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CN108704126A - 基于重组减毒单增李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗 - Google Patents

基于重组减毒单增李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗 Download PDF

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CN108704126A
CN108704126A CN201810885074.6A CN201810885074A CN108704126A CN 108704126 A CN108704126 A CN 108704126A CN 201810885074 A CN201810885074 A CN 201810885074A CN 108704126 A CN108704126 A CN 108704126A
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CN
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mesothelin
listeria monocytogenes
plasmid
gene
restriction enzyme
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CN201810885074.6A
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Original Assignee
Nanjing Song Yue Biotechnology Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种基于重组减毒单增李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗。本发明以减毒单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，在下文中简称Lm)作为载体，利用李斯特菌独特的能在宿主吞噬细胞胞内生长，是天然的T细胞免疫活化佐剂的特性，有效提高在肿瘤微环境中的特异性免疫应答，打破机体的免疫耐受，从而清除机体持续性病毒感染，达到清除病灶，遏制肿瘤发展的良好治疗效果。其优势在于弥补了核酸类及蛋白质多肽类疫苗免疫原性较低的缺点，减毒的李斯特菌保留了原始菌株能在胞内生长，完成抗原递呈的特性的同时又具有更高的安全性。

Description

基于重组减毒单增李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基于重组减毒单增李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗。
背景技术
研究发现间皮素是一种细胞表面糖蛋白，其表达通常局限于间皮(腹膜，心包，和胸膜)，同时发现在间皮瘤、胰腺癌、肺癌、卵巢癌中，间皮素蛋白显著高表达。(MesothelinA New Target for Immunotherapy，Raffit Hassan，Tapan Bera，and Ira Pastan doi:10.1158/1078-0432.CCR-03-0801 Clin Cancer Res June 15,2004 10；3937)这种特征使得间皮素成为运用重组李斯特菌治疗肿瘤的工具抗原。
间皮瘤是一种主要出现在胸腔或腹腔内壁上的肿瘤，与工作环境中接触石棉纤维有关。在美国每年被诊断的患者是2500～3000个。目前手术和放疗效果都不理想，化疗效果较好。
胰腺癌是出现在胰脏且非常致命的癌症，患者5年内的存活率小于5％，根据世界卫生组织2014年数据，2012年胰腺癌在全球造成33万人死亡，是癌症患者的7种最常见的致死因素。且胰腺癌初期没有明显症状，发现症状后通常是疾病的晚期，绝大多数病人在发现时已经是局部侵袭性疾病或已发生转移，这时候在通过手术治疗只能是缓解症状而无法治愈患者。目前通过每周静脉给药的吉西他滨(美国FDA在1997年批准上市)只能改善患者生活质量，稍微延长患者生存时间。使用FOLFIRINOX化疗方案(5-氟尿嘧啶，亚叶酸钙，伊立替康，和奥沙利铂)则副反应明显，只能用于非常有限的患者。
卵巢癌是指出现在女性卵巢的癌症，2012年全球有23万患者并且造成15万人死亡。是7种常见癌症，并且是造成女性癌症患者死亡的常见原因。目前手术和化疗结合是治疗卵巢癌的常见方法。
肺癌是一种发生在肺组织内，细胞失去控制生长的非常致命的疾病。肺癌如不及时接受治疗，很容易转移到附近组织和机体其他器官。肺癌是癌症患者最主要的死亡原因，2012年造成全球156万人口死亡，患者5年内的存活率小于17％。目前手术，放疗和化疗协同治疗是对抗肺癌的常见方法。
治疗性疫苗与传统的治疗手段，如外科手术，放化疗相比具有伤害小、毒性低的特点。目前治疗性疫苗的存在形式主要有三种：蛋白质多肽疫苗、病毒(细菌)疫苗以及核酸疫苗。其成功的关键是引起足够的免疫应答，但是目前的核酸类及蛋白质多肽类疫苗免疫原性较低，缺陷明显。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于重组减毒单增李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
基于重组减毒单增李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗，其有效成分为携带间皮素基因的重组减毒单增李斯特菌。
优选的，所述减毒单增李斯特菌为单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，简称Lm)完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得。
优选的，所述重组减毒单增李斯特菌的制备方法，是以减毒单增李斯特菌为载体，携带间皮素基因而得。
进一步优选的，具体步骤如下：
(1)合成间皮素基因片段；
(2)构建打靶质粒；
(3)制备感受态细胞LmΔactAplcB-lacZ；
(4)利用步骤(2)制备的打靶质粒对步骤(3)制备的感受态细胞进行电转化；
(5)LmΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养、筛选验证。
更进一步优选的，步骤(1)的具体方法是：从NCBI上查询间皮素氨基酸序列，然后根据李斯特菌偏好密码子表进行密码子优化得到优化后的序列，再在其上游加入HindⅢ酶切位点(AAGCTT)，下游加入XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)，将上述设计好的序列最后通过合成直接获得。其中，密码子优化方法是将氨基酸序列提交到网站(如http://www.jcat.de/)，然后选择单增李斯特菌偏好密码子优化选项即可实现；DNA序列的合成方法是：使用ABI3900-Thermo Fisher Scientific等型号的基因合成仪直接合成DNA序列，如SEQ ID NO.1所示。
更进一步优选的，步骤(2)的具体方法是：用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切步骤(1)获得的间皮素基因片段，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pCW203(专利CN103074361B)，经连接、转化等技术将间皮素基因片段插入pCW203 HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，得到中间质粒pCW203-Meso，如SEQ ID NO.2所示，通过PCR验证、提质粒验证、酶切验证证实中间质粒的成功构建。切下步骤中间质粒pCW203-Meso的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间的片段插入重组质粒pCW180的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间，得到打靶质粒pCW180-Meso，其中，所述重组质粒pCW180的基因序列为序列表中SEQ ID NO.3所示。
更进一步优选的，重组质粒pCW180的制备方法如下：
(2-A)将上游携带SpeⅠ、下游携带NotⅠ的Lm mpl基因(Genbank ID：DQ054595.1)插入质粒pCW154(专利CN103074361B)的SpeⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到第一中间重组质粒pCW160，所述第一中间重组质粒pCW160的基因序列为序列表中SEQ ID NO.4所示；
(2-B)将上游携带XbaⅠ、下游携带NotⅠ的Lm orfBAldh基因(Genbank ID：M82881.1)插入上述步骤(2-A)得到的第一中间重组质粒pCW160的XbaⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到第二中间重组质粒pCW170，所述第二中间重组质粒pCW170的基因序列为序列表中SEQ ID NO.5所示；
(2-C)用NotⅠ酶切质粒pCW154，得到两头为NotⅠ酶切位点的一段基因，插入上述步骤(2-B)得到的第二中间重组质粒pCW170的NotⅠ酶切位点，得到重组质粒pCW180。
进一步优选的，步骤(3)的具体方法是：将LmΔactAplcB-lacZ用含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基进行培养，定期测定A600，当A600＝0.4时，加入盘尼西林G，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当A600＝0.7时，离心，洗涤，分装，保存即可。
更进一步优选的，LmΔactAplcB-lacZ的制备方法如下：
(3-A)将上、下游分别带Not I酶切位点的lacZ基因片段(专利CN103074361B)插入第二中间重组质粒pCW170的NotI酶切位点之间，得到一个打靶质粒pCW190，所述质粒pCW190的基因序列为序列表中SEQ ID NO.6所示；
(3-B)将步骤(3-A)所得打靶质粒pCW190电转化Lm，然后将转化得到的菌经单、双同源重组杂交培养，即得。
更进一步优选的，步骤(3)的具体方法是：接种LmΔactAplcB-lacZ于15ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基，37℃220rpm培养12～16小时；将上述菌液转移至250ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基，定期测定A600，当A600＝0.4时，加入盘尼西林G，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当A600＝0.7时，倒入50mL离心管，4℃10000rpm离心5分钟，弃上清；以0.5mol/L冰冷蔗糖溶液反复洗涤沉淀，每次加入20ml 0.5mol/L蔗糖溶液，4℃10000rpm离心10分钟，弃上清，洗涤3次；每管加0.5mol/L蔗糖的300μl重悬，按50μl/支分装预冷无菌EP管，-80℃保存。
进一步优选的，步骤(4)的具体方法是：取打靶质粒电转至LmΔactAplcB-lacZ感受态细胞中，电转完成后加入BHI肉汤培养2小时；转化液涂布于红霉素BHI琼脂平板，通过蓝白斑筛选出单个蓝色菌落，纯培养后进行质粒提取和PCR验证。
更进一步优选的，步骤(4)的具体方法是：将制备的感受态细胞从-80℃冰箱中取出置于冰盒中，待其完全融化后，取5μl打靶质粒按1/10的比例用-20℃预冷枪头缓慢加至感受态细胞LmΔactAplcB-lacZ，同时作ddH2O阴性对照；温和混匀后，冰浴5分钟，再全部转入电转杯，冰浴5分钟，于电转仪中进行电转；电转完成后，冰浴5分钟，用37℃预热的枪头加入37℃预热的BHI肉汤750μl，混匀后全部转至EP管，摇床30℃，150rpm培养2小时；用无菌L形玻棒将菌液全量涂布于含红霉素1～5μg/ml、X-gal 20～60μg/ml的BHI琼脂平板(以下简称BHI-Ery-X-gal，BEXI平板)，30℃培养48～72小时后，阳性菌为蓝色菌落，于BEXI平板上进行纯培养，30℃培养24小时，进行提质粒及PCR验证。
