CN108715823B - 一种用于制备芒果苷糖苷的菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于制备芒果苷糖苷的菌株及其应用，属生物制药技术领域。用于制备芒果苷糖苷的菌株，是Microbacterium thalassium NJ16，保藏号为CCTCC NO：M 2013154。本发明还提供采用所述菌株制备芒果苷糖苷的方法，包括采用NJ16在非水相中催化芒果苷和糖基供体进行反应，得到芒果苷糖苷的步骤。本发明是利用用于芒果苷糖苷合成的微生物细胞NJ16的胞外酶催化制备芒果苷糖苷，将细胞固定化后，实现了芒果苷糖苷的高效制备和催化剂的重复使用，显著降低了生产成本，缩短制备时间。

Description

一种用于制备芒果苷糖苷的菌株及其应用

技术领域

本发明属生物制药技术领域，具体涉及一种用于制备芒果苷糖苷的菌株及其应用。

背景技术

芒果苷是一种四羟基吡酮的碳酮苷，属黄酮类化合物，具有如抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等多种生物活性，在多种植物中存在，其分子式为C₁₉H₁₈O₁₁，分子量为422.3。

由于芒果苷的水溶性较差，通过结构修饰进行糖基化，可提高其溶解度。如：Cantagrel 等（欧洲专利公开号：FR 2882762 (A1)）以肠膜状明串珠菌来源的葡萄糖基转移酶，对芒果苷进行糖基化修饰，得到葡萄糖基-β-(1,6)-芒果苷（CASRN：908570-23-0）。肠膜状明串珠菌Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299和NRRL 521-F菌株，在0.4g/L芒果苷，40g/L蔗糖条件下，糖基化反应收率为分别为25%和 28%。

通过生物转化对天然产物进行结构修饰，具有转化反应条件温和，转化产物简单易分离等优点，糖基化修饰后，化合物溶解度可显著提高。但是，现有技术中，通过生物转化法制备芒果苷糖苷，还存在转化率不高，胞外酶易失活不能重复使用，成本较高等问题。

发明内容

本发明目的是提供了一株可用于芒果苷糖苷合成的微生物细胞Microbacterium thalassium NJ16（CCTCC M 2013154）。

本发明的另一目的是提供一种了非水相体系中固定化细胞合成芒果苷糖苷及产物分离的方法。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

一种用于制备芒果苷糖苷的菌株，是Microbacterium thalassium NJ16，保藏号为CCTCC NO：M 2013154。

本发明还提供所述菌株在制备芒果苷糖苷中的应用。

本发明还提供采用所述菌株制备芒果苷糖苷的方法，包括采用Microbacterium thalassium NJ16在非水相中催化芒果苷和糖基供体进行反应，得到芒果苷糖苷的步骤。

在本发明中，所述糖基供体为蔗糖。

在本发明中，反应溶剂是亲水性有机溶剂和pH为4.0~9.0缓冲液的混合物，所述亲水性有机溶剂的体积百分含量为10%~30%，所述亲水性有机溶剂选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇中的一种或者两种以上的混合物。

优选的技术方案中，Microbacterium thalassium NJ16固定化后在非水相中催化芒果苷和糖基供体进行反应；固定化方法如下：将Microbacterium thalassium NJ16悬浮液与海藻酸钠溶液混合均匀后，滴至CaCl₂溶液中，形成固定化细胞小球；Microbacterium thalassium NJ16悬浮液的OD₆₈₀为4.0-6.0，Microbacterium thalassium NJ16悬浮液与海藻酸钠溶液混合后海藻酸钠的浓度为10-50g/L，CaCl₂溶液的浓度为10-40g/L，其中固定化细胞包埋量为20~60%。

优选的技术方案中，在转化体系中，芒果苷的浓度为1~50g/L，蔗糖的浓度为20~200 g/L；固定化细胞与转化体系的体积比为5～50:100，所述转化体系是在反应溶剂中添加芒果苷和蔗糖后形成的；反应温度为15~45℃，反应时间为1~24h。

优选的技术方案中，Microbacterium thalassium NJ16采用发酵培养基在20~40℃发酵培养6~24h，所述发酵培养基含有如下成分：蔗糖 5~40 g/L，酵母粉2~30 g/L，KH₂PO₄0.5~5 g/L， MgSO₄ 0.1~2g/L，pH 6~8。

在本发明中，芒果苷糖苷采用如下方法纯化：反应结束后，过滤收集固定化细胞，采用AB-8型大孔树脂层析分离滤液中的芒果苷糖苷。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果在于：

