CN108794642A

CN108794642A - 一种嵌合抗原细胞受体及其应用

Info

Publication number: CN108794642A
Application number: CN201810733608.3A
Authority: CN
Inventors: 荆光军; 岳庆; 李成; 欧晓红
Original assignee: Ningbo Anobode Biological Medicine Technology Co Ltd
Current assignee: Ningbo Anobode Biological Medicine Technology Co Ltd
Priority date: 2018-07-05
Filing date: 2018-07-05
Publication date: 2018-11-13

Abstract

本发明公开了一种嵌合抗原细胞受体及其应用，涉及生物技术领域。该嵌合抗原细胞受体包括抗原结合结构域、以及分别与抗原结合结构域连接的α链和β链，抗原结合结构域为抗体的Fab片段，抗体具有与靶标蛋白特异性结合的特性。表达该嵌合抗原细胞受体的免疫细胞可以与靶细胞上的靶标蛋白结合，传递激活信号并激活免疫细胞，从而对表达靶标蛋白的靶细胞进行杀伤，且该过程不用依赖MHC分子递呈靶标蛋白；该嵌合抗原细胞受体可应用于制备相应的肿瘤药物，用于恶性肿瘤细胞的清除、自身免疫疾病治疗等领域。

Description

一种嵌合抗原细胞受体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种嵌合抗原细胞受体及其应用。

背景技术

哺乳动物体内的T细胞抗原受体(TCR)识别与主要组织相容性复合体(MHC)结合的蛋白肽段，这些蛋白肽段-MHC复合物通常展示在不同类型的异常细胞膜表面，这些来源于病原体的蛋白多肽-MHC复合物或者来源于肿瘤新生抗原肽-MHC复合物是体内异常细胞上的分子标记物。

天然T细胞受体(TCR)是一个多亚基构成的抗原特异性跨膜复合物，可以介导抗原特异性激活T细胞。TCR由两种不同的多肽链组成(如图1示意图)，T细胞受体α链和T细胞受体β链。两条链分别有一个N端的可变区(V区)和一个C端的恒定区(C区)，两条链之间形成一个二硫键。TCR通过识别抗原多肽-MHC复合物从而赋予T细胞抗原特异性，所述抗原多肽-MHC复合物包含有主要组织相容性复合物呈递在靶细胞上的蛋白质短链氨基酸序列(如图2示意图)。

TCR识别该抗原肽需要同时接触MHC分子和抗原肽两部分。在与由MHC类分子呈递的抗原肽接触后，幼稚CD8+细胞毒性T细胞剧烈增殖并获得特异性的抗原表型和功能特性，使其充当效应T细胞，并通过诱导靶细胞凋亡或自身释放裂解颗粒来消除表达靶标抗原的肿瘤细胞或其他异常细胞。TCR受体具有高度的特异性，通常天然状态下自发形成的TCR受体亲和力普遍较低，且与蛋白抗原肽-MHC复合物的识别过程受到MHC分子类型的限制，而目前已经鉴定出来的人MHC分子种类超过三百种，几乎不可能针对每一种MHC分子和对应的抗原肽筛选一个特异的TCR，这就严重限制了TCR受体在过继免疫细胞治疗领域的应用。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人工改造的嵌合抗原细胞受体，该嵌合抗原细胞受体可以不受MHC分子的限制，可直接与相应的靶标蛋白结合。

本发明的另一目的在于提供一种分离的核酸。

本发明的另一目的在于提供一种载体。

本发明的另一目的在于提供一种细胞。

本发明的另一目的在于提供一种组合物。

本发明的另一目的在于提供上述的分离的核酸、载体以及细胞的应用。

本发明是这样实现的：

一种嵌合抗原细胞受体，其包括抗原结合结构域、以及分别与上述抗原结合结构域连接的α链和β链，上述抗原结合结构域为抗体的Fab片段，上述抗体具有与靶标蛋白特异性结合的特性。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述靶标蛋白选自CD19、CD22、CD20、BCMA、CD117、CD123、CD33、EGFRvIII、CD276、CLL1、GPC3和Claudin18.2中的任意一种。

但需要说明的是，本发明的靶标蛋白并不限于上述的抗原蛋白，也可以是其他的蛋白，至于选用何种蛋白作为抗原，均可以根据实际需求确定。将针对任意蛋白抗原的任意抗体的Fab片段应用到本发明中均属于本发明的保护范围。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述抗体为小鼠来源的单克隆抗体、兔来源的单克隆抗体、骆驼来源的单域抗体、鲨鱼来源的单域抗体、人源化抗体或全人抗体。

当然，需要说明的是，抗体的来源并不限于上述的来源，可以是任意动物来源的抗体。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，Fab片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；Fab片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.15所示。

具有SEQ ID NO.12的重链可变区和SEQ ID NO.15的轻链可变区形成的抗原结合结构域可以靶向人CD19蛋白。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述Fab片段的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述Fab片段的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

本研究发现，本发明提供的嵌合抗原细胞受体如果缺少抗体重链恒定区(CH1)和轻链恒定区(CL)后该嵌合抗原细胞受体的功能受到严重影响，丢失与靶标抗原的结合能力。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述α链由顺序连接的铰链区、跨膜区以及胞内活性信号结构域构成，上述α链的铰链区、跨膜区以及胞内活性信号结构域分别为哺乳动物细胞T细胞受体α链的铰链区(Hinge)、跨膜区(transmembrane)及胞内活性信号结构域(intracellular activation domain)。

优选的，上述α链的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述β链由顺序连接的铰链区、跨膜区以及胞内活性信号结构域构成，上述β链的铰链区、跨膜区以及胞内活性信号结构域分别为哺乳动物细胞T细胞受体β链的铰链区、跨膜区及胞内活性信号结构域。

优选的，上述β链的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

当然，需要说明的还有，在本发明的一些实施例方案中，α链的铰链区或β链的铰链区可以是任意的柔性多肽序列。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述细胞为免疫细胞。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述免疫细胞包括但不限于T细胞、NK细胞、粒细胞、B细胞等。

需要说明的是，在本发明的一些实施方案中，α链与Fab片段的重链恒定区连接即α链的N端与Fab片段的重链恒定区的C端连接，这样重链可变区、重链恒定区、α链构成第一链。

β链与Fab片段的轻链恒定区连接即β链的N端与Fab片段的轻链恒定区的C端连接，这样轻链可变区、轻链恒定区以及β链构成第二连。

或者，在本发明的另一些实施方案中，α链与Fab片段的轻链恒定区连接构成第一链，β链与Fab片段的重链恒定区连接构成第二链。即，α链的N端与Fab片段的轻链恒定区的C端连接，β链的N端与Fab片段的重链恒定区的C端连接。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述嵌合抗原细胞受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。该SEQ ID NO.19所示的嵌合抗原细胞受体可以特异性结合CD19蛋白。

