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CN108896521B - 一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法 - Google Patents

一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法 Download PDF

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CN108896521B CN201810692139.5A CN201810692139A CN108896521B CN 108896521 B CN108896521 B CN 108896521B CN 201810692139 A CN201810692139 A CN 201810692139A CN 108896521 B CN108896521 B CN 108896521B
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Abstract

本发明公开了一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，包括喹啉基花菁类衍生物(CyQ)的制备、荧光探针(CyQ‑Cys)溶液的制备、金属选择性实验、Fe3+的检测测试、黑茶备用液的制取、黑茶备用液测试等步骤。本发明以4‑甲基喹啉与二醛缩合剂反应得到喹啉基花菁类衍生物(CyQ)，随后，喹啉基花菁类衍生物(CyQ)与半胱氨酸(Cys)通过卤素‑巯基亲核取代和重排反应得到荧光探针(CyQ‑Cys)，而铁离子(Fe3+)可诱导荧光探针(CyQ‑Cys)荧光信号明显增强，其荧光信号的变化与Fe3+浓度呈良好的线性关系，且荧光探针(CyQ‑Cys)可快速(＜30s)、高特异性识别Fe3+而不受常见离子的干扰。

Description

一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法
技术领域
本发明涉及黑茶抗氧化领域，尤其涉及一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法。
背景技术
黑茶中的黄酮、儿茶素等抗氧化性物质能有效抑制活性氧的形成，具有良好的抗氧化活性，其测定方法主要有清除自由基能力法、氧化自由基吸收能力法及铁离子还原法。其中，Fe3+被抗氧化剂还原为Fe2+后，通过与三吡啶三嗪(TPTZ)络合引起吸光度的变化来检测抗氧化活性，但分光光度法的灵敏度偏低。因此，改进铁离子还原法，发展一种高灵敏、高特异性的荧光分析法检测黑茶的抗氧化活性将具有非常重要的意义。
另一方面，金属离子可与生物硫醇如谷胱甘肽(GSH)及半胱氨酸 (Cys)分子中的羧基、氨基和巯基配位，通过改变检测体系的光学信号，实现对金属离子的检测，有效的利用上述原理可高选择性、快速识别Fe3+而不受Fe2+的干扰。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，具体包括以下步骤：
S1、4-甲基-N-乙基喹啉基花菁类衍生物(CyQ)的制备：将4-甲基-N-乙基喹啉，N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐及无水醋酸钠溶于乙醇中，在氮气保护下于80℃反应 1h，冷却后，旋蒸除溶剂，然后在氯仿和醋酸钠溶液中搅拌1h，过滤，真空干燥，柱层析分离，得到4-甲基-N-乙基喹啉基花菁类衍生物(CyQ)，便于后续的使用；
