[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN108513584A - 苍白杆菌介导的植物转化 - Google Patents

苍白杆菌介导的植物转化 Download PDF

Info

Publication number
CN108513584A
CN108513584A CN201680051469.5A CN201680051469A CN108513584A CN 108513584 A CN108513584 A CN 108513584A CN 201680051469 A CN201680051469 A CN 201680051469A CN 108513584 A CN108513584 A CN 108513584A
Authority
CN
China
Prior art keywords
anthropi
seq
variant
genes
replication
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201680051469.5A
Other languages
English (en)
Inventor
A.阿南德
S.H.巴斯
S.M.伯泰恩
H-J.乔
A.J.金尼
T.M.克莱恩
M.拉斯纳
K.E.麦布里德
Y.莫伊
B.A.M.罗森
卫俊智
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pioneer Hi Bred International Inc
EIDP Inc
Original Assignee
Pioneer Hi Bred International Inc
EI Du Pont de Nemours and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pioneer Hi Bred International Inc, EI Du Pont de Nemours and Co filed Critical Pioneer Hi Bred International Inc
Publication of CN108513584A publication Critical patent/CN108513584A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明提供了用于苍白杆菌介导的植物转化的方法和组合物。这些方法包括但不限于使用苍白杆菌菌株将目的多核苷酸转移至植物细胞中。这些方法包括VirD2‑依赖性方法。这些组合物包含苍白杆菌菌株、转移DNA、构建体和/或质粒。这些组合物包含具有包含一个或多个毒力基因、边界区和/或复制起点的质粒的苍白杆菌菌株。本发明还提供了由这些方法产生的包含目的多核苷酸的植物细胞、组织、植物和种子。

Description

苍白杆菌介导的植物转化
技术领域
本公开涉及植物生物技术领域。具体而言，本公开涉及使用细菌介导的递送用于生产转基因植物和植物细胞的方法。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年8月28日提交的美国临时申请号62/211267的优先权，该申请以其全文通过引用并入本文中。
对经由EFS-WEB作为文本文件提交的序列表的引用
该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为“20160826_6502WOPCT_SeqList.txt”，创建于2016年8月24日，且具有861KB大小，并与本说明书同时提交。包括在该ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用并入本文。
背景技术
遗传修饰(GM)作物在1997年首次引入，在2014年代表了美国总种植面积的约80％-94％。从世界范围来看，从1996年到2013年，全球GM作物的公顷增加了超过100倍，1996年种植了170万公顷而2013年种植了超过1.75亿公顷。全球有约30个国家已经采用了修饰的作物。许多(如果不是大部分)遗传修饰作物是使用农杆菌介导的转化以整合一个或多个目的性状来产生的。然而，使用农杆菌介导的转化仍然存在许多挑战，这些挑战包括对农杆菌的需要的修饰、一些经济上重要的植物的基因型非依赖性转化、以及持续地获得转基因的可预测和稳定表达的问题。虽然农杆菌已经是细菌介导的植物转化的主要载体，但其对于所有目的植物不是同样有效的。研究表明，其他细菌也可用于植物转化。例如，US7888552 B2描述了使用非农杆菌物种来转化植物。
迄今为止，其他细菌菌株在测试的植物中使用的条件下与农杆菌相比通常具有显著更低的转化效率。因此，需要另外的非农杆菌菌株和方法来转化植物并提高植物转化效率。
发明内容
提供了用于苍白杆菌(Ochrobactrum)介导的植物转化的方法和组合物。所述方法包括但不限于使用苍白杆菌菌株将目的多核苷酸转移至植物细胞中。这些方法包括VirD2-依赖性方法。
组合物包括苍白杆菌菌株、转移DNA、和构建体和/或质粒。这些组合物包括具有包含一个或多个毒力基因、边界区和/或复制起点的质粒的苍白杆菌菌株。还提供了由这些方法产生的包含目的多核苷酸的植物细胞、组织、植物和种子。
本公开的一方面的特征在于：一种分离的海沃德苍白杆菌(Ochrobactrumhaywardense)H1，其中所述苍白杆菌于2015年7月10日被保藏在NRRL B-67078下。
在一方面，所述苍白杆菌还包含：(a)第一核酸，其包含Ti质粒的vir基因区域，其中vir基因区域发挥作用以VirD2依赖性方式将编码目的序列的核酸引入植物细胞中；和(b)第二核酸，其包含与目的序列有效地连接的一个或多个T-DNA边界序列。
