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CN108610417B - 抗破伤风毒素中和抗体、其制备方法及用途 - Google Patents

抗破伤风毒素中和抗体、其制备方法及用途 Download PDF

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CN108610417B CN201810404462.8A CN201810404462A CN108610417B CN 108610417 B CN108610417 B CN 108610417B CN 201810404462 A CN201810404462 A CN 201810404462A CN 108610417 B CN108610417 B CN 108610417B
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Abstract

本发明提供了一种抗破伤风毒素中和抗体、其制备方法和用途，所述抗体的轻链可变区的CDR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑3所示；所述中和抗体的重链可变区的CDR的氨基酸序列如SEQ ID NO.4‑6所示。本发明的中和抗体无免疫原性、特异性好、亲和力高、成分清晰、无病原体污染等潜在风险，广泛适用于各种人群，所述制备方法简单高效、适于标准化生产。

Description

抗破伤风毒素中和抗体、其制备方法及用途
技术领域
本发明属于细胞免疫学领域，涉及一种全人源抗破伤风毒素中和抗体；另外，本发明还涉及该中和抗体的制备方法和用途。
背景技术
破伤风(Tetanus)是由于感染破伤风梭状芽孢杆菌(clostridiumtetani)而引起的急性、致死性的人畜共患神经系统疾病。破伤风梭状芽孢杆菌广泛存在于人、畜的肠道和土壤中，人群携带率高达25％，不同类型和大小的伤口均可成为破伤风梭状芽孢杆菌入侵的门户。当人被感染后，潜伏期内破伤风梭状芽孢杆菌在厌氧条件下于创口处大量繁殖并释放毒素，破伤风毒素通过破坏人体神经细胞而侵害中枢神经系统，导致机体痉挛、四肢强直、角弓反张等症状，最终使人因窒息或呼吸衰竭而死亡。在战争爆发和自然灾害频发时期，破伤风成为一项严峻的公共卫生问题，任何年龄人群均可能发生破伤风感染，死亡率为20-30％，重症患者以及新生儿的死亡率高达80％。
破伤风毒素作用迅速，毒性很强。当患者被确诊为感染破伤风杆菌后，体内一般已存在大量细菌和毒素，使用抗菌素已不能挽救患者生命。预防和治疗破伤风的唯一有效的方法是及时注射抗破伤风毒素抗体中和毒素，并通过抗体受体的介导将毒素从体内清除。近年来出现越来越多关于人-鼠嵌合、人源和全人源抗破伤风毒素单克隆抗体的报道。利用B细胞筛选抗体工程技术对全人源单克隆抗体进行改造制备的基因工程抗体不仅消除了血清蛋白引起的过敏反应，而且克服了人源免疫球蛋白生产过程的弊端，具有较好的发展前景。采用基因重组技术，在基因水平上对抗体分子进行改造，形成嵌合抗体，即将鼠抗可变区基因与人IgG恒定区链接；人源化抗体，即将鼠抗可变区的互补决定区移植入人IgG的骨架区中，进一步降低了鼠抗引起的免疫反应；完全人源抗体，该类抗体不含任何外来基因，不会造成过敏反应，是目前基因工程抗体研究的热点之一。然而这些报道的抗体虽然能够与破伤风毒素结合，但中和毒素的效价不高，且抗体的产业化生产问题尚未解决。
因此，本领域迫切需要利用更先进的技术，开发高效安全的全人源抗破伤风毒素中和抗体，用于取代市场供应的血清制品，以满足人类的需求。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供适一种全人源抗破伤风毒素单克隆中和抗体，及其制备方法和用途，所述抗体无免疫原性、特异性好、亲和力高、成分清晰、无病原体污染等潜在风险，广泛适用于各种人群，所述制备方法简单高效、适于标准化生产。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种抗原结合片段，所述抗原结合片段的轻链可变区的互补决定区CDR的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示；
所述抗原结合片段的重链可变区的互补决定区CDR的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-6所示。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或SEQ ID NO.1经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且形成的抗体或其抗原结合片段具有相同或相似活性得到的氨基酸序列。
优选地，轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过不高于20％，优选为不高于5％的氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的同源性氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有结合破伤风毒素的活性。
优选地，轻链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或SEQID NO.2经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且形成的抗体或其抗原结合片段具有相同或相似活性得到的氨基酸序列。
优选地，轻链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过不高于20％，优选为不高于5％的氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的同源性氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有结合破伤风毒素的活性。
优选地，轻链可变区的补决定区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示或SEQ IDNO.3经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且形成的抗体或其抗原结合片段具有相同或相似活性得到的氨基酸序列。