首先，本发明提供了一种新的用于芒果苷糖苷合成的微生物细胞Microbacterium thalassium NJ16，该菌株能够产生催化芒果苷糖基化反应的胞内酶，因此催化酶不易失活、易于重复使用，产物易于分离。

其次，本发明将固定化技术与非水相体系相结合，实现了芒果苷糖苷的高效制备和催化剂的重复使用，显著降低了生产成本，缩短制备时间。

附图说明

图1显示了果糖基-β(2,6)-芒果苷的分子结构。

图2显示了果糖基-β(2,6)-芒果苷的H-H COSY谱图。

图3显示了果糖基-β(2,6)-芒果苷的C-H HSQC谱图。

图4显示了果糖基-β(2,6)-芒果苷的HMBC谱图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。

实施例1：用于制备芒果苷糖苷的菌株筛选及鉴定

筛选培养基：芒果苷 10g/L，玉米浆 1.5mL，硫酸铵 4g/L，硫酸镁 2g/L，磷酸二氢钾 3g/L，DMSO 20% (v/v)，pH7.0。发酵培养基：蔗糖 15 g/L，蛋白胨 5 g/L，酵母粉 3 g/L，磷酸二氢钾 1 g/L，硫酸镁 0.5 g/L，pH7.0。

可转化芒果苷菌种的筛选：取1 g土样，加入到盛有20 mL筛选培养基的三角瓶中，30℃、160 r/min振荡培养24 h，再以3%接种量转接3次。将培养菌液适当稀释后，以LB平板培养基稀释涂布，于30℃培养24 h，观察菌落形态，然后挑取单菌落在LB平板培养基进行划线分离获得单菌落，对单菌落编号并于超低温冻存保藏。

将筛选获得可转化芒果苷的菌株，以发酵培养基培养12 h后取发酵液5 mL，加入到150 mL带塞三角瓶中，另外加入底物溶液（其中含DMSO 20% (v/v)，芒果苷5 g/L，蔗糖100 g/L）至总体积达到20 mL，于30℃、160 r/min条件下转化24 h，转化液样品以HPLC检测。获得一株具有较高糖苷化芒果苷活性的菌株NJ16。

菌种鉴定：以通用方法提取具有糖苷化芒果苷活性菌株NJ16的基因组，进行16SrDNA片段PCR扩增、纯化及序列测定。以测序的16S rDNA序列利用BLAST程序与GenBank数据库进行相似性比较分析，鉴定为Microbacterium thalassium NJ16。该菌株已送中国典型培养物保藏中心进行专利菌种保藏，保藏信息如下：

分类命名为Microbacterium thalassium NJ16，保藏日期为2013年4月22日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏单位地址：武汉大学，保藏登记号为：CCTCC NO：M 2013154。

实施例2：制备Microbacterium thalassium NJ16固定化细胞

配制发酵培养基：蔗糖 25 g/L，酵母粉10 g/L，KH₂PO₄ 2.5 g/L，MgSO₄ 0.3 g/L，pH 7.0。

将40 ml发酵培养基装入250 ml三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌20 min后，接种Microbacterium thalassium NJ16，于30℃、180 rpm振荡发酵培养12小时，以获得的发酵液作为种子液接种至5L发酵罐中，发酵罐中发酵培养基装液量为70%，接种量为3%；然后在30℃、搅拌转速为300 rpm条件下发酵培养，通气量3 vvm，发酵培养6小时，取发酵液5000r/min离心10min，收集细胞并以生理盐水重新悬浮至OD_680nm为5.0。

配制60g/L的海藻酸钠溶液1L，将其放入高压灭菌锅中在121℃温度下灭菌20min，然后放入已灭菌的无菌操作台中冷却至室温。

取2LMicrobacterium thalassium NJ16悬浮液（OD_680nm为5.0）与3L海藻酸钠溶液（60g/L）混合均匀，用注射器吸取混合液，均匀滴至20g/L的CaCl₂溶液中，在4℃冰箱中放置12h进行固定化，此时固定化细胞包埋量为40%。用无菌水清洗固定化细胞，然后放入无菌水中在4℃冰箱内保存。

其中固定化细胞包埋量=Microbacterium thalassium NJ16悬浮液的体积/（Microbacterium thalassium NJ16悬浮液的体积+海藻酸钠溶液的体积）*100%。

