CN108888620B - 化合物knk437的新应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种化合物KNK437在制备防治结直肠癌药物中的应用。本发明构建结直肠癌DNAJA1过表达细胞株，并采用化合物KNK437进行药物处理，检测KNK437对结直肠癌Mock细胞、DNAJA1过表达细胞体外增殖活力、皮下成瘤能力和脾脏被膜下注射肝脏转移能力的影响，从而为KNK437应用于制备防治转移性结直肠癌的药物提供依据。化合物KNK437具有显著抑制结直肠癌细胞体外增殖、皮下成瘤和脾脏被膜下注射肝脏转移能力，且无明显毒副作用，因此可用于制备有效抑制结直肠癌增殖和转移的药物。

Description

化合物KNK437的新应用

技术领域

本发明涉及化合物的药物新应用，具体涉及一种化合物KNK437在制备防治消化系统肿瘤的药物中的应用。

背景技术

随着生活水平的提高和饮食习惯的改变，消化系统恶性肿瘤的发病率逐年升高并呈年轻化趋势。结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是我国常见的一种消化系统恶性肿瘤。转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因，约20％的结直肠癌患者在确诊时已经发生远处转移，严重威胁人们的生命健康。细胞内的蛋白质组装、分泌、运输，蛋白质降解以及调节转录因子等，与肿瘤细胞的增殖、侵袭、分化、转移都有密切关系。目前，直肠癌发生、发展的分子机制尚未阐明。

热休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)家族成员是一类蛋白质多肽，按照分子量大小可分为HSP90，HSP70，HSP60，HSP40和小分子HSP27。HSP40家族，也称DNAJ家族，是热休克蛋白家族下的一个分子伴侣家族，DNAJ家族成员的结构具有一个共同特点，即均有一个高度保守的氨基酸端J结构域、一个甘氨酸/丙氨酸富集结构域、4个CxxCxGxG锌指重复序列结构域，以及一个C端底物结合结构域。J结构域是DNAJ蛋白的标志性结构域，该结构域包含保守的组氨酸、脯氨酸和天冬氨酸残基。DNAJA1是DNAJ家族成员之一，其J结构域介导DNAJA1与HSP70的相互作用以招募底物及调节ATP水解活性。DNAJA1主要负责调节蛋白装配、拆卸以及蛋白转运，但是在结直肠癌中的作用尚不清楚。

化合物KNK437是一种泛HSPs抑制剂，低毒性，能够抑制包括HSP40、HSP72和HSP105的合成。研究发现，化合物KNK437能够抑制HSP70的mRNA水平，并且呈剂量依赖性地抑制细胞的热敏性。但目前而言，化合物KNK437在消化系统肿瘤增殖和转移中的治疗作用尚未见报道。

发明内容

针对上述问题，本发明的其中一个目的在于提供一种化合物KNK437的药物新应用。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

化合物KNK437在制备防治消化系统肿瘤的药物中的应用。

所述化合物KNK437的结构如式(I)所示：

在其中一些实施例中，所述消化系统肿瘤为结直肠癌。

在其中一些实施例中，所述结直肠癌为癌细胞中DNAJA1过表达的类型。

本发明的另一个目的还在于提供一种的应用，具体技术方案如下：

化合物KNK437在制备防治消化系统肿瘤转移的疾病或肿瘤的药物中的应用。

在其中一些实施例中，所述药物为防治结直肠癌转移的疾病或肿瘤的药物。

在其中一些实施例中，所述结直肠癌转移为结直肠癌的肝脏转移。

在其中一些实施例中，所述药物中还包括有与化合物KNK437联合用药的抗肿瘤化合物。

在其中一些实施例中，所述抗肿瘤化合物为氟尿嘧啶。

本发明的另一目的在于提供一种防治消化系统肿瘤的药物，具体技术方案如下：

一种防治消化系统肿瘤的药物，其活性成分包括化合物KNK437。

在其中一些实施例中，其活性成分还包括氟尿嘧啶。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明构建消化系统肿瘤结直肠癌DNAJA1过表达细胞株，并采用化合物KNK437进行药物处理，检测KNK437对结直肠癌Mock细胞、DNAJA1过表达细胞体外增殖活力、皮下成瘤能力和脾脏被膜下注射肝脏转移能力的影响，从而为KNK437应用于制备防治转移性结直肠癌的药物提供依据。化合物KNK437具有显著抑制结直肠癌细胞体外增殖、皮下成瘤和脾脏被膜下注射肝脏转移能力，且无明显毒副作用，因此可用于制备有效抑制结直肠癌增殖和转移的药物。