优选地，轻链可变区的互补决定区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列经过不高于20％，优选为不高于5％的氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的同源性氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有结合破伤风毒素的活性。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的CDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示或SEQ ID NO.4经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且形成的抗体或其抗原结合片段具有相同或相似活性得到的氨基酸序列。
优选地，重链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过不高于20％，优选为不高于5％的氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的同源性氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有结合破伤风毒素的活性。
优选地，重链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示或SEQID NO.5经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且形成的抗体或其抗原结合片段具有相同或相似活性得到的氨基酸序列。
优选地，重链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列还可以为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列经过不高于20％，优选为不高于5％的氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的同源性氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有结合破伤风毒素的活性。
优选地，重链可变区的互补决定区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示或SEQID NO.6经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且形成的抗体或其抗原结合片段具有相同或相似活性得到的氨基酸序列。
优选地，重链可变区的互补决定区CDR3的氨基酸序列还可以为SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列经过不高于20％，优选为不高于5％的氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的同源性氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有结合破伤风毒素的活性。
进一步，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示或SEQ ID NO.7经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且形成的抗体或其抗原结合片段具有相同或相似活性得到的氨基酸序列。
优选地，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列经过不高于20％，优选为不高于5％的氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的同源性氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有结合破伤风毒素的活性。
进一步地，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.8所示或SEQ ID NO.8经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且形成的抗体或其抗原结合片段具有相同或相似活性得到的氨基酸序列。
优选地，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列经过不高于20％，优选为不高于5％的氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的同源性氨基酸序列，且获得的氨基酸序列具有结合破伤风毒素的活性。
包括优选抗体氨基酸序列的保守序列变体的抗体也包括在本发明的范围之内。保守氨基酸序列变体包括不显著改变本发明所述的全人源抗破伤风毒素中和抗体结合性质和中和性质等的氨基酸序列的修饰，如源于本领域熟知的相似氨基酸替代的变体，氨基酸的缺失、增加的变体。
本发明的抗体还包括人源与非人源抗体，以及具有与本发明所述抗体相同功能或改造以及优化的一切抗体。
本发明所述术语“抗体”是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域C组成。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型))，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
本发明所述术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。在具体实施方案中，抗原结合片段可以例如选自下组：Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补决定区(CDR)片段、线性抗体、单链抗体(例如，scFv)、微型抗体、双抗体和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。
第二方面，本发明提供了一种全人源抗破伤风毒素中和抗体，所述中和抗体包括如第一方面所述的抗原结合片段。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的恒定区包括人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区中的任意一种或至少两种的组合，优选为人源IgG1恒定区。
