CN108588060A - 一种用丝状真菌宿主细胞表达的重组草酸脱羧酶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用丝状真菌宿主细胞表达的重组草酸脱羧酶，重组菌株的构建方法，重组酶的生产方法及应用，属于基因工程技术领域。重组丝状真菌宿主细胞包含一个或多个拷贝的整合在其基因组中的草酸脱羧酶表达盒，所述草酸脱羧酶表达盒包括启动子、信号肽编码序列、草酸脱羧酶编码基因和终止子。上述宿主细胞可以通过随机整合或位点特异性整合两种方式构建，另外本发明还优化了针对不同重组丝状真菌宿主细胞的培养基配方。草酸脱羧酶的生产，通过表达盒的构建、载体构建、宿主细胞的构建以及最终培养积极配方的调整，使得最终获得的产率和酶活都大大提高，有效解决了现有技术中草酸脱羧酶人工生产无法大规模工业化的难题。

Description

一种用丝状真菌宿主细胞表达的重组草酸脱羧酶

本申请要求在2017年3月7日提交中国专利局，申请号为201710130999.5，发明名称为“用于真核微生物表达草酸脱羧酶的表达盒、菌株、方法及应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及能够高效表达草酸脱羧酶的重组丝状真菌宿主细胞，以及重组草酸脱羧酶，重组草酸脱羧酶的生产方法及应用。

背景技术

草酸(oxalic acid)又名乙二酸，是生物体的一种代谢产物，以草酸盐的形式广泛存在于植物、动物和真菌体中。人类和其他哺乳动物的许多食物，如菠菜、草莓、甜菜、可可、芋头、甘薯、大黄和茶叶等，草酸盐含量都比较高。在人体和其他哺乳动物中，由于体内没有降解草酸盐的相关酶类，导致草酸盐是代谢的终产物，从食物中吸收的外源性草酸盐和由生理代谢产生的内源性草酸盐主要通过肾脏排泄到尿中。人类和其他哺乳动物在食用高含量草酸盐的食物时，在人体的血液和尿液中容易发生草酸盐浓度的升高，当与钙离子结合会生成不溶性的草酸钙，草酸钙是泌尿系结石的主要成分。另外高浓度的草酸盐还与其他多种病理有关，例如，高草酸尿症，心脏传导障碍、克罗恩病(Crohn’s disease)以及其他肠道疾病状态等。因此，在体外或者体内环境中分解来源于食物中的草酸盐，减少草酸盐在体内的吸收，能降低发生包括尿路结石在内的相关疾病的风险。

近年来，研究酶法降解草酸从而预防治疗草酸钙结石症等相关疾病成为研究热点。目前生物界已知存在的具有分解草酸功能的酶，包括草酸脱羧酶、草酸氧化酶和草酰CoA脱羧酶。草酸脱羧酶是一种活性中心含有锰离子，能催化降解草酸生产甲酸和二氧化碳的酶。目前发现的草酸脱羧酶主要存在于一些植物、细菌和真菌中，如黑曲霉、盾壳霉(Coniothyrium minitans)、金针菇、白腐菌(T.versicolor)、双孢蘑菇、褐腐菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)等。然而，草酸脱羧酶在上述各种天然来源的物种中产率和产量非常低，导致生产成本和价格高昂，难以进行商业化应用和推广。

因此将草酸脱羧酶进行重组表达生产，降低生产成本使其能进行商业化应用成为一种必然的选择。目前虽然在原核细胞中实现了细菌来源的草酸脱羧酶重组表达，如枯草芽孢杆菌YvrK基因来源草酸脱羧酶，但由于细菌来源的草酸脱羧酶在低pH条件下(低于pH值3.0)不稳定且没有活力，而人胃中的pH常常低于3.0，并且细菌来源的草酸脱羧酶在胃蛋白酶的作用容易被消化而失去活性，因此应用范围、领域和有效性受到极大限制。为了改善细菌来源的草酸脱羧酶的使用性能，Allena医药公司将草酸脱羧酶(PCT/US2007/075091)制成蛋白晶体再用戊二醛交联提高其稳定性，然后将这些晶体制成口服药剂用于降解胃肠中的草酸盐。临床试验表明，在严重高尿草酸的病人中，口服高剂量的该酶制剂也只能降低13％的尿草酸。Oxthera公司制备了另一种制剂形式的制剂，将该草酸脱羧酶与酸不溶聚合物混合，经喷雾干燥而制成微颗粒(Oxazyme，Oxthera公司)，临床试验表明，Oxazyme没有降低尿草酸的效果。

真菌来源的草酸脱羧酶在低pH值条件下具有良好的稳定性以及对胃蛋白酶也具有良好的抵抗性，因此非常适合作为口服酶制剂降解草酸。尽管人们做了很多努力和尝试,但从目前的公开报道来看，真菌来源的草酸脱羧酶不管是用原核表达系统还是用真核表达系统，都未获得良好重组表达结果，其中研究的最多是来源于金针菇的草酸脱羧酶，Meenu等(参见文献：Meenu Kesarwani，et.al，Oxalate Decarboxylase from Collybiavelutipes，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，2000)将其通过烟草进行重组表达，表达结果能检测显示有活力，但表达量极低，同时也进行了原核(E.coli)表达但无酶活力。Mohammad等(Mohammad Azam，et.al，A Secretion Signal Is Present in the CollybiavelutipesOxalate Decarboxylase Gene，doi:10.1006/bbrc.2001.6049)将其在酿酒酵母和粟酒裂殖酵母进行重组表达，其中在酿酒酵母未检测到酶活力，在粟酒裂殖酵母虽然检测到了酶活力，但表达量很低，无法进行商业化应用。

发明内容

为了解决现有技术中真菌来源的草酸脱羧酶无法进行有效的重组表达这一技术问题，本发明前期经过了长期的大量的试验和努力，尝试了多种表达系统，运用了多种生物技术手段，以期能够实现真菌来源的草酸脱羧酶的有效重组表达。在原核表达系统中，发明人在不同种类的大肠杆菌表达细胞、枯草芽孢杆菌细胞、地衣芽孢杆菌细胞、短小芽孢杆菌细胞、乳酸杆菌细胞等原核细胞中进行了各种表达尝试以及表达元件及表达策略的优化工作，但均未获得有效的重组表达；在真核表达系统中，发明人在烟草和豌豆植物中进行过瞬时表达和稳定转化表达，运用过烟草细胞进行悬浮培养表达，也运用过昆虫细胞、酿酒酵母细胞和毕赤酵母细胞等酵母属细胞进行表达和表达元件及表达策略的优化，获得的结果要么是没有检测到酶活力，要么是表达量极低，没有产业化生产可能。在经过长期而艰辛的探索和研究后，组合与优化各个环节，发明人最终在丝状真菌中获得了高效的重组表达。

本发明的目的在于提供一种重组草酸脱羧酶，所述重组草酸脱羧酶通过丝状真菌宿主细胞重组表达，致使重组草酸脱羧酶的糖基化修饰形式和程度不同于原始宿主细胞表达的草酸脱羧酶，所述重组草酸脱羧酶具有丝状真菌宿主细胞特有的糖基化修饰形式和程度。

所述重组草酸脱羧酶在pH值1.5-7.0的条件下保持其全部或者部分酶活力，且在pH值1.5-2.5的条件下保持不低于其在最适pH条件下酶活力的10％，在pH值2.5-4.5的条件下保持不低于其在最适pH条件下酶活力的50％，在pH值4.5-7.0的条件下保持不低于其在最适pH条件下酶活力的25％。

可选或优选地，所述重组草酸脱羧酶的最适pH值为2.5-3.5。

可选或优选地，所述重组草酸脱羧酶编码基因来源于真核生物，所述真核生物为茶树菇、杨树菇、金针菇、云芝，褐腐菌、琉球曲霉、双孢蘑菇或金福菇等真菌。

可选或优选地，所述重组草酸脱羧酶的氨基酸序列与SEQID NO.1或SEQ ID NO.5的第20～470位氨基酸序列、或SEQ ID NO.2的第25～472位氨基酸序列、或SEQ ID NO.3的第20～455位氨基酸序列、或SEQ ID NO.4的第21～447位氨基酸序列、或SEQ ID NO.6的第21～455的氨基酸序列、或SEQ ID NO.7的第25～440位氨基酸序列、SEQ ID NO.8的第24～472位氨基酸序列具有至少60％同一性，优选至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、或至少95％同一性。

优选地，所述重组草酸脱羧酶的氨基酸序列由SEQID NO.1或SEQ ID NO.5的第20～470位氨基酸序列、或SEQ ID NO.2的第25～472位氨基酸序列、或SEQ ID NO.3的第20～455位氨基酸序列、或SEQ ID NO.4的第21～447位氨基酸序列、或SEQ ID NO.6的第21～455的氨基酸序列、或SEQ ID NO.7的第25～440位氨基酸序列、SEQ ID NO.8的第24～472位氨基酸序列构成。

本发明的另一个目的在于提供一种新的表达草酸脱羧酶的方法，能够高效表达草酸脱羧酶基因，表达量和酶活力均远优于现有的表达方法，达到实际应用价值。

为了实现上述目的，本发明的第一方面，提供了一种重组丝状真菌宿主细胞，所述重组丝状真菌宿主细胞的染色体DNA中包含编码以上任一所述的重组草酸脱羧酶的基因序列。

具体来说，其包含一个或多个拷贝的整合在其基因组中的草酸脱羧酶表达盒，所述草酸脱羧酶表达盒包括启动子、信号肽编码序列、草酸脱羧酶编码基因和终止子。

发明人经过大量的研究工作发现，草酸脱羧酶能在丝状真菌宿主细胞中高效地重组分泌表达。在丝状真菌宿主细胞重组表达的草酸脱羧酶能够进行各种翻译后加工，如糖基化修饰等，重组表达的草酸脱羧酶具有与天然宿主细胞制备的草酸脱羧酶相似的酶学性质。通过在草酸脱羧酶5’端添加编码引导分泌的信号肽序列，能将重组表达的草酸脱羧酶有效分泌到培养基质中，有利于后续的分离纯化，降低生产成本。

所述信号肽编码序列，是指能引导草酸脱羧酶进入细胞特定区室或分泌通道的信号肽编码区，其可以得自但不限于草酸脱羧酶原始信号肽、木霉纤维二糖水解酶I、木霉纤维二糖水解酶II、木霉内切葡聚糖酶I、木霉内切葡聚糖酶II、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶和米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶等基因的信号肽编码序列，任何能将草酸脱羧酶引导至丝状真菌宿主细胞分泌途径的信号肽编码区都可用于本发明中。在一些实施方案中，优选的信号肽编码序列是里氏木霉纤维二糖水解酶I基因(cbh1)信号序列。

所述启动子，是指涉及结合RNA聚合酶含有可介导草酸脱羧酶基因表达的转录和翻译控制序列。启动子可以是在选定的宿主细胞中具有转录活性的任何核苷酸序列，可以源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。

本发明用于介导草酸脱羧酶表达盒在丝状真菌宿主细胞中转录的启动子的实例有得自但不限于以下酶的基因的启动子：SV40，hCMV，CaMV 35S、构巢曲霉乙酰胺酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、木霉丙酮酸脱羧酶、木霉β-葡糖苷酶、木霉纤维二糖水解酶I、木霉纤维二糖水解酶II、木霉内切葡聚糖酶I、木霉内切葡聚糖酶II、木霉内切葡聚糖酶III、木霉内切葡聚糖酶IV、木霉内切葡聚糖酶V、木霉木聚糖酶I、木霉木聚糖酶II、或木霉β-木糖苷酶等，以及前述基因启动子经过突变、截短或杂合后的同功能序列。

在一些优选的实施方案中，启动子是源自里氏木霉纤维二糖水解酶I基因启动子(Pcbh1)，在一些优选的实施方案中，启动子是源自里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因启动子(Ppdc)。

所述终止子，是指可被丝状真菌宿主细胞识别而终止转录的一段序列。在宿主细胞中起作用的任何终止子均可用于本发明。本发明用于介导草酸脱羧酶表达盒在丝状真菌宿主细胞中转录终止的终止子的实例有得自但不限于以下酶的基因的终止子：构巢曲霉乙酰胺酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂肪酶、木霉丙酮酸脱羧酶、木霉β-葡糖苷酶、木霉纤维二糖水解酶I、木霉纤维二糖水解酶II、木霉内切葡聚糖酶I、木霉内切葡聚糖酶II、木霉内切葡聚糖酶III、木霉内切葡聚糖酶IV、木霉内切葡聚糖酶V、木霉木聚糖酶I、木霉木聚糖酶II、木霉β-木糖苷酶等。

在一些优选的实施方案中，终止子是源自里氏木霉纤维二糖水解酶I基因终止子(Tcbh1)，在一些优选的实施方案中，终止子是源自里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因终止子(Tpdc)。

可选或优选地，所述的重组丝状真菌宿主细胞中，所述丝状真菌为曲霉属、革盖菌属、毛霉属、白腐菌属、枝顶孢属、隐球菌属、镰孢霉属、腐质霉属、毁丝霉属、短梗霉属、栓菌属、侧耳属、脉孢菌属、青霉属、拟青霉属、平革菌属、烟管菌属、拟蜡菌属、梭孢壳属、金孢子菌属、裂褶菌属、鬼伞属、稻瘟菌属、新美鞭菌属、弯颈霉属踝节菌属、嗜热子囊菌属或木霉属等真菌。

可选或优选地，上述重组丝状真菌宿主细胞中，所述丝状真菌为曲霉属的黑曲霉、构巢曲霉、米曲霉或泡盛曲霉菌株。

可选或优选地，上述重组丝状真菌宿主细胞中，所述丝状真菌为木霉属的哈茨木霉、康宁木霉、里氏木霉、长梗木霉或绿色木霉菌株。

更优选地，丝状真菌宿主细胞是里氏木霉细胞，包括但不限制于ATCC NO.56765、ATCC NO.13631、ATCC NO.26921、ATCC NO.56764、ATCC NO.56767和NRRLNO.15709等里氏木霉菌株细胞。在一些实施方案中，所述丝状真菌宿主细胞是里氏木霉菌株Rut-C30细胞。在一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞可以是里氏木霉菌株Rut-C30的变体细胞，包括通过遗传改造，敲除里氏木霉宿主细胞的多种天然基因，包括编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶的基因(pyr4)和参与非同源重组过程的基因(mus53)。敲除所述编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因的菌株为尿嘧啶营养缺陷型菌株(pyr4^-)，基于pyr4基因的营养缺陷筛选标记已被证明是十分行之有效的，并已在多种真核微生物中成功应用(Long et al.2008；Weidneret al.1998)；敲除所述参与非同源重组过程的基因，能显著降里氏木霉宿主细胞的非同源重组频率，有利于提高其同源重组的筛选。

可选或优选地，上述重组丝状真菌宿主细胞中，所述草酸脱羧酶基因的核苷酸序列中至少10％的碱基根据丝状真菌宿主细胞密码子偏爱性进行了密码子优化。优化后的基因编码或至少部分编码草酸脱羧酶蛋白。所述部分编码，是指删除部分氨基酸序列但还具有草酸脱羧酶功能。

可选或优选地，上述核苷酸序列选自SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的核酸序列；或与SEQ ID NO.9-16中任一具有至少50％同一性，优选至少60％同一性、至少70％同一性、至少80％同一性或至少90％同一性的序列。

当然地，作为本领域技术人员应该知晓的内容，上述重组丝状真菌宿主细胞在制备过程中，先构建草酸脱羧酶基因表达载体，表达载体除了含有草酸脱羧酶基因表达盒，还含有编码选择性标记的基因表达盒。

所述选择性标记，是指可以提供已转化宿主细胞的简单选择的标记基因。合适的选择性标记的实例包括但不限于潮霉素和bar等抗性基因。还可以使用营养选择标记，例如，乙酰胺酶(amdS)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(argB)和乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶等。

在编码选择性标记的表达盒的5’侧翼和3’侧翼有350-500bp的正向重复核苷酸序列，在反向选择压力下能通过自发的DNA分子内同源重组而切除。在一个实施方案中，选择标记是pyr4基因，营养缺陷筛选标记乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶是尿嘧啶核苷酸合成的一个关键酶，该基因的缺失将导致尿嘧啶核苷酸合成受阻，因此缺乏该酶的营养缺陷型菌株需要添加尿嘧啶/尿苷才能生长。当pyr4基因成功转化进pyr4基因缺失菌株后，该基因的表达使受体菌能够自身合成尿嘧啶/尿苷，从而不依赖尿嘧啶/尿苷生长，起到正向筛选的作用。另一方面，5-氟乳清酸(5′-fluorooroticacid，5′-FOA)是尿嘧啶合成前体的类似物，在pyr4的作用下会产生对细胞有毒害物质，所以野生型菌株在5′-FOA下不能生长，而变成pyr4基因缺失菌时就呈现5′-FOA抗性，从而实现反向筛选(参见Jeffrey L.Smith等.CurrGenet,1991,19:27-23)。用来提供已转化宿主细胞的简单选择。