S2、荧光探针(CyQ-Cys)溶液的制备：4-甲基-N-乙基喹啉基花菁类衍生物(CyQ)用N，N-二甲基甲酰胺配成10mol/L溶液，半胱氨酸 (Cys)用去离子水配成200mmol/L溶液，在离心管中依次加入 10mol/L的4-甲基-N-乙基喹啉基花菁类衍生物(CyQ)溶液，逐滴加入200mmol/L的半胱氨酸(Cys)溶液，10mmol/L、pH值为7的磷酸缓冲盐溶液，混合均匀后用N，N-二甲基甲酰胺稀释，反应3min，随后，用荧光分光光度计记录荧光信号的变化，通过卤素-巯基亲核取代和重排反应得到荧光探针(CyQ-Cys)母液；
S3、金属选择性实验：金属盐用去离子水配成1.0mmol/L溶液备用。在荧光池中加入S2步骤中制备的荧光探针(CyQ-Cys)溶液，测其荧光发射光谱，然后加入不同量的不同金属离子溶液，反应3min 后，检测其荧光发射光谱，用荧光分光光度计记录荧光信号变化，检测荧光探针(CyQ-Cys)用于Fe3+的特异性响应，Fe3+与其它金属离子共存时，荧光探针(CyQ-Cys)的抗干扰能力；
S4、Fe3+的检测测试：在荧光池中加入S2步骤中制备的荧光探针 (CyQ-Cys)溶液，测其荧光发射光谱，然后加入不同浓度的Fe3+溶液，检测其荧光发射光谱，用荧光分光光度计记录荧光信号的变化，检测不同浓度的Fe3+溶液荧光强度相应的变化情况；
S5、黑茶备用液的制取：称取未处理的安化黑茶和发酵后的安化黑茶于沸水中浸泡10min，残渣在加沸水浸泡2次，滤液合并后浓缩，然后加入容量瓶中，用蒸馏水定容，获得黑茶备用液；
S6、黑茶备用液测试：在荧光池中加入S2步骤中制备的荧光探针(CyQ-Cys)溶液和S5步骤中制取的黑茶备用液，检测其荧光发射光谱，用荧光分光光度计记录荧光信号的变化。
优选的：在S1中，所述4-甲基-N-乙基喹啉，N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐及无水醋酸钠的摩尔质量比为4∶1∶4，且所述柱层析分离的展开剂为甲醇和二氯甲烷，且所述甲醇和二氯甲烷的体积比为1∶9。
优选的：在S2中，所述喹啉基花菁类衍生物(CyQ)溶液与磷酸缓冲盐溶液的体积比为1∶25。
优选的：在S3中，所述金属盐采用Al3+、Fe2+、Cu2+，Zn2+，Hg2+，Pb2+，Mn2+，Ag+或Co2+金属盐。
优选的：在S5中，所述安化黑茶、发酵后的安化黑茶和水的质量比为1∶1∶10。
优选的：在S1-S6中，所述水均采用二次蒸馏水。
优选的：在S2、S3、S4、S6中，所述发射光谱的测试条件：激发光和发射光的狭缝宽度均为10nm，电压为500V，激发波长为460 nm，平行测试3次。
该方法大大的有效改进铁离子还原法，发展一种高灵敏、高特异性的荧光分析法检测黑茶的抗氧化活性。
本发明提供的一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，与现有技术相比，本发明的以将4-甲基-N-乙基喹啉与N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐反应得到4-甲基-N-乙基喹啉基花菁类衍生物(CyQ)，随后，4-甲基-N-乙基喹啉基花菁类衍生物(CyQ)与半胱氨酸(Cys)通过卤素-巯基亲核取代和重排反应得到荧光探针(CyQ-Cys)，而铁离子(Fe3+)可诱导荧光探针(CyQ-Cys)荧光信号明显增强，其荧光信号的变化与Fe3+浓度呈良好的线性关系，且荧光探针(CyQ-Cys)可快速(＜30s)、高特异性识别Fe3+而不受常见离子的干扰。利用黑茶中抗氧化活性物能还原铁离子而减弱检测体系的荧光恢复程度，构建了黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，并应用于实际样品分析，结果可靠，快捷灵敏。
附图说明
图1为本发明的喹啉类花菁染料合成路线示意图；
图2为本发明的喹啉基花菁类衍生物(CyQ)添加前后半胱氨酸 (Cys)的荧光发射光谱示意图；
图3为本发明的不同浓度半胱氨酸(Cys)对喹啉基花菁类衍生物(CyQ)荧光强度变化的影响示意图；