第三方面，本发明提供了一种DNA片段，所述DNA片段包括编码如第一方面所述的抗原结合片段和/或如第二方面所述的抗体的轻链可变区和/或重链可变区的核苷酸序列。
第四方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括如第二方面所述的DNA片段。在一个优选实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。
优选地，所述表达载体包括pcDNA3.3载体。
第五方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如第二方面所述的DNA片段和/或如第三方面所述的表达载体。
可用于本发明的宿主细胞包括但不限于微生物，例如可以是经含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；经含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母菌(酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia))；经含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；经重组病毒表达载体(花椰菜花叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV))感染的或经含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(Ti质粒)转化的植物细胞系统；或携带含有来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(金属硫蛋白启动子)、来源于哺乳动物病毒的启动子(腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(COS、CHO、BHK、293、3T3细胞)。
第六方面，本发明提供了一种制备如第一方面所述抗原结合片段和/或如第二方面所述抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)采集免疫个体的B细胞，PCR获得中和抗体可变区的DNA片段；
(2)将步骤(1)所述DNA片段连接入表达载体，转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；
(3)将筛选后的表达载体转入宿主细胞，培养并收集上清液，分离纯化得到所述中和抗体。
本发明利用单细胞RT-PCR与抗体筛选技术，从注射了破伤风疫苗的健康人B细胞中分离出来抗破伤风毒素中和抗体的可变区核苷酸序列，通过构建表达载体，获得了高纯度的全人源中和抗体蛋白，制备方法标准可控，成本低廉。
第七方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述的抗原结合片段、如第二方面所述的抗体、如第三方面所述的DNA片段、如第四方面所述的表达载体或如第五方面所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第七方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的抗原结合片段、如第二方面所述的抗体、如第三方面所述的DNA片段、如第四方面所述的表达载体或如第五方面所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所示试剂盒还包括洗涤液。
第八方面，本发明提供了一种如第一方面所述的如第二方面所述的抗体、如第三方面所述的DNA片段、如第四方面所述的表达载体或如第五方面所述的宿主细胞在制备破伤风相关药物和/或检测试剂中的应用。
本发明中，所述破伤风药物用于预防和/或治疗破伤风。
本发明中，“破伤风毒素”是指破伤风梭状杆菌在厌氧条件下产生的分泌蛋白，是本领域公知常识(参见NCBI GENEBANK数据库等公开序列)。
本发明中，“单克隆抗体”指从一类基本均一的群体中获得的抗体，除少数可能存在的天然突变外，所述群体中包含相同的单个抗体。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点，通过细胞株进行生产，不存在交叉污染；修饰语“单克隆”仅表示抗体的特性，是指从基本均一的抗体群中获得的，不能解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明中，所述抗体包括同系物或修饰物；其中，所述同系物包括利用单点突变或多点组合突变对抗体恒定区或CDR部分氨基酸序列进行改造和优化后的抗体片段、CDR移植抗体片段、恒定区与CDR氨基酸序列改造的单个重链CDR或单个轻链CDR的抗体片段、CDR移植抗体、恒定区与CDR改造的抗体或含有本发明抗体CDR的单个重链与单个轻链的一切抗体可变区进行连接得到的scFv抗体；所述修饰物包括对抗体的氨基酸序列或核苷酸序列进行添加、删除或修改后的仍旧保留中和破伤风毒素能力的产物。
本发明中，“可变”指抗体的可变区在序列上有所不同，形成了各种对特定抗原具有特异性结合功能的抗体。可变性集中于抗体轻链和重链可变区的互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中，天然重链和轻链的可变区中各包含四个FR区(可变区中较保守的部分)，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的中和抗体对破伤风毒素具有很强的结合活性和亲和力；
(2)本发明的中和抗体纯度高、无免疫原性、成分清晰，不存在病原体污染等潜在风险；
(3)本发明的制备中和抗体的方法标准可控、成本低廉、简单高效、适于标准化生产。
附图说明
图1为本发明TRN1013抗体的SDS-PAGE图，其中，第1泳道为非还原的抗体，第2泳道为蛋白分子量，第3泳道为还原的抗体；
图2为本发明TRN1013抗体与破伤风标准毒素的中和活性检测结果图；
图3为本发明TRN1013抗体与破伤风标准毒素的亲和活性检测图；
图4为本发明TRN1013抗体在20倍LD50剂量下在小鼠体内的中和试验结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例使用的术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于10-5M的解离平衡常数(KD)与抗原结合，例如可以小于10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M，KD采用表面等离子体共振术(SPR)利用BIACORE仪测定。