在一方面，所述第一核酸和所述第二核酸在单个多核苷酸分子上。
在另一方面，所述第一核酸和所述第二核酸在分离的多核苷酸分子上。
在另一方面，所述苍白杆菌还包含选择性标记。
另一方面的特征在于：一种产生转化的植物细胞的方法，所述方法包括：(a)使植物细胞与包含第一核酸和第二核酸的苍白杆菌接触，其中第一核酸包含Ti质粒的vir基因区域，并且第二核酸包含有效地连接至目的序列上的一个或多个T-DNA边界序列；(b)在允许苍白杆菌将目的序列转移至所述植物细胞的条件下培养所述植物细胞；并且(c)鉴定在其基因组中包含目的序列的转化的植物细胞。
在一方面，所述方法还包括使在其基因组中包含所述目的序列的植物再生。
在一方面，植物细胞来自单子叶植物或双子叶植物。
在一方面，所述植物细胞来自选自由以下组成的组的植物：大豆、烟草、向日葵、拟南芥(Arabidopsis)、红花、苜蓿、玉米、小麦、水稻、高粱、大麦、燕麦、粟、低芥酸菜籽、芸苔属(Brassica)、棉花和甘蔗。
在另一方面，在接触所述植物细胞之前，在乙酰丁香酮或诱导vir基因功能的其他化合物的存在下使所述苍白杆菌生长。
在另一方面，所述植物细胞包含在来自植物种子、幼苗、愈伤组织、细胞悬液、子叶、分生组织、叶、根或茎的外植体中；并且使所述外植体与所述苍白杆菌接触。
在另一方面，所述外植体包含胚分生组织、体细胞分生组织、愈伤组织、细胞悬液、子叶、子叶节，或者包含来自叶、根或茎的组织。
在一方面，所述鉴定包含所述目的序列的植物细胞在不存在选择剂的情况下进行。
在另一方面，所述鉴定包含所述目的序列的植物细胞包括在选择剂的存在下培养所述植物细胞，其中所述目的序列赋予对所述选择剂的耐受性或与赋予对所述选择剂的耐受性的选择性标记共递送。
在另一方面，所述选择剂是草甘膦、卡那霉素、双丙氨膦、2，4-D或麦草畏。
在另一方面，所述目的序列与选择性标记基因没有物理连锁。
在另一方面，所述标记基因和目的序列在从包含目的序列的植物细胞再生的植物的子代中遗传分离。
在另一方面，所述苍白杆菌还包含第三核酸，所述第三核酸包含第二目的序列，并且由此所述经转化的细胞在其基因组中包含所述第二目的序列。
在另一方面，从所述植物细胞使植物再生包括从包含所述植物细胞的外植体诱导形成一个或多个芽并且将至少第一芽培育成完整的可育植物。
在另一方面，再生通过器官发生来发生。
在另一方面，所述苍白杆菌选自由以下组成的组：海沃德苍白杆菌H1、金雀儿苍白杆菌(Ochrobactrum cytisi)、大田苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)、羽扇豆苍白杆菌(Ochrobactrum lupine)、稻苍白杆菌(Ochrobactrum oryzae)、小麦苍白杆菌(Ochrobactrum tritici)、LBNL 124-A-10、HTG3-C-07和牲畜苍白杆菌(Ochrobactrumpecoris)。
在一方面，其中根瘤菌科(Rhizobiaceae)毒力基因r-virF毒力基因具有SEQ IDNO：99或其变体和衍生物。
在一方面，用于在苍白杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自pBBR1复制起点。
本公开的一方面提供了一种分离的海沃德苍白杆菌H1，其中所述苍白杆菌于2015年7月10日被保藏在NRRL B-67078下。
在另一方面，本公开提供了包含载体的海沃德苍白杆菌H1，所述载体包含处于有效连接的：(a)第一核酸，其包含vir基因区域，其中vir基因区域发挥作用以VirD2依赖性方式将编码目的序列的核酸引入植物细胞中；和(b)第二核酸，其包含与目的序列有效地连接的一个或多个T-DNA边界序列。在一方面，所述第一核酸和所述第二核酸在单个多核苷酸分子上。在一方面，所述第一核酸和所述第二核酸在分离的多核苷酸分子上。在一方面，所述苍白杆菌还包含选择性标记基因。在一方面，所述选择性标记基因提供对庆大霉素、新霉素/卡那霉素、潮霉素或壮观霉素的抗性。在一方面，所述选择性标记基因是aacC1基因、npt1基因、npt2基因、hpt基因、SpcN基因、aph基因或aadA基因。在一方面，所述选择性标记基因是aacC1基因。在一方面，所述aacC1基因具有SEQ ID NO：1或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记基因是aadA基因。在一方面，所述aadA基因具有SEQ ID NO：39或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记基因是npt1基因。在一方面，所述npt1基因具有SEQ IDNO：40或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记基因是npt2基因。在一方面，所述npt2基因具有SEQ ID NO：41或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记基因是hpt基因。在一方面，所述hpt基因具有SEQ ID NO：67或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记基因是具有SEQ ID NO：77或其变体和片段的SpcN基因。在一方面，所述选择性标记基因是具有SEQID NO：78或其变体和片段的aph基因。在一方面，所述选择性标记基因不是四环素选择性标记基因。在一方面，所述选择性标记基因不是tetAR基因。在一方面，所述选择性标记基因是反向选择性标记基因。在一方面，所述反向选择性标记基因是sacB基因、rpsL(strA)基因、pheS基因、dhfr(folA)基因、lacY基因、Gata-1基因、ccdB基因、或thyA-基因。