上述的草酸脱羧酶基因表达载体，包括随机整合型表达载体和位点特异性整合型表达载体。例如，随机整合型表达载体通过农杆菌介导转化里氏木霉后，草酸脱羧酶的表达盒随机整合到里氏木霉基因组中，通过Tail-PCR方法分析其整合在基因组中的位置及拷贝数。在一个实施例中，通过2轮转化和筛选可获得不同整合位点及拷贝数的转化菌株，通过摇瓶发酵比较产酶情况，筛选了一系列工程菌株并分析了其拷贝数及其在里氏木霉基因组中的整合位点。位点特异性整合表达载体在草酸脱羧酶表达盒两端含有与里氏木霉特定位点相同的一段DNA序列作为5’同源臂和3’同源臂，通过位点特异性整合表达载体，在导入草酸脱羧酶表达盒到特定位点的同时还可以敲除这些特定位点上的基因。在一个实施例中，选择里氏木霉胞外分泌蛋白中占主要成分的几个纤维素酶基因(CBH1、CBH2、EG1和EG2)作为位点特异性整合位点，在整合进草酸脱羧酶表达盒的同时敲除了这些基因编码盒，构建了4拷贝表达菌株，该菌株在发酵条件下，重组分泌表达的草酸脱羧酶在胞外总蛋白中含量能达到90％以上。

本发明的第二方面，提供了一种构建以上任一所述的重组丝状真菌宿主细胞的方法(随机整合法)，所述重组丝状真菌宿主细胞包含一个或多个拷贝的整合在其基因组中的草酸脱羧酶表达盒，所述草酸脱羧酶表达盒包括启动子、信号肽编码序列、草酸脱羧酶编码基因和终止子，所述方法包括如下步骤：

S1：构建至少一个整合型表达载体，所述整合型表达载体包括选择标记基因表达盒和草酸脱羧酶表达盒。

S2:整合型表达载体在转化丝状真菌宿主细胞后，通过筛选获得含有一个拷贝或多个拷贝草酸脱羧酶表达盒的重组丝状真菌宿主细胞。

可选或优选地，上述方法中，其中步骤S2中所述的丝状真菌宿主细胞为人工构建的营养缺陷型细胞，所述整合型表达载体在整合进所述丝状真菌宿主细胞基因组中时能修复该类型营养缺陷。

可选或优选地，上述方法中，在转化丝状真菌宿主细胞后，所述整合型表达载体通过非同源重组而随机整合进丝状真菌宿主细胞基因组中。

可选或优选地，上述方法中，所述的整合型表达载体包含与丝状真菌宿主细胞基因组中特异性基因座一定长度核苷酸序列同源的5’端同源臂和3’端同源臂，从而在转化丝状真菌宿主细胞后所述整合型表达载体能通过同源重组的方式整合进基因组特定的位点；优选整合进编码胞外蛋白的基因中；更优选整合进编码胞外蛋白酶类或编码胞外糖苷水解酶类的基因中，最优选地整合进CBH1、CBH2、EG1或EG2基因中。

在一个实施例(随机整合法)中，其出发菌株为人工构建的pyr4基因缺失型里氏木霉，包括如下步骤：

构建至少一个随机整合表达载体，通过冻融法转入根癌农杆菌AGL-1感受态细胞，获得含有上述随机整合表达载体的根癌农杆菌AGL-1细胞，将该细胞制备成侵染液与pyr4基因缺失的里氏木霉共培养，筛选获得含有一个拷贝或多个拷贝草酸脱羧酶表达盒的里氏木霉菌株，即为目标宿主细胞。

本发明的第三方面，提供了一种培养基，适用上述方法(随机整合法)制备的宿主细胞的培养，其组成为：葡萄糖3-8g/L，微晶纤维素10-25g/L，玉米浆粉5-15g/L，(NH₄)₂SO₄0.5-5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.56g/L、CaCl₂ 0.5g/L，KH₂PO₄2-8g/L，尿素0-1g/L，麸皮粉0.2-2g/L，Mandels微量元素(1000X)1ml，MnCl₂0.5-5mM，pH 3.0-4.5。

本发明的第四方面，提供了另外一种构建以上任一所述的重组丝状真菌宿主细胞的方法(位点特异性整合法)，在一个实施例中，该方法包括如下步骤：

(1)分别构建针对里氏木霉CBH1、CBH2、EG1、EG2四个基因座位点的草酸脱羧酶表达载体；

(2)在pyr4和mus53基因缺失的里氏木霉菌株中，通过位点特异性整合敲入的方式在CBH1，CBH2，EG1和EG2位点基因组上整合步骤(1)中各位点对应的表达载体中的表达盒；定点整合到这几个位点后，胞外分泌总蛋白中杂蛋白含量非常少，目的蛋白占绝大部分，用该方法生产的草酸脱羧酶发酵液后处理更简单更经济。mus53基因敲除后定点整合的概率大大提高，有利于后续位点特异性整合菌株的筛选。

(3)通过pyr4和mus53基因修复载体，对步骤(2)获得的菌株进行mus53和pyr4基因修复；修复成功的菌株即为目标宿主细胞。pyr4基因的修复，发酵过程中培养基中就不需要额外加入尿嘧啶或者尿苷，宿主细胞能保存固有的代谢平衡，不提高发酵成本；mus53基因的修复，宿主细胞能保存固有的稳定性，消除mus53基因缺失带来基因组不稳定的因素。

本发明的第五方面，提供了另外一种培养基，适用于上述方法(位点特异性整合法)制备的宿主细胞的培养，其组成为：葡萄糖3-6g/L，乳糖30-40g/L，玉米浆粉7-10g/L，(NH₄)₂SO₄0.5-1g/L，MgSO₄·7H₂O 1.56g/L、CaCl₂ 0.5g/L，KH₂PO₄2-4g/L，尿素0-1g/L，麸皮粉10-20g/L，Mandels微量元素(1000X)1ml，MnCl₂0.5-5mM，pH 3.5-4.0。

本发明的第六方面，提供了一种生产草酸脱羧酶的方法，构建含有启动子、信号肽编码序列、草酸脱羧酶编码基因和终止子的草酸脱羧酶表达盒，通过表达载体转入丝状真菌宿主细胞，使宿主细胞基因组中整合一个或多个草酸脱羧酶表达盒，培养宿主细胞表达草酸脱羧酶，最后从宿主细胞培养基质中分离纯化表达产物。

本发明的第七方面，提供了以上任一所述的重组草酸脱羧酶或重组丝状真菌宿主细胞培养后分泌表达的草酸脱羧酶在制备药物、食品中的应用。

可选或优选地，上述应用中，所述药物为预防和/或治疗泌尿系结石的药物。

本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，用于预防或治疗尿草酸过多的疾病，其包含有上述方法制备的草酸脱羧酶。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明克服了真菌来源草酸脱羧酶无法得到有效重组表达的技术难题，草酸脱羧酶通过丝状真菌宿主细胞重组表达能够进行各种翻译后加工，高效分泌表达的草酸脱羧酶具有与天然宿主细胞制备的草酸脱羧酶相似的酶学性质。该宿主细胞培养简单，草酸脱羧酶分泌量大而且酶活高；本发明的两种培养基配方分别适用于两种重组丝状真菌宿主细胞，能够有效提高产量；草酸脱羧酶的生产，通过表达盒的构建、载体构建、宿主细胞的构建以及最终培养基配方的调整，使得产率和产品酶活都大大提高，有效解决了现有技术中草酸脱羧酶人工生产无法大规模工业化，酶学特性不稳定，生产成本高昂的难题。

附图说明

图1为载体pMDT05构建图谱。

图2为里氏木霉Rut-C30菌株pyr4基因敲除载体pMDT05-pyr4 KO构建图谱。

图3为里氏木霉随机整合诱导型表达载体pMGU-cbh1-TRA2构建图谱。

图4为里氏木霉随机整合组成型表达载体pDGU-pdc-TRA2构建图谱。

图5为里氏木霉转化体pyr4基因修复载体pMDT05-pyr4KI构建图谱。

图6为发酵144h和168h发酵液上清SDS-PAGE图，箭头处为重组草酸脱羧酶条带。

图7为mus53基因敲除载体构建图谱。

图8为在CBH1位点定点整合敲入载体构建图谱。

图9为在CBH2位点定点整合敲入载体构建图谱。

图10为在EG1位点定点整合敲入载体构建图谱。

图11为在EG2位点定点整合敲入载体构建图谱。

图12为mus53基因修复载体构建图谱。

图13为7L发酵罐发酵活力变化图。

图14为7L发酵罐发酵第136h和160h样品稀释10倍SDS-PAGE图。

图15为160h样品稀释200倍和500倍Western Blot检测分析图。

图16为pH值在1.5-7.0条件下草酸脱羧酶的相对活力。

图17为三种表达系统表的草酸脱羧酶SDA-PAGE图，其中泳道1和2为里氏木霉表达的重组草酸脱羧酶；泳道3和4为天然宿主茶树菇表达的草酸脱羧酶；泳道5和6为原核表达的草酸脱羧酶。

图18为里氏木霉表达的重组草酸脱羧酶MALDI-TOF-MS图谱。

图19为里氏木霉表达的重组草酸脱羧酶经胰蛋白酶消化后的MALDI-TOF-MS图谱。

图20为天然宿主茶树菇表达的草酸脱羧酶经胰蛋白酶消化后的MALDI-TOF-MS图谱。

图21为原核表达的草酸脱羧酶经胰蛋白酶消化后的MALDI-TOF-MS图谱。

具体实施方式

本发明以来源于茶树菇的草酸脱色酶在丝状真菌里氏木霉中重组表达为具体实施例进行说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

除特别指明以外，所用技术术语均为本领域中的普通技术人员常用术语；本说明书中未注明具体条件的实验方法是按常规实验方法；本说明书中所用的试验材料、试剂如无特别说明均为市售购买产品，各种试剂及培养基的成分和配制方法可参见常规实验手册中的操作。

本发明中用到的里氏木霉Rut-C30(ATCC 56765)购买自广东微生物菌种保藏中心。

本发明中用到的的黑曲霉CICC2439购买自中国工业微生物菌种保藏中心。

实施例1：草酸脱羧酶(OXDC)基因密码子优化及人工合成

本发明人经大量实验研究发现，可用于丝状真菌表达系统表达来源于真核生物的草酸脱羧酶，优选来自茶树菇、杨树菇、金针菇、云芝，褐腐菌、琉球曲霉、双孢蘑菇和金福菇等真菌的草酸脱羧酶。

编码草酸脱羧酶的基因可来自于茶树菇，所述草酸脱羧酶氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示氨基酸序列，其中所述草酸脱羧酶的信号肽序列为SEQ ID NO.1所示的1-19位氨基酸序列，成熟肽序列为SEQ ID NO.1所示的20-470位氨基酸序列。

将来源于茶树菇的OXDC基因分别按照里氏木霉密码子偏好性(见Codon UsageDatabase：Hypocrea jecorina)进行优化，人工设计和合成了新的草酸脱羧酶成熟肽的DNA编码序列。优化后的OXDC序列与优化前相比，CAI(Codon Adaptation Index)由原来的0.51变为0.99，G+C的含量由原来的53.09％变为69.23％，优化后的序列见SEQ ID NO.17所示。将优化后的茶树菇的OXDC基因成熟肽的DNA编码序列重新命名为TRA2。

实施例2：里氏木霉Rut-C30(pyr4^-)营养缺陷株构建

真核系统表达真核的OXDC所用丝状真菌宿主细胞选自曲霉属、革盖菌属、毛霉属、白腐菌属、枝顶孢属、隐球菌属、镰孢霉属、腐质霉属、毁丝霉属、短梗霉属、栓菌属、侧耳属、脉孢菌属、青霉属、拟青霉属、平革菌属、烟管菌属、拟蜡菌属、梭孢壳属、金孢子菌属、裂褶菌属、鬼伞属、稻瘟菌属、新美鞭菌属、弯颈霉属踝节菌属、嗜热子囊菌属或木霉属细胞或其有性型或同物异名型的细胞，但不限制于此。

木霉属宿主细胞是哈茨木霉、康宁木霉、里氏木霉、长梗木霉和绿色木霉，优选为里氏木霉和绿色木霉。下面以里氏木霉为例来说明本发明。

1、里氏木霉基因组提取

将里氏木霉Rut-C30(ATCC 56765)接种于PDA培养基上，于28℃恒温培养7d至孢子成熟。用无菌水洗脱孢子，制备适量孢子悬液并接种于20ml液体培养基中，于28℃，170rpm条件下培养36-48h。使用真空抽滤收集菌丝体，并用去离子水洗涤2次，在液氮冷冻下将菌丝体研磨成细粉，并使用Sangon Biotech Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒分离基因组DNA。

其中，上述PDA培养基配方为：去皮土豆薄片200g，加1000ml水煮沸30min，8层纱布过滤，滤液添加葡萄糖20g，并补足水分至1L，自然pH，2％琼脂粉。115℃灭菌30min。

上述液体培养基配方为：将葡萄糖15g、酵母提取物20g、硫酸铵2.5g、七水硫酸镁0.8g、无水氯化钙1.0g混合后，用蒸馏水溶解并定容至1L，调节pH到4.8。

2、载体pMDT05的构建

以pCAMBIA1300质粒为模板，使用下表1中的引物pMDT05-F1和pMDT05-R1进行PCR扩增，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离，将约6.8kb的片段从凝胶中切出，按照omega公司凝胶提取试剂盒方法进行回收，回收纯化的片段用限制性内切酶XhoI和XbaI消化1h，消化完成后按照omega公司PCR产物回收试剂盒方法进行纯化回收。

以上述提取的里氏木霉基因组DNA为模板，使用表1中的引物Hyg-Pgpd-F和pMDT05-R2扩增启动子Pgpd(约1.4kb)。以pCAMBIA1300质粒为模板，使用表1中的引物pMDT05-F2和Pgpd-Hyg-R扩增hygromycin基因(约1kb)。将上述扩增的启动子Pgpd片段和hygromycin基因按摩尔比1:1混合作为模板，使用引物pMDT05-F2和pMDT05-R2为上下游引物进行SOE-PCR扩增(扩增条件为94℃，10min；98℃，10s，60℃，30s，68℃，1min20s，30cycles；68℃，10min)得到约2.4kb的融合片段，融合片段经过1％琼脂糖凝胶电泳分离，将约2.4kb的片段从凝胶中切出，按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收纯化的片段用限制性内切酶XhoI和XbaI消化1h，消化完成后按照omega公司PCR产物回收试剂盒方法进行纯化回收。

将上述消化后的6.8kb和2.4kb片段按照摩尔比1:3混合，加入T4DNA连接酶和连接缓冲液，在22℃下连接3h，将连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布在50μg/mL卡那霉素抗性平板上筛选克隆子，用引物pMDT05-F2和pMDT05-R2进行PCR验证和测序验证，测序验证正确的质粒载体命名pMDT05，如图1为载体pMDT05构建图谱。

表1.所用引物的序列

3、里氏木霉Rut-C30菌株pyr4基因敲除载体构建

参照公开文献中提供的里氏木霉pyr4基因(编码乳清酸-5′-单磷酸脱羧酶)信息(Jeffrey L.Smith，Curr Genet,1991,19:27-33)，使用BLASTN程序检索里氏木霉基因组数据库中pyr4基因所在位置的基因座序列信息(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)。以上述提取的里氏木霉基因组DNA为模板，利用表2中的引物pyr4-3F/pyr4-3R和pyr4-5F/pyr4-5R分别扩增得到约1.3kb的pyr4基因上游同源臂片段和约1.3kb的pyr4基因下游同源臂片段。将pyr4基因上游同源臂片段和pyr4基因下游同源臂片段按摩尔比1:1的比例混合作为模板，以pyr4-3F和pyr4-5R为上下游引物，SOE-PCR扩增得到约2.6Kb的pyr4基因敲除盒。

将pMDT05载体和上述2.6kb的pyr4基因敲除盒用限制性内切酶XbaI和BglII消化1h，将消化后的片段分别用omega公司凝胶提取试剂盒回收，将凝胶纯化的经过XbaI/BglII消化的pMDT05载体与消化的2.6kb片段按摩尔比1:3混合，加入T4DNA连接酶和连接缓冲液，22℃连接3h，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为pMDT05-pyr4KO，如图2为里氏木霉Rut-C30菌株pyr4基因敲除载体pMDT05-pyr4KO构建图谱。