更进一步优选的，电转条件为：电压＝1500V，持续时间＝5ms，电转杯内径＝1mm。
更进一步优选的，提质粒的具体方法是：按照质粒提取试剂盒说明提取质粒(李斯特菌为革兰阳性菌，SolutionⅠ使用前需加入溶菌酶，溶菌酶终浓度为20mg/L，加入含溶菌酶的SolutionⅠ后重悬细菌，37℃水浴45min)，最后以30μl Elution Buffer洗脱后电泳；凝胶成像，观察有无条带以判断重组质粒导入是否成功，质粒大小为10455bp。
更进一步优选的，PCR验证的具体方法是：以煮沸法提取的细菌DNA基因组为模板，扩增目的条带间皮素，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示序列为引物进行PCR扩增；反应循环条件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，47℃30秒，72℃1分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结果，预期结果：间皮素片段约1781bp。
上游引物MESO-f：5’-CCACAAGCTTTGTCCCGTACACTTG-3’，如SEQ ID NO.7所示；
下游引物MESO-r：5’-TATACTCGAGAGCAAGTGTAGAAGC-3’，如SEQ ID NO.8所示；
更进一步优选的，电泳条件为：1％琼脂糖凝胶；90V，上样量：5μl PCR产物。
进一步优选的，步骤(5)的具体方法是：将携带打靶质粒的单增李斯特菌，在42℃和30℃连续传代，利用同源重组杂交原理和基因打靶技术，将打靶质粒携带的目的片段整合至李斯特菌中，利用蓝白斑及红霉素敏感性筛选出可疑菌株；然后进行PCR筛选和基因测序验证。
更进一步优选的，传代培养的具体方法是：将已电转入打靶质粒的LmΔactAplcB-lacZ划线接种BEXI平板，42℃传代培养，挑取单个蓝色菌落接种BHI肉汤，30℃传代培养，待传到肉汤第3代开始，每代取培养物加入BHI稀释，分别涂布稀释菌液100μl于BEXI和BXI(含X-gal 20～60μg/ml的BHI琼脂平板)平板，30℃培养24小时。
更进一步优选的，传代培养的具体方法是：将已电转入打靶质粒的LmΔactAplcB-lacZ划线接种BEXI平板，42℃传代培养2～3代(每代培养时间为48小时)，挑取单个蓝色菌落接种5ml BHI肉汤，30℃，200rpm传代培养6代(每代培养时间为24小时)；待传到肉汤第3代开始，每代取40μl培养物加入360μl BHI肉汤(1:10稀释)，多次连续1:10稀释直到稀释106倍，分别涂布106倍稀释的菌液100μl于BEXI和BXI平板，30℃培养24小时；阳性菌落LmΔactAplcB-Meso在BXI平板上长成白色菌落，在BEXI平板上不生长。
更进一步优选的，PCR筛选的具体方法是：对蓝白斑及红霉素筛选结果正确的上述可疑重组菌进行以下三组基因片段的扩增：抗红霉素基因、靶抗原基因间皮素以及actA基因，鉴定相应疫苗菌株。
更进一步优选的，PCR筛选的具体方法是：用细菌基因组提取试剂盒提取LmΔactAplcB-Meso的基因组DNA作为模板，进行以下三组基因片段的扩增：抗红霉素基因、靶抗原基因间皮素以及actA基因，根据扩增结果对重组菌LmΔactAplcB-Meso进行鉴定。
更进一步优选的，抗红霉素基因Ery以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示序列为引物进行PCR扩增；反应循环条件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，60℃30s，72℃2分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结果，预期结果：Ery基因片段约1471bp。
上游引物Ery-f：5’-GATAAGTCGACGATTCACAAAAAATAG-3’，如SEQ ID NO.9所示；
下游引物Ery-r：5’-AAAACTAGTCCCGGG GCGAATTG-3’，如SEQ ID NO.10所示。
更进一步优选的，Lm actA基因以SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示序列为引物进行PCR扩增；反应循环条件为：94℃3分钟→(94℃1分钟，50℃30s，72℃1分钟)×30个循环→72℃10分钟→4℃；电泳观察PCR结果，预期结果：Lm actA基因片段约950bp。
上游引物Lm-actA-f：5’-GCTATAAATGAAGAGGCTTCAGG-3’，如SEQ ID NO.11所示；
下游引物Lm-actA-r：5’-CTCTTAAATCAGCTAGGCGATC-3’，如SEQ ID NO.12所示。
更进一步优选的，基因测序验证的具体方法是：经PCR鉴定正确的相应疫苗菌株，以基因组DNA作为模板，PCR扩增靶抗原基因间皮素，对扩增产物测序验证，对测序正确的菌株进行菌种保存。
本发明的有益效果在于：
本发明所制备的间皮素高表达治疗性疫苗携带间皮素基因，以减毒单增李斯特菌(Listeria monocytogenes，在下文中简称Lm)作为载体，利用李斯特菌独特的能在宿主吞噬细胞胞内生长，是天然的T细胞免疫活化佐剂的特性，有效提高在肿瘤微环境中的特异性免疫应答，打破机体的免疫耐受，从而清除机体持续性病毒感染，达到清除病灶，遏制肿瘤发展的良好治疗效果。其优势在于弥补了核酸类及蛋白质多肽类疫苗免疫原性较低的缺点，减毒的李斯特菌保留了原始菌株能在胞内生长，完成抗原递呈的特性的同时又具有更高的安全性。
本发明的来源菌是LmΔactAplcB-lacZ，最后导致的减毒是actA和plcB这两个基因的全部基因的缺失减毒，缺失的基因与细菌在胞间的转移和细菌逃离次级溶酶体有关，缺失后细菌毒力减低，与仅缺失溶血素部分基因的减毒方式相比，具有更好的安全性，同时本发明缺失的基因不影响细菌在吞噬细胞内的抗原递呈作用。本发明插入的间皮素基因，经过了李斯特菌密码子优化，具有独特性。本发明插入的间皮素基因可以提高免疫系统对肿瘤细胞的识别，攻击更多的肿瘤细胞，达到更好的治疗效果。本发明对阳性菌的筛选是通过温度、红霉素和蓝白斑筛选。本发明的蓝白斑筛选通过肉眼识别，简单易行，筛选成功率高。间皮素基因插入位点是在mpl基因下游，该位点不影响细菌其他重要蛋白的表达，尽量保留了原菌株的生物活性。
具体如下：
1)针对性：诱导特异性针对高表达间皮素癌症细胞的细胞因子，靶向治疗癌组织，不损伤正常细胞。
2)高效：疫苗菌株免疫活性高，诱导高效的细胞因子表达。李斯特菌株本身具有高效活化机体细胞免疫功能的作用，因此携带抗原的重组菌株能激活多种抗肿瘤免疫机制，激活特异的肿瘤杀伤性T细胞，打破免疫抑制重新激活有效的肿瘤杀伤机制。
3)安全：减毒菌株不会在体内长期存在，不会引起感染，在我们的临床前试验中表现了很好的耐受性，并经其他类似临床试验证实了其安全性，且能跟其他肿瘤治疗手段很好的兼容，如鸡尾酒式免疫抑制剂、外科手术、放疗和化疗。
4)稳定：本发明制备的疫苗菌株携带的抗原基因是整合到菌株基因组中的，抗原基因在菌株内稳定存在，不会丢失。
5)低成本：疫苗的生产成本低、快速、经济，使用标准的细菌发酵技术就可完成疫苗的大规模生产，无需细胞培养。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为Lm打靶重组质粒结构图谱。为Lm打靶质粒的一种结构图谱，含有两段Lm同源基因(Lm mpl和Lm orfBAldh)、氨苄青霉素抗性基因(Amp)、红霉素抗性基因(Ery)、基因序列盒(gene cassette)：包含启动子phly、HAepitope基因、VSV-G epitope基因、GP33epitope基因、GP61 epitope基因、间皮素基因。
图2为打靶质粒电转化LmΔactAplcB-lacZ后的PCR鉴定电泳结果图。1为电转后从细菌中扩增出的目的片段间皮素，M为DNA ladder。
图3为重组菌LmΔactAplcB-Meso的基因组中插入的外源基因及前后基因结构示意图。由此图可知外源基因的插入位点，重组后的细菌基因组敲掉了actA和plcB基因。插入的外源基因在自带的启动子phly的作用下表达融合蛋白，融合蛋白具有分泌信号肽、GP33和GP61抗原表位肽标签、HA和VSV-G western blot检测标签。
图4为通过流式细胞术检测，LmΔactAplcB-Meso菌株免疫小鼠后所诱导的细胞免疫应答。主要检测IFN-γ细胞因子的分泌水平，可见LmΔactAplcB-Meso菌株能够诱导特异性细胞免疫应答。
图5为疫苗菌株对肿瘤肺转移模型治疗效果的评价
对模型小鼠进行免疫治疗，实验设立阴性对照组：注射生理盐水(NS)；治疗组：治疗组：首次注射LmΔactAplcB-Meso，加强注射LmΔactAplcB-Meso。将12只模型小鼠随机分为2组。分别于CT26-Meso细胞注射后第3天进行第一次免疫治疗，以各菌株0.1×LD50尾静脉接种小鼠，NS对照组尾静脉接种等体积NS。第10天进行第二次免疫治疗，方法和剂量同第一次免疫治疗。每天观察小鼠的生存率情况，治疗组明显延长了间皮素模型小鼠的生存时间。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1.疫苗菌LmΔactAplcB-Meso的制备
(1)间皮素基因片段合成
从NCBI上查询间皮素蛋白基因，然后根据李斯特菌密码子进行相应优化，并在上游加入HindⅢ酶切位点，下游加入XhoⅠ酶切位点，最后通过合成直接获得DNA序列(以公司提供克隆质粒pUC57-Meso的形式获得)，序列如序列表序列1所示。
(2)构建打靶质粒
①中间质粒pCW203-Meso的构建
按照质粒说明书提取质粒pUC57-Meso和pCW203，以30μL Elution Buffer洗脱。
pUC57-Meso和pCW203用HindⅢ和XhoⅠ双酶切，酶切体系20μL：pUC57-Meso或pCW203＜1ng，HindⅢ1μL，XhoⅠ1μL，10×NEB Buffer 2μL，ddH2O将体系补足20μL。37℃水浴1h酶切质粒，载体片段需加0.5μL CIAP，37℃水浴30min去磷酸化。将酶切混合物与6×Loading Buffer混合，电泳(1％琼脂糖，94V)并胶回收相应长度的片段(pUC57-Meso回收酶切后的小片段即间皮素基因片段，长度为1781bp；pCW203回收酶切后的大片段即载体片段，长度约>10Kb)，以30μL Elution Buffer洗脱。
分别取间皮素基因片段与载体片段按照连接体系：载体50ng，插入片段摩尔数：载体片段摩尔数＝5:1，T4 Ligase 1μL，10×Ligase Buffer 5μL，ddH2O将体系补足10μl，22℃连接1h。将连接产物按体积1:10与大肠杆菌DH5α的感受态细胞轻柔混匀，冰浴30min，42℃热击45s，冰浴3min，加入预热的SOB肉汤500μL，混匀后于37℃，180rpm培养1h，涂布于LA平板(LB-Amp平板：含100μg/mL Amp的LB平板)，37℃培养16-20h。
PCR筛选：以煮沸法提取的细菌DNA基因组为模板，扩增目的条带间皮素，上游引物MESO-f：5’-CCACAAGCTTTGTCCCGTACACTTG-3’，下游引物MESO-r：5’-TATACTCGAGAGCAAGTGTAGAAGC-3’，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，47℃30s，72℃1min)×30个循环→72℃10min→4℃；电泳观察PCR结果(电泳条件：1％琼脂糖凝胶；90V，上样量：5μl PCR产物)，预期结果：间皮素片段约1781bp。
酶切验证：PCR筛选验证的阳性菌提取质粒，按照上述酶切体系以HindⅢ和XhoⅠ进行酶切，将酶切混合物与6×Loading Buffer混合进行电泳(1％琼脂糖，94V)。
测序验证：提取PCR及酶切验证符合预期的质粒送测序公司测序。将测序验证后完全正确的携带阳性质粒的大肠杆菌保存于-80℃。
②打靶质粒的构建
提取质粒pCW180，以30μL Elution Buffer洗脱。将质粒pCW180及中间质粒pCW203-Meso分别用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ按照实施例(2)①的体系混匀(将HindⅢ酶替换为BamHⅠ酶)，进行酶切和去磷酸化，电泳后胶回收pCW203-Meso酶切后的小片段即插入片段(1840bp)及pCW180载体骨架(酶切后长片段，长度约8621bp)。按照(2)①的体系混匀进行连接并转化入大肠杆菌DH5α，涂布于LA平板，对长出的单个菌落进行PCR筛选、BamHⅠ和XhoⅠ双酶切验证以及测序验证，具体操作同实施例(2)①(将HindⅢ酶替换为BamHⅠ酶)。将测序验证后携带阳性质粒的大肠杆菌保存于-80℃。打靶质粒的结构图谱见图1。