在一方面，所述vir基因区域包含分别具有SEQ ID NO：4-14、或其变体和衍生物的根瘤菌科毒力基因virB1-virB11或分别具有SEQ ID NO：80-90、或其变体和衍生物的r-virB1-B11，其中包含所述毒力基因r-virB1-B11的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。在一方面，所述vir基因区域包含分别具有SEQ ID NO：16-17、或其变体和衍生物的根瘤菌科毒力基因virC1-C2或分别具有SEQ ID NO：92-93、或其变体和衍生物的r-virC1-C2，其中包含所述毒力基因r-virC1-C2的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。在一方面，所述vir基因区域包含分别具有SEQ ID NO：18-19、或其变体和衍生物的根瘤菌科毒力基因virD1-D2或分别具有SEQ ID NO：94-95、或其变体和衍生物的r-virD1-D2，其中包含所述毒力基因r-virD1-D2的载体还包含具有SEQ IDNO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。在一方面，所述vir基因区域包含具有SEQID NO：15、或其变体和衍生物的根瘤菌科毒力基因virG或具有SEQ ID NO：91、或其变体和衍生物的r-virG毒力基因，其中包含所述毒力基因r-virG的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。在一方面，所述vir基因区域包含一种或多种根瘤菌科毒力基因virA、virD3、virD4、virD5、virE1、virE2、virE3、virH、virH1、virH2、virK、virL、virM、virP、virQ、r-virA、r-virD3、r-virD4、r-virD5、r-virE3、或r-virF或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virA、r-virD3、r-virD4、r-virD5、r-virE3、或r-virF的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因是具有SEQ ID NO：26、或其变体和衍生物的virA，或具有SEQ IDNO：79、或其变体和衍生物的r-virA毒力基因，其中包含所述毒力基因r-virA的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virD3-D5分别具有SEQ ID NO：20-22、或其变体和衍生物或分别具有SEQ ID NO：96-98、或其变体和衍生物的r-virD3-D5毒力基因，其中包含所述毒力基因r-virD3-D5的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virE1-E3分别具有SEQ ID NO：23-25、或其变体和衍生物或具有SEQ ID NO：100、或其变体和衍生物的r-virE3毒力基因，其中包含所述毒力基因r-virE3的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virH-H1分别具有SEQ ID NO：42-43、或其变体和衍生物。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virK具有SEQ ID NO：45、或其变体和衍生物。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virL具有SEQ ID NO：46、或其变体和片段。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virM具有SEQ ID NO：47、或其变体和片段。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virP具有SEQ ID NO：48、或其变体和片段。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virQ具有SEQ ID NO：49、或其变体和片段。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virD3-D5和virE1-E3、或其变体和片段或r-virD3-D5和r-virE3、或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virD3-D5和r-virE3的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virA、virD3-D5和virE1-E3或其变体和片段，或r-virA、r-virD3-D5和r-virE3或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virA、r-virD3-D5和r-virE3的载体还包含具有SEQ IDNO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。在一方面，所述苍白杆菌还包含用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中繁殖和稳定维持的复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点来自Col E1、pSC101、p15A或R6K复制起点及其变体或衍生物。