抗体是一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白，由四条异源性多肽链组成，各肽链之间由数量不等的链间二硫键连接，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavy chain，HC)，而分子量较小的两条链称为轻链(Light chain，LC)。同一抗体分子中的两条重链和两条轻链的氨基酸组成完全相同(如图3示意图)，其中每一对重链可变区(VH)和对应的CH1恒定区与轻链可变区(VL)和对应的恒定区CL之间通过二硫键连接，形成的抗原结合片段(Fab)具有与抗原蛋白结合的特性(如图4示意图)，而且Fab结构稳定性以及对靶标抗原的亲和力都比由重链可变区与轻链可变区直接融合表达的单链抗体(scFv)更有显著优势。

本发明结合了天然T细胞受体在免疫细胞激活及清除体内异常细胞和病原体中的作用以及抗体的抗原结合片段(Fab)的稳定性及其对靶标抗原的亲和力特性，构建出的嵌合抗原细胞受体(如图5示意图)，该细胞受体对靶向抗原的识别是基于单克隆抗体的Fab片段，所以该人工嵌合受体与靶标抗原的识别过程区别于天然T细胞受体，不受抗原肽-MHC复合物的限制。

该嵌合抗原细胞受体与靶标蛋白的结合不受MHC种类的限制，其与靶标抗原的结合示意图如图6所示。该嵌合抗原细胞受体可以通过任意真核细胞表达载体进行表达，可以通过慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、脂质体转染、电转染等方法，将携带该嵌合抗原细胞受体编码基因的DNA片段或质粒转染至多种类型的免疫细胞内包括但不限于T细胞、NK细胞、粒细胞、B细胞等。表达该嵌合抗原细胞受体的免疫细胞与靶细胞上的靶抗原结合后，可以传递激活信号并激活免疫细胞，从而对表达靶抗原的靶细胞进行杀伤；该方法可应用于恶性肿瘤细胞的清除、自身免疫疾病治疗等领域。

另一方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码如上所述的嵌合抗原细胞受体。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该分离的核酸中含有编码Fab片段的重链可变区(SEQ ID NO.12)的核酸序列，其如SEQ ID NO.23，该分离的核酸中还含有编码Fab片段的轻链可变区(SEQ ID NO.15)的核酸序列，其如SEQ ID NO.24。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该分离的核酸中含有编码Fab片段的重链恒定区(SEQ ID NO.13)的核酸序列，该核酸序列如SEQ ID NO.25。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该分离的核酸中含有编码Fab片段的轻链恒定区(SEQ ID NO.16)的核酸序列，该核酸序列如SEQ ID NO.26。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该分离的核酸中含有编码α链(SEQ IDNO.14)的核酸序列，该核酸序列如SEQ ID NO.27。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该分离的核酸中含有编码β链(SEQ IDNO.17)的核酸序列，该核酸序列如SEQ ID NO.28。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该分离的核酸中还含有用于驱动上述嵌合抗原细胞受体表达的启动子。

需要说明的是，上述的第一链和第二链可以由两个独立的启动子驱动表达，也可以用T2A(氨基酸序列为SEQ ID NO.1，核酸序列为SEQ ID NO.29)、P2A(氨基酸序列为SEQID NO.2，核酸序列为SEQ ID NO.30)、F2A(氨基酸序列为SEQ ID NO.3，核酸序列为SEQ IDNO.31)、E2A(氨基酸序列为SEQ ID NO.4，核酸序列为SEQ ID NO.32)或IRES(核酸序列为SEQ ID NO.22)等类似的多肽连接，由同一个启动子驱动表达。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述启动子为EF1a启动子(核酸序列如SEQ ID NO.5所示)、CMV启动子(核酸序列为SEQ ID NO.6所示)、pGK启动子(核酸序列为SEQID NO.7所示)、SV40启动子(核酸序列为SEQ ID NO.8所示)或CBH启动子(核酸序列为SEQID NO.9所示)。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该分离的核酸中还含有编码信号肽的核酸序列。

该信号肽序列可以是任意跨膜蛋白或分泌蛋白的信号肽。例如，可以是CD8a的信号肽(氨基酸序列为SEQ ID NO.10，核酸序列SEQ ID NO.33)或GMCSF的信号肽(氨基酸序列为SEQ ID NO.11，核酸序列SEQ ID NO.34)。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该分离的核酸的核酸序列如SEQ IDNO.18所示，编码如SEQ ID NO.19所示嵌合抗原细胞受体。SEQ ID NO.18所示的分离的核酸的表达元件组成示意图如图7所示。

进一步地，在本发明的一些实施方案中，该分离的核酸的核酸序列如SEQ IDNO.20所示，编码如SEQ ID NO.21所示嵌合抗原细胞受体。

相较于SEQ ID NO.19所示嵌合抗原细胞受体，SEQ ID NO.21所示嵌合抗原细胞受体缺乏重链恒定区和轻链恒定区。

本研究发现，嵌合抗原细胞受体中缺少抗体重链CH1恒定区和轻链CL恒定区后该嵌合抗原细胞受体的功能受到严重影响，丢失与靶标抗原的结合能力。

另一方面，本发明提供了一种载体，其含有如上所述的分离的核酸。

在本发明的一些实施方案中，该载体是真核细胞表达载体，例如可以是慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体等。

当然，该载体也可以是其他类型的载体。在实际的操作中，载体类别均可以根据实际需求选择，均属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明提供了一种细胞，其含有如上所述的分离的核酸且表达有如上所述的嵌合抗原细胞受体。

在本发明的一些实施方案中，该细胞为免疫细胞。

在本发明的一些实施方案中，上述免疫细胞选自T细胞、NK细胞、粒细胞和B细胞中的任意一种。

当然，需要说明的是，上述免疫细胞的类型并不限于T细胞、NK细胞、粒细胞或B细胞，也可以是其他类型的免疫细胞，无论是何种类型的细胞，只要其表达有如上所述的嵌合抗原细胞受体，均属于本发明的保护范围。

表达如上所述嵌合抗原细胞受体的免疫细胞与靶细胞上的靶标蛋白结合后，可以传递激活信号并激活免疫细胞，从而对表达靶标蛋白的靶细胞进行杀伤，且不用依赖MHC分子递呈靶标蛋白；该细胞可应用于制备相应的肿瘤药物，用于恶性肿瘤细胞的清除、自身免疫疾病治疗等领域。

