CN108796026A - 赖氨酸的生产、提取以及纯化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于发酵技术领域，公开了赖氨酸的生产、提取以及纯化工艺，其包括如下步骤：步骤1）制备种子液；步骤2）制备发酵培养基；步骤3）发酵生产赖氨酸；步骤4）提取和纯化。本发明工艺成本低廉，赖氨酸产量和纯度高。
Description
技术领域
本发明属于氨基酸发酵技术领域，具体涉及赖氨酸的生产、提取以及纯化工艺。
背景技术
赖氨酸是人体需要的一种氨基酸，一种不可缺少的营养物质。蛋白质是构成人体细胞的主要成份，食物中的蛋白质进入人体后经过消化先分解成氨基酸，然后人体又利用这些氨基酸再合成新的人体蛋白质，如免疫抗体、消化酶、血浆蛋白、生长激素等都是合成后的人体蛋白质。在合成蛋白质的各种氨基酸中，L-赖氨酸是最重要的一种，缺少赖氨酸，其它氨基酸就受到限制或得不到利用，科学家称它为人体第一必需氨基酸。科学家还发现，L-赖氨酸是控制人体生长的重要物质抑长素中最重要的也是最必需的成份，对人的中枢神经和周围神经系统都起着重要作用。人体不能自身合成L-赖氨酸，必须从食物中吸取赖氨酸是帮助其它营养物质被人体充分吸收和利用的关键物质，人体只有补充了足够的L-赖氨酸才能提高食物蛋白质的吸收和利用，达到均衡营养，促进生长发育。其作用主要有：提高智力、促进生长、增强体质；增进食欲、改善营养不良状况；改善失眠，提高记忆力；帮助产生抗体、激素和酶，提高免疫力、增加血色素；帮助钙的吸收，治疗防止骨质疏松症；降低血中甘油三酯的水平，预防心脑血管疾病的产生。
目前生产赖氨酸的方法主要有发酵法和酶法。其中，发酵法是最广泛的生产方法，发酵法生产赖氨酸的主要微生物有谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌等。工业生产中最高产酸率已提高到每升发酵液100g以上，提取率达到80～90%左右。但是培养基的成本制约着企业的发展，原料成本高，企业的利润相应会降低。
申请人前期的研究成果“CN2018103846072，一种赖氨酸发酵培养基”，其包括玉米皮处理物，玉米浆，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，七水硫酸亚铁，七水硫酸镁，乙酸钙，甘露醇，生物素，维生素，水。该方法以玉米皮为主要原料进行处理，产酸率高，降低了发酵培养基成本；但是仍然需要添加其他组分，包括玉米浆等。
在现有的提取纯化赖氨酸的工艺中，调节赖氨酸清液的pH时，需要消耗大 量的硫酸，用氨水洗脱时又要消耗大量的液氨，对树脂进行水洗涤的时候又会产生大量的废水，增加了环保的负担，并造成了资源的浪费，而且在分离过程中会造成树脂破碎流失，对分离设备性能要求高。此工艺路线长，原辅料消耗大，成本高，制约了赖氨酸行业的发展。
发明内容
在申请人之前的研究“一种发酵制备赖氨酸的工艺”的基础上，本发明继续对赖氨酸进行了提取和纯化。
为了实现上述目的，本发明是通过如下技术方案来实现的：
赖氨酸的生产、提取以及纯化工艺，其包括如下步骤：
步骤1）制备种子液；
步骤2）制备发酵培养基；
步骤3）发酵生产赖氨酸；
步骤4）提取和纯化。
进一步地，所述步骤1）制备种子液，包括如下步骤：将产赖氨酸菌株接入种子培养基中，培养至密度为3-5×108cfu/mL的种子液；所述种子培养基的组分为：葡萄糖80g/L，酵母膏30g/L，玉米浆10g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸亚铁0.2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，生物素10mg/L，维生素B1 2mg/L。
进一步地，所述步骤2）制备发酵培养基，包括如下步骤：
（1）将小麦秸秆破碎，然后与麦麸按照2：3的质量比混合，再粉碎至粒径为50目，然后添加到4-5倍重量的水中，以200rpm的搅拌速度边搅拌边升温至60℃，保温条件下，超声处理20-30min，超声功率为500W，然后121℃蒸汽处理10min，自然冷却至室温，即得复合物；