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自Col E1复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：2、或其变体和片段的ColE1复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自pSC101复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：50、或其变体和片段的pSC101复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自p15A复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：51、或其变体和片段的p15A复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自R6K复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：52、或其变体和片段的R6K复制起点。在一方面，所述苍白杆菌还包含用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌物种中繁殖和稳定维持的复制起点是高拷贝数的复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是中等拷贝数的复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是低拷贝数的复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pRi、pVS1、pRFS1010、pRK2、pSa或pBBR1复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是pRK2复制起点的变体。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pRFS1010复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pVS1复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pSa复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点具有SEQ ID NO：3、37、38、53、57、58、59、60或112或其变体和片段。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是repABC相容性复制起点。在一方面，所述repABC相容性复制起点具有SEQ ID NO：57、58、59或60、或其变体和片段。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点以及用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是相同的复制起点。在一方面，所述复制起点源自pRK2复制起点、pSa复制起点或pRFS1010复制起点。在一方面，所述复制起点源自pRK2复制起点。在一方面，所述pRK2复制起点具有SEQ ID NO：38、或其变体和片段。在一方面，所述复制起点源自pSa复制起点。在一方面，所述pSa复制起点具有SEQ ID NO：53、或其变体和片段。在一方面，所述复制起点源自pRFS1010复制起点。在一方面，所述pRFS1010复制起点具有SEQ ID NO：37、或其变体和片段。在一方面，所述pRK2复制起点是迷你型或微型pRK2复制起点。在一方面，所述pRK2复制起点是微型pRK2复制起点。在一方面，所述微型pRK2复制起点具有SEQ ID NO：54、或其变体和片段。在一方面，所述pRK2复制起点是迷你型pRK2复制起点。在一方面，所述迷你型pRK2具有SEQ ID NO：66、或其变体和片段。在一方面，所述pRK2复制起点包含trfA和OriV序列。在一方面，所述pRK2复制起点包含SEQID NO：64和65、或其变体和片段。在一方面，所述苍白杆菌还包含源自所述par DE操纵子的序列。在一方面，所述par DE操纵子具有SEQ ID NO：55、或其变体和片段。在一方面，所述载体包含SEQ ID NO：34、35、36、106、113或114中的任一个、或其变体和衍生物。在另一方面，本公开提供了一种试剂盒，该试剂盒包含海沃德苍白杆菌H1，所述海沃德苍白杆菌H1包含载体，所述载体包含处于有效连接的：(a)第一核酸，其包含vir基因区域，其中vir基因区域发挥作用以VirD2依赖性方式将编码目的序列的核酸引入植物细胞中；和(b)第二核酸，其包含与目的序列有效地连接的一个或多个T-DNA边界序列；和(b)用于在植物转化中使用的说明书。
在另一方面，本公开提供了一种生产转化的植物细胞的方法，所述方法包括：(a)使植物细胞与包含处于有效连接的第一核酸和第二核酸的苍白杆菌接触，其中所述第一核酸包含vir基因区域并且所述第二核酸包含有效地连接至目的序列的一个或多个T-DNA边界序列；(b)在允许苍白杆菌将目的序列转移至所述植物细胞的条件下培养所述植物细胞；并且(c)鉴定在其基因组中包含目的序列的转化的植物细胞。在一方面，所述方法还包括使在其基因组中包含所述目的序列的植物再生。在一方面，植物细胞来自单子叶植物或双子叶植物。在一方面，所述植物细胞来自选自由以下组成的组的植物：大豆、烟草、向日葵、拟南芥、红花、苜蓿、玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、粟、低芥酸菜籽、芸苔属、棉花和甘蔗。在一方面，在接触所述植物细胞之前，在乙酰丁香酮或诱导vir或r-vir基因功能的其他化合物的存在下使所述苍白杆菌生长。