CN108686266A - 一种三维多孔微支架组装单元的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三维多孔微支架组装单元的制备方法，所述制备方法以改性明胶和丝素蛋白为原材料，结合光交联技术和化学改性方法，利用真空冷冻干燥技术制备出三维多孔微支架组装单元，本发明所公开制备方法设备简单，工艺参数易于控制，且成本费用低，制备出的微支架单元其孔隙率高，有良好的孔隙贯通性，平均孔径大小为70‑80μm之间，这非常有利于细胞的均匀分布和更可控的细胞微环境。并且通过制备不同形状的微支架单元，可以将这些支架材料按照不同的拼凑方法实现二维和三维层面上的组装。

Description

一种三维多孔微支架组装单元的制备方法

技术领域

本发明涉及医用材料领域，具体涉及一种三维多孔微支架组装单元的制备方法。

背景技术

再生和重建具有自然状态下生物结构和功能的组织，是现代组织工程学和生物支架材料研究的目标。传统的支架材料结构的设计思想是“自上而下”，即基于从大块材料出发，先从其外形进行形态模仿，再设计其组成和结构以尽量模拟出自然骨的微结构，如骨植入支架材料的多孔结构设计，虽然可以在一定尺度范围内模拟骨的孔结构，但其仿生结构主要还在宏观尺度范围，难以赋予其微米尺度范围内的仿生结构。

通过微单元组装实现复杂组织结构的构建，即“自下而上”的支架材料设计思想，是一个新兴的研究领域，已成为组织工程组织器官构建的新方向和研究热点。“自下而上”构建的组织工程复合体具有更均匀的细胞分布和更可控的细胞微环境，可以更好的弥补传统支架材料的不足。

考虑到传统方法各种问题，组织工程材料领域仍然需要改善的解决手段来愈合软组织缺损。

发明内容

为实现现有技术的不足，本发明为改性明胶和丝素蛋白为原材料，结合光交联技术和化学改性方法，利用真空冷冻干燥技术，开发出一种可以制造具有高模式、高保真度和模块化组织工程的开放多孔结构的新型微支架。通过制备不同形状的微支架单元，可以将这些支架材料按照不同的拼凑方法实现二维和三维层面上的组装。

为实现上述发明目的，具体提供了如下技术方案：

一种三维多孔微支架组装单元的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

1)玻璃片预处理:首先使玻璃片表面接上氢氧基，进一步使用TMSPMA试剂处理玻璃片表面，将玻璃片用锡箔纸包住，然后在60℃温度条件下反应促使玻璃片引入碳氧双键，反应结束后，用无水乙醇及去离子水清洗，即完成玻璃片预处理；

2)预聚溶液配制：将光引发剂与甲基丙烯酸酐改性明胶溶液混合均匀，然后加入丝素蛋白溶液，得到预聚溶液；

3)紫外光交联处理：将预聚溶液及时吸入至模具，用预处理过的玻璃片盖在溶液表面，将具有特定形状的光掩膜置于玻璃片上，用紫外光交联12s，最后用二次去离子水洗涤未经交联的溶液，最终得到微凝胶；

4)化学改性及预冻：将微凝胶浸入甲醇溶液中，以诱导丝素蛋白向结晶化转变，然后充分洗涤残留甲醇溶液后，去除微凝胶表面水分并预冻；

5)真空干燥：将预冻后的水凝胶置于真空干燥机干燥，得到三维多孔微支架组装单元。

进一步，步骤1)所述玻璃片表面接上氢氧基的方法为：首先使用乙醇及去离子水将玻璃片表面清洗干净并风干，然后将玻璃片置于碱性溶液中浸泡24小时以上，然后用去离子水清洗玻片表面并风干。

进一步，步骤2)所述预聚溶液中光引发剂质量分数为0.5％，所述甲基丙烯酸酐改性明胶溶液溶剂为去离子水，质量分数为6％，所丝素蛋白溶液溶剂为去离子水，质量分数为8％，所移取甲基丙烯酸酐改性明胶溶液与丝素蛋白溶液体积比为9:1。