本发明还可将化合物KNK437与其他抗肿瘤药物联合用药，其具有显著的结直肠癌细胞抑制作用，联合用药也是药物研究与开发中的热点途径之一。

附图说明

图1是QPCR实验检测结直肠癌细胞中DNAJA1的过表达模型中DNAJA1的表达水平及化合物KNK437对其表达水平的抑制结果；

图2Western blot实验检测结直肠癌细胞中DNAJA1的过表达模型中DNAJA1的表达水平及化合物KNK437对其表达水平的抑制结果；

图3是CCK-8细胞增殖实验检测构建的结直肠癌细胞的体外增殖能力，及化合物KNK437对其体外增殖能力的抑制作用；

图4是皮下成瘤实验检测构建的结直肠癌直肠癌细胞的裸鼠皮下成瘤能力，及化合物KNK437对其裸鼠皮下成瘤能力的抑制作用；

图5是脾脏被膜下注射肝脏转移实验检测构建的结直肠癌细胞的裸鼠肝脏转移能力，及化合物KNK437对其肝脏转移能力的抑制作用。

具体实施方式

本发明提供了一种化合物KNK437的药物新应用。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明实施例中所使用的化合物KNK437购自Selleck公司，cas号为：S7750。其结构式如下：

实施例1构建SW480/DNAJA1和DAJA1和HCT116/DNAJA1过表达细胞株

1、细胞培养：首先37℃水浴复苏细胞，然后接种于细胞培养瓶中。细胞培养使用含10％胎牛血清的1640培养基(FBS，Gibco，澳大利亚)。培养箱条件为37℃，5％CO₂。

2、DNAJA1过表达细胞株构建：第一天，将SW480、HCT116细胞分别铺24孔板，细胞数约2×10⁴个/孔，加入完全培养基600μl，置于37℃、5％CO₂培养箱过夜。第二天，每孔分别加入Enhance液1ml与polybrene液2μl，SW480、HCT116细胞中加入20μl Mock空载对照或者DNAJA1过表达的慢病毒上清，置于37℃，5％CO₂培养箱8-12h，第三天，弃掉原有培养基，加入RPMI 1640完全培养基，继续孵育72h，第六天，镜下观察细胞的荧光情况，扩大培养，提取RNA和全蛋白，利用荧光定量PCR和Western blot检测DNAJA1的表达。

3、QPCR检测DNAJA1的表达：(1)提取细胞总RNA，将培养瓶中的培养基吸出，用预冷PBS洗2次，然后加入1ml TRIZOL，充分吹打混匀，将液体转移到1.5ml EP管中，加入200μl三氯甲烷后剧烈震荡15s，是RNA纯化，静置分层，4℃，12000rpm离心5min，小心吸取上清转移到新的EP管，加入等体积异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min，4℃，12000rpm离心10min，弃上清，往EP管加入1mlDEPC水配制的75％乙醇，洗涤上述所得沉淀，然后4℃，12000rpm离心5min后弃上清，晾干后加入适量DEPC水溶解沉淀，利用紫外分光光度仪测定RNA浓度及A260/280值，将RNA冻存于-80℃备用。

(2)逆转录反应配制10μl体系，分别加入2μl逆转录缓冲液，0.5μl逆转录酶，0.5μlOligodTPrimer(50μM)，0.5μl Random6mers(100μM)，500ng RNA，用去RNA酶的ddH₂O补齐到10μl，混合液配制完成，离心去气泡，PCR仪上37℃反应15min，85℃灭火酶5s，得到cDNA，放置于-20℃备用。

(3)荧光定量PCR反应GAPDH上游引物5’ACAGCCCGCAGGATCAGGAAA3’(SEQ.IDNO.1)，下游引物5’AACACGCTTCACGGGCACTC3’(SEQ.ID NO.2)，DNAJA1上游引物5’CCTTCATTTGGATTCTTATCAGG3’(SEQ.ID NO.3)，下游引物5’GAGCCAAAACCACCACCTGC3’(SEQ.ID NO.4)，将上述所得cDNA冰上溶解，使用TAKARA的qPCR试剂盒按照下列体系配制：SYBR10μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，ROX DYEII 0.4μl，cDNA 2μl，DEPC水6.8μl。

qPCR反应条件为：95℃预变性10min、95℃15sec、60℃30sec、72℃34sec，40个循环。结果以CT值法计算不同样品中各基因的相对表达量。数据按2-ΔΔCt公式计算出基因的相对表达量。