4、根癌农杆菌介导法构建里氏木霉pyr4基因缺失突变株

将上述的敲除载体pMDT05-pyr4KO通过冻融法(具体参见An,G.et.al Binaryvectors,in Plant MolecularBiology Manual，1988)转入根癌农杆菌AGL-1感受态细胞中，在28℃活化3-4h后取适量的菌液涂布在含有kan(50μg/mL)+Gent(50μg/mL)的LB平板培养基中，于28℃倒置培养48-72h之后，挑取单克隆接种于含有kan(50μg/mL)+Gent(50μg/mL)的LB液体培养基中，于28℃摇床220rpm培养24h，取少量菌液作菌落PCR验证筛选阳性转化体。

用于转化的根癌农杆菌制备：将上述验证的阳性转化体接种到含有kan(50μg/mL)+Gent(50μg/mL)的LB液体培养基中，于28℃摇床220rpm培养20-24h，收集菌体，用IM培养基洗涤2次，并用IM培养基稀释至OD600＝0.15-0.20，添加乙酰丁香酮至终浓度为200μmol/L，于28℃下220rpm培养约6-10h至OD600＝0.6-0.8。

里氏木霉转化受体的制备：用4-5ml无菌水从培养6-7d的PDA平板上洗下里氏木霉的孢子，棉花过滤得到孢子悬液，离心收集孢子，用IM培养基洗涤2次，并用IM培养基重悬并调整至孢子浓度为10⁷个/ml，于28℃萌发培养3-4h。

根癌农杆菌和里氏木霉共培养：取制备好的根癌农杆菌菌液100μl与100μl萌发处理的孢子悬液混合，涂布在IM固体培养基平板的玻璃纸上，24℃暗培养36h。将玻璃纸揭下，反铺到含有5mg/ml 5-FOA，300μg/mL头孢霉素和10mM尿苷的固体MM初筛培养基平板上，28℃培养4-6d至转化体长出。

转化体复筛：将转化体分别点在含有100μg/mL潮霉素的PDA固体平板和含有5mg/ml 5-FOA和10mM尿苷的固体MM培养基平板上，于28℃培养2-3d，挑取在含有100μg/mL潮霉素的PDA固体平板不能生长而在含有5mg/ml 5-FOA和10mM尿苷的固体MM培养基平板上能正常生长的转化体，提取复筛的转化体基因组DNA，用上游同源臂和下游同源臂两端外侧基因组的引物pyr4-CX-F和pyr4-CX-R(序列如表2中所示)进行PCR验证，如果pyr4基因被敲除，扩增出的片段应为约2.8kb，如果没有被敲除扩增出的片段应该为约4.2kb。

本实施例一共筛选了23个转化体(编号1#-23#)，经PCR验证所有复筛的转化体都只能扩增出约2.8kb的片段，其中包含既能在含有100μg/mL潮霉素的PDA固体平板正常生长也能在含有5mg/ml 5-FOA和10mM尿苷的固体MM培养基平板上正常生长的转化体1个，说明该转化体在发生同源重组的同时也发生了随机整合插入，剔除该转化体，因此pyr4基因有效敲除率达到95.6％。

单孢子分离纯化：挑取上述23个转化体中编号为8#敲除菌株的菌丝体接种到含有10mM尿苷的PDA培养基平板中，28℃培养7d至孢子成熟。将成熟的孢子用4-5ml无菌水洗下来，并用无菌水梯度稀释，涂布在含有10mM尿苷和0.1％Triton-100的PDA培养基平板中，于28℃培养3d，挑取分离的单孢子菌落，重新接种到含有10mM尿苷的PDA培养基平板中，于28℃进行生孢子培养。将上述分离的单孢子菌落和PCR检测后仍为阳性的菌株为尿嘧啶营养缺陷株，命名为Rut-C30(pyr4^-)。

表2.构建pyr4基因敲除载体引物

实施例3：草酸脱羧酶随机整合重组表达载体的构建

1、随机整合诱导型表达载体pMGU-cbh1-TRA2的构建

载体pMGU的构建：

以实施例2中制备的质粒载体pMDT05为模板，用表3中的引物F1和R1为上下游引物PCR扩增约6.6kb的载体骨架片段，使用凝凝胶回收后用限制性内切酶DpnI消化3h，回收目的片段，备用。

参照实施例2中里氏木霉基因组提取的方法，提取黑曲霉CICC2439基因组DNA，以该基因组DNA为模板，用表3中的引物pyrG-F和pyrG-R扩增约2.9kb的黑曲霉pyrG基因表达框，凝凝胶回收目的片段，备用。以里氏木霉基因组DNA为模板，用表2中的引物Pcbh-DR-F和Pcbh-DR-R扩增CBH1基因启动子Pcbh1大小为0.4kb片段，凝凝胶回收后备用。将2.9kb的黑曲霉pyrG基因表达框和Pcbh1的0.4kb片段按摩尔比1:1混合作为模板，用引物Pcbh-DR-F和pyrG-R为上下游引物，SOE-PCR扩增扩增条件为：94℃，10min；98℃，10s，60℃，30s，68℃，1min50s，30cycles；68℃，10min得到约3.3kb的融合片段，凝胶回收该目的片段备用。

按照 II一步法克隆试剂盒的方法，将上述消化后的载体骨架片段和SOE-PCR扩增得到并回收的3.3kb的片段进行组装，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布平板，将验证和测序正确的载体命名为pMGU。

诱导型表达框pUC19-Pcbh1-sig-TRA2-Tcbh1构建：

以里氏木霉基因组DNA为模板，使用表3中的引物Pcbh1-F和Pcbh1-R为上下游引物，PCR扩增CBH1基因的启动子及CBH1基因信号肽编码序列Pcbh1-sig；以里氏木霉基因组DNA为模板，使用表3中的引物Tcbh1-F和Tcbh1-R为上下游引物PCR扩增CBH1基因的终止子序列Tcbh1。将Pcbh1-sig片段和Tcbh1片段按摩尔比1:1混合作为模板，用引物Pcbh1-F和Tcbh1-R作为上下游引物，PCR扩增约3.3kb的融合片段Pcbh1-sig-Tcbh1，回收目的片段并用EcoRI和PstI消化该片段，凝凝胶回收备用。将质粒pUC19同样用限制性内切酶EcoRI和PstI消化3h，凝凝胶回收载体骨架片段，并将其与消化回收后的Pcbh1-sig-Tcbh1片段用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为pUC19-Pcbh1-sig-Tcbh1。

以质粒pUC19-Pcbh1-sig-Tcbh1为模板，用表3中引物WF-CBH-R和WF-CBH-F为上下游引物PCR扩增约5.8kb的载体骨架片段，DpnI消化3小时后凝凝胶回收后备用。以含有合成的TRA2基因的质粒pUC57-TRA2(基因合成公司提供)为模板，用表3中的引物WF-TRA2-F和WF-TRA2-R为上下游引物，PCR扩增TRA2基因成熟肽编码序列。将消化回收的载体骨架片段与TRA2片段按照 II一步法克隆试剂盒的方法进行组装，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为

pUC19-Pcbh1-sig-TRA2-Tcbh1。

随机整合诱导型表达载体pMGU-cbh1-TRA2的构建：

将上述制备的载体pMGU用限制性内切酶EcoRI和XbaI消化3h，凝凝胶回收载体骨架片段备用。以上述制备的载体pUC19-Pcbh1-sig-TRA2-Tcbh1为模板，用表3中的引物F2和R2为上下游引物，PCR扩增Pcbh1-sig-TRA2-Tcbh1片段，凝胶回收该目的片段备用。将pMGU用限制性内切酶EcoRI和XbaI消化后回收的载体骨架与Pcbh1-sig-TRA2-Tcbh1片段按照 II一步法克隆试剂盒的方法组装，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为pMGU-cbh1-TRA2，里氏木霉随机整合诱导型表达载体pMGU-cbh1-TRA2的构建图谱如图3所示。

2、随机整合组成型表达载体pDGU-pdc-TRA2的构建

载体pDGU的构建：

以实施例2中制备的载体pMDT05为模板，用表3中的引物F1和R1PCR扩增6.6kb的载体骨架，凝胶回收该片段后用限制性内切酶DpnI消化3h，回收目的片段备用。

以黑曲霉CICC2439基因组DNA为模板，用表3中的引物pdcDR-pyrG-F和pyrG-R扩增获得2.9kb的黑曲霉pyrG基因的表达框，凝胶回收目的片段，备用。以里氏木霉基因组DNA为模板，用表3中的引物Ppdc-DR-F和pyrG-pdcDR-R扩增pdc基因启动子Ppdc的5’端0.4kb片段，凝胶回收后备用。将2.9kb的黑曲霉pyrG基因表达框和Ppdc的5’端0.4kb片段按摩尔比1:1混合作为模板，用引物Ppdc-DR-F和pyrG-R为上下游引物，SOE-PCR扩增得到3.3kb的片段，凝胶回收该目的片段备用。

按照 II一步法克隆试剂盒的方法，将上述消化后的6.6kbp载体骨架片段和SOE-PCR扩增，扩增条件为：94℃，10min；98℃，10s，60℃，30s，68℃，1min50s，30cycles；68℃，10min得到并回收的3.3kb的片段进行组装，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，涂布平板，将验证和测序正确的载体命名为pDGU。

组成型表达框构建pUC19-Ppdc-sig-TRA2-Tpdc构建：

以里氏木霉基因组DNA为模板，使用表3中的引物NdeI-Pdc-F和Ppdc-R为上下游引物，PCR扩增约1.4kb的PDC基因的启动子序列Ppdc；以里氏木霉基因组DNA为模板，使用表2中的引物Tpdc-F和PstI-Tpdc-R为上下游引物PCR扩增约1.0kb的PDC基因的终止子序列Tpdc。将上述获得的Ppdc片段和Tpdc片段按摩尔比1:1混合作为模板，用引物NdeI-Pdc-F和PstI-Tpdc-R作为上下游引物，PCR扩增约2.5kb的融合片段Ppdc-Tpdc，回收目的片段并用NdeI和PstI消化该片段，凝胶回收备用。将质粒pUC19同样用NdeI和PstI消化，凝胶回收载体骨架，并将其与消化回收后的Ppdc-Tpdc片段连接，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为pUC19-Ppdc-Tpdc。

以质粒pUC19-Ppdc-Tpdc为模板，用表3中引物WF-pdc-R和WF-pdc-F为上下游引物PCR扩增约5.0kb的载体骨架片段，DpnI消化3小时后凝胶回收后备用。以质粒pUC19-Pcbh1-sig-TRA2-Tcbh1为模板，用表3中的引物WF-TRA2-F2和WF-TRA2-R2为上下游引物，PCR扩增约1.4kb的sig-TRA2序列。将消化回收的约5.0kb的载体骨架片段与sig-TRA2片段按照 II一步法克隆试剂盒的方法进行组装，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为pUC19-Ppdc-sig-TRA2-Tpdc。

随机整合组成型表达载体pDGU-pdc-TRA2的构建：

将上述制备的载体pDGU用限制性内切酶XbaI酶切消化3h，然后加入限制性内切酶EcoRI酶切消化5min进行不完全酶切，凝胶回收较大的载体骨架片段备用。以质粒pUC19-Ppdc-sig-TRA2-Tpdc为模板，用表3中的引物F3和R3为上下游引物，PCR扩增Ppdc-sig-TRA2-Tpdc片段，凝胶回收目的片段。将上述pDGU用酶切回收后的载体骨架片段与Ppdc-sig-TRA2-Tpdc片段按照 II一步法克隆试剂盒的方法组装，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为pDGU-pdc-TRA2，即里氏木霉随机整合组成型表达载体pDGU-pdc-TRA2构建图谱如图4所示。

表3.诱导型表达载体构建引物

实施例4：通过随机整合构建里氏木霉草酸脱羧酶表达菌株，以及转化体的筛选和分子鉴定

将上述实施例3中的两种随机整合重组表达载体pMGU-cbh1-TRA2和pDGU-pdc-TRA2通过冻融法分别转入根癌农杆菌AGL-1感受态细胞。将PCR验证正确的阳性克隆按照实施例2中的方法制备用于转化的根癌农杆菌菌液。

里氏木霉转化受体的制备：用4-5ml无菌水从培养6-7d的PDA(含有10mM尿苷)平板上洗下里氏木霉Rut-C30(pyr4^-)菌株的孢子，棉花过滤得到孢子悬液，离心收集孢子，用IM培养基洗涤2次，并用IM培养基(加入终浓度为10mM尿苷)重悬并调整至孢子浓度为10⁷个/ml，于28℃萌发培养3-4h。

根癌农杆菌和里氏木霉共培养：取制备好的根癌农杆菌菌液100μl与100μl萌发处理的孢子悬液混合，涂布在固体IM培养基平板的玻璃纸上，24℃暗培养36h。将玻璃纸揭下，反铺到含有300μg/mL头孢霉素固体MM初筛培养基平板上，28℃培养4-6d至转化体长出。本实施例进行了3批次重组表达载体pMGU-cbh1-TRA2转化入实施例2制备的里氏木霉Rut-C30(pyr4^-)菌株，获得了230个转化株，一批次重组表达载体pDGU-pdc-TRA2转化里氏木霉Rut-C30(pyr4^-)菌株获得了73个转化株。

转化体复筛：将获得的转化株点在含有300μg/mL头孢霉素的固体MM培养基平板上，于28℃培养2-3d，挑取生长速度和形态正常的转化体，转接到PDA平板上于28℃进行生孢子培养7d。孢子成熟后，用无菌水将孢子洗出制备成孢子悬液，进行梯度稀释，涂布在含有0.1％Triton-100的PDA培养基上进行分离单孢子菌株，28℃培养3d，待单孢子长成菌落后，各挑取3个单孢子分离株转接到PDA培养基上28℃培养3d，挑取少量菌丝到20μl无菌水中，98℃加热10分钟，离心取上清用引物TRA2-F和TRA2-R作PCR鉴定，将各个转化体PCR鉴定为阳性转化体的单孢子分离株继续培养到第7d孢子成熟。

PCR鉴定引物序列(5’-3’)：

TRA2-F：ATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATC

TRA2-R：TTAGGCAGGGCCGACGACAATAGG

上述IM培养基配方为：K₂HPO₄ 10mmol/L，KH₂PO₄ 10mmol/L,，NaCl 2.5mmol/L，MgSO₄·7H₂O2mmol/L，CaCl₂ 0.7mmol/L，(NH₄)₂SO₄ 4mmol/L，Glucose 10mmol/L，Clycerol0.5％，AS 200μmol/L，Mandels微量元素(1000X)1ml，pH5.3。

上述MM培养基配方为(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨2，(NH₄)₂SO₄5,MgSO₄·7H₂O 0.6,CaCl₂0.6，KH₂PO₄15，Mandels微量元素(1000X)1ml/L，pH4.5-5.5。

上述Mandels微量元素(1000X)配方：FeSO₄·7H₂O 5g/L，MnSO₄ 1.6g/L，ZnSO₄·7H₂O 1.7g/L，CoCl·6H₂O 3.7g/L。

实施例5：里氏木霉随机整合转化体摇瓶发酵表达筛选

将上述实施例4中分离株的成熟孢子，用4-5ml无菌水洗下，按照1％的接种量接种于里氏木霉液体种子培养基中，培养24h后按10％的接种量转接到用于不同启动子类型的里氏木霉转化体表达培养基中，于28℃下，170rpm培养168h后分析发酵液上清中的草酸脱羧酶活力。

上述里氏木霉液体种子培养基配方：葡萄糖15g/L,蛋白胨2g/L,(NH₄)₂SO₄2.5g/L,MgSO₄·7H₂O 0.8g/L,CaCl₂1.0g/L，50mM柠檬酸缓冲液(pH 4.5)，尿素0.3g/L，KH₂PO₄ 2g/L，Mandels微量元素(1000X)1ml/L，1-2g/L吐温80。

在本实施例中，以诱导型启动子表达草酸脱羧酶的里氏木霉转化体表达培养基配方为：乳糖18g/L，微晶纤维素10g/L，玉米浆粉12g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L、CaCl₂ 1.0g/L，KH₂PO₄ 6g/L，麸皮粉2g/L，Mandels微量元素(1000X)1ml，MnCl₂ 5mM，pH4.5。

上述Mandels微量元素(1000X)配方：FeSO₄·7H₂O 5g/L，MnSO₄ 1.6g/L，ZnSO₄·7H₂O 1.7g/L，CoCl·6H₂O 3.7g/L。

在本实施例中，以组成型启动子表达草酸脱羧酶的里氏木霉转化体表达培养基配方为：葡萄糖50g/L、蛋白胨4.5g/L、(NH₄)₂SO₄ 1.4g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3g/L、CaCl₂ 0.4g/L，50mM柠檬酸缓冲液(pH 4.5)，尿素0.3g/L，KH₂PO₄ 2g/L，Mandels微量元素(1000X)1ml，1-2g/L吐温80，pH 4.5。