在一方面，所述植物细胞包含在来自植物种子、幼苗、愈伤组织、细胞悬液、子叶、分生组织、叶、根或茎的外植体中；并且使所述外植体与所述苍白杆菌接触。在一方面，所述外植体包含胚分生组织、体细胞分生组织、愈伤组织、细胞悬液、子叶、子叶节，或者包含来自叶、根或茎的组织。在一方面，鉴定包含所述目的序列的植物细胞在不存在选择剂的情况下进行。在一方面，鉴定包含所述目的序列的植物细胞包括在选择剂的存在下培养所述植物细胞，其中所述目的序列赋予对所述选择剂的耐受性或与赋予对所述选择剂的耐受性的选择性标记共递送。在一方面，所述选择剂是氯磺隆、胺苯磺隆、灭草烟、草甘膦、卡那霉素、壮观霉素、双丙氨磷、2，4-D或麦草畏。在一方面，所述目的序列与选择性标记基因没有物理连锁。在一方面，所述标记基因和目的序列在从包含目的序列的植物细胞再生的植物的子代中遗传分离。在一方面，所述苍白杆菌还包含第三载体，所述第三载体包含处于有效连接的第二目的序列。在一方面，从所述植物细胞使植物再生包括从包含所述植物细胞的外植体诱导形成一个或多个芽并且将至少第一芽培育成完整的可育植物。在一方面，再生通过器官发生来发生。在一方面，所述苍白杆菌选自由以下组成的组：海沃德苍白杆菌H1、金雀儿苍白杆菌、大田苍白杆菌、羽扇豆苍白杆菌、稻苍白杆菌、小麦苍白杆菌、LBNL124-A-10、HTG3-C-07和牲畜苍白杆菌。在一方面，所述苍白杆菌还包含选择性标记。在一方面，所述选择性标记提供对庆大霉素、新霉素/卡那霉素、潮霉素或壮观霉素的抗性。在一方面，所述选择性标记基因是aacC1基因、npt1基因、npt2基因、hpt基因、SpcN基因、aph基因或aadA基因。在一方面，所述选择性标记基因是aacC1基因。在一方面，所述aacC1基因具有SEQ ID NO：1、或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记基因是aadA基因。在一方面，所述aadA基因具有SEQ ID NO：39、或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记基因是npt1基因。在一方面，所述npt1基因具有SEQ ID NO：40或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记基因是npt2基因。在一方面，所述npt2基因具有SEQ ID NO：41或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记基因是hpt基因。在一方面，所述hpt基因具有SEQ IDNO：67或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记基因不是四环素选择性标记基因。在一方面，所述选择性标记基因是具有SEQ ID NO：77、或其变体和片段的SpcN基因。在一方面，所述选择性标记基因是具有SEQ ID NO：78、或其变体和片段的aph基因。在一方面，所述选择性标记基因不是tetAR基因。在一方面，所述选择性标记基因是反向选择性标记基因。在一方面，所述反向选择性标记基因是sacB基因、rpsL(strA)基因、pheS基因、dhfr(folA)基因、lacY基因、Gata-1基因、ccdB基因、或thyA-基因。在一方面，所述vir基因区域包含分别具有SEQ ID NO：4-14、或其变体和衍生物的根瘤菌科毒力基因virB1-virB11或分别具有SEQ ID NO：80-90、或其变体和衍生物的r-virB1-B11，其中包含所述毒力基因r-virB1-B11的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。在一方面，所述vir基因区域包含分别具有SEQ ID NO：16-17、或其变体和衍生物的根瘤菌科毒力基因virC1-C2或分别具有SEQ ID NO：92-93、或其变体和衍生物的r-virC1-C2，其中包含所述毒力基因r-virC1-C2的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。在一方面，所述vir基因区域包含分别具有SEQ ID NO：18-19、或其变体和衍生物的根瘤菌科毒力基因virD1-D2或分别具有SEQ ID NO：94-95、或其变体和衍生物的r-virD1-D2，其中包含所述毒力基因r-virD1-D2的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。在一方面，所述vir基因区域包含具有SEQ ID NO：15、或其变体和衍生物的根瘤菌科毒力基因virG或具有SEQ ID NO：91、或其变体和衍生物的r-virG毒力基因，其中包含所述毒力基因r-virG的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。在一方面，所述vir基因区域包含一种或多种根瘤菌科毒力基因virA、virD3、virD4、virD5、virE1、virE2、virE3、virH、virH1、virH2、virK、virL、virM、virP、virQ、r-virA、r-virD3、r-virD4、r-virD5、r-virE3、或r-virF或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virA、r-virD3、r-virD4、r-virD5、r-virE3、或r-virF的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因是具有SEQ ID NO：26、或其变体和衍生物的virA，或具有SEQ ID NO：79、或其变体和衍生物的r-virA毒力基因，其中包含所述毒力基因r-virA的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virD3-D5分别具有SEQ ID NO：20-22、或其变体和衍生物或分别具有SEQ ID NO：96-98、或其变体和衍生物的r-virD3-D5毒力基因，其中包含所述毒力基因r-virD3-D5的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virE1-E3分别具有SEQ ID NO：23-25、或其变体和衍生物或具有SEQ ID NO：100、或其变体和衍生物的r-virE3毒力基因，其中包含所述毒力基因r-virE3的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virH-H2分别具有SEQID NO：42-43、或其变体和衍生物。