(3)电转化用LmΔactAplcB-lacZ感受态细胞的制备
接种LmΔactAplcB-lacZ于15ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基，37℃220rpm培养12～16h。将上述菌液转移至250ml含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基，定期测定A600，当A600＝0.4时，加入盘尼西林G，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养。当A600＝0.7时，倒入50mL离心管，4℃10000rpm离心5min，弃上清。以0.5mol/L冰冷蔗糖溶液反复洗涤沉淀，每次加入20ml 0.5mol/L蔗糖溶液，4℃10000rpm离心10min，弃上清，洗涤3次。每管加0.5mol/L蔗糖的300μl重悬，按50μl/支分装预冷无菌EP管，-80℃保存。
(4)打靶质粒电转化LmΔactAplcB-lacZ
将制备的感受态细胞从-80℃冰箱中取出置于冰盒中，待其完全融化后，取5μl打靶质粒按1/10的比例用-20℃预冷枪头缓慢加至感受态细胞LmΔactAplcB-lacZ，同时作ddH2O阴性对照。温和混匀后，冰浴5min，再全部转入电转杯，冰浴5min，于电转仪中进行电转(电转条件：电压＝1500V，持续时间＝5ms，电转杯内径＝1mm)。电转完成后，冰浴5min，用37℃预热的枪头加入37℃预热的BHI肉汤750μl，混匀后全部转至EP管，摇床30℃，150rpm培养2h。用无菌L形玻棒将菌液全量涂布于含红霉素1～5μg/ml、X-gal 20～60μg/ml的BHI琼脂平板(以下简称BHI-Ery-X-gal，BEXI平板)，30℃培养48～72h后，阳性菌为蓝色菌落，于BEXI平板上进行纯培养，30℃培养24h，进行PCR验证及提质粒验证。
PCR验证：以煮沸法提取细菌全部基因为模板，扩增目的条带间皮素，上游引物MESO-f：5’-CCACAAGCTTTGTCCCGTACACTTG-3’，下游引物MESO-r：5’-TATACTCGAGAGCAAGTGTAGAAGC-3’，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，47℃30s，72℃1min)×30个循环→72℃10min→4℃；电泳观察PCR结果(电泳条件：1％琼脂糖凝胶；90V，上样量：5μl PCR产物)，预期结果：间皮素片段约1781bp。如图2所示，提示打靶质粒已转入细菌。
按照质粒提取试剂盒说明提取质粒(李斯特菌为革兰阳性菌，SolutionⅠ使用前需加入溶菌酶，溶菌酶终浓度为20mg/L，加入含溶菌酶的SolutionⅠ后重悬细菌，37℃水浴45min)，最后以30μl Elution Buffer洗脱后电泳。凝胶成像，观察有无条带以判断重组质粒导入是否成功，质粒大小为10455bp。
(5)LmΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组及筛选
①LmΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养
将已电转入打靶质粒的LmΔactAplcB-lacZ划线接种BEXI板，42℃传代培养2-3代(每代培养时间为48小时)，挑取单个蓝色菌落接种5ml BHI肉汤，30℃，200rpm传代培养6代(每代培养时间为24小时)。待传到肉汤第3代开始，每代取40μl培养物加入360μl BHI作1:10稀释，连续稀释106倍，分别涂布106倍稀释的菌液100μl于BEXI和BXI(含X-gal 20～60μg/ml的BHI琼脂平板)平板，30℃培养24h。阳性菌落LmΔactAplcB-Meso在BXI平板上长成白色菌落，在BEXI平板上不生长。
②PCR鉴定LmΔactAplcB-Meso
细菌基因组提取试剂盒提取LmΔactAplcB-Meso的基因组DNA作为模板，进行以下三组基因片段的扩增：抗红霉素基因、靶抗原基因盒以及actA基因，根据扩增结果对重组菌LmΔactAplcB-Meso进行鉴定。LmΔactAplcB-Meso基因组DNA为模板扩增间皮素，其引物及反应条件见(2)①，扩增目的条带抗红霉素基因Ery，约1471bp，引物Ery-f/r(f:5’-GATAAGTCGACGATTCACAAAAAATAG-3’，r:5’-AAAACTAGTCCCGGGGCGAATTG-3’)，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，60℃30s，72℃2min)×30个循环→72℃10min→4℃；扩增LmactA基因，约950bp，引物Lm-actA-f/r(f:5’-GCTATAAATGAAGAGGCTTCAGG-3’，r:5’-CTCTTAAATCAGCTAGGCGATC-3’)，反应循环条件为：94℃3min→(94℃1min，50℃30s，72℃1min)×30个循环→72℃10min→4℃。经PCR鉴定，LmΔactAplcB-Meso携带有间皮素基因，不携带抗红霉素基因，且actA基因被剔除。鉴定结果与预期吻合，表明LmΔactAplcB-Meso构建成功。
③基因测序验证
PCR鉴定后以细菌基因组DNA作为模板，PCR扩增靶抗原基因间皮素，对扩增产物测序验证，对测序正确的菌株进行菌种保存。最终得到的重组菌基因组插入的外源基因及插入位点前后的基因结构示意图如图3所示。
(6)LmΔactAplcB-Meso疫苗候选株LD50的测定
将-20℃保存的Lm-ΔactA/plcB-Meso菌株置37℃水浴融化后，分别取10μl接种于5ml BHI肉汤中，37℃200rpm培养过夜。第二日，取复苏一次的菌液40μl于20ml BHI肉汤中，37℃200rpm培养过夜二次复苏。
取17.5ml二次复苏的各菌液接种350ml BHI肉汤，于37℃200rpm摇床培养，培养至A600值为0.3～0.7之间时，根据李斯特菌生长曲线，确定此时A600值所对应的菌量，并根据预计的细菌接种剂量进行浓缩或是稀释处理：取一定量菌液离心，13000rpm 2min，用生理盐水重悬后，再次离心，再用生理盐水将菌液重悬至染菌剂量，并置于冰上备用。
6～8周龄BALB/c雌鼠适应性喂养3d后，随机分为3组，每组6只，LmΔactA/plcB-Meso免疫组尾静脉分别接种109CFU/ml、2x108CFU/ml、2x107CFU/ml的菌液100μl；连续观察10天，统计小鼠死亡、存活情况；利用改良寇式法计算LD50，并以0.1×LD50作为最适后续免疫剂量。
(7)LmΔactAplcB-Meso免疫小鼠诱导的细胞免疫应答
①C57BL/6雌鼠疫苗接种及观察
6～8周龄的C57BL/6雌鼠适应性喂养3d后，选取3只免疫LmΔactAplcB-Meso疫苗，注射0.1×LD50的LmΔactAplcB-Meso(注射剂量为2×106CFU/只)。
②流式细胞术检测分泌特异性IFN-γ细胞因子的CD4+和CD8+T淋巴细胞数量
脾细胞悬液制备：颈椎脱臼处死小鼠，将小鼠用针固定四肢于解剖板，75％酒精喷至其毛湿润，无菌操作取脾脏，放于装有1ml RPMI Medium 1640(含1％双抗)的5ml离心管中，置冰浴备用。加5ml RPMI Medium 1640(含1％双抗)于一灭菌平板，其中放一张无菌200目尼龙膜，用无菌眼科镊取脾脏放于尼龙膜上，并用尼龙膜将脾脏包裹，用无菌研棒轻研脾脏至其泛白(脾细胞脱落后剩下的被膜及未剔除干净的结缔组织)，用枪头将所有脾细胞悬液收集至灭菌15ml EP离心管。
红细胞裂解：将装有脾细胞悬液的离心管放入低温离心机中，1300rpm/min，4℃离心5min，弃去上清，震荡离心管，使沉淀在离心管底部的细胞分散，向离心管中加入4ml经过滤除菌的红细胞裂解液，上下颠倒离心管，使细胞与红细胞裂解液充分接触，静置5min后，立即加入4ml RPMI 1640 Medium(含1％双抗)终止裂红反应，1300rpm/min 4℃离心5min，弃去上清，震荡离心管，向离心管中加入5ml RPMI 1640 Medium(含1％双抗)，上下颠倒离心管以洗去残余的红细胞裂解液，1300rpm/min，4℃离心5min，弃去上清，震荡离心管，重复洗涤一次。震荡离心管后，向离心管中加入2ml RPMI 1640 Medium(含10％胎牛血清)重悬，将离心管置于冰上，备用。
刺激物配制：1.gp33-41储备液：1mg的肽段中加入1ml DMSO，配制成1mg/ml的储备液，10μl/支分装EP管，储存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；4.流式PMA储备液：0.1mg的PMA中加入1ml DMSO，配制成0.1mg/ml的储配液，10μl/支分装EP管，储存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；5.流式Ionomycine储备液：1mg的Ionomycine中加入1ml DMSO，配制成1mg/ml的储备液，10μl/支分装EP管，储存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；6.流式阳性刺激混合液：吸取100μl RPMI 1640 Medium(含10％胎牛血清)、0.2μl Golgi Stop、0.2μl Ionomycine储备液和0.2μl PMA储备液于EP管，用枪头吹打混合均匀；7.流式实验刺激混合液：吸取100μlRPMI 1640 Medium(含10％胎牛血清)、0.2μl gp33-41储备液和0.2μl Golgi Stop于EP管中，用枪头吹打混合均匀。
刺激：每个样品同时做阴性对照(不刺激)和实验处理(GP33肽段)2个孔；各组随机选取2个样品用阳性刺激物(PMA+Ionomycine)刺激作为阳性质控。于96孔板中，每孔加入50μl脾细胞悬液和50μl相应刺激物，5％CO2培养箱37℃刺激5h。
表面抗体染色：刺激完毕后，将96孔板取出，4℃1300rpm/min离心5min，弃上清，将96孔板置于漩涡震荡仪上震荡，使得沉淀于板底的细胞分散，于避光处将表面抗体Anti-Mouse CD8a PE、Anti-Mouse TCR beta PerCP-Cyanine5.5、Anti-Human/Mouse CD44FITC、用PBS(含体积浓度2％胎牛血清)在灭菌EP管中分别按照体积稀释为1：200。每孔加入50μl表面抗体混合液重悬，4℃避光孵育30min后，于避光向每孔细胞中加入150μl PBS(含2％胎牛血清)终止孵育，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清，震荡96孔板，加200μl PBS(含2％胎牛血清)重悬，洗去残余抗体，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清，震荡96孔板。
破膜：每孔加入100μl Cytofix/Cytoperm重悬，4℃避光静置20min后避光加入100μl Buffer Perm/Wash终止，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清，震荡96孔板，每孔加200μl Buffer Perm/Wash重悬洗涤，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清，震荡96孔板。
胞内抗体染色：于避光处用1×perm/wash buffer在灭菌EP管中将抗体Anti-Mouse IFN gamma APC按1:200体积比稀释。每孔分别加入混合抗体50μl重悬，4℃避光孵育45min后，于避光向每孔细胞中加入150μl 1×perm/wash buffer终止孵育，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清震荡96孔板，加200μl 1×perm/wash buffer重悬，洗去残余抗体，1300rpm/min 4℃离心5min，甩弃上清，每孔细胞加入200μl 2％多聚甲醛溶液重悬收集，4℃避光保存准备上机。
上机检测结果：用Research Beads进行Performance QC以校正光路和流路，去离子水为样品冲洗流式仪约10min，至Threshold Rate在20evts/sec以下。调试上机参数，选取所使用的荧光，确定样品收取数(106events)，用空白孔(不做任何处理的细胞)调节测试电压，使FSC A-FSC H散点图、FSC A-SSC A散点图中细胞群与横坐标轴呈约45°夹角，每一种染料在峰状图中的出峰值(阴性峰峰值)均小于102；测定样品并进一步调节电压，使分析某种荧光染料孵育的细胞时，该荧光染料的双峰峰值(阴性峰峰值、阳性峰峰值)以102为界，其余荧光染料峰值小于102。