以草酸为底物，将在特定条件(37℃，pH3.0)下中每分钟降解1μmol草酸或者每分钟生成1μmol甲酸所需酶量定义为一个活力单位(IU)。经过摇瓶发酵筛选所有的转化体，以诱导型启动子表达草酸脱羧酶的里氏木霉转化体发酵168h最高酶活力到达17940IU/L。以组成型启动子表达草酸脱羧酶的里氏木霉转化体发酵168h最高酶活力达到8800IU/L。

实施例6：里氏木霉转化体摇瓶发酵条件优化

本实施例通过优化初始培养基中的不同碳源成分、初始浓度以及氮源成分、初始浓度对诱导型重组菌株表达草酸脱羧酶的影响，发酵结果表明，使用优化前的发酵培养基(组成：乳糖18g/L，微晶纤维素10g/L，玉米浆12g/L，(NH₄)₂SO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.56g/L、CaCl₂ 0.5g/L，KH₂PO₄6g/L，麸皮粉2g/L，Mandels微量元素(1000X)1ml，MnCl₂ 5mM，pH4.0)，发酵168h发酵液上清中草酸脱羧酶活力在3000IU/L左右。使用优化后的培养基，其葡糖初始浓度8g/L，微晶纤维素23g/L时表达效果最佳。摇瓶发酵表达168h后上清发酵液中草酸脱羧酶活力到达50876IU/L。优选的培养基组成为：葡萄糖3-8g/L，微晶纤维素10-25g/L，玉米浆粉5-15g/L，(NH₄)₂SO₄0.5-5g/L，MgSO₄·7H₂O1.56g/L、CaCl₂ 0.5g/L，KH₂PO₄2-8g/L，尿素0-1g/L，麸皮粉0.2-2g/L，Mandels微量元素(1000X)1ml，MnCl₂0.5-5mM，pH 3.0-4.5。

实施例7：里氏木霉随机整合转化体插入位点侧翼序列分析

根据实施例2中的方法提取里氏木霉转化体菌株的基因组DNA，采用Song Gao等(Analytical Biochemistry，59(2016)79-81)的TD-TAILPCR(Touchdown TAIL-PCR)方法分析里氏木霉转化体T-DNA(即含有草酸脱羧酶表达盒的转移DNA片段)插入位点侧翼序列。本实施例采用的随机引物(LAD1-LAD5)和特异引物AC1、RB-1、RB-2、Tail-CX-F(见表4)。其中简并引物中V代表A/G/C，N代表A/G/C/T，B代表G/C/T，D代表A/G/T，H代表A/C/T。

首先，将里氏木霉基因组DNA用ddH₂O稀释成20-30ng/μl，以此作为预扩增PCR反应(Pre-amplification)的模板，分别以LAD1-LAD5为随机引物和特异引物RB-1进行预扩增PCR，然后将预扩增PCR反应的产物稀释50倍作为Touchdown PCR的模板，将Touchdown PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，切凝胶回收比较单一和明亮的条带并用表3中的Tail-CX-F引物测序分析。将测序结果序列在里氏木霉基因组数据库中，使用BLASTN程序检索，分析其插入的基因组位点。

表4.TD-TAILPCR中所采用的LAD引物序列和特异引物序列

Pre-amplification扩增反应体系(20μl)：20-30ng基因组DNA，LAD引物1.0μM，RB-1引物0.3μM，dNTP 2μl，10×buffer 2μl，Taq酶0.5U，补ddH₂O至20μl。

预扩增PCR反应条件：

93℃，120s；

95℃，60s；

94℃，30s；60℃，60s；72℃，180s；10个循环；

94℃，30s；25℃，120s；150s内温度均匀增至72℃；72℃，180s；

94℃，20s；58℃，60s；72℃，120s；25个循环；

最后72℃，300s。

Touchdown PCR反应体系(50μl)：预扩增PCR反应产物稀释50倍，AC1引物0.3μM，RB-1引物0.3μM，dNTP 5μl，10×buffer 5μl，Taq酶1U，补ddH₂O至50μl。

Touchdown PCR反应条件：

94℃，120s；

94℃，20s；68℃(-1℃/cycle)，60s；72℃，180s；15个循环；

94℃，20s；53℃，60s；72℃，180s；15个循环；

最后72℃，300s。

本实施例一共选取了摇瓶发酵表达酶活力在25000-65000IU/L之间的35株里氏木霉转化体作T-DNA插入位点的侧翼序列分析，在所有获得的T-DNA侧翼序列中有6条只鉴定出了RB边界外的约0.5kb载体序列，未鉴定出其基因组上的插入位置，有42条鉴定出了T-DNA侧翼序列对应在基因组上的位置。在42条T-DNA侧翼序列中有8条保存着完整的RB边界序列，34条T-DNA右边界序列发生了缺失现象。

在35株里氏木霉转化体中，经过多次PCR进一步分析，25株推断为单一拷贝T-DNA插入，5株推断为在同一位点存在2个拷贝并以正向重复形式存在，3株推断为在同一位点存在2个拷贝并以反向重复形式存在，2株推断为在2个不同位点各存在一个拷贝插入。

在选取的35株里氏木霉转化体中，2拷贝的转化体摇瓶发酵的酶活力比单一拷贝的高出60％-100％，体现出了很好的基因剂量关系。在后续分离纯化单孢子和平行发酵实验中，发现同一位点存在2个拷贝并以正向重复形式存在的菌株不稳定，同一转化体分离出的单孢子间发酵表达酶活力相差较大，相同发酵条件下，大多数比母体表达的酶活力低。同一位点存在2拷贝并以反向重复形式存在的转化体分离出的单孢子间发酵表达酶活力平行性很好，相同发酵条件下与母体表达的酶活力相当。

将其中一个发酵表达酶活力较高(高于50000IU/L)的且在同一位点存在2个拷贝并以反向重复形式存在的分离菌株命名为B4-6。分离株B4-6的插入位点经分析在Trire2|scaffold_12:102924-105333之间。

实施例8：里氏木霉转化体筛选标记基因pyrG删除

将实施例7中B4-6菌株，接种到PDA培养基(含有10mM尿苷)上，于28℃下培养7d至孢子成熟，用4-5ml无菌水洗下孢子制成孢子悬液，取适量孢子悬液涂布在含有5mg/ml 5-FOA，0.1％Trinton-100和10mM尿苷的PDA培养基上，28℃培养4-5d至长出单菌落。获得约100个5-FOA抗性的分离株。选取5个5-FOA抗性的分离株转接到含有10mM尿苷的PDA培养基上，于28℃培养7d至孢子成熟。用引物pyrG-F2和pyrG-R2做PCR鉴定发生同源重组切除pyrG表达框的菌落，结果表明5个孢子分离株均已切除pyrG表达框。上述引物序列：pyrG-F2：5’-TTATAGTATTAGTTTTCCGCCGAC-3’，pyrG-R2：5’-ATGTCCTCCAAGTCGCGATTGAC-3’。将其中一个已切除pyrG表达框的分量株命名为B4-6(pyr4^-)。

实施例9：随机整合重组表达载体pMGU-cbh1-TRA2转化里氏木霉B4-6(pyr4^-)株构建多拷贝转化体

根据实施例4中所述的方法和步骤，将表达载体pMGU-cbh1-TRA2通过农杆菌介导转化的方法转化里氏木霉B4-6(pyr4^-)株。得到42个转化体，将各个转化体分别转到含有300μg/mL头孢霉素的固体MM培养基平板上复筛，28℃培养3d，挑选其中39个复筛的转化体转接到PDA平板，于28℃下培养7d。

通过引物pyrG-F3和引物WF-CBH-R做PCR筛选所有39个转化体，以确认在原来拷贝数的基础上有新增的拷贝。

对于各个转化体，通过从培养到第3天的PDA平板上提取少量菌丝体到20μl无菌水中，98℃加热10分钟，离心取上清用引物pyrG-F3和WF-CBH-R作PCR鉴定，能扩增得到约2.3kb片段的为阳性转化体。上述引物序列为pyrG-F3：5’-TTACTTGTGGTGTTCTCAGCTTG-3’；引物WF-CBH-R的序列见表2。

使用实施例6中优化的培养基进行发酵筛选所有的转化体，从72h开始测定酶活力，每隔24h测定一次，并一直持续到168h发酵结束，结果发现，26#转化体活力最高，发酵168h酶活力可以达到103951IU/L。将144h和168h发酵液上清样品各稀释5倍，进行SDS-PAGE电泳检测，电泳结果如图6所示，泳道1和2分别为发酵144h和168h的发酵液上清，上样量为10μl发酵液上清。采用实施例7中的方法分析最高转化体的新拷贝插入位点，经过测序分析，该转化体在2个不同的位点分别插入一个新的拷贝，插入位点分别为Trire2|scaffold_7:1288320-1288321和Trire2|scaffold_1:1129134-1129157。采用实施例8中的方法切除筛选标记基因pyrG，并命名该转化体为HH03-26-8(pyr4^-)。

实施例10：里氏木霉转化体HH03-26-8(pyr4^-)中pyr4基因的修复

以里氏木霉Rut-C30的基因组DNA为模板，用引物pyr4-F1和pyr4-R1为上下游引物PCR扩增pyr4的完整表达盒以及pyr4基因两侧的同源臂片段，PCR扩增产物经过1％琼脂糖凝胶电泳分离，切除约4.0kb的条带，用凝胶提取试剂盒回收纯化，用限制性内切酶BglII和XbaI消化1h后，用PCR产物回收试剂盒回收目的片段，备用。将载体pMDT05同样用限制性内切酶BglII和XbaI消化3h后，凝胶提取试剂盒回收纯化载体片段，将其与消化回收的4.0kb的片段按摩尔比1:3混合，加入T4DNA连接酶于22℃条件下连接3h，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，PCR筛选阳性克隆，并测序验证。将测序验证正确的载体命名为pMDT05-pyr4KI，其图谱如图5所示。上述引物序列为：

pyr4-F1：5’-TCAGATCTAGTGTTTGATGCTCACGCTCGGAT-3’；

pyr4-R1：5’-TTTCTAGATGAACAGTAAGGTGTCAGCA-3’。

根据实施例4中所述的方法和步骤，将表达载体pMDT05-pyr4KI通过农杆菌介导转化的方法转化里氏木霉HH03-26-8(pyr4^-)株。获得了153个转化体，将转化体点到固体MM培养基上，于28℃培养48h，待菌丝体向外生长到直径为1厘米左右菌斑。将MM平板上的所有转化体做好编号，分别挑取部分菌丝体点到含有100μg/mL潮霉素的PDA固体平板上，于28℃培养48h。记录下在含100μg/mL潮霉素的PDA固体平板上不能生长的转化体的编号，获得了35个该转化体。从MM固体平板上挑取相对应的编号的转化体菌丝体转接到PDA平板上，于28℃下培养，在培养到第3天时，挑取少量菌丝体到20μl无菌水中，98℃加热10分钟，离心取上清用引物pyr4-F2和pyr4-R2做PCR验证。上述引物序列为：pyr4-F2：5’-CAAACGAACACATCACTTTCAAAG-3’；pyr4-R2：5’-GTGGGCTTCCTTGTTTCTCGACC-3’。当在pyr4基因位点发生同源重组修复了pyr4表达盒时，PCR扩增条带约为4.2kb，当未发生同源重组是扩增的条带约为2.7kb。通过PCR分析，在35个转化体中，28个转化体能扩增到约4.2kb的片段，7个转化体能扩增出约为2.7kb片段，推测这7个转化体在pyr4基因座外其他位置发生了随机插入同时丢失了潮霉素抗性。

实施例11：里氏木霉Rut-C30(pyr4^-)菌株中mus53基因敲除

根据公开文献报道(Matthias G.Steiger，APPLIEDAND ENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,Jan.2011,p.114–121)mus53基因(与人类Lig4基因同源)为非同源性末端结合(NHEJ)功能所必需的，其功能的破坏，能够带来将近100％的同源重组效率。在本实施例中，将里氏木霉Rut-C30(pyr4-)菌株中的mus53基因进行敲除，为后续定点整合敲入实施例的进行奠定基础。

1、构建mus53基因敲除载体pMDT05-mus53KO

参照公开文献中提供的里氏木霉mus53基因(Protein Id:58509)信息(MatthiasG.Steiger，APPLIEDAND ENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,Jan.2011,p.114–121)，检索里氏木霉基因组数据库中mus53基因所在位置的基因座序列信息(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)。

以里氏木霉基因组DNA为模板，利用表5中的引物mus53-3F/mus53-3R和mus53-5F/mus53-5R分别扩增得到约1.4kb的mus53基因上游同源臂Up片段和约1.3kb的mus53基因下游同源臂Down片段，用引物mus53-mid-F/mus53-mid-R扩增mus53基因座约1.3kb的Middle片段。

以里氏木霉基因组DNA为模板，用引物pyr4-TprC-F/pyr4-R扩增约1.5kb的pyr4基因编码区和其终止子，以质粒pBARGPE1为模板，用引物pyr4-F/pyr4-TrpC-R扩增386bp的PtrpC启动子。

将上述5段PCR扩增的片段按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收后按照等摩尔比混合作为PCR扩增模板，用引物mus53-3R/mus53-mid-F为上下游引物SOE-PCR扩增约6.1kb的融合片段，并按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收目的片段。

将质粒pMDT05用限制性内切酶EcoRI和XbaI消化3h，凝凝胶回收载体骨架片段，并与回收的6.1kb片段按照 II一步法克隆试剂盒的方法组装，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为pMDT05-mus53KO，载体构建图谱参见图7。

2、里氏木霉Rut-C30(pyr4^-)中mus53基因敲除

根据实施例4中所述的方法和步骤，将mus53基因敲除载体pMDT05-mus53KO通过农杆菌介导转化的方法转化里氏木霉Rut-C30(pyr4^-)株，得到294个转化体，将各个转化体分别点板到固体MM培养基(300μg/mL头孢霉素和200μg/mL潮霉素)平板和固体MM培养基(300μg/mL头孢霉素)平板上复筛，28℃培养3d，得到44个没有潮霉素抗性的转化体，挑选其中的31个转化体转接到PDA平板，于28℃下培养7d。

通过引物MUS-F/TrpC-CX-F和pyr4-LB-R/MUS-R做PCR筛选所有31个转化体，以确定是否在mus53基因座位点通过Up与Middle区域发生同源重组。通过引物RB-YZ-F和引物RB-YZ-R做PCR扩增筛选转化体，以确定是否在mus53基因座位点外发生随机整合。

本实施例中，对于各个转化体，通过从培养到第3天的PDA平板上提取少量菌丝体到20μl无菌水中，98℃加热10分钟，离心取上清作为模板，用引物MUS-F/TrpC-CX-F和pyr4-LB-R/MUS-R能分别扩增到约3.1kb和1.6kb片段的说明在相应区域发生了预期形式的同源重组，同时用引物RB-YZ-F和引物RB-YZ-R不能扩增到425bp的片段，说明没有发生随机整合，本实施例中筛选到同时满足这些条件的阳性转化子15株。将其中一个阳性转化子接种到PDA培养基(含有10mM尿苷)上，于28℃下培养7d至孢子成熟，用4-5ml无菌水洗下孢子制成孢子悬液，取适量孢子悬液涂布在含有5mg/ml 5-FOA，0.1％Trinton-100和10mM尿苷的PDA培养基上，28℃培养4-5d至长出单菌落，选择其中3个菌落转接到含有10mM尿苷的PDA培养基上，于28℃培养7d至孢子成熟。用引物MUS-F/MUS-R做PCR鉴定发生同源重组切除pyr4表达框的菌落，发生同源重组切除pyr4的能扩增到约2.9kb的片段，结果表明3个菌落均已切除pyr4表达框。并将验证的阳性菌株命名为Rut-C30(pyr4^-，mus53^-)。引物序列见表5。

表5.构建mus53基因敲除载体引物

实施例12:定点整合表达载体构建

1、CBH1位点定点整合表达载体构建pMDT05-CBH1-TRA2(KI)

通过关键词搜索在里氏木霉基因组数据库中(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)获取CBH1(Cel7A)基因座相应DNA序列信息。

以质粒pMGU-cbh1-TRA2为模板，使用引物CBH1-F1和CBH1-R1扩增包含部分Pcbh1在内的Pcbh1-TRA2-Tcbh1片段，其中的1115bp的部分Pcbh1作为5’端同源臂序列。以里氏木霉基因组DNA为模板，使用引物CBH1-F2和CBH1-R2扩增Tcbh1终止子后一段500bp的序列作为重复序列(DR)。以质粒pMDT05-mus53KO为模板，使用引物CBH1-F3和CBH1-R3扩增pyr4表达框。以里氏木霉基因组DNA为模板，使用引物CBH1-F4和CBH1-R4扩增Tcbh1终止子后1041bp序列作为3’端同源臂序列。