另一方面，本发明提供了一种组合物，其包括如上所述的细胞以及药学上可接受的辅料。

另一方面，本发明提供了如上所述的分离的核酸、如上所述的载体或如上所述的细胞在制备治疗肿瘤或自身免疫疾病的药物中的应用。

例如，肿瘤可以是纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤或视网膜母细胞瘤等。

例如，自身免疫疾病可以是慢性淋巴性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、慢性溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬变、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎等；还有系统性自身免疫病如系统性红斑狼疮、口眼干燥综合征、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、结节性多动脉炎或Wegener肉芽肿病等。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为天然T细胞受体结构示意图。

图2为天然T细胞受体识别靶细胞抗原肽/MHC复合物示意图。

图3为抗体的结构示意图。

图4为抗体的抗原结合片段(Fab)示意图。

图5为本发明提供的嵌合抗原细胞受体的结构示意图。

图6为本发明提供的嵌合抗原细胞受体与靶标蛋白识别的示意图。

图7为本发明实施例中的编码嵌合抗原细胞受体的核酸序列的主要表达元件结构示意图。

图8为本发明实施例中的表达嵌合抗原细胞受体的慢病毒表达载体的结构示意图。

图9为本发明实验例1中的T细胞膜表面的嵌合抗原细胞受体T细胞与靶抗原CD19的FACS实验结果。

图10为本发明实验例1中的表达嵌合抗原细胞受体的T细胞对表达靶标抗原的肿瘤细胞的杀伤作用结果。

图11为本发明实验例1中的表达嵌合抗原细胞受体的T细胞白介素2的分泌表达水平。

图12为本发明实验例1中的表达嵌合抗原细胞受体的T细胞γ干扰素的分泌表达水平。

图13为本发明实验例1中的表达嵌合抗原细胞受体的T细胞小鼠体内杀伤靶细胞的作用。

图14为本发明实验例2中表达嵌合抗原受体的Jurkat细胞株表达白介素2的检测结果。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例以靶向人CD19蛋白为例，对本实施例的人工的嵌合抗原细胞受体的结构进行说明，如下：

该嵌合抗原细胞受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。

该嵌合抗原细胞受体包括抗原结合结构域、以及分别与所述抗原结合结构域连接的α链和β链，抗原结合结构域为抗CD19蛋白抗体的Fab片段，所述抗CD19蛋白抗体具有与靶标蛋白CD19特异性结合的特性。

其中，α链与Fab片段的重链恒定区连接，构成第一链，第一链包括Fab片段的重链可变区(SEQ ID NO.12)、Fab片段的人源化的重链CH1恒定区(SEQ ID NO.13)、来自T细胞受体α链的铰链区、跨膜区及胞内活性区域(SEQ ID NO.14，即本发明嵌合抗原细胞受体的α链)；

β链与Fab片段的轻链恒定区连接，构成第二链，第二链包括识别Fab片段的轻链可变区(SEQ ID NO.15)、Fab片段的人源化的抗轻链CL恒定区(SEQ ID NO.16)、来自T细胞受体β链的铰链区、跨膜区及胞内活性区域(SEQ ID NO.17，即本发明嵌合抗原细胞受体的β链)。

本实施例还提供了编码上述的嵌合抗原细胞受体的核酸序列，其如SEQ ID NO.18所示，该核酸序列含有的表达元件如图7所示，其从上游往下游依次包括：信号肽-重链可变区-重链恒定区-T细胞受体α链的铰链区、跨膜区及胞内活性区域-2A肽-信号肽-轻链可变区-轻链恒定区-T细胞受体β链的铰链区、跨膜区及胞内活性区域。

将上述嵌合抗原细胞受体的编码核酸序列(SEQ ID NO.18所示)进行全基因合成后，使用EcoRI/KpnI限制性内切酶切位点将合成的上述嵌合抗原细胞受体的编码核酸序列克隆至慢病毒表达载体LV6-EF1a-puroGFP中，获得携带上述嵌合抗原细胞受体编码序列的慢病毒表达载体LV6-EF1a-CAFabR-puroGFP，其结构如图8所示。

实施例2

嵌合抗原细胞受体慢病毒制备

(1)从液氮罐中取出HEK293T细胞，并迅速放入37℃水浴锅中解冻。在生物安全柜内，用移液器将管内的细胞悬液加入至含有5mL培养基的15mL离心管中，颠倒混匀，250xg室温离心10分钟。

(2)离心结束后，加入5mL完全培养基(DMEM、10％FBS)，轻轻吹打细胞团，然后将细胞悬液转移至10cm培养皿中，补充完全培养基(DMEM、10％FBS)至终体积10mL。将培养皿置于37℃、5％CO₂培养箱中过夜培养。

(3)制备脂质体/DNA复合物。取500uL PBS至无菌离心管中，分别加入22μg LV6-EF1a-CAFabR-puroGFP、12μg Lenti-Gag、9μg Lenti-Rev、5μg pTetOff、5μg pVSVG，移液枪上下吹打充分混匀后，加入500μL 1μg/μL脂质体，立即用移液器上下吹打混匀，室温下静置10-15分钟。

(4)从培养箱中取出293T细胞，在生物安全柜内，打开培养皿，将上述DNA/脂质体复合物逐滴加入培养皿中，充分混匀。将培养皿置于37℃、5％CO₂培养箱，培养6～8小时后，将含有转染试剂的培养基去掉，更换为新鲜的完全培养基。

(5)48小时后，收集皿中的培养基至无菌离心管中，2000xg、4℃离心10分钟，将上清通过0.45um的PES材质的滤膜过滤，取一个新的无菌超速离心管，加入含有病毒的培养基上清，使用贝克曼SW28转子配平后，20,000xg、4℃离心3小时。

(6)离心结束后，在生物安全柜中，小心将离心管中的液体吸去，加入1mL PBS或HBSS缓冲液将沉淀重悬，将病毒置于-80℃保存。

实施例3

嵌合抗原细胞受体T细胞制备

(1)将抗凝血样转移至一个15mL无菌离心管内，旋紧盖子，调整离心机离心力至800xg、离心降速设为最低，将血样室温离心20分钟。

(2)离心结束后，从离心机中取出离心管，用一次性移液器将上层浅黄色血清层丢弃；然后向下层的红色外周血细胞层加入等体积的生理盐水，旋紧离心管盖后，轻轻上下颠倒混匀。

(3)取出淋巴细胞分离液，并上下颠倒数次，充分混匀。

(4)在生物安全柜中，首先用一次性无菌移液管向15mL离心管中加入5mL淋巴细胞分离液，然后使用移液器小心将生理盐水稀释后的血样沿管壁缓慢添加至淋巴细胞分离试剂的上层。