（2）将绿色木霉种子液和地衣芽孢杆菌种子液按照1-2:2-3的体积比混合，得到混合接种液，将混合接种液按照6-8%（占步骤1）所得复合物的体积比）的接种量接入到含有步骤1）所得复合物的发酵罐中进行培养，温度为30℃，培养时间为72-96h，得到培养液；
（3）超声处理培养液，超声时间为30-60min，超声功率为500W，再调整温度为55℃，加硫酸调整pH为6，分别加入溶菌酶和酸性蛋白酶，溶菌酶的添加量为2万U：1L溶液，酸性蛋白酶的添加量为1万U：1L溶液，保温条件下，酶解12-24小时，然后通过过滤网进行过滤，过滤网孔径为5-10微米，去除絮状物，收集滤过液，然后100℃灭酶5min，自然冷却至室温，再添加相同体积的水、适量乙酸钙和甘露醇，搅拌均匀，121℃蒸汽处理5min，自然冷却至室温，即得发酵培养基。
进一步地，所述步骤3）发酵生产赖氨酸，包括如下步骤：将种子液按照5-10％的接种量接种至含有发酵培养基的发酵罐中，进行好氧发酵，发酵温度为32-35℃，罐压为0.05MPa，发酵48-60小时得到发酵液。
进一步地，所述步骤4）提取和纯化，包括如下步骤：
往发酵液中加盐酸调pH至5.5，利用碟片离心机进行固液分离，收集液体，泵入脱色罐进行脱色处理，脱色罐中添加占液体质量0.5-0.8%的活性炭，脱色30min，然后离心去除活性炭，收集上清液，再添加盐酸调pH至4.9，进入浓缩结晶器中蒸发浓缩，控制温度40℃、真空度为-0.09Mpa，待蒸发浓缩至原体积的三分之一到四分之一时，进行离心分离，收集湿晶体，烘干即得。
优选地，所述绿色木霉种子液的制备方法为：将绿色木霉划线接种在PDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基进行培养，得到绿色木霉种子液。
优选地，所述地衣芽孢杆菌种子液的制备方法为：将地衣芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行培养，得到地衣芽孢杆菌种子液。
优选地，所述乙酸钙的添加量为100-200mg/L
优选地，所述甘露醇的添加量为50-100mg/L。
本发明实施方式中具体使用的菌株为谷氨酸棒状杆菌ATCC14997，绿色木霉ATCC9275，地衣芽孢杆菌ATCC12759；也可以使用同一种属中功能类似的其他菌株。本发明菌株种子液还可以按照现有技术记载的其他培养方式来制备，只需达到合适的接种浓度即可。
与现有技术相比，本发明制备的培养基的优点主要包括以下几个方面：
本发明提取纯化工艺简单，不采用树脂，成本较低，而且废水产生量低；
本发明通过对小麦秸秆和麦麸进行加热浸泡和超声处理，利用的超声波的空化作用，产生局部高压高温进行冲击，有助于纤维、蛋白以及碳水化合物的分离，更容易被菌株利用；
绿色木霉可以产生纤维素酶，地衣芽孢杆菌可以产生蛋白酶和淀粉酶，本发明采用绿色木霉和地衣芽孢杆菌联合对小麦秸秆和麦麸处理物进行发酵酶解处理，然后酶解菌体，得到含有糖类化合物、菌体蛋白、多肽以及无机矿物质的培养基，供大肠杆菌使用，提高了发酵效率，并且利用了农业废弃物，降低了成本。本发明利用的超声波的空化作用，产生局部高压高温，对菌体细胞进行冲击，导致细胞变形和破裂，辅助溶菌酶进行破壁溶解，并且采用酸性蛋白酶进行辅助，提高了菌体蛋白的酶解效率。
乙酸钙在细胞内部参与了乙酰辅酶A的合成，能够参与到三羧酸循环中，从而增加了细胞的代谢强度，适量的乙酸钙能促进棒杆菌菌体细胞生长，从而促进赖氨酸的发酵；甘露醇能够维持渗透压，同时防止细胞水分的流出和盐分的入侵，提高细胞对缺水，高温，高盐和高渗环境的耐受力，稳定酶活性和生物大分子的功能，菌体能够吸收培养基中的甘露醇来抵抗高渗透的压力，在赖氨酸发酵过程中，适量甘露醇的添加能够起到加快菌种生长速率，耗糖速率和产酸速率的作用。
附图说明
图1：乙酸钙添加量对发酵产赖氨酸量的影响；
图2：甘露醇添加量对发酵产赖氨酸量的影响。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
赖氨酸的生产、提取以及纯化工艺，其包括如下步骤：
选取谷氨酸棒状杆菌ATCC14997作为发酵菌株；将谷氨酸棒状杆菌接入种子培养基中，培养至密度为3×108cfu/mL的种子液；所述种子培养基的组分为：葡萄糖80g/L，酵母膏30g/L，玉米浆10g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸亚铁0.2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，生物素10mg/L，维生素B1 2mg/L；