如图4所示；为小鼠脾细胞IFN-γ细胞因子的分泌水平，可见相比未加GP33肽段组，LmΔactAplcB-Meso能够诱导特异性GP33细胞免疫应答。
实施例2：疫苗菌株对间皮素高表达肿瘤治疗效果评价
(1)CT26-MESO肿瘤细胞培养及肿瘤模型的建立
用含10％胎牛血清、1％青霉素、链霉素的RPMI1640 Medium在37℃5％CO2培养箱内培养CT26-MESO细胞，待其密度达到80％左右，用Hank’s液润洗细胞2～3次后，胰酶消化并用PBS重悬计数，将细胞配制成浓度为5×106/ml的细胞悬液，6～8周龄的BALB/c雌鼠尾静脉注射100μl细胞悬液，建立小鼠肿瘤模型，观察生存率。
(2)对建模小鼠进行免疫治疗
实验设立阴性对照组：分别于造模第3、10天注射与治疗组同等体积生理盐水(NS)；治疗组：分别于造模第3、10天注射0.1×LD50的LmΔactAplcB-Meso(注射剂量为2×106CFU/只)。
将造模小鼠随机分为2组，每组6只。分别于CT26-MESO细胞尾静脉注射后第3天进行第一次免疫治疗，按实施例1(6)配制菌液，各菌株尾静脉接种100μl，NS对照组尾静脉接种等体积NS。第10天进行第二次加强免疫治疗，方法和剂量同第一次免疫治疗。每天观察生存状况。可见治疗组比阴性对照组小鼠生存率显著更高。实验制备疫苗株对间皮素高表达肿瘤起到有效的控制和治疗作用(图5)。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 南京颂悦生物科技有限公司
<120> 基于重组减毒单增李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1781
<212> DNA
<213> 人工(Artificial)
<400> 1
aagctttgtc ccgtacactt gctggtgaaa ctggtcaaga agctgctcca ctagatggtg 60
ttttagccaa tccacctaat atttcgagtt taagcccacg tcaattacta ggttttcctt 120
gtgcagaagt atctggcctt tctacagaac gtgttcgtga attagcagtt gcattagcac 180
aaaaaaacgt taaactatct acagaacaac ttcgttgttt agctcatcgt ctatctgaac 240
cgccagaaga tcttgatgca cttcctcttg atttattact atttcttaac ccagatgcat 300
tcagcggtcc gcaagcctgt acacatttct tctctcgtat tactaaagca aatgttgacc 360
tacttccgcg tggcgctcca gaacgtcaac gtttgctacc agcagcgcta gcatgttggg 420
gtgtacgtgg tagtctttta tccgaagcag atgtacgtgc tcttggtggt ttagcctgtg 480
atcttccagg tcgtttcgtt gctgaatcgg cagaagttct attaccacgt ttggtttcat 540
gtccaggtcc acttgaccaa gaccaacaag aggcagcacg tgcagctttg caaggtggtg 600
gcccaccata cggcccgcca tctacctgga gtgtatccac tatggatgcg cttcgtggtc 660
tattaccagt acttggccaa ccgattatcc gtagcatccc acaaggtatc gttgcagctt 720
ggcgtcaacg ctctagcaga gatccatctt ggcgtcaacc tgaacgtaca atccttcgtc 780
cacgttttcg tcgtgaagtt gaaaaaacag catgtccttc tggtaaaaaa gctcgtgaaa 840
ttgatgaatc cttaattttt tacaaaaaat gggaattgga agcatgcgtt gatgctgctt 900
tacttgcaac tcaaatggac agagtcaatg caatcccatt tacttacgaa caacttgacg 960
ttcttaaaca taaacttgat gaattatacc cacaaggtta tccagaatct gttattcaac 1020
acctaggcta cctattcctt aaaatgtctc cggaagacat tcgcaaatgg aatgtaacta 1080
gcctggaaac tttaaaagca ttattagaag tgaataaagg ccatgaaatg tcaccacaag 1140
tagcaacatt aattgatcgt tttgtcaaag gtcgtggaca acttgacaag gatactttag 1200
atactttgac agcattctat ccaggttact tatgttcact ttctccagaa gaattatcct 1260
ctgtaccacc atcctcgatc tgggctgtac gccctcaaga tcttgataca tgcgatccgc 1320
gtcaacttga tgttctatat cctaaagctc gtttagcatt tcaaaatatg aacggctctg 1380
aatattttgt aaaaatccaa tccttccttg gtggtgctcc tacagaagac cttaaagctc 1440
tatctcaaca aaacgtaagt atggatttag cgactttcat gaaattaaga acggatgcag 1500
tactaccttt aacggtagca gaggttcaaa aattactagg cccacacgtt gaaggtctta 1560
aagctgagga acgtcaccgc ccagtacgtg attggatttt acgtcaacgc caagatgatc 1620
ttgatacctt ggggttaggt ttacaaggtg gtatcccaaa tggttatctt gtacttgatt 1680
taagtgtaca agaagctctt agcggtacac cttgcttatt gggtcctggc ccagttttga 1740
cagttttagc attgttatta gcttctacac ttgctctcga g 1781
<210> 2
<211> 14828
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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tatcaaaaga gaggggtggc aaacggtatt tggcattatt aggttaaaaa atgtagaagg 240
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aattcaaggg taaaatggcc ttttcctgag ccgatttcaa agatattatc atgttcattt 2940
aatcttatat ttgtcattat tttatctata ttatgttttg aagtaataaa gttttgactg 3000
tgttttatat ttttctcgtt cattataacc ctctttaatt tggttatatg aattttgctt 3060
attaacgatt cattataacc acttattttt tgtttggttg ataatgaact gtgctgatta 3120
caaaaatact aaaaatgccc atattttttc ctccttataa aattagtata attatagcac 3180
gagctctgat aaatatgaac atgatgagtg atcgttaaat ttatactgca atcggatgcg 3240
attattgaat aaaagatatg agagatttat ctaatttctt ttttcttgta aaaaaagaaa 3300
gttcttaaag gttttatagt tttggtcgta gagcacacgg tttaacgact taattacgaa 3360
gtaaataagt ctagtgtgtt agactttatg aaatctttat acgtttatat atatttatta 3420
tccggaggtg tagcatgtct cattcaattt tgagggttgc cagagttaaa ggatcaagta 3480
atacaaacgg gatacaaaga cataatcaaa gagagaataa aaactataat aataaagaca 3540
taaatcatga ggaaacatat aaaaattatg atttgattaa cgcacaaaat ataaagtata 3600
aagataaaat tgatgaaacg attgatgaga attattcagg gaaacgtaaa attcggtcag 3660
atgcaattcg ccccgggact agtgcggccg ctaataatct tgcgcttcga tgacaacagc 3720
tgtaccagat gcagtgacca ttagcattcc gttatcagct ccaagcactt cataatcaat 3780
atcaacaccg ataacggcat ttgcgccaat atctttcgca cgttgttcca tttcacgaat 3840
tgcttcctcg cgagcattaa taagttcatc ttcatagcct tgcgaacggc ccccgaagaa 3900
atttcgaagt ccagccccaa tatctttcat aaagttaacg ccagtgatga cttcgccgaa 3960
aacgattttt ttatattcga taatttgttt gccttcaata tttggtgaag ttgttacaat 4020
catgagttat ccctacagtt tttcttttat catacctctt agtacttttt ctagtcaaag 4080
gatatccggt tatttcgtac gatttcgcgc tttttctata taagaaatag catctggaac 4140
tttacaagct gtatttccaa ggtttacatg aactttcccg actgatttcg cggcttccat 4200
cgctttttcg tgcaaatcgt ctttgtaaat tccacaagtg ataataaaac cgttcattga 4260
atagcgggtt ctattggttt ctgtttgcag cgtttctttc gcgcgttgaa gtaatgtctc 4320
tgcttcaggc aaattgttaa tatgttcgct gtaaatctgc cagcccatgg atttagttaa 4380
atcataatca ctttcaatcc atgttttggc gaaaaggagt gcatcatcac gtttgcttac 4440
aatcgatgct agtccaaaag ttagttgtga ccatgtttcg cgaaaagcga tattccattt 4500
ttcgatttgt tcggtggtta ttttgtttgg attaattgct agcaaaccga gataaatcaa 4560
gtcactatta tttgattcaa tcagttttac ggcgagttcg tgattttttg tcagtttttc 4620
tcggcggatg attttcttta aatcaccaat ttttagtccg taaagatcta atgaatccgg 4680
acaaccgtga ttacgaaaaa ttttgatcgt attggggttt tctaaggctt gtagctcggt 4740
gtcaagttgg tcaaaagtaa tcatacgcgt cactcctctc gaataaagta agtataacaa 4800