实验材料
(1)健康志愿者注射1500IU破伤风类毒素疫苗后，分别于第0、14和21天采集血液样本20mL，抗凝；
(2)试剂：破伤风疫苗，Ficoll淋巴细胞分离液(Cedarlane公司)，TAT-FITC，TAT-FITC-Isotype，引物(Invitrogen)，Superscript III反转录酶，HotStarTaq Plus酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)，琼脂糖，Tris，LB培养基，氨苄青霉素，PolyFect转染试剂(Qiagen，Valencia，CA)，FCS，DMEM培养基，PBS缓冲液，BSA，HBsAg试剂盒等；
(3)载体：pcDNA3.3；
(4)菌株：大肠杆菌DH5α；
(5)细胞：293T。
实施例1单个核细胞分离和浆细胞分选
(1)分别于第0、14和21天从注射了1500IU破伤风类毒素疫苗的健康志愿者的血液中采集15mL血液样本于含有肝素的抗凝管中，用Ficoll分离，吸取单个核细胞(PBMC)层悬液，用PBS洗涤3次，吸弃上清；
(2)用40μm滤膜过滤，细胞计数后利用BD FACSria流式细胞仪从PBMC分选出目标细胞群，挑选形态完好的单个细胞置于96孔PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)板中(每孔20μL单细胞裂解液)，使每个孔含有一个B细胞，-80℃冰箱保存备用。
实施例2利用RT-PCR从单个B细胞中分离抗体可变区基因
(1)RT-PCR：向含有单个B细胞的96孔板中加入0.5μM不同亚型重链与轻链的恒定区引物(引物采用常规方法在特定位点设计)和Superscript III反转录酶，37℃孵育1小时，按以下条件进行PCR扩增：95℃ 15min；95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min；4℃ 5min；获得的产物cDNA于-20℃保存；
(2)PCR：50μL体系中含有5μL反转录产物、HotStarTaq Plus酶、dNTPs、和0.5μM的不同亚型重链与轻链可变区的特异性引物(引物采用常规方法在特定位点设计)，按以下条件进行PCR扩增：预变性94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 50s，35个循环；72℃ 7min；获得的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
结果显示，PCR产物约400bp。
实施例3构建重组抗体的表达载体
将凝胶电泳鉴定为阳性、且重链与轻链可匹配成对的抗体可变区基因的PCR产物利用TA克隆的方法连接到pcDNA3.3载体上，构建抗破伤风毒素全人源中和抗体的表达载体，然后将表达载体转化DH5α感受态细菌，在含有氨苄青霉素的平板上37℃培养过夜，挑取10个单菌落用特异性引物进行PCR，反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸100s，28个循环；72℃延伸5min。取5μL PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
结果显示，在阳性转化子中鉴定出了含有抗体重链和轻链基因的转化子。
实施例4抗体表达
将阳性质粒转化DH5α进行大量扩增，快速提取重组质粒后，与转染试剂PolyFect共转染293细胞，转染后6-8小时换大量新鲜培养基，并在37℃8％CO2培养箱中培养96小时，收集细胞上清进行检测。
实施例5表达抗体的筛选检测
利用包被液将破伤风类毒素10倍稀释后，向96孔ELISA板加入100μL/每孔，4℃过夜包被，封闭液常温封闭2小时；加入100μL瞬时转染上清(一抗)37℃孵育2小时，再加入HRP/anti-His-tag(1:2000稀释，二抗)37℃孵育1小时，加入底物显色液100μL/孔，常温避光放置5min后，用2M硫酸中止反应，在450nm波长下进行比色检测。
实施例6抗体的表达与纯化
将中和实验鉴定的有中和活性的抗体重链与轻链的表达载体(其中，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)共转染293细胞，转染后6-8小时换大量新鲜培养基，并在37℃8％CO2培养箱中培养96小时；收集转染上清，4000rpm离心1小时，利用蛋白A亲和层析法进行纯化；利用SDS-PAGE检验抗体的表达及纯化情况。
结果如图1所示，得到蛋白纯度高，可清晰观察到解链后的轻链和重链。共转染表达质粒载体的293细胞成功表达全人源抗体，能有效识别破伤风类毒素抗原，而未转染表达质粒的293细胞培养上清不能识别破伤风类毒素抗原，即瞬时转染293成功表达了能特异性识别破伤风类毒素的抗破伤风痉挛毒素全人源抗体。
实施例7单抗中和活性检测
用前文提到的相同的ELISA方法对表达纯化的抗体的中和活性进行检测：利用包被液将破伤风类毒素10倍稀释后，向96孔ELISA板加入100μL/每孔，4℃过夜包被，封闭液常温封闭2小时；加入100μL表达纯化的抗体作为一抗，37℃孵育2h，再加入HRP/anti-His-tag(1:2000稀释)作为二抗37℃孵育1h，加入底物显色液100μL/孔，常温避光放置5min后，用2M硫酸中止反应，用450nm波长下进行比色检测。
结果如图2所示，稀释浓度大于50,000倍的TRN1013抗体(抗体浓度约为0.0005μg/mL)依然可以与抗原中和，具有极强的中和活性。
实施例8单抗亲和活性检测
抗体亲和力测试采用捕获法，缓冲液为HBS-EP，CM5芯片先用proteinA进行偶联。然后稀释捕获抗体使其浓度为1μg/mL，结合时间为50s。将分析物破伤风素素以逐渐增高的浓度依次流过芯片，分别得到信号曲线。每个浓度作为1个循环，完成1次循环后用3M MgCl2再生芯片以回复到原始未捕获抗体的状态，再生时间为30s。用BiaCore X-100System软件对得到的信号曲线进行分析，得到本发明实施例提供的中和抗体与破伤风毒素的亲和活性检测图。
结果如图3和表1所示，全人源抗破伤风毒素中和抗体的结合的速率(ka)为5.51E+04Ms-1，其解离的速率(kd)达6.07E-05s-1，该抗体的解离平衡常数(KD)达1.10E-9M，表明该抗体对破伤风毒素具有很高的亲和力；.