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virK具有SEQ ID NO：45、或其变体和衍生物。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virL具有SEQ ID NO：46、或其变体和片段。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virM具有SEQ ID NO：47、或其变体和片段。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virP具有SEQ ID NO：48、或其变体和片段。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virQ具有SEQ ID NO：49、或其变体和片段。在一方面，所述方法包括根瘤菌科毒力基因virD3-D5和virE1-E3、或其变体和片段或r-virD3-D5和r-virE3、或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virD3-D5和r-virE3的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。在一方面，所述方法包括根瘤菌科毒力基因virA、virD3-D5和virE1-E3或其变体和片段，或r-virA、r-virD3-D5和r-virE3或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virA、r-virD3-D5和r-virE3的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。在一方面，所述苍白杆菌还包含用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点来自Col E1、pSC101、p15A、或R6K复制起点及其变体或衍生物。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自Col E1复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：2、或其变体和片段的ColE1复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自pSC101复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：50、或其变体和片段的pSC101复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自p15A复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：51、或其变体和片段的p15A复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自R6K复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：52、或其变体和片段的R6K复制起点。在一方面，所述苍白杆菌还包含用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌物种中繁殖和稳定维持的复制起点是高拷贝数的复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是中等拷贝数的复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是低拷贝数的复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pRi、pVS1、pRFS1010、pRK2、pSa或pBBR1复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是pRK2复制起点的变体。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pRFS1010复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pVS1复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pSa复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点具有SEQ ID NO：3、37、38、53、57、58、59、60或112或其变体和片段。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是repABC相容性复制起点。在一方面，所述repABC相容性复制起点具有SEQ ID NO：57、58、59或60、或其变体和片段。