(5)将离心机的离心力设置为800xg，转速下降速度设为最低，温度设为20℃，离心20分钟。

(6)离心结束后，轻轻的取出离心管，避免剧烈晃动或上下颠倒离心管，在生物安全柜内用一次性无菌移液器将处于中间的白色单核细胞层吸至一个新的无菌离心管中，加入等体积的生理盐水后，旋紧离心管盖，上下颠倒混匀，将离心机的离心力设置为800xg，离心5分钟，离心结束后，使用无菌移液器将上层液体全部吸出，然后加入5mL生理盐水，轻轻混匀后，取部分细胞悬液进行计数，并计算细胞总数，将离心机的离心力设置为800xg，离心5分钟。

(7)离心结束后，用无菌移液器将上层液体全部吸出，然后加入10mL预热至室温的完全培养基，然后上下颠倒混匀。

(8)洗涤Dynabeads

a)从冰箱中取出Dynabeads，使用涡旋振荡器震动45秒(若无涡旋振荡器，上下颠倒装有Dynabeads的管子5分钟，直至沉淀在管底的磁珠完全重悬)；

b)使用无菌移液器将Dynabeads转移至一个5mL无菌细胞冻存管中；根据Dynabeads:T＝1:1或3:1的比例计算所需Dynabeads的量。

c)加入相同体积的DPBS，使用移液器吹打混匀。

d)将5mL细胞冻存管插入磁极中间的孔内，室温静置1分钟，保持冻存管插在磁极的孔内，轻轻倒置，将管内的液体倒出。

e)将冻存管从磁极孔内取出，用移液器加入和C)步骤相同体积的DPBS，使用移液器吹打混匀。

(9)将洗涤后的beads和PBMC混合，室温(≈20℃)孵育30分钟。

(10)向管中加入适当体积的X-Vivo 15培养基(体积根据5mL细胞冻存管插入磁极孔中的位置添加培养基)，充分混匀。

(11)将5mL细胞冻存管插入磁极孔中，室温静置1分钟，保持冻存管插在磁极的孔内，轻轻倒置，将管内的液体倒出。

(12)将细胞冻存管从磁极中取出，加入3mL X-Vivo 15培养基(含200IU/mL白介素2、10ng/mL白介素7、5ng/mL白介素15、5ng/mL白介素21)，用移液器重悬细胞和beads混合物，并调整细胞密度至0.5～1x10⁶个细胞/mL。

(13)将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中连续3天。从第三天开始，每天轻轻吹打培养体系中的beads/细胞团，至完全分开；每天对细胞进行一次计数(取50μL细胞悬液，使用血球计数板在显微镜下计数)，当细胞密度>1x10⁶个/mL时，添加新鲜的培养基调整细胞密度至0.5x10⁶个/mL。

(14)按照MOI＝10-20，计算所需要的病毒量。计算公式如下：

所需病毒量(mL)＝(MOI*细胞数量)/病毒滴度

(15)从-80℃超低温冰箱中，取出慢病毒，迅速在37℃水浴锅中解冻。

(16)使用75％的医用酒精对贮存病毒的冻存管外表面进行消毒处理。

(17)从培养箱中取出准备的T细胞，向培养器皿中加入polybrene至终浓度为6μg/mL，加入上述计算所得的病毒量，用移液器轻轻吹打充分混匀，使所有细胞/beads团吹散后，使用封口膜将培养器皿密封，800xg室温离心1小时。

(18)离心结束后，撕掉封口膜，将培养器皿置于37℃5％CO₂的培养箱中，继续培养24小时。

(19)250xg离心10分钟，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的培养器皿中，继续培养5天。每天轻轻吹打培养体系中的beads/细胞团，至完全分开；每天对细胞进行一次计数(取50μL细胞悬液，使用血球计数板在显微镜下计数)，当细胞密度>1x10⁶个/mL时，添加新鲜的培养基调整细胞密度至0.5x10⁶个/mL。

(20)取部分细胞使用FACS检测T细胞表面嵌合抗原细胞受体分子的表达。

实验例1

1.嵌合抗原细胞受体T细胞对靶细胞体外杀伤实验

(1)调整靶细胞状态至对数生长期，在进行实验前需连续传代2次；

(2)用胰酶将贴壁的靶细胞消化重悬于完全培养基中，调整细胞密度至5*10⁵个/mL，取一块新的96孔板，按照100μL/孔的量接种靶细胞。96孔板四周未用的孔，每孔加入100μL无菌水，以防中间的实验孔水分蒸发。将孔板置于5％CO₂、37℃培养箱中，过夜培养。

(3)离心收集上述4.3制备的嵌合抗原细胞受体-T细胞，使用无血清的1640培养基重悬；从培养箱中取出96孔板，将孔中的培养基完全吸出，用无菌PBS轻轻将细胞洗涤一遍，然后按照上述E/T比例，加入嵌合抗原细胞受体-T细胞，并将最终体积补至100μL/孔；Maxilysis和Mini lysis为接种同样数量的靶细胞，但是不加嵌合抗原细胞受体-T细胞。将孔板置于5％CO₂、37℃培养箱中，培养6小时。

(4)培养结束后，将孔板从培养箱中取出，向Maxi lysis孔加入LDH检测试剂盒中的裂解液，将其中的靶细胞完全裂解后，1200xg室温离心96孔板5分钟，轻轻的将板取出，从每孔中转移50μL至另一个新的96孔板中，加入LDH检测试剂后，使用酶标仪读取OD值。

(5)靶细胞裂解百分数计算公式：

(6)将上述处理后的数据使用GraphPad 5.0进行作图。

2.嵌合抗原细胞受体T细胞对靶细胞体内杀伤实验

(1)6周龄雌性NSG小鼠10只，平均体重18.3-23.5g，饲养于恒温恒湿的独立通风盒内，饲养室温度22-23℃，湿度56-60％，10-20次/小时换气，昼夜明暗交替时间12h/12h；持续供给经钴60放射灭菌鼠全价颗粒饲料，不限量自由摄取，饮用自来水(高压蒸汽灭菌后使用)，饮水瓶不间断供水，自由摄取。

(2)Nalm6-Luc细胞培养在含10％胎牛血清的DMEM培养液中。该细胞由我公司实验室自行制备保种，收集指数生长期的细胞，PBS重悬至适合浓度用于接种。

(3)所有小鼠经尾静脉输注Nalm6-Luc细胞，每只接种5*10⁶个肿瘤细胞，小鼠连续饲养5天后，腹腔注射荧光素酶底物D-luciferin，进行预实验观察肿瘤在小鼠体内的生长情况。根据肿瘤大小平均随机分为2组。