将种子液按照10％的接种量接种至含有发酵培养基的发酵罐中，进行好氧发酵，发酵温度为32℃，罐压为0.05MPa，发酵48小时得到发酵液，发酵过程中持续加氯化铵作为发酵液中和剂，使发酵液出料pH控制在7.2；
往发酵液中加盐酸调pH至5.5，利用碟片离心机进行固液分离，收集液体，泵入脱色罐进行脱色处理，脱色罐中添加占液体质量0.5%的活性炭，脱色30min，然后离心去除活性炭，收集上清液，再添加盐酸调pH至4.9，进入浓缩结晶器中蒸发浓缩，控制温度40℃、真空度为-0.09Mpa，待蒸发浓缩至原体积的三分之一时，进行离心分离，收集湿晶体，在100℃下烘干即得；经检测：纯度为98.7%，收率为73.5%。
所述发酵罐培养基的制备方法包括如下步骤：
步骤1）将小麦秸秆破碎，然后与麦麸按照2：3的质量比混合，再粉碎至粒径为50目，然后添加到4倍重量的水中，以200rpm的搅拌速度边搅拌边升温至60℃，保温条件下，超声处理30min，超声功率为500W，然后121℃蒸汽处理10min，自然冷却至室温，即得复合物；
步骤2）将绿色木霉种子液和地衣芽孢杆菌种子液按照2:3的体积比混合，得到混合接种液，将混合接种液按照8%（占步骤1）所得复合物的体积比）的接种量接入到含有步骤1）所得复合物的发酵罐中进行培养，温度为30℃，培养时间为72h，得到培养液；
步骤3）超声处理培养液，超声时间为60min，超声功率为500W，再调整温度为55℃，加硫酸调整pH为6，分别加入溶菌酶和酸性蛋白酶，溶菌酶的添加量为2万U：1L溶液，酸性蛋白酶的添加量为1万U：1L溶液，保温条件下，酶解12小时，然后通过过滤网进行过滤，过滤网孔径为5微米，去除絮状物，收集滤过液，然后100℃灭酶5min，自然冷却至室温，再添加相同体积的水、终浓度为200mg/L的乙酸钙和100mg/L的甘露醇，搅拌均匀，121℃蒸汽处理5min，自然冷却至室温，即得发酵培养基。
所述绿色木霉种子液的制备方法为：将绿色木霉划线接种在PDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基进行培养，得到菌体浓度为1×108cfu/ml的绿色木霉种子液；
所述地衣芽孢杆菌种子液的制备方法为：将地衣芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行培养，得到菌体浓度为1×108cfu/ml的地衣芽孢杆菌种子液。
实施例2
赖氨酸的生产、提取以及纯化工艺，其包括如下步骤：
选取谷氨酸棒状杆菌ATCC14997作为发酵菌株；将谷氨酸棒状杆菌接入种子培养基中，培养至密度为5×108cfu/mL的种子液；所述种子培养基的组分为：葡萄糖80g/L，酵母膏30g/L，玉米浆10g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸亚铁0.2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，生物素10mg/L，维生素B1 2mg/L；
将种子液按照10％的接种量接种至含有发酵培养基的发酵罐中，进行好氧发酵，发酵温度为35℃，罐压为0.05MPa，发酵60小时得到发酵液，发酵过程中持续加氯化铵作为发酵液中和剂，使发酵液出料pH控制在7.2；
往发酵液中加盐酸调pH至5.5，利用碟片离心机进行固液分离，收集液体，泵入脱色罐进行脱色处理，脱色罐中添加占液体质量0.8%的活性炭，脱色30min，然后离心去除活性炭，收集上清液，再添加盐酸调pH至4.9，进入浓缩结晶器中蒸发浓缩，控制温度40℃、真空度为-0.09Mpa，待蒸发浓缩至原体积的四分之一时，进行离心分离，收集湿晶体，在100℃下烘干即得；经检测：纯度为98.1%，收率为70.8%。
所述发酵罐培养基的制备方法包括如下步骤：
步骤1）将小麦秸秆破碎，然后与麦麸按照2：3的质量比混合，再粉碎至粒径为50目，然后添加到5倍重量的水中，以200rpm的搅拌速度边搅拌边升温至60℃，保温条件下，超声处理20min，超声功率为500W，然后121℃蒸汽处理10min，自然冷却至室温，即得复合物；