实施例3：在非水相体系中采用固定化细胞生产芒果苷糖苷

将pH 6.5、浓度为1/15 mol/L的磷酸缓冲液（溶质为Na₂HPO₄和KH₂PO₄）与二甲基亚砜按照体积比为8:2混合，然后加入终浓度为20g/L的芒果苷和100g/L的蔗糖，得到体积为5L的非水相转化体系。将1L固定化细胞（实施例2制备），加入5L非水相转化体系中，在30℃、搅拌转速为200r/min条件下转化24h。过滤回收固定化细胞后，滤液（转化液）以10倍柱床体积、pH4.0的蒸馏水（采用冰乙酸调节pH）稀释，然后经AB-8大孔树脂吸附（层析柱40×800mm，流速20 ml/min），采用10倍柱床体积pH4.0的蒸馏水洗去残余的糖基供体（蔗糖），接着用10%-30%的甲醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，经40℃旋转蒸干得到产物。

产物的结构鉴定：

HRMS（高分辨质谱）给出产物准分子离子峰m/z 583.1324[M-H]^-，元素组成为C₂₅H₂₇O₁₆，M-H计算值583.1299，表明产物分子式为C₂₅H₂₈O₁₆，与芒果苷相比较增加了C₆H₁₀O₅，C₆H₁₀O₅为一个残糖基，推测转化产物是芒果苷单糖基化衍生物。

产物的¹H NMR显示出δ 6.36(1H, s), 6.86 (1H, s), 7.38 (1H, s)等3个烯氢信号，为芒果苷特征信号峰。δ 4.59 (1H, d, J=9.8 Hz)应为为芒果苷母核上葡萄糖的端基氢信号，且端基为β-构型。与芒果苷的NMR数据对照，数据基本无差异，表明芒果苷母核未发生变化，仅仅增加了1个糖基。

产物的¹³C NMR显示出25个碳信号，其中13个位于180-90 ppm范围，为芒果苷母核骨架碳信号，11个位于85-60 ppm 范围，应为2个糖基上的碳信号，与底物碳谱数据对照，其中位于δ 73.1 ppm 次甲基为芒果苷母核上葡萄糖的端基碳，以C-C键与苷元相连，位于δ104.2 ppm 季碳推测其为另一糖基的端基碳。

具体的碳谱和氢谱数据如下数据为：¹H-NMR(500 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm) =13.75(1H, s, OH₁₎, 7.38(1H, s, H₈), 6.86(1H, s, H₅), 6.36(1H, s, H₄), 4.59(1H,d, J=9.8 Hz, H_1'), 3.92-4.00(2H, m, H_2', H_4''), 3.77-3.89(2H, m, H_5', H_6'')，3.50-3.56(3H, m, H_5'', H_6', H_6''), 3.20-3.42(7H, m, H_2', H_3', H_4', H_6', 2H_1'', H_3''); ¹³C-NMR(125 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm) = 179.1(C₉), 163.8(C₃), 161.7(C₁), 156.3(C_4a),154.1(C₆), 150.8(C_4b), 143.7(C₇), 111.7(C_8a), 108.1(C₈), 107.4(C₂), 104.2(C_2''),102.6(C₅), 101.3(C_8b), 93.4(C₄), 82.1(C_5''), 79.6(C_3''), 78.7(C_3'), 76.7(C_4''),75.2(C_5'), 73.1(C_1'), 70.7(C_4'), 70.2(C_2'), 62.4(C_6'), 61.9(C_6''), 61.3(C_1'')。

根据氢谱、碳谱及2D NMR数据（图2-4），确定连接的糖基为β-D-呋喃果糖。芒果苷母核葡萄糖上的羟基苷化会使该-OH所在碳原子产生一个明显的低场位移，产物葡萄糖上C-6'信号（62.4 ppm）比苷化前（61.5 ppm）向低场位移了+0.9 ppm，表明连接果糖的一端是在葡萄糖上C-6'位；而2D NMR数据表明，连接果糖的另一端是在果糖C-2''位。以上结果，证明产物为果糖基-β(2,6)-芒果苷，结构式如图1。

经HPLC检测，发现上述反应中，底物的转化率为90%。

实施例4：固定化细胞批次转化芒果苷糖苷产物

将实施例3中回收的固定化细胞，加入5L非水相转化体系：将pH 6.5、浓度为1/15mol/L的磷酸缓冲液（溶质为Na₂HPO₄和KH₂PO₄）与二甲基亚砜按照体积比为8:2混合，然后加入终浓度为20g/L的芒果苷，100g/L的蔗糖。转化反应在30℃、搅拌转速为200r/min条件下转化24h，经检测底物的转化率为90%。过滤回收固定化细胞，重复上述步骤5次，底物的转化率分别为89%、88%、86%、85%和85%，表明该固定化细胞催化稳定性好，可降低生产成本，缩短制备时间。

