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CN108531643B - 一种用于鉴定西瓜品种苏蜜6号种子纯度的rapd引物及其应用 - Google Patents

一种用于鉴定西瓜品种苏蜜6号种子纯度的rapd引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定西瓜品种苏蜜6号种子纯度的RAPD引物，包括引物JAASRP1059和JAASCR1036，引物JAASRP1059的序列为5'‑GTTGCCAGCC‑3'；引物JAASCR1036的序列为5'‑GTGACGTAGG‑3'。利用该RAPD引物能鉴定苏蜜6号种子纯度，首先提取苏蜜6号DNA，采用RAPD引物JAASRP1059和JAASCR1036，以西瓜杂交种苏蜜6号种子基因组DNA为模板进行PCR扩增；将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。通过比较DNA片段序列差异形成的多态性扩增片段及电泳图谱的位置差异，可以鉴定苏蜜6号遗传纯度，鉴定结果快速稳定可靠，而且操作简单方便。

Description

一种用于鉴定西瓜品种苏蜜6号种子纯度的RAPD引物及其 应用
技术领域
本发明涉及一种用于鉴定西瓜品种种子纯度的RAPD引物及其应用，尤其是一种用于鉴定西瓜品种苏蜜6号种子纯度的RAPD引物及其应用，属于作物育种技术领域。
背景技术
西瓜为葫芦科葫芦属一年生草本植物，是重要的世界性园艺作物。我国是西瓜生产大国，其种植面积和产量均居世界第一位。目前国内市场上西瓜新品种已实现了100％的杂交种，西瓜种子质量与西瓜产业的发展密切相关，也直接影响瓜农们的经济效益。但在西瓜杂种制种过程中，由于昆虫或风媒传粉等原因，导致母本系自交的种子常混杂于F1中，导致种子质量不合格，给企业和农户造成巨大的经济损失。因此，西瓜品种种子纯度对种植者来说是必需保证的。
西瓜品种‘苏蜜6号’是江苏省农科院蔬菜研究所以自交系20-207为母本，以自交系20-WS-3-1为父本配制而成的杂种一代西瓜。早熟，果实发育期30d；植株长势中等，耐低温弱光，坐果性强；果实高圆球形，果皮底色墨绿，覆深绿色网纹，果皮厚0.9cm，单瓜质量3.3kg；中心可溶性固形物含量11.8％，瓜瓤粉红色，瓤质酥，纤维含量少，水分足，口感风味佳；一般667m2产量约3500kg；适于华东地区作保护地早熟栽培。为保证优良品种产生最大的经济效益，需要一种快速、准确、稳定的检测方法进行西瓜品种‘苏蜜6号’的鉴定。
目前，传统的西瓜杂交种子纯度鉴定方法主要靠田间种植鉴定，依据品种特异性(DUS)测试，即通过测试品种的特异性、一致性和稳定性来评判，而西瓜DUS测试的性状大部分都是受多基因控制的数量性状，易受栽培条件和气候条件的影响，且所需时间较长，测试结果不稳定、费工费时。
发明内容
本发明的目的在于为了解决现有技术西瓜品种种子纯度的鉴定方法耗时长、费时费力、稳定性差的问题，提供了一种用于鉴定西瓜品种苏蜜6号种子纯度的RAPD引物，利用其能快速鉴定西瓜品种苏蜜6号种子纯度，鉴定结果稳定可靠，操作简单方便。
技术方案
一种用于鉴定西瓜品种苏蜜6号种子纯度的RAPD引物，包括引物JAASRP1059和引物JAASCR1036，所述引物JAASRP1059的核苷酸序列为5'-GTTGCCAGCC-3'；所述引物JAASCR1036的核苷酸序列为5'-GTGACGTAGG-3'。
上述引物在鉴定西瓜品种苏蜜6号种子纯度方面的应用。所述应用包括如下步骤：
应用方法：
(1)提取西瓜品种苏蜜6号的基因组DNA；
(2)以西瓜品种苏蜜6号的基因组DNA为模板，分别利用引物JAASRP1059和JAASCR1036，进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
(4)对电泳结果进行分析，以父母本样品DNA的特异标记作为对照，只有同时具有亲本特异标记的单株才可确定为苏蜜6号杂交种，否则为杂种。
进一步，步骤(1)中，基因组DNA的提取方法为：在西瓜品种苏蜜6号两叶一心时取幼嫩叶片1.5-3.5g，经液氮研磨，用CTAB裂解液(2％CTAB，2M NaCl，20mM EDTA，100mMTris-HCl(pH＝8.0)与0.2％的-巯基乙醇)转入1.5mL离心管中，65℃水浴0.5～1h后取出冷却，加入等体积的体积比为24:1的氯仿与异戊醇的混合物，轻轻摇晃20～30min后，12000r/min离心8～10min，取上清液用体积比为24:1的氯仿与异戊醇的混合物抽提1～2次，加入10％醋酸钠和预冷的异丙醇，4℃冰箱静置3h以上，收集絮状DNA，用70％乙醇洗涤后干燥，溶于TE(1mL 1mol/L Tris·Hcl(PH8.0),0.2mL 0.5mol/L EDTA(PH8.0)，加ddH2O定容至100mL)中，4℃保存备用。