步骤2）将绿色木霉种子液和地衣芽孢杆菌种子液按照1:2的体积比混合，得到混合接种液，将混合接种液按照6%（占步骤1）所得复合物的体积比）的接种量接入到含有步骤1）所得复合物的发酵罐中进行培养，温度为30℃，培养时间为96h，得到培养液；
步骤3）超声处理培养液，超声时间为30-60min，超声功率为500W，再调整温度为55℃，加硫酸调整pH为6，分别加入溶菌酶和酸性蛋白酶，溶菌酶的添加量为2万U：1L溶液，酸性蛋白酶的添加量为1万U：1L溶液，保温条件下，酶解24小时，然后通过过滤网进行过滤，过滤网孔径为10微米，去除絮状物，收集滤过液，然后100℃灭酶5min，自然冷却至室温，再添加相同体积的水、终浓度为100mg/L的乙酸钙和50mg/L的甘露醇，搅拌均匀，121℃蒸汽处理5min，自然冷却至室温，即得发酵培养基。
所述绿色木霉种子液的制备方法为：将绿色木霉划线接种在PDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基进行培养，得到菌体浓度为1×108cfu/ml的绿色木霉种子液；
所述地衣芽孢杆菌种子液的制备方法为：将地衣芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行培养，得到菌体浓度为1×108cfu/ml的地衣芽孢杆菌种子液。
实施例3
本发明发酵培养基中各主要成分含量：
设置对照组来检验菌株对培养基主要成分含量的影响，对照组1：仅采用绿色木霉；对照组2：仅采用地衣芽孢杆菌。具体结果见表1：
表1
| 成分指标 | 糖组分g/L | 大分子蛋白（5万Da以上） | 小分子蛋白（5万Da以下） | 钙离子mg/L | 钾离子mg/L | 二价铁离子mg/L |
| 实施例1 | 72.6 | 19.1 | 25.4 | 126.7 | 309.5 | 60.8 |
| 对照组1 | 61.5 | 14.5 | 14.1 | 85.8 | 221.6 | 41.8 |
| 对照组2 | 37.9 | 20.5 | 11.7 | 66.4 | 148.8 | 32.5 |
如表1所示，与采用单一菌株的对照组1-2相比较，采用绿色木霉和地衣芽孢杆菌联合处理获得的培养基组分更丰富全面，符合谷氨酸棒杆菌发酵产酸的使用标准。
实施例4
发酵培养基产酸性能测试：
对照组1：葡萄糖80g/L，酵母膏30g/L，玉米浆10g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸亚铁0.2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，生物素10mg/L，维生素B1 2mg/L；
对照组2：葡萄糖80g/L，酵母膏30g/L，玉米浆10g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸亚铁0.2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，乙酸钙200mg/L，甘露醇50mg/L，生物素10mg/L，维生素B1 2mg/L；
具体发酵工艺参照实施例1，具体的发酵产酸量见表2：
表2
| 组别 | 实施例1 | 对比例1 | 对比例2 |
| 赖氨酸产量mg/100ml | 14.1 | 11.9 | 12.7 |
| 生物量g/L（干重） | 14.7 | 13.1 | 13.5 |
如表2所示，对照组1为常用发酵培养基，对照组2在常用培养基的基础上添加了乙酸钙和甘露醇，与对照组1-2相比，实施例1的生物量和产酸量均最高，说明实施例1发酵培养基的培养效果更好。
实施例5
乙酸钙和甘露醇添加量对发酵产赖氨酸量的影响：
以实施例1为实验例，维持其他组分不变的前提下，设定乙酸钙的浓度梯度分别为0、50、100、200、400、800mg/L，如图1所示，随着乙酸钙浓度的增加，赖氨酸产量不断提高，当添加量增加到100mg/L后，产量增幅并不明显，200mg/L以后，产量有所降低，因此，本发明选择100－200mg/L的添加量。