所有PCR扩增的片段按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收后的片段按照等摩尔比混合作为PCR扩增模板，用引物CBH1-F1和CBH1-R4为上下游引物SOE-PCR扩增约7kb的融合片段。使用引物pMDT-SpeI-R和pMDT-XbaI-F扩增线性化载体pMDT-05，扩增产物用DpnI消化3h。将上述2片段并按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收后的目的片段按照 II一步法克隆试剂盒的方法组装，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为pMDT05-CBH1-TRA2(KI)，图谱参见图8。引物序列见表6。

2、CBH2位点定点整合表达载体构建pMDT05-CBH2-TRA2(KI)

通过关键词搜索在里氏木霉基因组数据库中(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)获取CBH2(Cel6A)基因座相应DNA序列信息。

以里氏木霉基因组DNA为模板，使用引物CBH2-F1和EcoRI-CBH2-UR扩增其5’端同源臂序列(1087bp)。以质粒pMDT05-mus53KO为模板，使用引物EcoRI-CBH2-TrpC-F和CBH2-D-TU-R扩增pyr4表达框。以里氏木霉基因组DNA为模板，使用引物Tpyr4-CBH2-D-F和CBH2-R3扩增其3’端同源臂序列(1187bp)。

所有PCR扩增的片段按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收后的片段按照等摩尔比混合作为PCR扩增模板，用引物CBH2-F1和CBH2-R3为上下游引物SOE-PCR扩增约4.2kb的融合片段。使用引物pMDT-SpeI-R和pMDT-XbaI-F扩增线性化载体pMDT-05，扩增产物用DpnI消化3h。将上述2片段并按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收后的目的片段按照 II一步法克隆试剂盒的方法组装，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为pMDT05-CBH2-pyr4，参见图9。

以质粒pMGU-cbh1-TRA2为模板，使用引物E-CBH2-PCBH-F和CBH2-DR-R2扩增约4.7kb的表达框Pcbh1-TRA2-Tcbh1。以里氏木霉基因组DNA为模板，使用引物CBH-DR-F和E-CBH2-DR-R扩增437bp序列作为重复序列(DR)。

将上述2个PCR片段按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收后的片段按照等摩尔比混合作为PCR扩增模板，用引物E-CBH2-PCBH-F和E-CBH2-DR-R为上下游引物SOE-PCR扩增约5.1kb的融合片段，并按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收目的片段。回收后的片段与用EcoRI酶切的载体pMDT05-CBH2-pyr4(EcoRI)按照II一步法克隆试剂盒的方法组装，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为pMDT05-CBH2-TRA2(KI)。引物序列见表6。

3、EG1位点定点整合表达载体构建pMDT05-EG1-TRA2(KI)

通过关键词搜索在里氏木霉基因组数据库中(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)获取EG1(Cel7B)基因座相应DNA序列信息。

以里氏木霉基因组DNA为模板，使用引物WF-EG1-UF1和P-EG1-R扩增其5’端同源臂序列(1149bp)。以质粒pMDT05-mus53KO为模板，使用引物EG1-pyr4-F和CBH2-R6扩增pyr4表达框。以里氏木霉基因组DNA为模板，使用引物CBH2-F5和EG1-TRA2-R扩增501bp序列作为重复序列(DR)。以里氏木霉基因组DNA为模板，使用引物EG1-DW-F和EG1-DW-R扩增其3’端同源臂序列(1211bp)。

所有PCR扩增的片段按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收后的片段按照等摩尔比混合作为PCR扩增模板，使用引物WF-EG1-UF1和EG1-DW-R为上下游引物SOE-PCR扩增约4.8kb的融合片段。使用引物pMDT-SpeI-R和pMDT-XbaI-F扩增线性化载体pMDT-05，扩增产物用DpnI消化3h。将上述2片段并按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收后的目的片段按照 II一步法克隆试剂盒的方法组装，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为pMDT05-EG1-pyr4。

以质粒pMGU-cbh1-TRA2为模板，使用引物EG1-TRA2-F和CBH2-R22扩增约4.7kb的表达框Pcbh1-TRA2-Tcbh1。以质粒pMDT05-EG1-pyr4为模板，使用引物CBH2-F66和P-EG1-R扩增载体线性化，扩增后的产物用DpnI消化3h。将上述两个片段按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收的片段按照 II一步法克隆试剂盒的方法组装，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为pMDT05-EG1-TRA2(KI)，参见图10。引物序列见表6。

4、EG2位点定点整合表达载体构建pMDT05-EG2-TRA2(KI)

通过关键词搜索在里氏木霉基因组数据库中(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)获取EG2(Cel5B)基因座相应DNA序列信息。

以里氏木霉基因组DNA为模板，使用引物WF-EG2-UF1和P-EG2-R扩增其5’端同源臂序列(1100bp)。以质粒pMDT05-mus53KO为模板，使用引物EG2-pyr4-F和CBH2-R6扩增pyr4表达框。以里氏木霉基因组DNA为模板，使用引物CBH2-F5和EG2-TRA2-R扩增501bp序列作为重复序列(DR)。以里氏木霉基因组DNA为模板，使用引物EG2-DW-F和EG2-DW-R扩增其3’端同源臂序列(1098bp)。

所有PCR扩增的片段按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收后的片段按照等摩尔比混合作为PCR扩增模板，使用引物WF-EG2-UF1和EG2-DW-R为上下游引物SOE-PCR扩增约4.6kb的融合片段。使用引物pMDT-SpeI-R和pMDT-XbaI-F扩增线性化载体pMDT-05，扩增产物用DpnI消化3h。将上述2片段并按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收后的目的片段按照 II一步法克隆试剂盒的方法组装，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为pMDT05-EG2-pyr4。

以质粒pMGU-cbh1-TRA2为模板，使用引物EG2-TRA2-F和CBH2-R22扩增约4.7kb的表达框Pcbh1-TRA2-Tcbh1。以质粒pMDT05-EG2-pyr4为模板，使用引物CBH2-F66和P-EG2-R扩增载体线性化，扩增后的产物用DpnI消化3h。将上述两个片段按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收的片段按照 II一步法克隆试剂盒的方法组装，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为pMDT05-EG2-TRA2(KI)，参见图11。引物序列见表6。

表6.构建定点整合载体引物

实施例13:4拷贝定点整合表达菌株构建

在里氏木霉纤维素酶诱导表达条件下，其胞外纤维素酶系中CBH1，CBH2，EG1和EG2占胞外总蛋白的75％以上。诱导型启动子Pcbh1在诱导目的基因TRA2表达的同时，也诱导了大量纤维素酶系基因的表达，这样在发酵液上清中会有比较多的纤维素酶系成分作为杂蛋白存在，给下游处理带来不利因素，同时也消耗部分原料合成这些纤维素酶系的成分。本实施例在Rut-C30(pyr4^-，mus53^-)菌株基础上通过定点整合敲入的方式在CBH1，CBH2，EG1和EG2位点基因组上一共整合4个拷贝的目的基因表达框。

1、CBH1位点定点整合表达株构建

根据实施例4中所述的方法和步骤，将CBH1位点定点整合表达载体pMDT05-CBH1-TRA2(KI)通过农杆菌介导转化的方法转化里氏木霉Rut-C30(pyr4^-，mus53^-)株，挑取36个转化体点板到固体MM培养基(300μg/mL头孢霉素)平板上复筛，28℃培养3d，挑取其中20个将生长良好的转化体菌丝点板至PDA平板，28℃生孢培养7d。

通过引物NdeI-Pcbh1-F2/TRA2-CX-R1和pyr4-LB-R/CBH-down-R做PCR筛选这20个转化体，以确定是否在CBH1基因座位点通过5’端同源臂和3’端同源臂发生同源重组。通过引物RB-YZ-F和引物RB-YZ-R(见表5)做PCR扩增筛选转化体，以确定是否在CBH1基因座位点外发生随机整合。本实施例中，对于各个转化体，通过从培养到第3天的PDA平板上提取少量菌丝体到20μl无菌水中，98℃加热10分钟，离心取上清作为模板，用引物NdeI-Pcbh1-F2/TRA2-CX-R1和pyr4-LB-R/CBH-down-R能分别扩增到约2.7kb和1.3kb片段的说明在相应区域发生了预期形式的同源重组，同时用引物RB-YZ-F和引物RB-YZ-R不能扩增到425bp的片段，说明没有发生随机整合，本实施例中筛选到同时满足这些条件的阳性转化子14株。选取其中一个阳性转化子，按照实施例11中方法删除pyr4基因表达框，并使用引物HC2-JD-F2和CBH1-JD-R2进行验证，发生删除的能扩增到698bp片段，将验证阳性的菌株命名为LYH-D1(pyr4^-，mus53^-)。引物序列见表7。

2、CBH2位点定点整合表达株构建

在菌株LYH-D1(pyr4^-，mus53^-)的基础上，根据上述CBH1位点定点整合敲入的方法和步骤，将CBH2位点定点整合表达载体pMDT05-CBH2-TRA2(KI)通过农杆菌介导转化的方法转化里氏木霉LYH-D1(pyr4^-，mus53^-)株，获得了2拷贝的定点整合菌株LYH-D2(pyr4^-，mus53^-)。

在本实施例中，通过引物CBH2-F/Pcbh1-CX和pyr4-LB-R/CBH2-R做PCR筛选转化体，以确定是否在CBH2基因座位点通过5’端同源臂和3’端同源臂发生同源重组。通过引物RB-YZ-F和引物RB-YZ-R(见表5)做PCR扩增筛选转化体，以确定是否在CBH2基因座位点外发生随机整合。通过引物Tcbh1-CX-F和CBH2-R2验证是否删除pyr4基因表达框。引物序列见表7。

3、EG1位点定点整合表达株构建

在菌株LYH-D2(pyr4^-，mus53^-)的基础上，根据上述CBH1位点定点整合敲入的方法和步骤，将EG1位点定点整合表达载体pMDT05-EG1-TRA2(KI)通过农杆菌介导转化的方法转化里氏木霉LYH-D2(pyr4^-，mus53^-)株，获得了3拷贝的定点整合菌株LYH-D3(pyr4^-，mus53^-)。

在本实施例中，通过引物EG1-UF1/Pcbh1-CX和pyr4-LB-R/EG1-R做PCR筛选转化体，以确定是否在EG1基因座位点通过5’端同源臂和3’端同源臂发生同源重组。通过引物RB-YZ-F和引物RB-YZ-R(见表5)做PCR扩增筛选转化体，以确定是否在EG1基因座位点外发生随机整合。通过引物Tcbh1-CX-F和EG1-DR1验证是否删除pyr4基因表达框。引物序列见表7。

4、EG2位点定点整合表达株构建

在菌株LYH-D3(pyr4^-，mus53^-)的基础上，根据上述CBH1位点定点整合敲入的方法和步骤，将EG2位点定点整合表达载体pMDT05-EG2-TRA2(KI)通过农杆菌介导转化的方法转化里氏木霉LYH-D3(pyr4^-，mus53^-)株，获得了4拷贝的定点整合菌株LYH-D4(pyr4^-，mus53^-)。

在本实施例中，通过引物EG2-UF1/Pcbh1-CX和pyr4-LB-R/EG22-R做PCR筛选转化体，以确定是否在EG2基因座位点通过5’端同源臂和3’端同源臂发生同源重组。通过引物RB-YZ-F和引物RB-YZ-R(见表5)做PCR扩增筛选转化体，以确定是否在EG1基因座位点外发生随机整合。通过引物Tcbh1-CX-F和EG2-DR1验证是否删除pyr4基因表达框。引物序列见表7。

表7.定点整合敲入验证引物

实施例14:里氏木霉mus53基因修复载体pMDT05-mus53(KI)构建

以里氏木霉基因组DNA为模板，使用引物mus53-up-F和mus53-up-R扩增包含其5’端同源臂序列和重复序列(DR)在内的片段(2209bp)。以质粒pMDT05-mus53KO为模板，使用引物mus53-pyr4-F和mus53-pyr4-R扩增pyr4表达框。将上述2个PCR扩增片段按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收后的片段按照等摩尔比混合作为PCR扩增模板，使用引物mus53-up-F和mus53-pyr4-R为上下游引物SOE-PCR扩增约4.0kb的融合片段。使用引物pMDT-SpeI-R和pMDT-XbaI-F扩增线性化载体pMDT-05，扩增产物用DpnI消化3h。将上述2片段并按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收后的目的片段按照 II一步法克隆试剂盒的方法组装，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为pMDT05-mus53-pyr4。

以里氏木霉基因组DNA为模板，使用mus53-down-F和mus53-down-R扩增包含其3’端同源臂和mus53修复区的片段(4343bp)。使用限制性内切酶EcoRI酶切载体pMDT05-mus53-pyr43h。将上述PCR扩增片段和酶切线性化的pMDT05-mus53-pyr4(EcoRI)载体按照omega公司凝胶回收试剂盒方法进行回收，回收后的目的片段按照 II一步法克隆试剂盒的方法组装，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，将验证和测序正确的载体命名为pMDT05-mus53(KI)，构建图谱参见图12。

实施例15:4拷贝菌株LYH-D4(pyr4^-，mus53^-)中mus53和pyr4基因修复

在里氏木霉LYH-D4(pyr4^-，mus53^-)菌株中对里氏木霉mus53基因进行修复，根据实施例4中所述的方法和步骤，将mus53基因修复载体pMDT05-mus53(KI)通过农杆菌介导转化的方法转化里氏木霉LYH-D4(pyr4^-，mus53^-)株，挑取27个转化体点板到固体MM培养基(300μg/mL头孢霉素)平板上复筛，28℃培养3d，挑取其中15个将生长良好的转化体菌丝点板至PDA平板，28℃生孢培养7d。

通过引物MUS-F/TrpC-CX-F和MUS-YZ-F2/MUS-R做PCR筛选15个转化体，以确定是否在mus53基因座位点通过其5’端同源臂和3’端同源臂发生同源重组。通过引物RB-YZ-F和引物RB-YZ-R做PCR扩增筛选转化体，以确定是否在mus53基因座位点外发生随机整合。按照实施例11中方法删除pyr4基因表达框，并使用引物mus3-YZ-F和MUS-YZ-R2进行验证是否删除pyr4基因表达框，将mus53基因修复的阳性菌株命名为LYH-D4(pyr4^-)。验证引物序列(部分见表5)：

MUS-YZ-F2：GTGCTGGGAGACGATGTGATG

mus3-YZ-F：CAGCAGCGACGCGATTCCTTC

MUS-YZ-R2：CTGCTTCAGAATGATGCGGATG

在mus53基因修复后，按照实施例10中的方法和步骤，通过pyr4基因修复载体pMDT05-pyr4KI将LYH-D4(pyr4^-)中的pyr4基因进行修复，最终获得的阳性菌株命名为LYH-D4。

实施例16:定点整合4拷贝菌株LYH-D4摇瓶发酵优化

由于里氏木霉LYH-D4株的4个主要的纤维素酶基因被敲除，不能利用微晶纤维素作为诱导物和碳源，所以在实施例6中用于随机整合转化菌株优化的培养基不适合于里氏木霉LYH-D4株。

本实施例通过一系列培养基组分单因素实验，PB实验及响应面曲线实验优化培养基配方，提高里氏木霉LYH-D4株单位体积发酵活力，优化结果表明，使用优化前的发酵培养基(组成：乳糖30g/L，玉米浆12g/L，(NH₄)₂SO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.56g/L、CaCl₂ 0.5g/L，KH₂PO₄6g/L，麸皮粉2g/L，Mandels微量元素(1000X)1ml，MnCl₂ 5mM，pH 4.0)，发酵168h发酵液上清中草酸脱羧酶活力在6800IU/L左右。使用优化的培养基，摇瓶发酵表达168h后上清发酵液中草酸脱羧酶活力可到达26500IU/L。优选的培养基组成为：葡萄糖3-6g/L，乳糖30-40g/L，玉米浆粉7-10g/L，(NH₄)₂SO₄0.5-1g/L，MgSO₄·7H₂O 1.56g/L、CaCl₂ 0.5g/L，KH₂PO₄2-4g/L，尿素0-1g/L，麸皮粉10-20g/L，Mandels微量元素(1000X)1ml，MnCl₂0.5-5mM，pH 3.5-4.0。

实施例17:定点整合4拷贝菌株LYH-D4发酵罐发酵

1、种子液的制备

将重组里氏木霉菌LYH-D4的菌丝接种于多个PDA固体斜面培养基中，28℃培养7d，待分生孢子长成绿色后，用无菌水冲洗收集孢子悬液，并调整孢子浓度到1.0*10⁸个/ml左右，以1％接种量接种于500mL MM液体培养基中，28℃避光震荡(170转/分)培养24-36h，以其作为7L发酵罐发酵的种子液。