步骤(2)中，所述PCR扩增按RAPD引物JAASRP1059和JAASCR1036分两组同时进行或先后进行，除了采用的引物不同，反应体系和反应程序都相同。进一步，步骤(2)中，PCR扩增的反应体系为18uL，其中含：20ng基因组DNA,2.0mmol·L-1MgCl2，0.15mmol·L-1dNTPs，0.44umol·L-110 RAPD引物JAASRP1059或JAASCR1036，0.75U Taq DNA聚合酶。
进一步，步骤(2)中，PCR扩增的反应程序为：94℃2min，94℃30s，37℃45s，72℃90s，40个循环，72℃10min延伸。
进一步，步骤(3)中，琼脂糖凝胶电泳检测的电压为120V，电泳时间为0.5-1h。
进一步，步骤(4)中，所述父母本样品DNA的特异标记是指：利用RAPD引物JAASRP1059扩增时，产生大小分别为350bp和450bp的母本特异标记，利用RAPD引物JAASCR1036扩增时，产生大小分别为875bp和1800bp的父本特异标记，只有同时具有亲本特异标记的单株才为真正的苏蜜6号杂交种。
有益效果：本发明提供了用于鉴定西瓜品种苏蜜6号种子纯度的RAPD引物，并利用其进行PCR扩增，通过鉴别西瓜品种‘苏蜜6号’单株中父母本特异条带的有无，计算出种子的遗传纯度。本发明的检测方法，具有快速、准确的优点，有益于提高西瓜种子的质量控制进程。
附图说明
图1是西瓜品种苏蜜6号及其亲本的DNA片段的电泳图，其中图1a采用的是RAPD引物JAASRP1059，图1b采用的是RAPD引物JAASCR1036。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种用于鉴定西瓜品种苏蜜6号种子纯度的RAPD引物，包括引物JAASRP1059和引物JAASCR1036，所述引物JAASRP1059的核苷酸序列为5'-GTTGCCAGCC-3'；所述引物JAASCR1036的核苷酸序列为5'-GTGACGTAGG-3'。引物由擎科生物科技有限公司合成。
利用上述引物在鉴定西瓜品种苏蜜6号种子纯度的方法，包括如下步骤：
(1)提取西瓜品种苏蜜6号的基因组DNA；
基因组DNA的提取方法为：基因组DNA的提取方法为：在西瓜品种苏蜜6号两叶一心时取幼嫩叶片2g，经液氮研磨，用CTAB裂解液(2％CTAB，2M NaCl，20mM EDTA，100mM Tris-HCl(pH＝8.0)与0.2％的-巯基乙醇)转入1.5mL离心管中，65℃水浴0.5～1h后取出冷却，加入等体积的体积比为24:1的氯仿与异戊醇的混合物，轻轻摇晃20～30min后，12000r/min离心8～10min,取上清液用体积比为24:1的氯仿与异戊醇的混合物抽提1～2次，加入10％醋酸钠和预冷的异丙醇，4℃冰箱静置3h以上，收集絮状DNA，用70％乙醇洗涤后干燥，溶于TE(1mL 1mol/L Tris·Hcl(PH8.0),0.2mL 0.5mol/L EDTA(PH8.0)，加ddH2O定容至100mL)中，4℃保存备用。
(2)分别利用RAPD引物JAASRP1059和JAASCR1036，以西瓜品种苏蜜6号的基因组DNA为模板，在美国ABI 2720热循环仪上进行PCR扩增，得到扩增产物；
PCR扩增反应体系为18uL，其中含：20ng基因组DNA,2.0mmol·L-1MgCl2，0.15mmol·L-1dNTPs，0.44umol·L-110RAPD引物JAASRP1059或JAASCR1036，0.75U Taq DNA聚合酶(TAKARA)；
PCR扩增反应程序为：94℃2min，94℃30s，37℃45s，72℃90s，40个循环，72℃10min延伸，后于4℃保存。
(3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
根据DNA定量检测的结果，用H2O稀释PCR扩增产物至200ng/ul备用。TAE电泳缓冲液：50×TAE电泳缓冲液：12.2g Tris,2.85mL冰醋酸，10ml 0.25mol/L EDTA(PH8.0),加水至50mL。
以电泳缓冲液为溶剂，称取1g琼脂糖，加50×TAE电泳缓冲液2mL和98mL蒸馏水，在微波炉上溶解，配成1％的琼脂糖凝胶100mL。稍冷后，加入0.5ug/mLGoldView,混匀；安装好电泳槽和样品梳，灌胶；胶冷却后，在电泳槽内倒入1×TAE电泳缓冲液。连接电极，在120V恒压条件进行电泳，电泳时间为0.5～1h，以扩增的DNA条带充分展开为止。
紫外检测仪上观察并拍照，结果见图1，图1a是西瓜品种苏蜜6号及其亲本DNA片段的RAPD引物JAASRP1059电泳图，图1b是西瓜品种苏蜜6号及其亲本DNA片段的RAPD引物JAASCR1036电泳图，1：母本；2：父本；3：苏蜜6号杂交种；M是DNAmarker。
(4)对电泳结果进行分析，以父母本样品DNA的特异标记作为对照，只有同时具有亲本特异标记的单株才可确定为苏蜜6号杂交种，否则为杂种。