图4为本发明的添加Fe3+前后荧光探针(CyQ-Cys)的紫外-可见吸收光谱示意图；
图5为本发明的添加Fe3+前后荧光探针(CyQ-Cys)的荧光发射光谱示意图；
图6为本发明的pH值对Fe3+处理前后荧光探针(CyQ-Cys)的荧光强度的影响示意图；
图7为本发明的Fe3+处理前后荧光探针(CyQ-Cys)的稳定性示意图；
图8为本发明的荧光探针(CyQ-Cys)与Fe3+孵育的动力学曲线示意图；
图9为本发明的不同离子孵育荧光探针(CyQ-Cys)的荧光发射光谱示意图；
图10为本发明的Fe3+加入不同金属离子溶液前后荧光探针 (CyQ-Cys)荧光强度的变化的荧光强度示意图；
图11为本发明的不同浓度Fe3+对荧光探针(CyQ-Cys)的荧光发射光谱的影响示意图；
图12为本发明的过量的Fe3+与荧光探针(CyQ-Cys)的荧光强度变化的线性关系示意图；
图13为本发明的喹啉基花菁类衍生物(CyQ)与谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)和N-乙酰基半胱氨酸(NAC)孵育后的荧光发射光谱示意图；
图14为本发明的荧光探针(CyQ-Cys)与Fe3+的工作曲线示意图；
图15为本发明的识别机理示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，具体包括以下步骤：
S1、4-甲基-N-乙基喹啉基花菁类衍生物(CyQ)的制备：将4-甲基-N-乙基喹啉，N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐及无水醋酸钠溶于乙醇中，在氮气保护下于80℃反应 1h，冷却后，旋蒸除溶剂，然后在氯仿和醋酸钠溶液中搅拌1h，过滤，真空干燥，柱层析分离，得到4-甲基-N-乙基喹啉基花菁类衍生物(CyQ)，以4-甲基-N-乙基喹啉与N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯 -1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐反应得到喹啉基花菁类衍生物 (CyQ)，便于后续的使用；
S2、荧光探针(CyQ-Cys)溶液的制备：4-甲基-N-乙基喹啉基花菁类衍生物(CyQ)用N，N-二甲基甲酰胺配成10mol/L溶液，半胱氨酸 (Cys)用去离子水配成200mmol/L溶液，在离心管中依次加入 10mol/L的4-甲基-N-乙基喹啉基花菁类衍生物(CyQ)溶液，逐滴加入200mmol/L的半胱氨酸(Cys)溶液，10mmol/L、pH值为7的磷酸缓冲盐溶液，混合均匀后用N，N-二甲基甲酰胺稀释，反应3min，随后，用荧光分光光度计记录荧光信号的变化，通过卤素-巯基亲核取代和重排反应得到荧光探针(CyQ-Cys)母液；
S3、金属选择性实验：金属盐用去离子水配成1.0mmol/L溶液备用。在荧光池中加入S2步骤中制备的荧光探针(CyQ-Cys)溶液，测其荧光发射光谱，然后加入不同量的不同金属离子溶液，反应3min 后，检测其荧光发射光谱，用荧光分光光度计记录荧光信号变化，检测荧光探针(CyQ-Cys)用于Fe3+的特异性响应，尤其是，Fe3+与其它金属离子共存时，荧光探针(CyQ-Cys)的抗干扰能力；
S4、Fe3+的检测测试：在荧光池中加入S2步骤中制备的荧光探针 (CyQ-Cys)溶液，测其荧光发射光谱，然后加入不同浓度的Fe3+溶液，检测其荧光发射光谱，用荧光分光光度计记录荧光信号的变化，检测不同浓度的Fe3+溶液荧光强度相应的变化情况；
S5、黑茶备用液的制取：称取未处理的安化黑茶和发酵后的安化黑茶于沸水中浸泡10min。残渣在加沸水浸泡2次，滤液合并后浓缩，然后加入容量瓶中，用蒸馏水定容，获得黑茶备用液；