结果如图1所示，图1A是QPCR实验检测构建的结直肠癌SW480/Mock、SW480/DNAJA1、SW480/DNAJA1/KNK437细胞中DNAJA1的表达情况。该图显示构建的SW480/DNAJA1细胞中DNAJA1的表达水平显著高于SW480/Mock细胞，而化合物KNK437能显著降低SW480/DNAJA1细胞中DNAJA1的表达水平。图1B是QPCR实验检测构建的结直肠癌HCT116/Mock、HCT116/DNAJA1、HCT116/DNAJA1/KNK437细胞中DNAJA1的表达情况。该图显示构建的HCT116/DNAJA1细胞中DNAJA1的表达水平显著高于HCT116/Mock细胞，而化合物KNK437能显著降低HCT116/DNAJA细胞中DNAJA1的表达水平。

4、Western blot：收集KNK437处理不同时间的Mock、DNAJA1过表达细胞，通过全蛋白提取试剂盒(杭州弗德生物有限公司)提取总蛋白，使用Bio-Rad公司BCA Protein AssayReagengt Kit进行蛋白定量，煮沸变性。

SDS-PAGE电泳：浓缩胶恒定电压在100V，分离胶恒定电压在120V，至跑出目的蛋白。

转膜：Tenon微型电转系统200MA进行转膜。

封闭：5％脱脂牛奶室温孵育1h。

敷一抗：DNAJA1兔多克隆抗体(1:1000，Abcam)，HSP70兔多克隆抗体(1:500，)GAPDH鼠单克隆抗体，1:5000，Proteintech)，4℃孵育过夜。

敷二抗：HRP标记的抗兔及抗鼠二抗(1:10000，杭州弗德生物有限公司)室温孵育1h。

ECL超敏化学发光试剂(南京凯基生物科技发展有限公司)对条带进行检测。

结果发现，在SW480细胞中转染DNAJA1过表达质粒，同时加入KNK437药物进行处理，同时转染和KNK437处理36h以上时DNAJA1的表达明显降低，而HSP70的表达并未降低；在SW480细胞中过表达DNAJA1后，与Mock对照组和DMSO组相比较，KNK437处理组的DNAJA1表达均明显减少，而HSP70的表达无明显变化。

结果如图2所示，图2A是Western blot实验检测KNK437处理不同时间对构建的结直肠癌SW480/Mock、SW480/DNAJA1细胞中DNAJA1和HSP70的表达情况。该图显示构建的SW480/DNAJA1细胞中同时加入KNK437刺激36h以上时，DNAJA1的表达明显降低，而HSP70的表达并未降低。图2B是Western blot实验检测KNK437对构建的结直肠癌SW480/Mock、SW480/DNAJA1细胞中DNAJA1和HSP70的表达情况。该图显示KNK437能显著抑制构建的SW480/DNAJA1细胞中DNAJA1的表达水平，而HSP70的表达无显著变化。

实施例2 KNK437抑制结直肠癌SW480、HCT116细胞的体外增殖能力

选取生长状态良好的SW480、HCT116细胞铺板，给予Mock、DNAJA1过表达质粒瞬时转染，DNAJA1过表达组在分2组分别用完全培养基和含有KNK437的培养基培养24h后，PBS洗涤2次，消化、离心，去除培养基，加入无血清的空培重选，计数，按照每孔1000个细胞的数量加入到96孔板中，每孔用完全培养基将细胞稀释到100ul，每个处理组内分5个复孔，同时设立仅加培养基的空白对照组。铺板24h后CCK-8法测定每个空的OD值，每孔洗出培养基，加入100ul由完全培养基及CCK-8试剂按照9:1的比例配好的混合液，37℃孵育2h，酶标仪检测450nm处的OD值，将空白对照组为基准进行调零，得出显示细胞增殖能力的OD值，每组取5个复孔的均值，间隔24h进行下一轮检测，连测5天，绘制细胞增值曲线。

结果发现，与SW480/Mock组细胞相比较，SW480/DNAJA1组细胞的增殖活力显著增强，而使用KNK437处理后，SW480/DNAJA1组细胞的增殖活力显著降低，差异均具有统计学意义。