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cgtcgtctag ctagaattaa ttcttgaaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta 4920
taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat 4980
gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 5040
agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 5100
catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 5160
ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 5220
atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 5280
ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc 5340
gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 5400
ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 5460
ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 5520
gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 5580
ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgcagcaatg 5640
gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 5700
ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 5760
gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 5820
gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 5880
caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 5940
cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 6000
ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 6060
taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 6120
tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 6180
gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 6240
agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 6300
aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 6360
gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 6420
gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 6480
tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 6540
agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 6600
cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 6660
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 6720
gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 6780
ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 6840
cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg 6900
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gggtcatggc tgcgccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc 7080
tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga 7140
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cgtgaagcga ttcacagatg tctgcctgtt catccgcgtc cagctcgttg agtttctcca 7260
gaagcgttaa tgtctggctt ctgataaagc gggccatgtt aagggcggtt ttttcctgtt 7320
tggtcacttg atgcctccgt gtaaggggga atttctgttc atgggggtaa tgataccgat 7380
gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc ggttactgga 7440
acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa aaatcactca 7500
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accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca cccgtggcca 7800
ggacccaacg ctgcccgacg atgataagct gtcaaacatg agaattaatt cccgattatg 7860
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acctaaattc aaaatctatc ggtcagattt ataccgattt gattttatat attcttgaat 7980
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ataatccatt aaactcttaa attctacgat tccttgttca tcaataaact caatcatttc 8100
tttaattaat ttatatctat ctgttgttgt tttctttaat aattcatcaa catctacacc 8160
gccataaact atcatatctt ctttttgata tttaaattta ttaggatcgt ccatgtgaag 8220
catatatctc acaagacctt tcacacttcc tgcaatctgc ggaatagtcg cattcaattc 8280
ttctgttatt atttttatct gttcataaga tttattaccc tcatacatca ctagaatatg 8340
ataatgctct tttttcatcc taccttctgt atcagtatcc ctatcatgta atggagcact 8400
acaaattgaa tgtgtaactc ttttaaatac tctaaccact cggctttgct gattctggat 8460
ataaaacaaa tgtccaatta cgtcctcttg aatttttctt gttttcagtt tcttttatta 8520
cattttcgct catgatataa taacggtgct aatacactta acaaaattta gtcatagata 8580
ggcagcatgc cagtgctgtc tatctttttt tgtttaaaat gcaccgtatt cctcctttgc 8640
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tctatttaat atctcatttt cttctgttgt aagtcttaaa gtaacagcaa cttttttctc 8760
ttcttttcta tctacaacta tcactgtacc tcccaacatc tgtttttttc actttaacat 8820
aaaaaacaac cttttaacat taaaaaccca atatttattt atttgtttgg acaatggaca 8880
atggacacct aggggggagg tcgtagtacc cccctatgtt ttctccccta aataacccca 8940
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attccaattt cctttttgcg tgtgatgcgc tgcgtccatt aaaaatccta gagctttgca 9060
accgaaagtt aatagctgtc gctactactt tcgcttacgc tctaagtata ttttaaggac 9120
tgtcacacgc aaaaagtttt ctcggcataa aagtacctct acatctctaa atcgtctgta 9180
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gagggcgcat ccgttttggc gaaaaagagt aaaacggcga ggatgagtgc acagccagag 9480
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agcgcccagc caacacagcc aaacatccgc gcgcgaccaa attcgaaatt actgcgacgg 9600
ctgactttct caataaatgc ctctactgct ggcgcaccgg cgttaaaaca aaagcctaga 9660
taaataccac caacaatcga tcctactaaa atgttgtatt gtaacagtgg cccgaagata 9720
aaaataaaga acggcgcaaa catcactaac atgccggtaa taatccacag caggtatttg 9780
cgcagcccga gtttgtcaga aagcagacca aacagcggtt ggaataatag cgagaacaga 9840
gaaatagcgg caaaaataat acccgtatca cttttgctga tatggttgat gtcatgtagc 9900
caaatcggga aaaacgggaa gtaggctccc atgataaaaa agtaaaagaa aaagaataaa 9960
ccgaacatcc aaaagtttgt gttttttaaa tagtacataa tggatttcct tacgcgaaat 10020
acgggcagac atggcctgcc cggttattat tatttttgac accagaccaa ctggtaatgg 10080
tagcgaccgg cgctcagctg gaattaattc cgccgatact gacgggctcc aggagtcgtc 10140
gccaccaatc cccatatgga aaccgtcgat attcagccat gtgccttctt ccgcgtgcag 10200
cagatggcga tggctggttt ccatcagttg ctgttgactg tagcggctga tgttgaactg 10260
gaagtcgccg cgccactggt gtgggccata attcaattcg cgcgtcccgc agcgcagacc 10320