表1全人源抗破伤风毒素中和抗体的亲和力测定结果破伤风类毒素(抗原)
抗体名称 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
TRN1013 5.51E+04 6.07E-05 1.10E-0.9
实施例9体内中和试验
(1)半数致死量(LD50)的测定
按照2015版《中国生物制品规程》制备标准抗毒素和毒素稀释，将配制好的毒素用稀释液进行梯度稀释(10，20，40，80，160，320，640，1280，2560，5120和10240倍)，取0.2mL注射小鼠，每组4只，观察5天，根据实验结果计算出LD50，实验组使用20倍×LD50量。
(2)单抗效价测定
用稀释液将待检单抗稀释成100μg/mL(单抗浓度＞1mg/ml)，即与毒素等量混合后每0.4ml注射量中单抗浓度为50μg/mL。
混合定量吸取已稀释的标准抗毒素和待检单抗分别装入小试管中，每管加入等量之稀释试验毒素，混合均匀，加塞，37℃孵育1小时，立即注射。
取28只体重为18-22g的健康实验小白鼠，每组4只，分为7组。将混合物(空白对照组包括0.2mL毒素(Toxin20LD50)；阴性对照组包括0.2mL毒素+0.2mL硼酸盐缓冲盐水(20LD50+PAb)和阴性抗体对照组(20LD50+TRN006)；阳性对照组包括0.2mL毒素+0.2mL抗毒素；实验组包括0.2mL毒素+0.2mL单抗(20LD50+TRN1013))皮下注射小白鼠腹部，每只注射0.4mL。每日上、下午各观察一次，连续一周，记录小白鼠发病与死亡情况。
结果如图4所示，阴性对照组和阴性抗体对照组的小白鼠于48小时之内全部死亡，单抗浓度为20倍半数致死量(LD50)+50μg/mL剂量的实验组小鼠于全部存活，表明当本发明的单抗在50μg/mL剂量时，与标准抗毒素的效价(10IU/ml)相当，能有效保护动物防御致死剂量破伤风毒素的攻击，与标准抗毒素的保护性基本一致。同时，本发明单抗的实际用量远远低于标准抗毒素，表明本发明的全人源抗破伤风毒素中和抗体具有极强的效价作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 暨南大学 珠海泰诺麦博生物技术有限公司 广州泰诺迪生物科技有限公司
<120> 抗破伤风毒素中和抗体、其制备方法及用途
<130> 20180427
<141> 2018-04-28
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工合成()
<400> 1
Gln Ser Ile Ser Asn His
1 5
<210> 2
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工合成()
<400> 2
Gly Ala Ser
1
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工合成()
<400> 3
Gln Gln Tyr Asn Gln Trp Pro Pro Tyr Thr
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工合成()
<400> 4
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工合成()
<400> 5
Ile Tyr Tyr Asn Gly Asn Thr
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工合成()
<400> 6
Ala Leu Thr Thr Asp Asn Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 7
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工合成()
<400> 7
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn His
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Gln Trp Pro Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工合成()
<400> 8
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Arg Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Ser Ala Thr Phe Tyr
85 90 95
Cys Ala Leu Thr Thr Asp Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Pro Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115

Claims (15)

1.一种抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段的轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列如SEQID NO.2所示，轻链可变区的互 补决定区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述抗原结合片段的重链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，重链可变区的互补决定区CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，重链可变区的互补决定区CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的抗原结合片段，其特征在于，所述抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.一种全人源抗破伤风毒素中和抗体，其特征在于，所述中和抗体包括如权利要求1或2所述的抗原结合片段；
所述抗体的恒定区包括人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区中的任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求3所述的中和抗体，其特征在于，所述抗体的恒定区为人源IgG1恒定区。
5.一种DNA片段，其特征在于，所述DNA片段包括编码如权利要求1或2所述的抗原结合片段或如权利要求3所述抗体的核苷酸序列。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求5所述的DNA片段。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pcDNA3.3载体。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求5所述的DNA片段和/或如权利要求6或7所述的表达载体。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为CHO细胞或293细胞。
10.一种制备如权利要求1或2所述抗原结合片段和/或如权利要求3所述抗体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)采集免疫个体的B细胞，PCR获得抗体可变区的DNA片段；
(2)将步骤(1)所述DNA片段连接入表达载体，转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；
(3)将筛选后的表达载体转入宿主细胞，培养并收集上清液，分离纯化得到所述抗原结合片段和/或抗体。
11.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1或2所述抗原结合片段、如权利要求3或4所述抗体、如权利要求5所述的DNA片段、如权利要求6或7所述的表达载体或如权利要求8或9所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
13.一种试剂盒，其特征在于，所述 试剂盒包括如权利要求1或2所述抗原结合片段、如权利要求3或4所述抗体、如权利要求5所述的DNA片段、如权利要求6或7所述的表达载体或如权利要求8或9所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述 试剂盒还包括洗涤液。
15.一种如权利要求1或2所述抗原结合片段、如权利要求3或4所述抗体、如权利要求5所述的DNA片段、如权利要求6或7所述的表达载体或如权利要求8或9所述的宿主细胞在制备破伤风药物和/或检测试剂中的应用。
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