2、里氏木霉菌株LYH-D4在7L发酵罐中发酵

里氏木霉的整个发酵过程分为以下两个阶段：第一阶段为菌丝体生长阶段(0～72h)：在7L发酵罐(上海保兴生物设备工程有限公司)中加入4.5L基础发酵培养基(葡萄糖20g/L，玉米浆粉7g/L，KH₂PO₄4g/L，尿素1g/L，硫酸铵2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，CaCl₂1g/L，MnCl₂1mM，Mandels微量元素(1000X)1ml/L,pH 4.0)，按10％的比例接种制备好的里氏木霉种子液，28℃通气搅拌培养72小时左右，溶氧量维持在30％以上，搅拌转速根据溶氧量进行调整，一般控制在250-500转/分钟，pH维持在3.5-4.0左右。在菌丝体生长阶段，随着里氏木霉菌体的生长，一般在24-28h左右葡糖糖基本消耗完，此时以12ml/h的速率补加250g/L乳糖溶液。培养至72h左右菌体的干重达到15-18g/L。第二阶段为诱导表达阶段(72～168h)：在发酵开始的第72h，通过蠕动泵流加250g/L的乳糖溶液，使其工作浓度始终不超过2g/l，溶氧量始终大于20％，28℃通气搅拌培养至接种后168小时左右，pH维持在4.0左右。每隔24小时取样检测发酵液上清草酸脱羧酶活力，发酵160小时左右发酵液上清活力可达到271756U/L(图13)。取136h和160h发酵液上清稀释10倍进行SDS-PAGE检测，可明显看到分子量约为60KDa的目的蛋白条带(图14)。将160h发酵液样品稀释200倍和500倍进行WesternBlot检测分析(图15)。

实施例18:重组草酸脱羧的回收提取

发酵液在常温下经5000rpm离心15分钟，留取上清。发酵液上清经过孔径100nm的无机陶瓷膜(三达膜环境技术股份有限公司)过滤，收集透过液，澄清后的透过液边搅拌边加入浓度为10％的单宁酸，使单宁酸终浓度在1％左右，室温下静置1h，然后在常温下8000rpm离心15分钟，收集草酸脱羧酶与单宁酸的复合物沉淀。此复合物沉淀物用1/2体积透过液的无菌水充分重悬清洗，8000rpm离心15分钟，留取复合物沉淀，如此重复1次。向此复合物沉淀中加入0.4倍澄清液体积的聚乙二醇溶液(聚乙二醇的用量为澄清液体积的0.3-0.5％)，常温下不断搅拌4h，利用聚乙二醇同单宁酸之间有更强的结合力而使草酸脱羧酶从单宁酸蛋白复合物中解析出来。然后室温下8000rpm离心15分钟去除单宁酸聚乙二醇聚合物，留取上清，该上清即为浓缩2.5倍的浓缩酶液。最后向浓缩酶液中加入糖用活性炭2％脱色，得到浅黄色的草酸脱羧酶酶液，酶回收率可达到90-95％。脱色后的草酸脱羧酶酶液用截留分子量为10KDa的超滤膜进行浓缩10-30倍，浓缩后经喷雾干燥得到草酸脱羧酶酶粉。

实施例19:重组草酸脱羧酶性质及对比分析

将通过里氏木霉丝状真菌宿主细胞表达的重组草酸脱羧酶与通过天然宿主茶树菇诱导表达的草酸脱羧酶，在pH值1.5-7.0条件下测定相对酶活力，结果如图16所示，在不同pH值条件下，重组草酸脱羧酶与天然茶树菇诱导表达草酸脱羧酶具有相似的相对酶活力保持。重组草酸脱羧酶在pH值1.5-7.0的条件下保持其全部或部分酶活力，且在pH值1.5-2.5的条件下保持不低于其在最适pH条件下酶活力的10％，在pH值2.5-4.5的条件下保持不低于其在最适pH条件下酶活力的50％，在pH值4.5-7.0的条件下保持不低于其在最适pH条件下酶活力的25％，最适pH值为2.5-3.5。

将通过里氏木霉丝状真菌宿主细胞表达的重组草酸脱羧酶，天然宿主茶树菇诱导表达的草酸脱羧酶以及原核表达的草酸脱羧酶进行SDS-PAGE分析，结果如图17所示，里氏木霉表达的重组草酸脱羧酶与茶树菇表达的草酸脱羧酶由于糖基化修饰形式和程度的不同，在表观分子量上有差异，天然宿主茶树菇表达的草酸脱羧酶的分子量70kDa左右，而里氏木霉表达的重组草酸脱羧酶的分子量在60kDa左右，但两者都比无糖基化修复的原核表达的草酸脱羧酶的分子量大，原核表达的无糖基化修饰的草酸脱羧酶分子量在50kDa左右。将里氏木霉表达的重组草酸脱羧酶用MALDI-TOF-MS进行分子量分析，如图18所示，其真实分子量为57.1kDa。

分别将上述三种表达系统表达的草酸脱羧酶用经过TPCK处理的胰蛋白酶酶解消化后，做MALDI-TOF-MS分析，其峰图如图19,20和21所示，这三种表达系统表达的草酸脱羧酶由于在糖基化修饰的形式和程度不同，其经胰蛋白酶酶解消化后的质谱峰图具有差异性，这种差异性具有宿主细胞特异性。

本发明所述SEQ ID NO.10-16序列在里氏木霉中进行单拷贝重组表达与SEQ IDNO.9能得到相似的实验结果。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 武汉康复得生物科技股份有限公司

<120> 一种用丝状真菌宿主细胞表达的重组草酸脱羧酶

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 470

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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1 5 10 15

Ala Phe Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ile Val Val

20 25 30

Ser Ala Thr Ser Ser Ser Thr Val Ser Ser Ala Pro Val Ser Val Ser

35 40 45

Ser Phe Leu Pro Thr Thr Ser Ile Ala Ala Ala Thr Pro Ser Ser Ile

50 55 60

Ala Val Ala Leu Ser Ser Thr Ala Thr Val Pro Phe Ile Asp Leu Asn

65 70 75 80

Pro Asn Gly Pro Leu Trp Asp Pro Ser Val Ser Gly Val Pro Gln Ala

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Glu Arg Gly Ser Leu Gly Ala Thr Ile Met Gly Pro Thr Asp Val Asp

100 105 110

Thr Thr Lys Ala Asn Pro Asp Leu Leu Ala Pro Pro Thr Thr Asp His

115 120 125

Gly Ser Val Asp Asn Ala Lys Trp Ala Phe Ser Leu Ser His Asn Arg

130 135 140

Leu Gln Thr Gly Gly Trp Ala Arg Glu Gln Asn Ile Gly Ala Met Pro

145 150 155 160

Ile Ala Thr Glu Met Ala Ser Val Asn Met Arg Leu Glu Pro Gly Ala

165 170 175

Ile Arg Glu Leu His Trp His Lys Thr Ala Glu Trp Ala Tyr Val Leu

180 185 190

Lys Gly Asn Thr Gln Val Thr Ala Val Asp Gln Asn Gly Lys Asn Phe

195 200 205

Ile Gly Thr Val Gly Pro Gly Asp Leu Trp Tyr Phe Pro Pro Gly Ile

210 215 220

Pro His Ser Leu Gln Ala Thr Gly Asp Asp Pro Glu Gly Ser Glu Phe

225 230 235 240

Ile Leu Val Phe Asp Ser Gly Ala Phe Ser Glu Asp Ser Thr Phe Leu

245 250 255

Leu Thr Asp Trp Met Ser His Val Pro Val Glu Val Leu Ala Lys Asn

260 265 270

Phe Gln Thr Asp Ile Ser Ala Phe Ala Arg Ile Pro Ala Glu Glu Leu

275 280 285

Tyr Ile Phe Pro Ala Ala Val Pro Pro Asp Ser Gln Gln Asp Pro Thr

290 295 300

Ser Pro Glu Gly Thr Val Pro Asn Pro Phe Thr Phe Ala Leu Ser Lys

305 310 315 320

Val Pro Pro Met Gln Leu Ser Gly Gly Thr Ala Lys Ile Val Asp Ser

325 330 335

Thr Thr Phe Thr Val Ser Lys Ala Ile Ala Ala Ala Glu Val Thr Ile

340 345 350

Glu Pro Gly Ala Ile Arg Glu Leu His Trp His Pro Thr Gln Asp Glu

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Trp Ser Phe Phe Ile Glu Gly Arg Ala Arg Met Thr Ile Phe Ala Ala

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Gln Ser Asn Ala Arg Thr Phe Asp Tyr Gln Ala Gly Asp Ile Gly Tyr

385 390 395 400

Val Pro Ala Thr Met Gly His Tyr Val Glu Asn Ile Gly Asn Thr Thr

405 410 415

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420 425 430

Leu Ser Asn Trp Leu Ala Leu Thr Pro Pro Glu Leu Val Lys Ala His

435 440 445

Leu Gly Phe Asp Asp Ala Thr Met Ala His Leu Ala Lys Val Lys Pro

450 455 460

Ile Val Val Gly Pro Ala

465 470

<210> 2

<211> 472

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Ser Ser Leu Pro Trp Val Ile Thr Ser

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Val His Gly Ala Pro Thr Gly Thr Lys Ser Asn

20 25 30

Pro Pro Leu Arg Gly Ser Glu Asn Leu Leu Gly Tyr Ser Ala Ser Asn

35 40 45

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65 70 75 80

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Gly Pro Arg Asn Asp Tyr Tyr Asp Arg Ile Asn Ser Asp Lys Leu Ala

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115 120 125

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Asp Met Arg Leu Glu Ala Gly Ala Tyr Arg Glu Leu His Trp His Val

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180 185 190

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195 200 205

Val Trp Phe Phe Pro Pro Gly Val Pro His Ser Ile Gln Ala Leu Asp

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Gly Gly Ser Val Lys Ile Val Asp Ser Leu Thr Phe Pro Ile Ser Thr

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Leu Asp Arg Leu Lys Thr Glu Lys Met Tyr Val Val Ala Gly Ser Asn

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Glu Thr Asp Val Ala Ala Thr Ala

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<210> 3

<211> 455

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ile Arg Leu Ser Ser Cys Leu Cys Ala Leu Leu Leu Ala Thr Phe

1 5 10 15

Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ser Asp Ser Ala Ser Ser Val Pro Ala

20 25 30

Ser Ile Ser Ser Glu His Pro Ser Ser Thr Val Lys Pro Thr Gly Thr

35 40 45

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<210> 4

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Phe Asn Asn Phe Gln Arg Leu Leu Thr Val Ile Leu Leu Ser Gly

1 5 10 15

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<211> 470

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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Leu Gln Thr Gly Gly Trp Ala Arg Glu Glu Asn Ile Ala Val Met Pro

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165 170 175

Val Arg Glu Leu His Trp His Lys Thr Ala Glu Trp Ala Tyr Val Leu

180 185 190

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260 265 270

Phe Gln Val Asn Ile Ser Ala Phe Ala His Ile Pro Ala Glu Glu Leu

275 280 285

Tyr Ile Phe Pro Ala Ala Leu Pro Glu Pro Asp Ser Ala Ala Pro Lys

290 295 300

Ser Pro Gln Gly Thr Val Pro Asp Pro Phe Ser Phe Ser Met Ser Lys

305 310 315 320

Val Lys Pro Thr Gln Leu Thr Gly Gly Thr Val Lys Val Val Asp Ser

325 330 335

Thr Thr Phe Lys Ile Ser Lys Thr Ile Ala Ala Ala Glu Val Thr Val

340 345 350

Glu Pro Gly Ala Ile Arg Glu Leu His Trp His Pro Thr Gln Asp Glu

355 360 365

Trp Ser Phe Phe Ile Glu Gly Glu Gly Arg Met Thr Ile Phe Ala Ser

370 375 380

Gln Ser Asn Ala Arg Thr Phe Asn Tyr Gln Ala Gly Asp Ile Gly Tyr

385 390 395 400

Val Pro Ala Thr Met Gly His Tyr Leu Glu Asn Thr Gly Asn Thr Thr

405 410 415

Leu Arg Phe Leu Glu Ile Phe Lys Ser Glu Lys Phe Gln Asp Ile Ser

420 425 430

Leu Ala Gln Trp Leu Ala Leu Thr Pro Pro Lys Leu Val Lys Glu His

435 440 445

Leu Gly Phe Ser Asp Asp Val Ile Ala Arg Leu Ser Lys Thr Lys Leu

450 455 460

Thr Val Val Gly Pro Lys

465 470

<210> 6

<211> 455

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Gly Lys Phe Leu Ala Thr Val Leu Cys Ala Val Leu Tyr Gly Ser

1 5 10 15

Leu Ala Ala Ala Ile Pro Val Gly Asp Val Ser Ala Ser Ser Ser Ala

20 25 30

Ser Ser Ser Ile Ala Glu Ala Ala Thr Ser Thr Ser Gly Gly Ala Ser

35 40 45

Pro Ser Pro Thr Val Pro Leu Ala Ser Asp Asp Pro Asn Tyr Trp Leu

50 55 60

Trp Asn Glu Thr Thr Thr Thr Asp Pro Gln Pro Glu Arg Gly Ser Leu

65 70 75 80

Gly Ala Asn Ile Leu Gly Pro Gln Asn Val Ala Ile Asp Lys Gln Asn

85 90 95

Pro Asp Ile Leu Ala Pro Pro Thr Thr Asp Gln Gly Thr Val Gly Asn

100 105 110

Ala Lys Trp Pro Phe Ser Leu Ser Lys Gln Gln Leu Asn Thr Gly Gly

115 120 125

Trp Val Arg Gln Gln Asn Val Gln Gln Met Pro Ile Ala Thr Ala Met

130 135 140

Ala Gly Val Asn Met Arg Leu Glu Ser Gly Ala Ile Arg Glu Leu His

145 150 155 160

Trp His Gln Thr Ala Glu Trp Ala Tyr Val Leu Ser Gly Ser Thr Gln

165 170 175

Ile Ser Ser Val Asp Gln Leu Gly Arg Asn Tyr Val Ala Thr Val Arg

180 185 190

Gln Gly Asp Leu Trp Tyr Phe Pro Pro Gly Ile Pro His Ser Leu Gln

195 200 205

Ala Thr Asn Asp Ser Ser Glu Gly Thr Glu Phe Leu Leu Ile Phe Pro

210 215 220

Asp Gly Asn Phe Asn Asp Asp Asp Thr Leu Leu Leu Thr Asp Trp Leu

225 230 235 240

Ala His Thr Pro Lys Glu Val Ile Ala Lys Asn Phe Gln Asp Asn Ile

245 250 255

Ala Asp Trp Asp Asp Ile Pro Gly Ser Gln Leu Tyr Ile Phe Pro Gly

260 265 270

Val Pro Pro Pro Asp Asn Gln Gln Pro Pro Thr Ser Pro Ala Gly Glu

275 280 285

Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr Ala Phe Ser Glu Ile Thr Pro Thr Gln

290 295 300

Tyr Thr Gly Gly Thr Ala Lys Ile Ala Asp Ser Thr Thr Phe Lys Val

305 310 315 320

Ala Thr Lys Ile Ala Val Ala Glu Val Thr Val Glu Pro Gly Ala Met

325 330 335

Arg Glu Met His Trp His Pro Thr Gln Ser Glu Trp Gly Phe Phe Leu

340 345 350

Glu Gly Thr Ala Arg Val Thr Leu Phe Ala Gly Thr Ala Ile Ala Gln

355 360 365

Thr Phe Asp Tyr Gln Pro Gly Asp Ile Ser Tyr Ile Pro Thr Ala Tyr

370 375 380

Gly His Tyr Val Glu Asn Thr Gly Asn Thr Thr Leu Lys Phe Leu Glu

385 390 395 400

Ile Phe Asn Ser Asp Val Phe Gln Asp Val Ser Leu Ala Gln Trp Leu

405 410 415

Ala Leu Thr Pro Pro Ala Leu Val Lys Gln His Leu Gln Leu Ser Asp

420 425 430

Ala Thr Ile Ser Arg Phe Asn Arg Thr Lys Gly Val Val Val Gly Gly

435 440 445

Pro Gly Ala Asn Val Ser Ser

450 455

<210> 7

<211> 440

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Arg Arg Gln Leu Val Thr Arg Leu Gln Ser Leu Val Val Ala Ala