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tacccgctct gctacctgcg ccagctggca gttcaggcca atccgcgccg gatgcggtgt 10500
atcgctcgcc acttcaacat caacggtaat cgccatttga ccactaccat caatccggta 10560
ggttttccgg ctgataaata aggttttccc ctgatgctgc cacgcgtgag cggtcgtaat 10620
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gctgatgtgc ccggcttctg accatgcggt cgcgttcggt tgcactacgc gtactgtgag 11040
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catccagtgc aggagctcgt tatcgctatg acggaacagg tattcgctgg tcacttcgat 11220
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cagcgactga tccacccagt cccagacgaa gccgccctgt aaacggggat actgacgaaa 11460
cgcctgccag tatttagcga aaccgccaag actgttaccc atcgcgtggg cgtattcgca 11520
aaggatcagc gggcgcgtct ctccaggtag cgaaagccat tttttgatgg accatttcgg 11580
cacagccggg aagggctggt cttcatccac gcgcgcgtac atcgggcaaa taatatcggt 11640
ggccgtggtg tcggctccgc cgccttcata ctgcaccggg cgggaaggat cgacagattt 11700
gatccagcga tacagcgcgt cgtgattagc gccgtggcct gattcattcc ccagcgacca 11760
gatgatcaca ctcgggtgat tacgatcgcg ctgcaccatt cgcgttacgc gttcgctcat 11820
cgccggtagc cagcgcggat catcggtcag acgattcatt ggcaccatgc cgtgggtttc 11880
aatattggct tcatccacca catacaggcc gtagcggtcg cacagcgtgt accacagcgg 11940
atggttcgga taatgcgaac agcgcacggc gttaaagttg ttctgcttca tcagcaggat 12000
atcctgcacc atcgtctgct catccatgac ctgaccatgc agaggatgat gctcgtgacg 12060
gttaacgcct cgaatcagca acggcttgcc gttcagcagc agcagaccat tttcaatccg 12120
cacctcgcgg aaaccgacat cgcaggcttc tgcttcaatc agcgtgccgt cggcggtgtg 12180
cagttcaacc accgcacgat agagattcgg gatttcggcg ctccacagtt tcgggttttc 12240
gacgttcaga cgtagtgtga cgcgatcggc ataaccacca cgctcatcga taatttcacc 12300
gccgaaaggc gcggtgccgc tggcgacctg cgtttcaccc tgccataaag aaactgttac 12360
ccgtaggtag tcacgcaact cgccgcacat ctgaacttca gcctccagta cagcgcggct 12420
gaaatcatca ttaaagcgag tggcaacatg gaaatcgctg atttgtgtag tcggtttatg 12480
cagcaacgag acgtcacgga aaatgccgct catccgccac atatcctgat cttccagata 12540
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tgcgctcagg tcaaattcag acggcaaacg actgtcctgg ccgtaaccga cccagcgccc 12660
gttgcaccac agatgaaacg ccgagttaac gccatcaaaa ataattcgcg tctggccttc 12720
ctgtagccag ctttcatcaa cattaaatgt gagcgagtaa caacccgtcg gattctccgt 12780
gggaacaaac ggcggattga ccgtaatggg ataggttacg ttggtgtaga tgggcgcatc 12840
gtaaccgtgc atctgccagt ttgaggggac gacgacagta tcggcctcag gaagatcgca 12900
ctccagccag ctttccggca ccgcttctgg tgccggaaac caggcaaagc gccattcgcc 12960
attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca 13020
gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg gtaacgccag ggttttccca 13080
gtcacgacgt tgtaaaacga cgggatccat aaaaactagc attatttttt tcatgggttt 13140
cactctcctt ctacattttt taacctaata atgccaaata ccgtttgcca cccctctctt 13200
ttgataatta taatattggc gaaattcgct tctaaagatg aaacgcaata ttatatgctt 13260
gctttatagc tttattctag tcctgctgtc cctttatcgt cgttaacaaa tgttaatgcc 13320
tcaacataaa agtcactcta gtacattttt atctcatttt tataatcctg atagagataa 13380
tacttatttg ccgggttttg ctaatgcgaa aataacagga gcaaagtatt tcaatcaatc 13440
ggtgactgat taccgagaag ggaaatttga cacagcgttt tataaattag gcctagcaat 13500
ccattattat acggatatta gtcaacctat gcacgccaat aattttaccg caatatcata 13560
ccctccaggc taccactgtg catatgaaaa ttacgtagat accattaaac acaattatca 13620
agcaacggaa gacatggtag caaaaagatt ttgctcagat gacgtgaaag actggctcta 13680
tgaaaatgcg aaaagggcga aagcggacta cccgaaaata gtcaatgcga aaactaaaaa 13740
atcatattta gtaggaaatt ctgaatggaa aaaggataca gtggaaccta ctggagctag 13800
actaagagat tcacagcaaa ctttggcagg ttttttagaa ttttggtcta aaaaaacaaa 13860
tgaataacaa tatttaggaa tacattctta tccactcgtt agcgggtgga tatattttat 13920
ggggaggaag taagccaaat gtatataaaa gggaggttaa tctttttctt tgtagtgtta 13980
gtaatcgcgt tatgttccgt attaatattg cttataataa aaataagcgt atggaaagat 14040
gaaccatttc atttaagcga tgcaaaggag attgagtgtc ttggaagttg tgaaataaaa 14100
aatactaatc aaaaaatcca tttcttctcc ataaaagaga atttgtttga ggaaaagggt 14160
gatatagctg gaattttaaa tgaagacgaa caaaaagttg ctgataagtc cattttcatt 14220
gttattttgg atgatgaaaa agggattgcg aacgaagagt aaagcggttt gttaggtagt 14280
cttgaatagt taaaaaacaa tataggagga acatctatga aaatgcttaa aaagggtacc 14340
gcagttctat ttgtaatgat catggcagtt atgttagtcg cgtgtgggga taaagaagaa 14400
acgaaaactt acacactttc ccaaaatggt gttgattcta aattaacata cacatataag 14460
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gcttcaaaag aagacgctga aaaaatgctt aaagcaacaa gcgataaatt ccaaggtatt 14580
gatggtttaa aagaaaagat tgaatataaa gatgataaag ctattgaaac actagaagta 14640
gattacacta aaatctcttc ggaagatatg aacaaaatcc ctggtatgtc ttcaaatggt 14700
gatacttcta aagggattag catggaggaa tctgcaaaaa tgctagaatc ccaaggctat 14760
aaagaagttt caaaataaat ttgcaataaa aaagaagtat ccgattcatt tggatacttc 14820
ttttttat 14828
<210> 3
<211> 9285
<212> DNA
<213> 人工(Artificial )
<400> 3
gaattcccga ttatgtcttt tgcgcactcg gcttaaacca gttttcgctg gtgcgaaaaa 60
agagtgtctt gtgacaccta aattcaaaat ctatcggtca gatttatacc gatttgattt 120
tatatattct tgaataacat acgccgagtt atcacataaa agcgggaacc aatcatcaaa 180
tttaaacttc attgcataat ccattaaact cttaaattct acgattcctt gttcatcaat 240
aaactcaatc atttctttaa ttaatttata tctatctgtt gttgttttct ttaataattc 300
atcaacatct acaccgccat aaactatcat atcttctttt tgatatttaa atttattagg 360
atcgtccatg tgaagcatat atctcacaag acctttcaca cttcctgcaa tctgcggaat 420
agtcgcattc aattcttctg ttattatttt tatctgttca taagatttat taccctcata 480
catcactaga atatgataat gctctttttt catcctacct tctgtatcag tatccctatc 540
atgtaatgga gcactacaaa ttgaatgtgt aactctttta aatactctaa ccactcggct 600
ttgctgattc tggatataaa acaaatgtcc aattacgtcc tcttgaattt ttcttgtttt 660
cagtttcttt tattacattt tcgctcatga tataataacg gtgctaatac acttaacaaa 720