Claims (6)

1.一种RAPD引物在鉴定西瓜品种苏蜜6号种子纯度方面的应用，其特征在于，所述RAPD引物包括引物JAASRP1059和引物JAASCR1036，所述引物JAASRP1059的核苷酸序列为5'-GTTGCCAGCC-3'；所述引物JAASCR1036的核苷酸序列为5'-GTGACGTAGG-3'；所述应用方法包括如下步骤：
(1)提取西瓜品种苏蜜6号的基因组DNA；
(2)以西瓜品种苏蜜6号的基因组DNA为模板，分别利用引物JAASRP1059和JAASCR1036，进行PCR扩增，得到扩增产物；
(3)将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
(4)对电泳结果进行分析，以父母本样品DNA的特异标记作为对照，只有同时具有亲本特异标记的单株才可确定为苏蜜6号杂交种，否则为杂种。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，基因组DNA的提取方法为：在西瓜品种苏蜜6号两叶一心时取幼嫩叶片1.5～3.5g，经液氮研磨，用CTAB裂解液转入1.5mL离心管中，65℃水浴0.5～1h后取出冷却，加入等体积的体积比为24:1的氯仿与异戊醇的混合物，轻轻摇晃20～30min后,12000r/min离心8～10min,取上清液用体积比为24:1的氯仿与异戊醇的混合物抽提1～2次，加入10％醋酸钠和预冷的异丙醇，4℃冰箱静置3h以上，收集絮状DNA，用70％乙醇洗涤后干燥，溶于TE中，4℃保存备用。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增的反应体系为18uL，其中含：20ng基因组DNA,2.0mmol·L-1 MgCl2，0.15mmol·L-1dNTPs，0.44umol·L-1 10 RAPD引物JAASRP1059或JAASCR1036，0.75U Taq DNA聚合酶。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增的反应程序为：94℃2min，94℃30s，37℃45s，72℃90s，40个循环，72℃10min延伸。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，琼脂糖凝胶电泳检测的电压为120V，电泳时间为0.5-1h。
6.如权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于，步骤(4)中，所述父母本样品DNA的特异标记是指：利用RAPD引物JAASRP1059扩增时，产生大小分别为350bp和450bp的母本特异标记，利用RAPD引物JAASCR1036扩增时，产生大小分别为875bp和1800bp的父本特异标记，只有同时具有亲本特异标记的单株才为真正的苏蜜6号杂交种。
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王春晖等.基于ＩＳＳＲ和ＲＡＰＤ标记的八株灰树花栽培菌株遗传多样性分析.《食用菌学报》.2013,第20卷(第4期), *

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