如图3所示，图3A是CCK-8细胞增殖实验检测构建的结直肠癌SW480/Mock、SW480/DNAJA1、SW480/DNAJA1/KNK437细胞的体外增殖能力。该图显示构建的结直肠癌SW480/DNAJA1的体外增殖能力显著大于SW480/Mock组细胞，而使用化合物KNK437能够显著抑制SW480/DNAJA1细胞的体外增殖能力。图3B是CCK-8细胞增殖实验检测构建的结直肠癌HCT116/Mock、HCT116/DNAJA1、HCT116/DNAJA1/KNK437细胞的体外增殖能力。该图显示构建的结直肠癌HCT116/DNAJA1的体外增殖能力显著大于HCT116/Mock组细胞，而使用化合物KNK437能够显著抑制HCT116/DNAJA1细胞的体外增殖能力。

实施例3

选取生长状态良好的结直肠癌SW480/Mock、SW480/DNAJA1细胞，分别传代扩大培养，常规PBS清洗、胰酶消化细胞，离心后用PBS重悬，用1ml注射器向4周龄雌性裸鼠腿部皮下注射SW480/Mock、SW480/DNAJA1细胞，1周后皮下瘤明显可见时，分别用20mg/kg/day和100mg/kg/day的化合物KNK437进行肿瘤内注射处理，分别记录肿瘤的体积以及最终的肿瘤重量。

结果如图4显示，与SW480/Mock组细胞相比较，SW480/DNAJA1组细胞的裸鼠皮下成瘤能力显著增强，肿瘤组织块的大小明显体积较大，重量更重；而使用KNK437进行瘤内注射治疗后，SW480/DNAJA1组细胞的裸鼠皮下成瘤能力显著降低，在化合物KNK437剂量为20mg/kg/day和100mg/kg/day时，差异均具有统计学意义。

实施例4 KNK437抑制结直肠癌SW480细胞脾脏被膜下注射肝脏转移能力

选取生长状态良好的结直肠癌SW480/Mock、SW480/DNAJA1细胞，分别传代扩大培养，常规PBS清洗、胰酶消化细胞，离心后用PBS重悬、计数后放冰上备用。

用0.3％戊巴比妥腹腔注射4周龄雌性裸鼠，麻醉后于细胞超净台内消毒、做腹部切口，暴露脾脏，然后用胰岛素注射器吸取1×10⁵个细胞，注射到裸鼠脾被膜下，注射完毕后用无菌棉球按压止血，缝合伤口，术后1周对裸鼠进行腹腔注射药物治疗，根据药物的种类将裸鼠分为4组：SW480/Mock+DMSO组、SW480/DNAJA1+DMSO组、SW480/DNAJA1+氟尿嘧啶(12.5mg/kg)组、SW480/DNAJA1+氟尿嘧啶(12.5mg/kg)+KNK437(100mg/kg)组，每周注射2次，连续用药4周后处死裸鼠，检测各组裸鼠肝脏肿瘤转移情况。

图5是脾脏被膜下注射肝脏转移实验检测构建的结直肠癌SW480/Mock、SW480/DNAJA1、SW480/DNAJA1/KNK437细胞的裸鼠肝脏转移能力。该图显示构建的SW480/DNAJA1的肝脏转移能力显著大于SW480/Mock细胞，而使用化合物KNK437能够显著抑制SW480/DNAJA1细胞的肝脏转移能力。

可知，与SW480/Mock相比，SW480/DNAJA1组具有明显的肝转移，而化合物KNK437可与氟尿嘧啶联合用药，并显著抑制裸鼠的结直肠癌肝脏转移。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以下实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 南方医科大学

<120> 化合物KNK437的新应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acagcccgca ggatcaggaa a 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aacacgcttc acgggcactc 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccttcatttg gattcttatc agg 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagccaaaac caccacctgc 20

Claims (5)

1.化合物KNK437在制备防治转移性结直肠癌的药物中的应用；所述结直肠癌为癌细胞中DNAJA1过表达的类型；

所述癌细胞为SW480细胞或HCT116细胞。

2.化合物KNK437在制备防治转移性结直肠癌转移导致的疾病或肿瘤的药物中的应用，所述结直肠癌为癌细胞中DNAJA1过表达的类型，所述癌细胞为SW480细胞或HCT116细胞。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述结直肠癌转移为结直肠癌的肝脏转移。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物中还包括有与化合物KNK437联合用药的抗肿瘤化合物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤化合物为氟尿嘧啶。

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