进一步，所述光交联剂为2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐中的一种或几种。

进一步，步骤3)所述模具为高度为300μm的细胞培养皿，所述紫外光所述紫外光光源波长：320-500nm，紫外点光源功率：7.0mW/cm²，交联时间为12s。

进一步，步骤4)所述甲醇溶液质量分数为80％，浸入时间为1小时，预冻温度为-80℃，预冻时间为24小时。

进一步，步骤5)所述真空干燥机设置参数为：冷井温度为-81℃，板层温度为25℃，真空度为10Pa,干燥时间24小时。

本发明的有益效果为：本发明以改性明胶和丝素蛋白为原材料，结合光交联技术和化学改性方法，利用真空冷冻干燥技术，开发出了一种可以制造具有高模式、高保真度和模块化组织工程的开放多孔结构的新型微支架，本发明所公开制备方法设备简单，工艺参数易于控制，且成本费用低，制备出的微支架单元其孔隙率高，有良好的孔隙贯通性，平均孔径大小为70-80μm之间，这非常有利于细胞的均匀分布和更可控的细胞微环境。并且通过制备不同形状的微支架单元，可以将这些支架材料按照不同的拼凑方法实现二维和三维层面上的组装。

附图说明

图1为25倍下明胶-丝素蛋白组的SEM图片；

图2为200倍下明胶-丝素蛋白组的SEM图片。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明进行更加详细的阐述。

实施例

一种三维多孔微支架组装单元的制备：

1)用TMSPMA处理玻璃片：1)将待处理玻璃片用无水乙醇和去离子水清洗干净并风干后，放在一个玻璃片固定架上，随后用氢氧化钠溶液处理玻璃片，处理时间为1天,该过程可使玻璃片接上氢氧基；氢氧化钠处理结束后，用去离子水反复清洗并风干，并将所有玻璃片整齐放在一个玻璃片盒里面，用TMSPMA试剂处理玻璃片的侧面，利用玻璃片之间的表面张力，即可实现对每块玻璃片的处理。随后，将全部玻璃片用锡箔纸包住并放在60℃的烘箱内反应1天。该过程可使玻璃片上的氢氧基与TMSPMA反应由此使玻璃片引入碳氧双键。3)TMSPMA溶液与玻璃片反应结束后，取出后用无水乙醇彻底清洗两遍，主要去除没有反应的油性物质，然后用去离子水反复清洗，最后用风筒风干，即完成了TMSPMA玻璃片的处理；

2)明胶的改性：称取5g A型明胶溶解于50mLPBS中，用磁力搅拌器加热匀速搅拌，溶解完全后，缓慢滴入5mL的甲基丙烯酸酐溶液。滴加完成之后保持一定转速在50℃下反应3小时，最后加入100mL PBS溶液稀释，将稀释好的溶液放入到截留分子量为8000-12000D的透析袋中，用去离子水在60℃下透析7天，每天更换5次去离子水，透析完成后将所得的明胶溶液冷冻干燥处理，最终的到具有紫外光敏感性的改性明胶；

3)将改性后的明胶用去离子水配成质量分数为6％的溶液，取900μl该溶液与100μl浓度为8％丝素蛋白溶液的均匀混合，得到明胶-丝素蛋白组预聚溶液，整个预聚溶液中含光引发剂2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮的质量浓度为0.5％；

4)紫外光交联处理：将90μl预聚溶液吸移到一细胞培养皿的背面，控制微凝胶的高度为300μm，并用TMSPMA试剂处理过后的玻璃片贴在溶液上面，随后，将具有特定形状的光掩膜置于玻璃片上，用紫外光(紫外光光源波长：320-500nm，紫外点光源功率：7.0mW/cm²)交联12s，最后用二次去离子水洗涤未经交联的溶液，最终得到微凝胶；

5)化学改性及预冻：对于明胶-丝素蛋白组经紫外交联所得的微凝胶浸入浓度为80％甲醇溶液1小时，用于诱导丝素蛋白向结晶化转变。充分洗涤残留甲醇溶液后，将微凝胶表面的水分部分吸走并将其放在-80℃的冰箱中预冻。

