，反应得到磁性Alg-HKUST-1复合材料；
步骤三、加入戊二醛，使所述磁性Alg-HKUST-1复合材料交联，得到复合载体；
步骤四、向所述复合载体中加入辣根过氧化物酶，振荡后得到所述固载酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述海藻酸盐与所述磁流体溶液中的磁性颗粒的质量比为1:(1～5)。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述磁性海藻酸盐、铜盐和均苯三甲酸的质量比为1:(10～20):(10～20)。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述戊二醛与所述磁性Alg-HKUST-1复合材料的质量比为(1～5)：1；所述复合载体与所述辣根过氧化物酶的质量比为(50～200)：3。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤四中，将所述复合载体分散于磷酸盐缓冲液中，加入辣根过氧化物酶溶液，冰浴振荡3～5h，离心分离后得到所述固载酶。
9.权利要求1至3任一项所述的固载酶在降解含酚废水中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述含酚废水为含苯酚、邻苯二酚、间苯二酚或2,4-二氯苯酚的废水。
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