S6、黑茶备用液测试：在荧光池中加入S2步骤中制备的荧光探针(CyQ-Cys)溶液和S5步骤中制取的黑茶备用液，检测其荧光发射光谱，用荧光分光光度计记录荧光信号的变化。
荧光探针(CyQ-Cys)的构建及光谱表征分析：
根据生物硫醇可与金属离子络合的特性，利用巯基与卤素之间的亲核取代反应和重排机制，将喹啉基花菁类衍生物(CyQ)与半胱氨酸 (Cys)结合而构建荧光探针(CyQ-Cys)，如图2和3所示，随着半胱氨酸(Cys)浓度的增加，化合物CyQ的荧光强度逐渐减弱，当Cys 浓度为110mol/L时，荧光猝灭最明显，后续实验均取此最佳值；此外，研究了荧光探针(CyQ-Cys)与Fe3+作用前后的紫外-可见吸收光谱及荧光发射光谱的变化情况；如图4所示，荧光探针(CyQ-Cys) 在460nm处产生强的吸收峰，与Fe3+作用后，吸收峰的强度明显减弱；如图5所示，荧光探针(CyQ-Cys)与Fe3+作用后，在近红外区662nm 处的荧光信号显著增强；光谱信号的变化说明，荧光探针(CyQ-Cys) 与Fe3+作用前后展现了荧光的“关-开”过程，有利于Fe3+的荧光检测。
pH的影响分析：
考虑到喹啉基花菁类衍生物(CyQ)的等电点为5.05，荧光探针 (CyQ-Cys)作为Fe3+的荧光探针主要基于Fe3+与羧基、氨基和巯基之间的配位作用，而溶液的pH会改变氨基的存在方式，进而改变喹啉基花菁类衍生物(CyQ)与半胱氨酸(Cys)的结合方式，从而影响荧光探针(CyQ-Cys)的荧光响应；图6和图7是不同pH条件下荧光探针 (CyQ-Cys)与Fe3+作用前后在最大发射波长处的荧光强度与pH关系曲线；如图6所示，荧光探针(CyQ-Cys)在pH为7时，展现较弱的荧光信号，但Fe3+的加入显著提高了检测体系的荧光强度；然而，在 pH为6.0-6.5范围内，半胱氨酸(Cys)并不能有效淬灭喹啉基花菁类衍生物(CyQ)的荧光强度，尽管加入Fe3+后的荧光信号有增强，但荧光强度的变化可以忽略不计；而pH为8.0时，半胱氨酸(Cys)促使喹啉基花菁类衍生物(CyQ)的荧光强度显著减弱，但加入的Fe3+并不能恢复体系的荧光信号；原因是，酸性条件下，半胱氨酸(Cys) 分子中的氨基带正电荷，难以竞争取代巯基，导致荧光信号不易淬灭，而Fe3+会在碱性条件下形成Fe(OH)3，从而减少了其与荧光探针 (CyQ-Cys)的配位，阻碍了体系荧光信号的恢复；由图7可知，荧光探针(CyQ-Cys)的荧光信号在30min内保持稳定，且与Fe3+作用后的荧光信号也保持恒定，说明荧光探针(CyQ-Cys)与Fe3+作用前后均具有较强的稳定性；因此，本方法可在pH为7的条件下检测Fe3+含量。
动力学过程分析：
室温下，固定pH为7，在荧光探针(CyQ-Cys)的荧光信号趋于平稳后加入Fe3+，进一步考察了荧光探针(CyQ-Cys)与Fe3+反应过程中荧光发射光谱的变化情况；如图8所示，在30～60s内，荧光探针(CyQ-Cys)在662nm处的荧光强度迅速增强，大约20s后荧光强度达到峰值并基本保持恒定；结果表明，荧光探针(CyQ-Cys)与Fe3+存在良好的络合作用且反应迅速，从而实现对Fe3+的快速检测。
离子选择性分析：
为了验证荧光探针(CyQ-Cys)对Fe3+的高选择性，我们选择Fe3+及其它常见离子为识别对象，考察它们与荧光探针(CyQ-Cys)作用前后荧光强度的变化；图9表明，部分常见金属离子(如Al3+，Fe2+) 对荧光探针(CyQ-Cys)荧光强度的增强可以忽略不计，而Cu2+，Zn2+，Hg2+，Pb2+，Mn2+，Ag+，Co2+等离子却使体系的荧光强度进一步减弱；与之形成鲜明对比的是，Fe3+的加入显著提高了检测体系的荧光强度，表明荧光探针(CyQ-Cys)用于Fe3+检测具有较好的特异性响应；尤其是，Fe3+与其它金属离子共存时，荧光探针(CyQ-Cys)对Fe3+仍显示较强的抗干扰能力，结果如图10所示；因此，荧光探针(CyQ-Cys) 是一个高选择性的荧光增强型Fe3+近红外荧光探针。