(4)其中一组小鼠为处理组，每只小鼠接种5*10⁶个表达嵌合抗原细胞受体T细胞；另一组小鼠为对照组，每只小鼠接种5*10⁶个对照T细胞。每隔5天对小鼠腹腔注射荧光素酶底物D-luciferin同时使用气体麻醉机对小鼠进行麻醉，采集肿瘤活体成像数据。

3.实验结果

3.1嵌合抗原细胞受体T细胞表面抗体Fab与靶蛋白的结合

取5*10⁶个表达嵌合抗原细胞受体的T细胞及相同数量的对照T细胞，分别与异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的CD19重组蛋白室温孵育30分钟，用生理盐水洗涤三次后，使用流式细胞仪分析重组T细胞膜表面嵌合抗原细胞受体与靶标蛋白CD19的结合情况。如图9所示(图9-图14中涉及的嵌合抗原FAB受体T细胞即代表表达本发明实施例的嵌合抗原细胞受体的T细胞)，表达在T细胞膜表面的嵌合抗原细胞受体可以识别靶标蛋白CD19，且不依赖MHC分子。

3.2嵌合抗原细胞受体T细胞体外杀伤靶细胞的作用

取表达嵌合抗原细胞受体T细胞及对照T细胞，按照不同的比例分别与表达CD19蛋白的肿瘤细胞Nalm6进行共培养实验，取共培养的培养基上清分别检测LDH的含量和细胞因子IL-2及IFN-γ。结果如图10所示，表达嵌合抗原细胞受体的T细胞可以高效的对表达靶标抗原的肿瘤细胞进行杀伤，在比例为1：1时就可以对40％的肿瘤细胞产生杀伤作用，随着嵌合抗原细胞受体的T细胞比例的升高，对肿瘤细胞的裂解效果迅速增强，在比例为5：1时，可完全清除所有的肿瘤细胞；在靶标细胞的刺激作用下，表达嵌合抗原细胞受体的T细胞被激活，表现为白介素2和γ干扰素分泌表达水平显著升高(如图11和图12所示)，并且随着嵌合抗原细胞受体的T细胞数量的增多，白介素2和γ干扰素分泌表达水平逐步上升，而对照T细胞对靶标细胞的刺激几乎没有产生任何显著的响应。证明表达嵌合抗原细胞受体的T细胞可特异性的识别靶标细胞，并向免疫T细胞内传递激活信号，导致靶标细胞的杀伤和细胞因子分泌水平上升。

3.3嵌合抗原Fab细胞受体T细胞小鼠体内杀伤靶细胞的作用

在小鼠体内移植肿瘤细胞，然后输注表达嵌合抗原细胞受体的T细胞，定期观察小鼠体内肿瘤细胞的生长情况，结果表明，输注对照T细胞的小鼠体内肿瘤细胞增殖迅速，而输注嵌合抗原细胞受体T细胞的小鼠体内肿瘤细胞随着时间的推移，完全被清除，表明表达嵌合抗原细胞受体的T细胞在体内亦可有效的清除小鼠体内的靶标细胞(图13)。

实验例2

验证重链恒定区和轻链恒定区对本发明提供的嵌合抗原受体的作用

实验方法：

1慢病毒制备

参考实施例1和实施例2的方法制备出表达不具有重链恒定区和轻链恒定区的嵌合抗原受体A(氨基酸序列如SEQ ID NO.21，编码序列SEQ ID NO.20)的慢病毒载体；嵌合抗原受体A较于实施例1的嵌合抗原受体的差别仅在于嵌合抗原受体A不具有重链恒定区和轻链恒定区。

1.1表达嵌合抗原受体的Jurkat细胞株构建方法如下：

(1)从液氮中复苏Jurkat细胞株，使用完全培养基RPMI1640、10％FBS的完全培养基进行培养，连续培养5代后，将细胞按照1*10⁶细胞/mL的密度接种至6孔板中；共接种3个孔，其中两个孔用表达嵌合抗原受体(分别带有恒定区的实施例2或不带恒定区的嵌合抗原受体A)的慢病毒进行感染，另一个孔作为对照细胞。

(2)向两个孔内分别加入20uL嵌合抗原受体慢病毒，用移液器轻轻吹打混匀后，将孔板置于离心机中，800xg、室温离心1小时。

(3)离心结束后，将孔板置于5％CO₂、37℃培养箱中，过夜培养。

(4)将孔板取出后，在生物安全柜内，向孔内加入嘌呤霉素至终浓度为1ug/mL。连续培养5天，直至对照孔内的细胞全部死亡，慢病毒感染孔内存活的细胞即为稳定表达嵌合抗原受体的Jurkat稳定细胞株。扩大培养后，进行共培养实验。

1.2表达嵌合抗原受体的Jurkat细胞与表达CD19的靶细胞Nalm6

(2)用RPMI1640、10％FBS培养基调整细胞密度至5*10⁵个/mL，取一块新的96孔板，按照100μL/孔的量接种靶细胞。离心收集上述制备的嵌合抗原细胞受体-Jurkat细胞，使用RPMI1640、10％FBS培养基重悬；然后按照图示的E/T比例，加入嵌合抗原细胞受体-Jurkat细胞，并将最终体积补至100μL/孔；对照为接种同样数量的靶细胞，但是加入不表达嵌合抗原细胞受体的对照Jurkat细胞。96孔板四周未用的孔，每孔加入100μL无菌水，以防中间的实验孔水分蒸发。将孔板置于5％CO₂ 37℃培养箱中，培养12小时。

(3)培养结束后，将孔板从培养箱中取出，1200xg室温离心96孔板5分钟，轻轻的将板取出，从每孔中转移50μL培养基上清，使用ELISA试剂盒检测白介素2的表达水平。

1.3结果

Jurkat细胞是一个T细胞系，在受到外源因素刺激下，可以高表达白介素2，这与天然T细胞的激活机制完全一致，因此可以作为一个模型细胞用于本发明的嵌合抗原受体功能评价。从图14的结果可以看出，带有抗体重链和轻链恒定区的嵌合抗原受体在靶细胞的激活作用下，可以有效的激活Jurkat细胞，表现为IL2的表达水平急剧升高。而去掉嵌合抗原受体的重链和轻链恒定区后，

Jurkat细胞的IL2表达水平与对照Jurkat细胞基本没有显著差异，表明重链和轻链恒定区对本发明中设计的嵌合抗原受体功能具有重要的影响。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 宁波安诺柏德生物医药科技有限公司