atttagtcat agataggcag catgccagtg ctgtctatct ttttttgttt aaaatgcacc 780
gtattcctcc tttgcatatt tttttattag aataccggtt gcatctgatt tgctaatatt 840
atatttttct ttgattctat ttaatatctc attttcttct gttgtaagtc ttaaagtaac 900
agcaactttt ttctcttctt ttctatctac aactatcact gtacctccca acatctgttt 960
ttttcacttt aacataaaaa acaacctttt aacattaaaa acccaatatt tatttatttg 1020
tttggacaat ggacaatgga cacctagggg ggaggtcgta gtacccccct atgttttctc 1080
ccctaaataa ccccaaaaat ctaagaaaaa aagacctcaa aaaggtcttt aattaacatc 1140
tcaaatttcg catttattcc aatttccttt ttgcgtgtga tgcgctgcgt ccattaaaaa 1200
tcctagagct ttgcaaccga aagttaatag ctgtcgctac tactttcgct tacgctctaa 1260
gtatatttta aggactgtca cacgcaaaaa gttttctcgg cataaaagta cctctacatc 1320
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<210> 4
<211> 7967
<212> DNA
<213> 人工(Artificial )
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ctacgcgtac tgtgagccag agttgcccgg cgctctccgg ctgcggtagt tcaggcagtt 5340
caatcaactg tttaccttgt ggagcgacat ccagaggcac ttcaccgctt gccagcggct 5400
taccatccag cgccaccatc cagtgcagga gctcgttatc gctatgacgg aacaggtatt 5460
cgctggtcac ttcgatggtt tgcccggata aacggaactg gaaaaactgc tgctggtgtt 5520
ttgcttccgt cagcgctgga tgcggcgtgc ggtcggcaaa gaccagaccg ttcatacaga 5580
actggcgatc gttcggcgta tcgccaaaat caccgccgta agccgaccac gggttgccgt 5640
tttcatcata tttaatcagc gactgatcca cccagtccca gacgaagccg ccctgtaaac 5700
ggggatactg acgaaacgcc tgccagtatt tagcgaaacc gccaagactg ttacccatcg 5760
cgtgggcgta ttcgcaaagg atcagcgggc gcgtctctcc aggtagcgaa agccattttt 5820
tgatggacca tttcggcaca gccgggaagg gctggtcttc atccacgcgc gcgtacatcg 5880
ggcaaataat atcggtggcc gtggtgtcgg ctccgccgcc ttcatactgc accgggcggg 5940
aaggatcgac agatttgatc cagcgataca gcgcgtcgtg attagcgccg tggcctgatt 6000
cattccccag cgaccagatg atcacactcg ggtgattacg atcgcgctgc accattcgcg 6060
ttacgcgttc gctcatcgcc ggtagccagc gcggatcatc ggtcagacga ttcattggca 6120
ccatgccgtg ggtttcaata ttggcttcat ccaccacata caggccgtag cggtcgcaca 6180
gcgtgtacca cagcggatgg ttcggataat gcgaacagcg cacggcgtta aagttgttct 6240
gcttcatcag caggatatcc tgcaccatcg tctgctcatc catgacctga ccatgcagag 6300
gatgatgctc gtgacggtta acgcctcgaa tcagcaacgg cttgccgttc agcagcagca 6360
gaccattttc aatccgcacc tcgcggaaac cgacatcgca ggcttctgct tcaatcagcg 6420
tgccgtcggc ggtgtgcagt tcaaccaccg cacgatagag attcgggatt tcggcgctcc 6480
acagtttcgg gttttcgacg ttcagacgta gtgtgacgcg atcggcataa ccaccacgct 6540
catcgataat ttcaccgccg aaaggcgcgg tgccgctggc gacctgcgtt tcaccctgcc 6600
ataaagaaac tgttacccgt aggtagtcac gcaactcgcc gcacatctga acttcagcct 6660
ccagtacagc gcggctgaaa tcatcattaa agcgagtggc aacatggaaa tcgctgattt 6720
gtgtagtcgg tttatgcagc aacgagacgt cacggaaaat gccgctcatc cgccacatat 6780
cctgatcttc cagataactg ccgtcactcc aacgcagcac catcaccgcg aggcggtttt 6840
ctccggcgcg taaaaatgcg ctcaggtcaa attcagacgg caaacgactg tcctggccgt 6900
aaccgaccca gcgcccgttg caccacagat gaaacgccga gttaacgcca tcaaaaataa 6960
ttcgcgtctg gccttcctgt agccagcttt catcaacatt aaatgtgagc gagtaacaac 7020
ccgtcggatt ctccgtggga acaaacggcg gattgaccgt aatgggatag gttacgttgg 7080
tgtagatggg cgcatcgtaa ccgtgcatct gccagtttga ggggacgacg acagtatcgg 7140
cctcaggaag atcgcactcc agccagcttt ccggcaccgc ttctggtgcc ggaaaccagg 7200
caaagcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct 7260
cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa 7320
cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggg atccataaaa actagcatta 7380
tttttttcat gggtttcact ctccttctac attttttaac ctaataatgc caaataccgt 7440
ttgccacccc tctcttttga taattataat attggcgaaa ttcgcttcta aagatgaaac 7500
gcaatattat atgcttgctt tatagcttta ttctagtcct gctgtccctt tatcgtcgtt 7560
aacaaatgtt aatgcctcaa cataaaagtc actctaggcg gccgctaata atcttgcgct 7620
tcgatgacaa cagctgtacc agatgcagtg accattagca ttccgttatc agctccaagc 7680
acttcataat caatatcaac accgataacg gcatttgcgc caatatcttt cgcacgttgt 7740
tccatttcac gaattgcttc ctcgcgagca ttaataagtt catcttcata gccttgcgaa 7800
cggcccccga agaaatttcg aagtccagcc ccaatatctt tcataaagtt aacgccagtg 7860
atgacttcgc cgaaaacgat ttttttatat tcgataattt gtttgccttc aatatttggt 7920
gaagttgtta caatcatgag ttatccctac agtttttctt ttatcatacc tcttagtact 7980
ttttctagtc aaaggatatc cggttatttc gtacgatttc gcgctttttc tatataagaa 8040
atagcatctg gaactttaca agctgtattt ccaaggttta catgaacttt cccgactgat 8100
ttcgcggctt ccatcgcttt ttcgtgcaaa tcgtctttgt aaattccaca agtgataata 8160
aaaccgttca ttgaatagcg ggttctattg gtttctgttt gcagcgtttc tttcgcgcgt 8220
tgaagtaatg tctctgcttc aggcaaattg ttaatatgtt cgctgtaaat ctgccagccc 8280
atggatttag ttaaatcata atcactttca atccatgttt tggcgaaaag gagtgcatca 8340
tcacgtttgc ttacaatcga tgctagtcca aaagttagtt gtgaccatgt ttcgcgaaaa 8400
gcgatattcc atttttcgat ttgttcggtg gttattttgt ttggattaat tgctagcaaa 8460
ccgagataaa tcaagtcact attatttgat tcaatcagtt ttacggcgag ttcgtgattt 8520
tttgtcagtt tttctcggcg gatgattttc tttaaatcac caatttttag tccgtaaaga 8580
tctaatgaat ccggacaacc gtgattacga aaaattttga tcgtattggg gttttctaag 8640
gcttgtagct cggtgtcaag ttggtcaaaa gtaatcatac gcgtcactcc tctcgaataa 8700
agtaagtata acaaaaaaag catgcgaagg cgcatgcttt aggatttaag aatattagtc 8760
tatttgtttc attgcgtcgt tctagaactt ttttaagtgt atctgcggag tttttcattt 8820
gttctttttc tttgtcattt aagttcattt caacaatatg gcgaacgcct tgacggttaa 8880
cgactgctgg tgcacctata taaatatcgt tcataccgta atggccatct aaataaacag 8940
aaagtggcaa aatcgcattt tcgttattta gaattgcttt tgtaatacga gcaagagctg 9000
cagcaacgcc gtagaatgta gcgccttttt tattaataat ttcataagct gcatcacgaa 9060
cacttacgaa aatagtatcc attgcacctt gttcatcttc gctaatccat tcagtaattg 9120
gaaggccgcc gacagttgtg tggctccatg ctgggaattc ttgaagacga aagggcctcg 9180
tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg 9240
gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa 9300
atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 9360
agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 9420
ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 9480
gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 9540
gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 9600
tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 9660
acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 9720
aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 9780
cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 9840
gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 9900
cgatgcctgc agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 9960
tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 10020
tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 10080
ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 10140
tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 10200
gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 10260
ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 10320
tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 10380
agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 10440
aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 10500
cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt 10560
agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 10620
tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 10680
gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 10740
gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 10800
ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 10860
gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 10920
ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 10980
ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 11040
acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 11100
gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 11160
cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 11220
tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc 11280
gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc 11340
gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg 11400
gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agctgcggta 11460
aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct gcctgttcat ccgcgtccag 11520
ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg ataaagcggg ccatgttaag 11580
ggcggttttt tcctgtttgg tcacttgatg cctccgtgta agggggaatt tctgttcatg 11640
ggggtaatga taccgatgaa acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa 11700
catgcccggt tactggaacg ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac 11760
cagagaaaaa tcactcaggg tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca 11820
cagggtagcc agcagcatcc tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac 11880
ttccgcgttt ccagacttta cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag 11940
gtcgcagacg ttttgcagca gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc 12000
tgctaaccag taaggcaacc ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc 12060
atgcgcaccc gtggccagga cccaacgctg cccgacgatg ataagctgtc aaacatga 12118
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工(Artificial )
<400> 7
ccacaagctt tgtcccgtac acttg 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工(Artificial )
<400> 8
tatactcgag agcaagtgta gaagc 25
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工(Artificial )
<400> 9
gataagtcga cgattcacaa aaaatag 27
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工(Artificial )
<400> 10
aaaactagtc ccggggcgaa ttg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工(Artificial )
<400> 11
gctataaatg aagaggcttc agg 23
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工(Artificial )
<400> 12
ctcttaaatc agctaggcga tc 22

Claims (9)

1.基于重组减毒单增李斯特菌的间皮素高表达癌症治疗性疫苗，其特征在于，其有效成分为携带间皮素基因的重组减毒单增李斯特菌。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述减毒单增李斯特菌为单增李斯特菌完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得。
3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述重组减毒单增李斯特菌的制备方法，是以减毒单增李斯特菌为载体，携带间皮素基因而得。
4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，具体步骤如下：
(1)合成间皮素基因片段；
(2)构建打靶质粒；
(3)制备感受态细胞LmΔactAplcB-lacZ；
(4)利用步骤(2)制备的打靶质粒对步骤(3)制备的感受态细胞进行电转化；
(5)LmΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养、筛选验证。
5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，步骤(1)的具体方法是：从NCBI上查询间皮素蛋白氨基酸序列，然后根据李斯特菌密码子进行相应优化得到优化后的序列，再在其上游加入HindⅢ酶切位点，下游加入XhoⅠ酶切位点，将上述设计好的序列最后通过合成直接获得，如SEQ ID NO.1所示。
6.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，步骤(2)的具体方法是：用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切步骤(1)获得的间皮素基因片段，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pCW203(专利CN103074361B)，经连接、转化等技术将间皮素基因片段插入pCW203HindⅢ和XhoⅠ酶切位点，得到中间质粒pCW203-Meso，如SEQ ID NO.2所示，通过PCR验证、提质粒验证、酶切验证证实中间质粒的成功构建，切下中间质粒pCW203-Meso的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间的片段插入重组质粒pCW180的BamHI酶切位点与XhoI酶切位点之间，得到打靶质粒pCW180-Meso，其中，所述重组质粒pCW180的基因序列为序列表中SEQ ID NO.3所示。
7.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，步骤(3)的具体方法是：将LmΔactAplcB-lacZ用含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基进行培养，定期测定A600，当A600＝0.4时，加入盘尼西林G，使其终浓度为12.5μg/ml继续培养；当A600＝0.7时，离心，洗涤，分装，保存即可。
8.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，步骤(4)的具体方法是：取打靶质粒电转至LmΔactAplcB-lacZ感受态细胞中，电转完成后加入BHI肉汤培养2小时；转化液涂布于红霉素BHI琼脂平板，通过蓝白斑筛选出单个蓝色菌落，纯培养后进行质粒提取和PCR验证。
9.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，步骤(5)的具体方法是：将携带打靶质粒的单增李斯特菌，在42℃和30℃连续传代，利用同源重组杂交原理和基因打靶技术，将打靶质粒携带的目的片段整合至李斯特菌中，利用蓝白斑及红霉素敏感性筛选出可疑菌株；然后进行PCR筛选和基因测序验证。
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