6)真空干燥：将上述两种微凝胶冷冻24小时后，将其置于真空干燥机中，设置冷井温度为-81℃，板层温度为25℃，真空度最终为10Pa,干燥24小时，最终得到微支架。

对比实施例

与以上实施例不同之处在于：步骤3)为配制0.5％的光引发剂，溶解完全后，用该溶液将改性后的明胶配成6％的溶液，制备得到纯明胶组预聚溶液。步骤5)为微凝胶经去离子水浸泡半小时后，将微凝胶表面的水分部分吸走，随后放入-80℃的冰箱中预冻。

进一步将实施例1所得微支架进行电子显微镜照射，得到如图1所示的25倍下明胶-丝素蛋白组的SEM图片，由图1可看出通过实施例所述方法制备得到的微支架具有高精度、高保真度。图2为200倍下明胶-丝素蛋白组的SEM图片，结果表明，微支架呈现均匀分布的、开放的孔状结构，平均孔径大小为70-80μm之间，这非常有利于细胞的均匀分布和更可控的细胞微环境。

而通过同样的照射方式对对比实施例所制备微凝胶进行照射，其性能远不如实施例所制备的产品。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种三维多孔微支架组装单元的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

1)玻璃片预处理:首先使玻璃片表面接上氢氧基，进一步使用TMSPMA试剂处理玻璃片表面，将玻璃片用锡箔纸包住，然后在60℃温度条件下反应促使玻璃片引入碳氧双键，反应结束后，用无水乙醇及去离子水清洗，即完成玻璃片预处理；

2)预聚溶液配制：将光引发剂与甲基丙烯酸酐改性明胶溶液混合均匀，然后加入丝素蛋白溶液，得到预聚溶液；

3)紫外光交联处理：将预聚溶液及时吸入至模具，用预处理过的玻璃片盖在溶液表面，将具有特定形状的光掩膜置于玻璃片上，用紫外光交联12s，最后用二次去离子水洗涤未经交联的溶液，最终得到微凝胶；

4)化学改性及预冻：将微凝胶浸入甲醇溶液中，以诱导丝素蛋白向结晶化转变，然后充分洗涤残留甲醇溶液后，去除微凝胶表面水分并预冻；

5)真空干燥：将预冻后的水凝胶置于真空干燥机干燥，得到三维多孔微支架组装单元。

2.根据权利要求1所述一种三维多孔微支架组装单元的制备方法，其特征在于，其特征在于，步骤1)所述玻璃片表面接上氢氧基的方法为：首先使用乙醇及去离子水将玻璃片表面清洗干净并风干，然后将玻璃片置于碱性溶液中浸泡24小时以上，然后用去离子水清洗玻片表面并风干。

3.根据权利要求1所述一种三维多孔微支架组装单元的制备方法，其特征在于，步骤2)所述预聚溶液中光引发剂质量分数为0.5％，所述甲基丙烯酸酐改性明胶溶液溶剂为去离子水，质量分数为6％，所丝素蛋白溶液溶剂为去离子水，质量分数为8％，所移取甲基丙烯酸酐改性明胶溶液与丝素蛋白溶液体积比为9:1。

4.根据权利要求1所述一种三维多孔微支架组装单元的制备方法，其特征在于，所述光交联剂为2-羟基-4′-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮，苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述一种三维多孔微支架组装单元的制备方法，其特征在于，步骤3)所述模具为高度为300μm的细胞培养皿，所述紫外光所述紫外光光源波长：320-500nm，紫外点光源功率：7.0mW/cm²，交联时间为12s。

6.根据权利要求1所述一种三维多孔微支架组装单元的制备方法，其特征在于，步骤4)所述甲醇溶液质量分数为80％，浸入时间为1小时，预冻温度为-80℃，预冻时间为24小时。

7.根据权利要求1所述一种三维多孔微支架组装单元的制备方法，其特征在于，其特征在于，步骤5)所述真空干燥机设置参数为：冷井温度为-81℃，板层温度为25℃，真空度为10Pa,干燥时间24小时。