以实施例1为实验例，维持其他组分不变的前提下，设定甘露醇的浓度梯度分别为0、25、50、100、200、400mg/L，如图2所示，随着甘露醇浓度的增加，赖氨酸产量也随着提高，当添加量增加到100mg/L时，赖氨酸产量达到最大值，随着甘露醇添加量的增大，赖氨酸产量有所降低，因此，本发明选择选择50－100mg/L的添加量。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.赖氨酸的生产、提取以及纯化工艺，其包括如下步骤：
步骤1）制备种子液；
步骤2）制备发酵培养基；
步骤3）发酵生产赖氨酸；
步骤4）提取和纯化。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述步骤1）制备种子液，包括如下步骤：将产赖氨酸菌株接入种子培养基中，培养至密度为（3-5）×108cfu/mL的种子液；所述种子培养基的组分为：葡萄糖80g/L，酵母膏30g/L，玉米浆10g/L，磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水硫酸亚铁0.2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，生物素10mg/L，维生素B1 2mg/L。
3.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，所述步骤2）制备发酵培养基，包括如下步骤：
（1）将小麦秸秆破碎，然后与麦麸按照2：3的质量比混合，再粉碎至粒径为50目，然后添加到4-5倍重量的水中，以200rpm的搅拌速度边搅拌边升温至60℃，保温条件下，超声处理20-30min，超声功率为500W，然后121℃蒸汽处理10min，自然冷却至室温，即得复合物；
（2）将绿色木霉种子液和地衣芽孢杆菌种子液按照1-2:2-3的体积比混合，得到混合接种液，将混合接种液按照6-8%的接种量接入到步骤（1）所得复合物中进行培养，温度为30℃，培养时间为72-96h，得到培养液；
（3）超声处理培养液，超声时间为30-60min，超声功率为500W，再调整温度为55℃，加硫酸调整pH为6，分别加入溶菌酶和酸性蛋白酶，溶菌酶的添加量为2万U：1L溶液，酸性蛋白酶的添加量为1万U：1L溶液，保温条件下，酶解12-24小时，然后过滤，收集滤过液， 100℃灭酶5min，自然冷却至室温，再添加相同体积的水、适量乙酸钙和甘露醇，搅拌均匀，121℃蒸汽处理5min，自然冷却至室温，即得发酵培养基。
4.根据权利要求2或3所述的工艺，其特征在于，所述步骤3）发酵生产赖氨酸，包括如下步骤：将种子液按照5-10％的接种量接种至含有发酵培养基的发酵罐中，进行好氧发酵，发酵温度为32-35℃，罐压为0.05MPa，发酵48-60小时得到发酵液。
5.根据权利要求4所述的工艺，其特征在于，所述步骤4）提取和纯化，包括如下步骤：
往发酵液中加盐酸调pH至5.5，利用碟片离心机进行固液分离，收集液体，泵入脱色罐进行脱色处理，脱色罐中添加占液体质量0.5-0.8%的活性炭，脱色30min，然后离心去除活性炭，收集上清液，再添加盐酸调pH至4.9，进入浓缩结晶器中蒸发浓缩，控制温度40℃、真空度为-0.09Mpa，待蒸发浓缩至原体积的三分之一到四分之一时，进行离心分离，收集湿晶体，烘干即得。
6.根据权利要求3所述的工艺，其特征在于，所述绿色木霉种子液的制备方法为：将绿色木霉划线接种在PDA培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到PDA液体培养基进行培养，得到绿色木霉种子液。
7.根据权利要求3所述的工艺，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌种子液的制备方法为：将地衣芽孢杆菌接种到LB固体培养基上培养，得到单菌落；挑取单菌落接种到LB液体培养基上进行培养，得到地衣芽孢杆菌种子液。
8.根据权利要求3所述的工艺，其特征在于，所述乙酸钙的添加量为100-200mg/L 。
9.根据权利要求3所述的工艺，其特征在于，所述甘露醇的添加量为50-100mg/L。
10.根据权利要求1-9任其一所述的工艺制备的赖氨酸产品。
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