1 5 10 15

Val Cys Ala Ala Ser Val Thr Ala Ile Pro Leu Ala Pro Ser Leu Thr

20 25 30

Glu Ser Ala Pro Ala Tyr Pro Ser Pro Thr Val Pro Tyr Ala Thr Asp

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50 55 60

Pro Ile Arg Gly Thr Leu Gly Ala Asp Ile Ile Ala Gln Gln Asn Val

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Pro Leu Gln Leu Gln Asn Ser Asp Leu Leu Ala Pro Pro Thr Thr Asp

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100 105 110

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115 120 125

Pro Ile Ser Thr Glu Met Ala Gly Val Asp Met Arg Leu Glu Ala Gly

130 135 140

Ala Ile Arg Glu Leu His Trp His Thr Ala Ala Glu Trp Ala Tyr Val

145 150 155 160

Leu Lys Gly Ser Thr Gln Val Ser Thr Val Thr Pro Asp Gly Gln Asn

165 170 175

Tyr Val Ala Thr Ala Asn Gln Gly Asp Leu Trp Tyr Phe Pro Pro Gly

180 185 190

Gln Pro His Ser Leu Gln Ala Thr Ala Gln Asp Pro Asp Gly Thr Glu

195 200 205

Phe Leu Leu Val Phe Asp Asn Gly Glu Phe Ser Glu Asp Ser Thr Phe

210 215 220

Leu Leu Thr Asp Trp Leu Ala His Val Pro Lys Glu Val Leu Val Arg

225 230 235 240

Asn Phe Gln Ala Thr Lys Ser Ala Phe Asp His Ile Pro Asp Arg Glu

245 250 255

Leu Tyr Ile Phe Pro Gly Val Pro Pro Asp Pro Asn Ala Gln Pro Pro

260 265 270

Ser Ser Pro Gln Gly Gln Thr Pro Leu Pro Tyr Thr Phe Pro Leu Ser

275 280 285

Gln Val Glu Ala Thr Lys Phe Pro Gly Gly Thr Thr Lys Ile Val Asp

290 295 300

Ser Thr Thr Phe Lys Val Ser Lys Thr Met Ala Val Ala Glu Val Thr

305 310 315 320

Leu Glu Pro Gly Ala Met Arg Glu Leu His Trp His Pro Thr Gln Thr

325 330 335

Glu Trp Asp Tyr Phe Met Ser Gly Tyr Ala Arg Val Thr Val Phe Ala

340 345 350

Ala Asn Ala Asp Ala Arg Thr Phe Asp Phe Gln Ala Gly Asp Ile Gly

355 360 365

Tyr Ile Pro Gln Ser Tyr Gly His Tyr Ile Glu Asn Thr Gly Asn Thr

370 375 380

Thr Leu His Phe Leu Glu Ile Leu Lys Thr Asp Ile Asp Lys Phe Gln

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Asp Val Ser Leu Ala Gln Trp Leu Ala Leu Thr Pro Pro Ala Val Val

405 410 415

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<210> 8

<211> 472

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Lys Pro Ser Thr Leu Tyr Ser Ser Leu Pro Trp Val Ile Thr Ser

1 5 10 15

Leu Leu Thr Val Ala Val His Gly Ala Pro Thr Gly Thr Lys Ser Asn

20 25 30

Pro Pro Leu Arg Gly Ser Glu Asn Leu Leu Gly Tyr Ser Ala Ser Asn

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65 70 75 80

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85 90 95

Gly Pro Arg Asn Asp Tyr Tyr Asp Arg Ile Asn Ser Asp Lys Leu Ala

100 105 110

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165 170 175

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180 185 190

Val Asn Glu Asn Gly Gln Thr Phe Val Asp Asp Val Ser Ala Gly Asp

195 200 205

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210 215 220

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Asp Asn Thr Phe Leu Ala Thr Glu Val Phe Ala His Gln Pro Arg Glu

245 250 255

Val Leu Ala Lys Asn Phe Asp Leu Pro Val Ala Ala Phe Asp Asp Ile

260 265 270

Pro Glu Asp Glu Leu Tyr Ile Phe Pro Gly Thr Pro Ala Pro Gln Asn

275 280 285

Ile Glu Glu Gln Asn Val Thr Gly Ser Ala Gly Val Leu Pro Lys Ser

290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

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Ile His Trp His Pro Ser Ser Asp Glu Trp Thr Phe Phe Ile Ser Gly

355 360 365

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Asp Tyr Arg Pro Gly Asp Val Gly Tyr Phe Pro Gln Ser Asn Ser His

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Leu Asp Arg Leu Lys Thr Glu Lys Met Tyr Val Val Ala Gly Ser Asn

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<210> 9

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgatcagtg tcgcgtcttg cactattgca ctcttgctat cgagtgttgc ctttgccgca 60

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ccatcctcga ttgctgttgc cttatcctct accgcaaccg tccctttcat cgacctgaat 240

ccaaatggcc ctttatggga tccctccgtc agtggggttc ctcaggccga aagaggttct 300

ctaggggcaa ccatcatggg cccgacagac gtcgacacta ctaaggccaa ccccgatctt 360

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agccacaacc gccttcagac tggaggctgg gctcgcgagc agaacatcgg cgccatgccc 480

attgccacag aaatggccag cgttaacatg agactcgagc ctggcgctat tcgcgaactt 540

cactggcaca agactgcaga gtgggcatat gttctcaagg gcaacaccca agtcactgca 600

gtcgatcaga atggaaagaa cttcattggc actgtgggcc ctggtgatct ttggtacttc 660

ccgcctggca taccccactc tcttcaagca acaggcgacg acccagaggg ttctgaattc 720

attctggtct tcgatagtgg tgctttcagc gaagattcga cctttttgct gactgattgg 780

atgtcccacg ttccggtcga agtcctcgca aagaacttcc aaacagatat ctctgcattt 840

gctcgtatac cagccgaaga actctacata ttcccagctg ctgttccgcc tgacagccag 900

caagacccaa ccagccctga aggaactgtt cccaatcctt ttaccttcgc gctatcgaag 960

gttcctccga tgcagctaag cggcggtact gctaagatcg tggactctac cacttttaca 1020

gtatccaaag caatcgcagc ggcggaggtc actatcgaac ccggagctat cagagaactg 1080

cattggcatc ccacacagga cgagtggagc tttttcattg aagggcgtgc gcgaatgacg 1140

attttcgctg cccaatccaa tgcacggact ttcgactatc aggctgggga tattggttac 1200

gttcctgcca cgatgggcca ttacgtcgag aacattggta acaccaccgt gcgttacctt 1260

gaaatattta acacggccgt tttcgaggat atttcgctca gcaattggct tgctttgacc 1320

cctccagaat tagtcaaggc ccaccttggc ttcgatgatg cgaccatggc ccacctggcg 1380

aaggtcaagc caatcgttgt cggtcccgct tag 1413

<210> 10

<211> 1419

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgaaaccat ctactcttta ctcttctcta ccttgggtca tcacgtccct cgtcacggta 60

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gactactacg accggattaa tagcgataag ctggctcctc cgggtacgga caatggccag 360

acgatcaatg cccaatggcc tatgggacta agccataatc ggctgggatt gaacgagtct 420

ggatgggctc ggcaagagaa cgaggtggtg atgccgggcg cgaccgagat ggctggagtg 480

gatatgcgcc tagaagcagg tgcttatcgg gagctgcatt ggcatgtggc atcggaatgg 540

tcgttggtgt tgaacggatc gtgtcggatc gaggccgtca acgagaacgg acaaactttc 600

gtcgatgacg tgagcgctgg tgatgtctgg ttcttccctc ccggtgttcc gcattccatc 660

caagccctcg actcgggcgt cgagtttctc ctcatcttcg atgacggttc cttctctgag 720

gataatactt tcctcgccac tgaagtgttt gcccatcaac cgcgcgaggt cctcgccaaa 780

aacttcgacc tccccgttgc cgctttcgac gacattcccg aagatgaact ttatatcttc 840

cccggcactc cggcaccgca aaacatcgag gagcaaaatg taactggctc tgcaggcgtc 900

ttgcccaagt cccaaagcta ctcgtaccac ttctccgagc agcccgcgca cgaagtgcaa 960

ggcggatccg tcaagatcgt cgactccctc accttcccca tctccaccaa cacggctgcc 1020

gcgctggtga cagtgcaccc aggtggcatg cgtgaaattc attggcaccc aagcagcgat 1080

gaatggacgt tcttcattag tggcaaggca cgcgcgaccc tgttcacggc gcccagcacc 1140

gccacgacgt tcgattaccg cccgggggat gtaggatact tcccacagag caacagccat 1200

tatatcgaga acacaggaga tgaggatctg gttttcttgg aggtgttgca gacggatcaa 1260

ttcagcgaca tctcattggg ccagtggatc ggctccacgc cgaagcagat tgtctcggat 1320

acgctgaacc tgccgcagag tgcgctggat cggttgaaga cggagaagat gtatgtggtg 1380

gctggatcaa atgagacgga tgttgctgct actgcgtag 1419

<210> 11

<211> 1368

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgatacgtc tctcttcatg tctctgtgct ttactcttgg ctacctttgc cgctgctgct 60

cctgcggcat ctgactctgc atctagtgtc cccgcatcga tctcgtccga acacccatct 120

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aaacagaacc cagacttcct ggctccacct acgacagatc atggaagcct cccgaacgca 360

aagtggccct tctctttgag tcacaacagg ttgcaaactg gtggatgggc tcgtcaagag 420

aatactggtg tcatgccgat tgctgaacaa atgtcaagtg tgaacatgag gttagaacct 480

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accacccaaa ttgcggccac agaccctaat ggacggaact atgttgccaa tgttgaaccc 600

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cctccccaga ctgaggatgc tcccaaatcc ccgcagggta ccgtggagaa cccattctct 900

ttcccttttt cgaaagtaaa ggaaactcag ctcgagggtg gcagcgttaa ggtagtcgat 960

tccaccacct tcaagatctc aaagaccatt gcggcggctg aagtaaccgt cgaacctgga 1020

gcaatgcgcg aactccattg gcacccaaca caagacgagt ggagcttctt cctatcgggt 1080

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ggtgatatcg gttacgttcc tggggcaatg ggtcattacg ttgaaaacac tgggaacaca 1200

accctgaggt tccttgagat tttcagagac gacgttttcc aggatgtcag tttgaaccag 1260

tggttggctc ttactccgcc cgagttggtc aaggcgcatc ttggattctc agatgaggtt 1320

atttcgaaac tgactaagaa gaagaaaact gttgtcggac ccgcttaa 1368

<210> 12

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgtttaaca acttccagag attgttgact gttatcttgt tgtccggttt cactgctggt 60

gtcccattgg catccactac tactggtact ggaactgcta ctggtacttc tactgctgct 120

gaaccatctg ctactgttcc tttcgcttcc actgatccaa accctgtttt gtggaacgaa 180

acttccgatc cagctttggt taagccagag agaaaccagt tgggagctac tattcaaggt 240

ccagacaact tgccaatcga cttgcaaaac ccagatttgt tggctccacc aactactgat 300

cacggtttcg ttggtaacgc taagtggcca ttctcattct ccaagcagag attgcaaact 360

ggtggatggg ctagacaaca gaacgaagtt gttttgccat tggctacaaa cttggcttgt 420

acaaacatga gattggaggc tggtgctatt agagaattgc actggcacaa gaacgctgaa 480

tgggcttacg ttttgaaggg ttccactcag atttctgctg ttgacaacga gggtagaaac 540

tacatctcca ctgttggtcc tggtgatttg tggtacttcc caccaggtat tccacattcc 600

ttgcaggcta ctgctgatga tccagaaggt tccgagttca tcttggtttt cgactccggt 660

gctttcaacg atgacggtac tttcttgttg actgattggt tgtcccacgt tccaatggaa 720

gttatcttga agaacttcag agctaagaac cctgctgctt ggtcacatat tccagctcaa 780

cagttgtaca tcttcccatc tgaacctcca gctgataacc aaccagaccc agtttctcca 840

caaggtactg ttccattgcc atactcattc aacttctcat ccgttgagcc aactcaatac 900

tctggtggta ctgctaagat tgctgactcc actactttca acatctccgt tgctattgct 960

gttgctgagg ttacagttga acctggtgct ttgagagagt tgcattggca tccaactgaa 1020

gatgagtgga ctttcttcat ctccggtaac gctagagtta ctatcttcgc tgctcaatcc 1080

gttgcttcca ctttcgatta ccagggtggt gacattgctt acgttccagc ttctatggga 1140

cactacgttg agaacatcgg taacactact ttgacttact tggaggtttt caacactgac 1200

agattcgctg acgtttcttt gtctcagtgg cttgctttga ctccaccatc tgttgttcag 1260

gctcacttga acttggacga cgaaactttg gctgagttga agcagtttgc tactaaggct 1320

actgttgttg gtccagttaa ctaa 1344

<210> 13

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgattagct ttgcctcttg tgtttgtgcg cttctctttg cacggttggc tctttcagca 60

cctgcacctg ctgcgtcgtc ttccgcacct actgtgagca cggtgtcttc agtcattgca 120

ccaatcagcc ccaccgccga aagttcagtt gctgcctcca gtgcctcaaa caaacctcgt 180

ccaacctcga cggcgactgc cacggaaccg actgcaacgg tgcctttcat tgacctcgac 240

cctaatgagc cgctttggaa cgaggacact cctggaatcc atcaaccaat tcatggctca 300

cttggagcca agcttctcgg accgacaaac aacgcgatcg tcaagcagaa ccccgactta 360

ctcgctcctc ccaccactga tcacggcagc gtacccaatg ccaaatggcc tttcagtctt 420

agtcataatc gactccaaac tggaggctgg gcgcgtgaag aaaatattgc tgtaatgcct 480

gtcgcccagg ctatggccag tgtcaacatg cgccttgaag ctggtgcagt aagagaactc 540

cactggcata agactgcaga gtgggcatat gttctgaagg gctccaccca agtcacagcc 600

gtggatgccg atgggcgtaa cttcgtctcc accgttggcc ctggtgacct ttggtacttc 660

ccacctggta tccctcattc acttcaagca acgaatgacg accctgatgg ttctgagttc 720

gtcttggtct tcgactcagg ctcttttagt gaagattcaa cgttcttgct aactgattgg 780

ttggatcacg ttccagctga agtattggcc aaaaatttcc aagtcaacat ctctgccttc 840

gcacacattc ctgctgagga actctacatt ttccccgctg cactgccgga gcctgatagc 900

gctgctccga aaagtccgca aggcactgtc cctgatccat tttcattttc aatgtcaaag 960

gtcaagccca cccagctgac gggaggcacc gtcaaggttg tggattccac taccttcaag 1020

atctccaaga ctattgccgc tgcagaggtc actgttgaac caggtgcaat tagggagctc 1080

cattggcacc cgactcaaga cgaatggagt ttctttattg agggtgaagg tcgaatgacc 1140

attttcgcct cgcagtccaa tgcccgaacg ttcaactatc aggctggtga tatcggctat 1200

gttcccgcaa ccatggggca ttacctcgag aacaccggca acacgacact aaggttcctg 1260

gagattttca agtccgagaa attccaggat atcagtttgg ctcagtggct tgcattgacc 1320

cctccaaaat tggtcaaaga gcatttaggt ttctctgacg acgtcattgc tcggctttcg 1380

aagactaagc ttaccgtggt tggtccgaag tga 1413

<210> 14

<211> 1368

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgggaaagt tcttggctac tgttttgtgt gctgttttgt acggttcttt ggctgctgct 60

attccagttg gtgacgtttc tgcttcttct tctgcatcat catctattgc tgaggctgct 120

acttctactt ctggtggtgc ttctccatct ccaactgttc cattggcttc cgatgatcct 180

aactactggt tgtggaacga gactactact actgacccac aaccagaaag aggatccttg 240

ggagctaaca ttttgggtcc acagaacgtt gctatcgaca agcaaaaccc agacattttg 300

gctccaccaa ctactgatca gggtactgtt ggtaacgcta agtggccatt ctctttgtcc 360

aagcagcagt tgaatactgg tggatgggtt agacaacaga acgttcagca gatgccaatt 420

gctactgcta tggctggtgt taacatgaga ttggagtccg gtgctattag agaattgcac 480

tggcaccaaa ctgctgaatg ggcttacgtt ttgtccggtt ccactcagat ttcttccgtt 540

gaccagttgg gtagaaacta cgttgctact gttagacagg gagacttgtg gtactttcca 600

ccaggtatcc cacattcctt gcaggctact aatgactctt ctgagggtac tgagttcttg 660

ttgatcttcc cagacggtaa cttcaacgac gacgacactt tgttgttgac tgactggctt 720

gctcacactc caaaagaggt tatcgctaag aacttccagg acaacattgc tgattgggac 780

gacattccag gttcccagtt gtacatcttc ccaggtgttc caccaccaga taaccaacaa 840

ccaccaactt ctccagctgg tgaaattcca cagccattct cttacgcttt ctccgagatc 900

actccaactc aatacactgg tggtactgct aagattgctg actccactac tttcaaagtt 960

gctactaaga tcgctgttgc tgaggttaca gttgaaccag gtgctatgag agagatgcat 1020

tggcatccta ctcaatctga gtggggattc ttcttggaag gtactgctag agttactttg 1080

ttcgctggta ctgctattgc tcagactttc gactaccaac caggtgacat ttcctacatc 1140

ccaactgctt acggtcacta cgttgagaac actggtaaca ctactttgaa gttcttggag 1200

atcttcaact ccgacgtttt ccaagacgtt tccttggctc aatggcttgc tttgactcct 1260

ccagctttgg ttaagcagca cttgcaattg tccgacgcta ctatctccag attcaacaga 1320

actaagggtg ttgttgttgg tggtccaggt gctaacgttt catcctaa 1368

<210> 15

<211> 1323

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgagaagac agttggttac tagattgcag tccttggttg ttgctgctgt ttgtgctgct 60