Fe3+的检测分析：
根据图11和12，为了考察Fe3+对荧光探针(CyQ-Cys)荧光强度的影响，在该检测体系中加入不同浓度的Fe3+，并得到相应的荧光发射光谱，结果如图11所示。荧光探针(CyQ-Cys)在662nm处展现较弱的荧光信号，但随着Fe3+浓度的增加，其荧光强度相应的逐渐增强，过量的Fe3+仍能增强体系的荧光强度，且Fe3+浓度分别在 40-280mol/L和280-900mol/L的范围内与荧光探针(CyQ-Cys)的荧光强度变化呈现良好的线性关系，拟合得其线性回归方程分别为Y＝ 0.0034x+0.9682(R2＝0.9958)和Y＝0.010x+0.9227(R2＝0.9968)，其最低检出限为18.2mol/L。
识别机理研究分析：
为进一步证明荧光探针(CyQ-Cys)与Fe3+的作用机制，首先考察喹啉基花菁类衍生物(CyQ)与半胱氨酸(Cys)的结合方式，如图13所示；喹啉基花菁类衍生物(CyQ)与半胱氨酸(Cys)作用后，其荧光强度显著淬灭，而与N-乙酰基半胱氨酸作用后仍显示较强的荧光强度，说明喹啉基花菁类衍生物(CyQ)与半胱氨酸(Cys)通过卤素 -巯基亲核取代反应结合，然后氨基竞争取代巯基而得到荧光探针 (CyQ-Cys)；随后，我们固定荧光探针(CyQ-Cys)与Fe3+的总浓度，通过绘制二者之间的络合曲线，进一步证明荧光探针(CyQ-Cys)与 Fe3+的络合比，如图14所示。随着Fe3+摩尔分数的增加，体系的荧光强度逐渐增强；当Fe3+的摩尔分数为0.5时，荧光探针(CyQ-Cys) 与Fe3+的络合物展现最大的荧光发射，表明荧光探针(CyQ-Cys)与 Fe3+为1∶1络合比；CyQ-Cys与Fe3+的作用过程见图15，是CyQ-Cys 分子中的-SH，-NH及-COOH与Fe3+配位。
Fe3+的实际样品检测：
以江河水测试对象，进一步评价本方法检测Fe3+的可靠性。根据线性回归方程计算Fe3+的浓度，结果如下表1所示。
表1 下表为江河水样中Fe3+的测定
Figure GSB0000189560950000101
结果表明，本方法检测环境水样中Fe3+的加标回收率和相对标准偏差符合要求，具有检测Fe3+的应用前景；尤其是，Fe2+极易被氧化为Fe3+，因此，本方法可应用于实际水样中铁含量的检测。
黑茶抗氧化活性检测：
参考铁离子还原法，以茶叶水提物为测试对象，进一步考察本方法检测黑茶抗氧化活性的可行性，结果如下表2所示；结果表明，检测体系的荧光强度随水提物体积分数的增大而下降，荧光强度越弱，说明体系的还原性越强；黑茶具有较强的抗氧化活性，且安化黑茶的抗氧化活性强于发酵后的安化黑茶。
表2 安化黑茶和发酵后的安化黑茶的还原能力
Figure GSB0000189560950000111
结论：本发明合成了喹啉基花菁类衍生物(CyQ)，采用卤素-巯基亲核取代反应导致喹啉基花菁类衍生物(CyQ)的荧光信号淬灭的策略，构建了一种近红外荧光荧光探针(CyQ-Cys)，它可以快速识别 Fe3+(＜30s)，具有高选择性、高灵敏的优势；基于半胱氨酸(Cys) 介导的“关-开”型近红外荧光探针检测Fe3+的方法，利用黑茶抗氧化物质可还原Fe3+为Fe2+过程，构建了一种黑茶抗氧化活性荧光分析方法，并应用于金花黑茶的实际样品分析，结果可靠。
综上所述：本发明的一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，其与传检测技术相比具有以下多个优点：高灵敏、高特异性，检测速度快等优良特性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