<120> 一种嵌合抗原细胞受体及其应用

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 2

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 3

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala

1 5 10 15

Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 4

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp

1 5 10 15

Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 5

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gagtaattca tacaaaagga ctcgcccctg ccttggggaa tcccagggac cgtcgttaaa 60

ctcccactaa cgtagaaccc agagatcgct gcgttcccgc cccctcaccc gcccgctctc 120

gtcatcactg aggtggagaa gagcatgcgt gaggctccgg tgcccgtcag tgggcagagc 180

gcacatcgcc cacagtcccc gagaagttgg ggggaggggt cggcaattga accggtgcct 240

agagaaggtg gcgcggggta aactgggaaa gtgatgtcgt gtactggctc cgcctttttc 300

ccgagggtgg gggagaaccg tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctttttcgca 360

acgggtttgc cgccagaaca caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg cctggcctct 420

ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa ttacttccac gcccctggct gcagtacgtg 480

attcttgatc ccgagcttcg ggttggaagt gggtgggaga gttcgaggcc ttgcgcttaa 540

ggagcccctt cgcctcgtgc ttgagttgag gcctggcttg ggcgctgggg ccgccgcgtg 600

cgaatctggt ggcaccttcg cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct agccatttaa 660

aatttttgat gacctgctgc gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc 720

caagatctgc acactggtat ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg 780

tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg 840

gggtagtctc aagctggccg gcctgctctg gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc 900

ccgccctggg cggcaaggct ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg 960

cttcccggcc ctgctgcagg gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg 1020

ggtgagtcac ccacacaaag gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac 1080

tccacggagt accgggcgcc gtccaggcac ctcgattagt tctcgagctt ttggagtacg 1140

tcgtctttag gttgggggga ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg 1200

gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt 1260

gagtttggat cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca 1320

tttcaggtgt cgtga 1335

<210> 6

<211> 603

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aagcttggga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 60

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 120

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 180

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 240

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 300

tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 360

ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 420

ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 480

tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 540

agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgactctact 600

aga 603

<210> 7

<211> 509

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aattctaccg ggtaggggag gcgcttttcc caaggcagtc tggagcatgc gctttagcag 60

ccccgctggg cacttggcgc tacacaagtg gcctctggcc tcgcacacat tccacatcca 120

ccggtaggcg ccaaccggct ccgttctttg gtggcccctt cgcgccacct tctactcctc 180

ccctagtcag gaagttcccc cccgccccgc agctcgcgtc gtgcaggacg tgacaaatgg 240

aagtagcacg tctcactagt ctcgtgcaga tggacagcac cgctgagcaa tggaagcggg 300

taggcctttg gggcagcggc caatagcagc tttgctcctt cgctttctgg gctcagaggc 360

tgggaagggg tgggtccggg ggcgggctca ggggcgggct caggggcggg gcgggcgccc 420

gaaggtcctc cggaggcccg gcattctgca cgcttcaaaa gcgcacgtct gccgcgctgt 480

tctcctcttc ctcatctccg ggcctttcg 509

<210> 8

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gtgtgtcagt tagggtgtgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatgcaaagc 60

atgcatctca attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga 120

agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc 180

atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt 240

tttatttatg cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga 300

ggcttttttg gaggcctagg cttttgcaaa 330

<210> 9

<211> 650

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agagctagaa atagcaagtt aaaataaggc tagtccgttt ttagcgcgtg cgccaattct 60

gcagacaaat ggctctagag gtacccgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 120

gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caatagtaac gccaataggg actttccatt 180

gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 240

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattgtg 300

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 360

ctattaccat ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct 420

ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg 480

gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga 540

ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg 600

cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg 650

<210> 10

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile

1 5 10 15

Ser

<210> 12

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 13

<211> 99

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu

<210> 14

<211> 160

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Phe Gly Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro

1 5 10 15

Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser

20 25 30

Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser

35 40 45

Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg

50 55 60

Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser

65 70 75 80

Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu

100 105 110

Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val

115 120 125

Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu

130 135 140

Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly

145 150 155 160

<210> 15

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

100 105

<210> 16

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

1 5 10 15

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

20 25 30

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

35 40 45

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

65 70 75 80

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

85 90 95

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100

<210> 17

<211> 189

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val

1 5 10 15

Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser

20 25 30

His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro

35 40 45

Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser

50 55 60

Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn

65 70 75 80

Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe

85 90 95

Trp Gln Asp Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly

100 105 110

Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr

115 120 125

Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr

130 135 140

Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu

145 150 155 160

Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu

165 170 175

Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly

180 185

<210> 18

<211> 2508

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggctc tgcttctgca tgccgccaga 60

cctgacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggagat cacagccgct cctagcgtgt tcatcttccc accttccgac 420