tccgttactg ctattccatt ggctccatcc ttgactgaat ctgctccagc ttacccatct 120

ccaactgttc catacgctac tgacgaccca aacagagaat tgtggaaccc attgtccaac 180

gttgacccac aaccaatcag aggaactttg ggtgctgaca ttatcgctca acagaacgtt 240

ccattgcagt tgcaaaactc cgatttgttg gctccaccaa ctactgatca cggttccgtt 300

ccaaacatta agtggccatt cactttgtcc cacaacagat tgcatactgg tggatgggct 360

agacaacaaa acatccacga cttgccaatt tctactgaga tggctggtgt tgacatgaga 420

ttggaggctg gtgctattag agaattgcac tggcacactg ctgctgaatg ggcttacgtt 480

ttgaagggtt ccactcaggt ttccactgtt actccagacg gacagaacta cgttgctact 540

gctaaccagg gagacttgtg gtattttcca ccaggtcaac cacattcctt gcaagctact 600

gctcaagatc cagacggtac tgagttcttg ttggttttcg acaacggtga attctctgag 660

gactccactt tcttgttgac tgactggctt gctcacgttc caaaagaggt tcttgttaga 720

aacttccagg ctactaagtc tgctttcgac cacattccag acagagagtt gtacatcttc 780

ccaggtgttc caccagatcc aaacgctcaa ccaccatctt ctccacaagg acagactcca 840

ttgccataca ctttcccatt gtcccaagtt gaggctacta aattcccagg tggtactact 900

aagatcgttg actccactac tttcaaggtt tcaaagacta tggctgttgc tgaggttaca 960

ttggaaccag gtgctatgag agagttgcat tggcatccaa ctcaaactga gtgggactac 1020

ttcatgtctg gttacgctag agttactgtt ttcgctgcta atgctgacgc tagaactttc 1080

gacttccagg ctggtgacat tggttacatc ccacaatcct acggtcacta catcgagaac 1140

actggtaaca ctactttgca ctttttggag atcttgaaaa ctgacatcga caagttccag 1200

gacgtttctt tggctcaatg gcttgctttg actcctccag ctgttgttaa ggctcacttg 1260

gatgtttccg acgacactat tgctgctttc tccaagacta agcagagaat cgttggtaaa 1320

taa 1323

<210> 16

<211> 1419

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atgaaaccat ctacacttta ctcttctcta ccttgggtca tcacgtccct cctcacggta 60

gctgttcatg gcgctcctac agggacgaag tcgaaccctc ccctacgagg ctccgagaac 120

ttgctgggtt actcggcctc caacaccgtg acggaccagt ccaccgatga gatcccttat 180

gtgccggtgc caggacagac cgatgccgct gacctcggcg tgtacttgga ctttgaagat 240

atcgagaacc cgcaaccggt ccgcggaagc acgggaggaa ctgaccctgg acctcgcaac 300

gactactacg atcggattaa tagcgataag ctggctcctc cgggtacgga caatggccag 360

acgatcaatg cccaatggcc tatgggacta agccataatc ggctgggatt gaacgagtct 420

ggatgggctc ggcaagagaa cgaggtggtg atgccgggcg cgaccgagat ggctggagtg 480

gatatgcgcc tagaagcagg tgcttatcgg gagctgcatt ggcatgtggc atcggaatgg 540

tcgttggtgt tgaacggatc gtgtcggatc gaggccgtca acgagaacgg acaaactttc 600

gtcgatgacg tgagcgctgg tgatgtctgg ttcttccctc ccggtgttcc gcattccatc 660

caagccctag actcgggcgt cgagtttctc ctcatctttg atgacggttc cttctctgag 720

gataatactt tcctcgccac tgaagtgttt gcccatcaac cgcgcgaagt cctcgccaaa 780

aacttcgacc tccccgttgc cgctttcgac gacattcccg aagatgaact ttatatcttc 840

cccggcactc cggcaccgca gaacatcgag gagcaaaatg taactggctc cgcaggcgtc 900

ttgcccaagt cccaaagcta ctcgtaccac ttctccgagc agcccgcgca cgaagtgcaa 960

ggcggatccg tcaagatcgt cgactcgctc accttcccca tctccaccaa cacggctgcc 1020

gcgctggtga cagtgcaccc aggtggcatg cgcgaaatcc attggcaccc aagcagcgat 1080

gaatggacgt tcttcatcag tggcaaggca cgcgcgaccc tattcacggc gcccagcacc 1140

gccacgacgt tcgattaccg cccgggtgat gtaggatact tcccgcagag caacagtcat 1200

tacattgaga acacgggaga tgaggatctg gtcttcttgg aggtgttgca gacggaacaa 1260

ttcagcgaca tctcattggg ccagtggatc ggctccacgc cgaagcagat cgtctcggat 1320

acgctgaacc tgccgcagag tgcgctggat cggttgaaga cggagaagat gtatgtggtg 1380

gctggatcaa atgagacgga tgttgctgct actgcgtag 1419

<210> 17

<211> 1356

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcccccgccc ccagcagcgc cgccagcagc atcgtcgtca gcgccaccag cagcagcacc 60

gtcagcagcg cccccgtcag cgtcagcagc ttcctcccca ccaccagcat cgccgccgcc 120

acccccagca gcatcgccgt cgccctcagc agcaccgcca ccgtcccctt catcgacctc 180

aaccccaacg gccccctctg ggaccccagc gtcagcggcg tcccccaggc cgagcgcggc 240

agcctcggcg ccaccatcat gggccccacc gacgtcgaca ccaccaaggc caaccccgac 300

ctcctcgccc cccctaccac cgaccacggc tctgtcgaca acgccaagtg ggccttttct 360

ctctctcaca accgactcca gaccggcggc tgggcccgag agcagaacat tggcgccatg 420

cctattgcca ccgagatggc ctctgtcaac atgcgactcg agcctggcgc cattcgagag 480

ctccactggc acaagaccgc cgagtgggcc tacgtcctca agggcaacac ccaggtcacc 540

gccgtcgacc agaacggcaa gaactttatt ggcaccgtcg gccctggcga cctctggtac 600

tttcctcctg gcattcctca ctctctccag gccaccggcg acgaccctga gggctctgag 660

tttattctcg tctttgactc tggcgccttt tctgaggact ctacctttct cctcaccgac 720

tggatgtctc acgtccctgt cgaggtcctc gccaagaact ttcagaccga catttctgcc 780

tttgcccgaa ttcctgccga ggagctctac atttttcctg ccgccgtccc tcctgactct 840

cagcaggacc ctacctctcc tgagggcacc gtccctaacc cttttacctt tgccctctct 900

aaggtccctc ctatgcagct ctctggcggc accgccaaga ttgtcgactc taccaccttt 960

accgtctcta aggccattgc cgccgccgag gtcaccattg agcctggcgc cattcgagag 1020

ctccactggc accctaccca ggacgagtgg tcttttttta ttgagggccg agcccgaatg 1080

accatttttg ccgcccagtc taacgcccga acctttgact accaggccgg cgacattggc 1140

tacgtccctg ccaccatggg ccactacgtc gagaacattg gcaacaccac cgtccgatac 1200

ctcgagattt ttaacaccgc cgtctttgag gacatttctc tctctaactg gctcgccctc 1260

acccctcctg agctcgtcaa ggcccacctc ggctttgacg acgccaccat ggcccacctc 1320

gccaaggtca agcctattgt cgtcggccct gcctaa 1356

Claims (23)

1.一种重组草酸脱羧酶，其特征在于：通过丝状真菌宿主细胞重组表达，致使重组草酸脱羧酶的糖基化修饰形式和程度不同于原始宿主细胞表达的草酸脱羧酶，所述重组草酸脱羧酶具有丝状真菌宿主细胞特有的糖基化修饰形式和程度。

2.根据权利要求1所述的重组草酸脱羧酶，其特征在于，所述重组草酸脱羧酶在pH值1.5-7.0的条件下保持其全部或部分酶活力，且在pH值1.5-2.5的条件下保持不低于其在最适pH条件下酶活力的10％，在pH值2.5-4.5的条件下保持不低于其在最适pH条件下酶活力的50％，在pH值4.5-7.0的条件下保持不低于其在最适pH条件下酶活力的25％。

3.根据权利要求1所述的重组草酸脱羧酶，其特征在于，所述重组草酸脱羧酶的最适pH值为2.5-3.5。

4.根据权利要求1所述的重组草酸脱羧酶，其特征在于，所述重组草酸脱羧酶编码基因来源于真核生物，所述真核生物为茶树菇(Agrocybe aegirit)、杨树菇(AgrocybeCylindracea)、金针菇(Flammulina velutipes)、云芝(Coriolus versicolor)，褐腐菌(Postiaplacenta)、琉球曲霉(Aspergillus luchuensis)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)或金福菇(Tricholoma LobayenscHeim)等真菌。

5.根据权利要求1-4所述的重组草酸脱羧酶，其特征在于，所述重组草酸脱羧酶的氨基酸序列与SEQID NO.1或SEQ ID NO.5的第20～470位氨基酸序列、或SEQ ID NO.2的第25～472位氨基酸序列、或SEQ ID NO.3的第20～455位氨基酸序列、或SEQ ID NO.4的第21～447位氨基酸序列、或SEQ ID NO.6的第21～455的氨基酸序列、或SEQ ID NO.7的第25～440位氨基酸序列、SEQ ID NO.8的第24～472的氨基酸序列具有至少60％同一性，优选至少65％同一性、至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、或至少95％同一性。

6.根据权利要求1-5所述的重组草酸脱羧酶，其特征在于，所述重组草酸脱羧酶的氨基酸序列由SEQID NO.1或SEQ ID NO.5的第20～470位氨基酸序列、或SEQ ID NO.2的第25～472位氨基酸序列、或SEQ ID NO.3的第20～455位氨基酸序列、或SEQ ID NO.4的第21～447位氨基酸序列、或SEQ ID NO.6的第21～455的氨基酸序列、或SEQ ID NO.7的第25～440位氨基酸序列、SEQ ID NO.8的第24～472的氨基酸序列构成。

7.一种重组丝状真菌宿主细胞，其特征在于，所述重组丝状真菌宿主细胞的染色体DNA中包含编码权利要求1-6中任一项所述的草酸脱羧酶基因序列。

8.根据权利要求7所述的重组丝状真菌宿主细胞，其特征在于，所述丝状真菌为曲霉属(Aspergillus)、革盖菌属(Coriolus)、毛霉属(Mucor)、白腐菌属(Phlebia)、枝顶孢属(Acremonium)、隐球菌属(Cryptococcus)、镰孢霉属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毁丝霉属(Myceliophthora)、短梗霉属(Aureobasidium)、栓菌属(Trametes)、侧耳属(Pleurotus)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、拟青霉属(Paecilomyces)、平革菌属(Phanerochaete)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、梭孢壳属(Thielavia)、金孢子菌属(Chrysosporium)、裂褶菌属(Schizophyllum)、鬼伞属(Coprinus)、稻瘟菌属(Magnaporthe)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、弯颈霉属(Tolypocladium)踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)或木霉属(Trichoderma)等真菌。

9.根据权利要求7所述的重组丝状真菌宿主细胞，其特征在于，所述丝状真菌为曲霉属的黑曲霉(A.niger)、构巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉(A.oryzae)或泡盛曲霉(A.awamori)菌株。

10.根据权利要求7所述的重组丝状真菌宿主细胞，其特征在于，所述丝状真菌为木霉属的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(T.koningii)、里氏木霉(T.reesei)、长梗木霉(T.longibrachiatum)或绿色木霉(T.viride)菌株。

11.根据权利要求7所述的重组丝状真菌宿主细胞，其特征在于，所述丝状真菌为里氏木霉。

12.根据权利要求7-11任一所述的重组丝状真菌宿主细胞，其特征在于，所述草酸脱羧酶编码基因的核苷酸序列中至少10％的碱基根据丝状真菌宿主细胞密码子偏爱性进行了密码子优化。

13.根据权利要求12所述的重组丝状真菌宿主细胞，其特征在于，所述核苷酸序列选自SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16的核酸序列；或与SEQ ID NO.9-16中任一具有至少50％同一性，优选至少60％同一性、至少70％同一性、至少80％同一性或至少90％同一性的序列。

14.一种构建权利要求7-12任一所述的重组丝状真菌宿主细胞的方法，其特征在于，所述重组丝状真菌宿主细胞包含一个或多个拷贝的整合在其基因组中的草酸脱羧酶表达盒，所述草酸脱羧酶表达盒包括启动子、信号肽编码序列、草酸脱羧酶编码基因和终止子，所述方法包括如下步骤：

S1：构建至少一个整合型表达载体，所述整合型表达载体包括选择标记基因表达盒和草酸脱羧酶表达盒。

S2:整合型表达载体在转化丝状真菌宿主细胞后，通过筛选获得含有一个拷贝或多个拷贝草酸脱羧酶表达盒的重组丝状真菌宿主细胞。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，其中步骤S2中所述的丝状真菌宿主细胞为人工构建的营养缺陷型细胞，所述整合型表达载体在整合进所述丝状真菌宿主细胞基因组中时能修复该类型营养缺陷。

16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，在转化丝状真菌宿主细胞后，所述整合型表达载体通过非同源重组而随机整合进丝状真菌宿主细胞基因组中。

17.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的整合型表达载体包含与丝状真菌宿主细胞基因组中特异性基因座一定长度核苷酸序列同源的5’端同源臂和3’端同源臂，从而在转化丝状真菌宿主细胞后所述整合型表达载体能通过同源重组的方式整合进基因组特定的位点；优选整合进编码胞外蛋白的基因中；更优选整合进编码胞外蛋白酶类或编码胞外糖苷水解酶类的基因中，最优选地整合进CBH1、CBH2、EG1或EG2基因中。

18.一种培养基，适用于权利要求16所述方法制备的宿主细胞的培养，其特征在于，组成为：葡萄糖3-8g/L，微晶纤维素10-25g/L，玉米浆粉5-15g/L，(NH₄)₂SO₄0.5-5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.56g/L、CaCl₂0.5g/L，KH₂PO₄2-8g/L，尿素0-1g/L，麸皮粉0.2-2g/L，Mandels微量元素(1000X)1ml，MnCl₂0.5-5mM，pH 3.0-4.5。

19.一种培养基，适用于权利要求17方法制备的宿主细胞的培养，其特征在于，组成为：葡萄糖3-6g/L，乳糖30-40g/L，玉米浆粉7-10g/L，(NH₄)₂SO₄0.5-1g/L，MgSO₄·7H₂O 1.56g/L、CaCl₂0.5g/L，KH₂PO₄2-4g/L，尿素0-1g/L，麸皮粉10-20g/L，Mandels微量元素(1000X)1ml，MnCl₂0.5-5mM，pH 3.5-4.0。

20.一种生产重组草酸脱羧酶的方法，其特征在于，构建含有启动子、信号肽编码序列、草酸脱羧酶编码基因和终止子的草酸脱羧酶表达盒，通过表达载体转入丝状真菌宿主细胞，使宿主细胞基因组中整合一个或多个草酸脱羧酶表达盒，培养宿主细胞表达草酸脱羧酶，最后从宿主细胞培养基质中分离纯化表达产物。

21.权利要求1-6任一所述的重组草酸脱羧酶或权利要求7-13所述的重组丝状真菌宿主细胞培养后分泌表达的草酸脱羧酶在制备药物、食品中的应用。

22.根据权利要求21所述的应用，所述药物为预防和/或治疗泌尿系结石的药物。

23.一种药物组合物，用于预防或治疗尿草酸过多的疾病，其特征在于：其包含有如权利要求20方法制备的草酸脱羧酶。