实施例5采用Microbacterium thalassium NJ16固定化细胞制备芒果苷糖苷的另一案例

（1）制备Microbacterium thalassium NJ16固定化细胞

配制发酵培养基：蔗糖 40 g/L，酵母粉25 g/L，KH₂PO₄ 4.5 g/L，MgSO₄ 1.0 g/L，pH 7.5。

将40 ml发酵培养基装入250 ml三角瓶，121℃高压蒸汽灭菌20 min后，接种Microbacterium thalassium NJ16，于35℃、180 rpm振荡发酵培养12小时，以获得的发酵液作为种子液接种至5L发酵罐中，发酵罐中发酵培养基装液量为70%，接种量为3%；然后在35℃、搅拌转速为300 rpm条件下发酵培养，通气量3 vvm，发酵培养10小时，取发酵液5000r/min离心10min，收集细胞并以生理盐水重新悬浮至OD_680nm为5.0。

配制40g/L的海藻酸钠溶液1L，将其放入高压灭菌锅中在121℃温度下灭菌20min，然后放入已灭菌的无菌操作台中冷却至室温。

取4L Microbacterium thalassium NJ16悬浮液（OD_680nm为5.0）与4L海藻酸钠溶液（40g/L）混合均匀，用注射器吸取混合液，均匀滴至30g/L的CaCl₂溶液中，在4℃冰箱中放置12h进行固定化，此时固定化细胞包埋量为50%。用无菌水清洗固定化细胞，然后放入无菌水中在4℃冰箱内保存。

（2）在非水相体系中采用固定化细胞生产芒果苷糖苷

将pH 7.5、浓度为1/15 mol/L的磷酸缓冲液（溶质为Na₂HPO₄和KH₂PO₄）与二甲基亚砜按照体积比为7:3混合，然后加入终浓度为50g/L的芒果苷和180g/L的蔗糖，得到体积为5L的非水相转化体系。将2.5L固定化细胞（实施例2制备），加入5L非水相转化体系中，在35℃、搅拌转速为200r/min条件下转化20h过滤回收固定化细胞后，滤液（转化液）以10倍柱床体积、pH4.0的蒸馏水（采用冰乙酸调节pH）稀释，然后经AB-8大孔树脂吸附（层析柱40×800mm，流速20 ml/min），采用10倍柱床体积pH4.0的蒸馏水洗去残余的糖基供体（蔗糖），接着用10%-30%的甲醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，经40℃旋转蒸干得到产物。通过计算发现，底物转化率为92%。

Claims (5)

1.采用Microbacterium thalassium NJ16制备芒果苷糖苷的方法，其特征在于包括采用Microbacterium thalassium NJ16固定化后在非水相中催化芒果苷和蔗糖进行反应，得到芒果苷糖苷的步骤，Microbacterium thalassium NJ16的保藏号为CCTCC NO：M2013154；反应溶剂是二甲基亚砜和pH为4.0~9.0磷酸缓冲液的混合物，二甲基亚砜的体积百分含量为10%~30%；固定化方法如下：将Microbacterium thalassium NJ16悬浮液与海藻酸钠溶液混合均匀后，滴至CaCl₂溶液中，形成固定化细胞小球。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于Microbacterium thalassium NJ16悬浮液的OD680为4.0-6.0，Microbacterium thalassium NJ16悬浮液与海藻酸钠溶液混合后海藻酸钠的浓度为10-50g/L，CaCl₂溶液的浓度为10-40g/L，其中固定化细胞包埋量为20~60%。

3.根据权利要求2所述制备芒果苷糖苷的方法，其特征在于在转化体系中，芒果苷的浓度为1~50g/L，蔗糖的浓度为20~200 g/L；固定化细胞与转化体系的体积比为5～50:100，所述转化体系是在反应溶剂中添加芒果苷和蔗糖后形成的；反应温度为15~45℃，反应时间为1~24h。

4.根据权利要求3所述制备芒果苷糖苷的方法，其特征在于Microbacterium thalassium NJ16采用发酵培养基在20~40℃发酵培养6~24h，所述发酵培养基含有如下成分：蔗糖 5~40 g/L，酵母粉2~30 g/L，KH₂PO₄ 0.5~5 g/L， MgSO₄ 0.1~2g/L，pH 6~8。

5.根据权利要求4所述制备芒果苷糖苷的方法，其特征在于芒果苷糖苷采用如下方法纯化：反应结束后，过滤收集固定化细胞，采用AB-8型大孔树脂层析分离滤液中的芒果苷糖苷。

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