gagcagctga aaagcggcac agcctctgtc gtgtgcctgc tgaacaactt ctaccccaga 480

gaagccaagg tgcagtggaa ggtggacaac gccctgcaga gcggcaatag ccaagagagc 540

gtgaccgagc aggacagcaa ggactctacc tacagcctga gcagcaccct gacactgagc 600

aaggccgact acgagaagca caaagtgtac gcctgcgaag tgacccacca gggcctttct 660

agccctgtga ccaagagctt caaccggggc gagtgttttg gcgagggaag cagactgacc 720

gtgctggaag atctgaagaa cgtgttccca cctgaggtgg ccgtgttcga gccttctgag 780

gccgagatca gccacacaca gaaagccaca ctcgtgtgtc tggccaccgg cttctatccc 840

gatcacgtgg aactgtcttg gtgggttaac ggcaaagagg tgcactccgg cgtctgcaca 900

gatccccagc ctctgaaaga acagcccgct ctgaacgaca gcagatacgc cctgtccagc 960

aggctgagag tgtccgccac attctggcag gaccccagaa accacttcag atgccaggtg 1020

cagttctacg gcctgagcga gaacgatgag tggacccagg atagagccaa gcctgtgact 1080

cagatcgtgt ctgccgaagc ctggggcaga gccgattgtg gctttaccag cgagagctac 1140

caacagggcg tgctgtctgc caccatcctg tacgagatcc tgctgggcaa agccactctg 1200

tacgccgtgc tggtgtctgc cctggtgctg atggccatgg tcaagcggaa agacagcaga 1260

ggcgaaggca gaggctctct gctgacatgt ggcgacgtgg aagagaaccc cggacctatg 1320

tggctgcagt ctttgctgct gctgggaacc gtggcctgta gcatctctga ggtgaaactg 1380

caggagtcag gacctggcct ggtggcgccc tcacagagcc tgtccgtcac atgcactgtc 1440

tcaggggtct cattacccga ctatggtgta agctggattc gccagcctcc acgaaagggt 1500

ctggagtggc tgggagtaat atggggtagt gaaaccacat actataattc agctctcaaa 1560

tccagactga ccatcatcaa ggacaactcc aagagccaag ttttcttaaa aatgaacagt 1620

ctgcaaactg atgacacagc catttactac tgtgccaaac attattacta cggtggtagc 1680

tatgctatgg actactgggg ccaaggaacc tcagtcaccg tctcctcagc ctctacaaag 1740

ggcccaagcg tgttcccgct ggctcctagc agcaagtcta caagcggagg aacagctgcc 1800

ctgggatgcc tggtcaagga ctactttcct gagccagtga ccgtgtcttg gaactctggc 1860

gctctgacaa gcggcgtgca cacatttcca gcagtgctgc agtccagcgg cctgtactct 1920

ctgtctagcg tggtcacagt gcccagctct agcctgggca cacagaccta catctgcaat 1980

gtgaaccaca agcctagcaa caccaaggtc gacaagaagg tggaatttgg cagaggcacc 2040

agcctgatcg tgcaccccta cattcagaac cccgatcctg ccgtgtacca gctgagagac 2100

agcaagagca gcgacaagag tgtgtgcctg ttcaccgact tcgacagcca gaccaacgtg 2160

tcccagagca aggacagcga cgtgtacatc accgataagt gcgtgctgga catgcggagc 2220

atggacttca agagcaacag cgccgtggct tggagcaaca agagcgattt cgcctgcgcc 2280

aacgccttca acaacagcat tatccccgag gacacattct tcccaagtcc tgagagcagc 2340

tgcgacgtga agctggtgga aaagagcttc gagacagaca ccaacctgaa cttccagaac 2400

ctgagcgtga tcggcttcag aatcctgctg ctgaaggtgg ccggcttcaa cctgctgatg 2460

accctgagac tgtggtccag ccgggccaag agatctggat ctggatga 2508

<210> 19

<211> 835

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 19

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe

245 250 255

Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val

260 265 270

Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp

275 280 285

Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro

290 295 300

Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser

305 310 315 320

Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His Phe

325 330 335

Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr

340 345 350

Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp

355 360 365

Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val

370 375 380

Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu

385 390 395 400

Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg

405 410 415

Lys Asp Ser Arg Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp

420 425 430

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu

435 440 445

Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly

450 455 460

Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val

465 470 475 480

Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro

485 490 495

Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr

500 505 510

Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp

515 520 525

Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp

530 535 540

Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser

545 550 555 560

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

565 570 575

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

580 585 590

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

595 600 605

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

610 615 620

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

625 630 635 640

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

645 650 655

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

660 665 670

Lys Val Glu Phe Gly Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val His Pro Tyr Ile

675 680 685

Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser

690 695 700

Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val

705 710 715 720

Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu

725 730 735

Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser

740 745 750

Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile

755 760 765

Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys

770 775 780

Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn

785 790 795 800

Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe

805 810 815

Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser Arg Ala Lys Arg Ser

820 825 830

Gly Ser Gly

835

<210> 20

<211> 1899

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggctc tgcttctgca tgccgccaga 60

cctgacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggagat cacatttggc gagggaagca gactgaccgt gctggaagat 420

ctgaagaacg tgttcccacc tgaggtggcc gtgttcgagc cttctgaggc cgagatcagc 480

cacacacaga aagccacact cgtgtgtctg gccaccggct tctatcccga tcacgtggaa 540

ctgtcttggt gggttaacgg caaagaggtg cactccggcg tctgcacaga tccccagcct 600

ctgaaagaac agcccgctct gaacgacagc agatacgccc tgtccagcag gctgagagtg 660

tccgccacat tctggcagga ccccagaaac cacttcagat gccaggtgca gttctacggc 720

ctgagcgaga acgatgagtg gacccaggat agagccaagc ctgtgactca gatcgtgtct 780

gccgaagcct ggggcagagc cgattgtggc tttaccagcg agagctacca acagggcgtg 840

ctgtctgcca ccatcctgta cgagatcctg ctgggcaaag ccactctgta cgccgtgctg 900

gtgtctgccc tggtgctgat ggccatggtc aagcggaaag acagcagagg cgaaggcaga 960

ggctctctgc tgacatgtgg cgacgtggaa gagaaccccg gacctatgtg gctgcagtct 1020

ttgctgctgc tgggaaccgt ggcctgtagc atctctgagg tgaaactgca ggagtcagga 1080

cctggcctgg tggcgccctc acagagcctg tccgtcacat gcactgtctc aggggtctca 1140

ttacccgact atggtgtaag ctggattcgc cagcctccac gaaagggtct ggagtggctg 1200

ggagtaatat ggggtagtga aaccacatac tataattcag ctctcaaatc cagactgacc 1260

atcatcaagg acaactccaa gagccaagtt ttcttaaaaa tgaacagtct gcaaactgat 1320

gacacagcca tttactactg tgccaaacat tattactacg gtggtagcta tgctatggac 1380

tactggggcc aaggaacctc agtcaccgtc tcctcatttg gcagaggcac cagcctgatc 1440

gtgcacccct acattcagaa ccccgatcct gccgtgtacc agctgagaga cagcaagagc 1500

agcgacaaga gtgtgtgcct gttcaccgac ttcgacagcc agaccaacgt gtcccagagc 1560

aaggacagcg acgtgtacat caccgataag tgcgtgctgg acatgcggag catggacttc 1620

aagagcaaca gcgccgtggc ttggagcaac aagagcgatt tcgcctgcgc caacgccttc 1680

aacaacagca ttatccccga ggacacattc ttcccaagtc ctgagagcag ctgcgacgtg 1740

aagctggtgg aaaagagctt cgagacagac accaacctga acttccagaa cctgagcgtg 1800

atcggcttca gaatcctgct gctgaaggtg gccggcttca acctgctgat gaccctgaga 1860

ctgtggtcca gccgggccaa gagatctgga tctggatga 1899

<210> 21

<211> 632

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 21

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Phe Gly Glu Gly Ser Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val

130 135 140

Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser

145 150 155 160

His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro

165 170 175

Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser

180 185 190

Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn

195 200 205

Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe

210 215 220

Trp Gln Asp Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly

225 230 235 240

Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr

245 250 255

Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr

260 265 270

Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu

275 280 285

Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu

290 295 300

Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly Glu Gly Arg

305 310 315 320

Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met

325 330 335

Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser

340 345 350

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

355 360 365

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

370 375 380

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

385 390 395 400

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

405 410 415

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

420 425 430

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

435 440 445

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

450 455 460

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Phe Gly Arg Gly Thr Ser Leu Ile