S1、4-甲基-N-乙基喹啉基花菁类衍生物(CyQ)的制备：将4-甲基-N-乙基喹啉、N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐及无水醋酸钠溶于乙醇中，在氮气保护下于80℃反应1h，冷却后，旋蒸除溶剂，然后在氯仿和醋酸钠溶液中搅拌1h，过滤，真空干燥，柱层析分离，得到4-甲基-N-乙基喹啉基花菁类衍生物(CyQ)，便于后续的使用；
S2、荧光探针(CyQ-Cys)溶液的制备：4-甲基-N-乙基喹啉基花菁类衍生物(CyQ)用N，N-二甲基甲酰胺配成10mol/L溶液，半胱氨酸(Cys)用去离子水配成200mmol/L溶液，在离心管中依次加入10mol/L的4-甲基-N-乙基喹啉基花菁类衍生物(CyQ)溶液，逐滴加入200mmol/L的半胱氨酸(Cys)溶液，10mmol/L、pH值为7的磷酸缓冲盐溶液，混合均匀后用N，N-二甲基甲酰胺稀释，反应3min，随后，用荧光分光光度计记录荧光信号的变化，通过卤素-巯基亲核取代和重排反应得到荧光探针(CyQ-Cys)母液；
S3、金属选择性实验：金属盐用去离子水配成1.0mmol/L溶液备用，在荧光池中加入S2步骤中制备的荧光探针(CyQ-Cys)溶液，测其荧光发射光谱，然后加入不同量的不同金属离子溶液，反应3min后，检测其荧光发射光谱，用荧光分光光度计记录荧光信号变化，检测荧光探针(CyQ-Cys)用于Fe3+的特异性响应，Fe3+与其它金属离子共存时，荧光探针(CyQ-Cys)的抗干扰能力；
S4、Fe3+的检测测试：在荧光池中加入S2步骤中制备的荧光探针(CyQ-Cys)溶液，测其荧光发射光谱，然后加入不同浓度的Fe3+溶液，检测其荧光发射光谱，用荧光分光光度计记录荧光信号的变化，检测不同浓度的Fe3+溶液荧光强度相应的变化情况；
S5、黑茶备用液的制取：称取未处理的安化黑茶和发酵后的安化黑茶于沸水中浸泡10min，残渣在加沸水浸泡2次，滤液合并后浓缩，然后加入容量瓶中，用蒸馏水定容，获得黑茶备用液；
S6、黑茶备用液测试：在荧光池中加入S2步骤中制备的荧光探针(CyQ-Cys)溶液和S5步骤中制取的黑茶备用液，检测其荧光发射光谱，用荧光分光光度计记录荧光信号的变化。
2.根据权利要求1所述一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，其特征在于：在S1中，所述4-甲基-N-乙基喹啉，N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐及无水醋酸钠的摩尔质量比为4∶1∶4，且所述柱层析分离的展开剂为甲醇和二氯甲烷，且所述甲醇和二氯甲烷的体积比为1∶9。
3.根据权利要求2所述一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，其特征在于：在S2中，所述4-甲基-N-乙基喹啉基花菁类衍生物(CyQ)溶液与磷酸缓冲盐溶液的体积比为1∶25。
4.根据权利要求1所述一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，其特征在于：在S3中，所述金属盐采用Al3+、Fe2+、Cu2+，Zn2+，Hg2+，Pb2+，Mn2+，Ag+或Co2+金属盐。
5.根据权利要求1所述一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，其特征在于：在S5中，所述安化黑茶、发酵后的安化黑茶和水的质量比为1∶1∶10。
6.根据权利要求1所述一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，其特征在于：在S1-S6中，所述水均采用二次蒸馏水。
7.根据权利要求1所述一种黑茶抗氧化活性的荧光分析方法，其特征在于：在S2、S3、S4、S6中，所述发射光谱的测试条件：激发光和发射光的狭缝宽度均为10nm，电压为500V，激发波长为460nm，平行测试3次。
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