465 470 475 480

Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg

485 490 495

Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp

500 505 510

Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr

515 520 525

Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser

530 535 540

Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe

545 550 555 560

Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser

565 570 575

Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn

580 585 590

Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu

595 600 605

Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser

610 615 620

Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly

625 630

<210> 22

<211> 608

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cgcccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg 60

tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc 120

cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa 180

ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga 240

caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc 300

ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc 360

cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac 420

aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 480

tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac 540

ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga tgataagctt gccacaaccc acaaggagac 600

gaccttcc 608

<210> 23

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gaggtgaaac tgcaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccgtc 60

acatgcactg tctcaggggt ctcattaccc gactatggtg taagctggat tcgccagcct 120

ccacgaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggta gtgaaaccac atactataat 180

tcagctctca aatccagact gaccatcatc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatttact actgtgccaa acattattac 300

tacggtggta gctatgctat ggactactgg ggccaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360

<210> 24

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggagatcac a 321

<210> 25

<211> 297

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gcctctacaa agggcccaag cgtgttcccg ctggctccta gcagcaagtc tacaagcgga 60

ggaacagctg ccctgggatg cctggtcaag gactactttc ctgagccagt gaccgtgtct 120

tggaactctg gcgctctgac aagcggcgtg cacacatttc cagcagtgct gcagtccagc 180

ggcctgtact ctctgtctag cgtggtcaca gtgcccagct ctagcctggg cacacagacc 240

tacatctgca atgtgaacca caagcctagc aacaccaagg tcgacaagaa ggtggaa 297

<210> 26

<211> 312

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gccgctccta gcgtgttcat cttcccacct tccgacgagc agctgaaaag cggcacagcc 60

tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac cccagagaag ccaaggtgca gtggaaggtg 120

gacaacgccc tgcagagcgg caatagccaa gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac 180

tctacctaca gcctgagcag caccctgaca ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaaa 240

gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc ctttctagcc ctgtgaccaa gagcttcaac 300

cggggcgagt gt 312

<210> 27

<211> 480

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tttggcagag gcaccagcct gatcgtgcac ccctacattc agaaccccga tcctgccgtg 60

taccagctga gagacagcaa gagcagcgac aagagtgtgt gcctgttcac cgacttcgac 120

agccagacca acgtgtccca gagcaaggac agcgacgtgt acatcaccga taagtgcgtg 180

ctggacatgc ggagcatgga cttcaagagc aacagcgccg tggcttggag caacaagagc 240

gatttcgcct gcgccaacgc cttcaacaac agcattatcc ccgaggacac attcttccca 300

agtcctgaga gcagctgcga cgtgaagctg gtggaaaaga gcttcgagac agacaccaac 360

ctgaacttcc agaacctgag cgtgatcggc ttcagaatcc tgctgctgaa ggtggccggc 420

ttcaacctgc tgatgaccct gagactgtgg tccagccggg ccaagagatc tggatctgga 480

<210> 28

<211> 567

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tttggcgagg gaagcagact gaccgtgctg gaagatctga agaacgtgtt cccacctgag 60

gtggccgtgt tcgagccttc tgaggccgag atcagccaca cacagaaagc cacactcgtg 120

tgtctggcca ccggcttcta tcccgatcac gtggaactgt cttggtgggt taacggcaaa 180

gaggtgcact ccggcgtctg cacagatccc cagcctctga aagaacagcc cgctctgaac 240

gacagcagat acgccctgtc cagcaggctg agagtgtccg ccacattctg gcaggacccc 300

agaaaccact tcagatgcca ggtgcagttc tacggcctga gcgagaacga tgagtggacc 360

caggatagag ccaagcctgt gactcagatc gtgtctgccg aagcctgggg cagagccgat 420

tgtggcttta ccagcgagag ctaccaacag ggcgtgctgt ctgccaccat cctgtacgag 480

atcctgctgg gcaaagccac tctgtacgcc gtgctggtgt ctgccctggt gctgatggcc 540

atggtcaagc ggaaagacag cagaggc 567

<210> 29

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

gaaggcagag gcagcctgct tacatgtggc gacgtggaag agaaccccgg acct 54

<210> 30

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ggatctggcg ccaccaattt cagcctgctg aaacaggctg gcgacgtgga agagaaccct 60

ggacct 66

<210> 31

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

ggatctggcg tgaagcagac cctgaacttc gacctgctga aactggccgg cgacgtggaa 60

agcaatcctg gacct 75

<210> 32

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ggctctggcc agtgtaccaa ttacgccctg ctgaaactgg ccggcgacgt ggaatctaac 60

cctggacct 69

<210> 33

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

atggctctgc ctgtgacagc tctgctgctg cctctggctc tgcttctgca tgccgccaga 60

cct 63

<210> 34

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

atgtggctgc agtctttgct gctgctggga accgtggcct gtagcatctc t 51

Claims

1.一种嵌合抗原细胞受体，其特征在于，其包括抗原结合结构域、以及分别与所述抗原结合结构域连接的α链和β链，所述抗原结合结构域为抗体的Fab片段，所述抗体具有与靶标蛋白特异性结合的特性。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原细胞受体，其特征在于，所述抗体为小鼠来源的单克隆抗体、兔来源的单克隆抗体、骆驼来源的单域抗体、鲨鱼来源的单域抗体、人源化抗体或全人抗体。

3.根据权利要求1-2任一项所述的嵌合抗原细胞受体，其特征在于，Fab片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；Fab片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.15所示。

4.根据权利要求1-2任一项所述的嵌合抗原细胞受体，其特征在于，所述Fab片段的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

5.根据权利要求1-2任一项所述的嵌合抗原细胞受体，其特征在于，所述Fab片段的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

6.根据权利要求1-2任一项所述的嵌合抗原细胞受体，其特征在于，

所述α链由顺序连接的铰链区、跨膜区以及胞内活性信号结构域构成，所述α链的铰链区、跨膜区以及胞内活性信号结构域分别为哺乳动物细胞T细胞受体α链的铰链区、跨膜区及胞内活性信号结构域；

优选的，所述α链的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

7.根据权利要求1-2任一项所述的嵌合抗原细胞受体，其特征在于，

所述β链由顺序连接的铰链区、跨膜区以及胞内活性信号结构域构成，所述β链的铰链区、跨膜区以及胞内活性信号结构域分别为哺乳动物细胞T细胞受体β链的铰链区、跨膜区及胞内活性信号结构域；

优选的，所述β链的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

8.一种细胞，其特征在于，其表达有权利要求1-7任一项所述的嵌合抗原细胞受体。

9.一种组合物，其特征在于，其包括权利要求8所述的细胞以及药学上可接受的辅料。

10.权利要求8所述的细胞在制备治疗肿瘤或自身免疫疾病的药物中的应用。