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点以及用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是相同的复制起点。在一方面，所述复制起点源自pRK2复制起点、pSa复制起点或pRFS1010复制起点。在一方面，所述复制起点源自pRK2复制起点。在一方面，所述pRK2复制起点具有SEQ ID NO：38、或其变体和片段。在一方面，所述复制起点源自pSa复制起点。在一方面，所述pSa复制起点具有SEQ ID NO：53、或其变体和片段。在一方面，所述复制起点源自pRFS1010复制起点。在一方面，所述pRFS1010复制起点具有SEQ IDNO：37、或其变体和片段。在一方面，所述pRK2复制起点是迷你型或微型pRK2复制起点。在一方面，所述pRK2复制起点是微型pRK2复制起点。在一方面，所述微型pRK2复制起点具有SEQID NO：54、或其变体和片段。在一方面，所述pRK2复制起点是迷你型pRK2复制起点。在一方面，所述迷你型pRK2具有SEQ ID NO：66、或其变体和片段。在一方面，所述pRK2复制起点包含trfA和OriV序列。在一方面，所述pRK2复制起点包含SEQ ID NO：64和65、或其变体和片段。在一方面，所述方法还包含源自所述par DE操纵子的序列。在一方面，所述par DE操纵子具有SEQ ID NO：55、或其变体和片段。在一方面，所述载体包含SEQ ID NO：34、35、36、106、113或114中的任一个、或其变体和衍生物。
在另一方面，本公开提供了海沃德苍白杆菌H1，其包含：第一载体，其包含处于有效连接的：(a)用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点；(b)用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点；(c)选择性标记基因；和(d)根瘤菌科毒力基因virB1-B11或r-virB1-B11、virC1-C2或r-virC1-C2、virD1-D2或r-virD1-D2、和virG或r-virG或其变体和衍生物，其中所述包含毒力基因r-virB1-B11、r-virC1-C2、r-virD1-D2、和r-virG的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因；以及第二载体，其包含处于有效连接的一个或多个T-DNA边界序列，所述T-DNA边界序列有效地连接至目的序列。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因是分别具有SEQ ID NO：4-14、或其变体和衍生物的virB1-virB11，或分别具有SEQ ID NO：80-90、或其变体和衍生物的r-virB1-B11。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因是分别具有SEQ ID NO：16-17、或其变体和衍生物的virC1-C2，或分别具有SEQ ID NO：92-93、或其变体和衍生物的r-virC1-C2。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因是分别具有SEQ ID NO：18-19、或其变体和衍生物的virD1-D2，或分别具有SEQ IDNO：94-95、或其变体和衍生物的r-virD1-D2。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因是具有SEQID NO：15、或其变体和衍生物的virG，或具有SEQ ID NO：91、或其变体和衍生物的r-virG毒力基因。在一方面，所述苍白杆菌还包含一种或多种根瘤菌科毒力基因virA、virD3、virD4、virD5、virE1、virE2、virE3、virH、virH1、virH2、virK、virL、virM、virP、virQ、r-virA、r-virD3、r-virD4、r-virD5、r-virE3、或r-virF或其变体和衍生物。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点来自Col E1、pSC101、p15A、或R6K复制起点或变体或衍生物。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自Col E1复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：2、或其变体和片段的ColE1复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自pSC101复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：50、或其变体和片段的pSC101复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自p15A复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：51、或其变体和片段的p15A复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自R6K复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：52、或其变体和片段的R6K复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌物种中繁殖和稳定维持的复制起点是高拷贝数的复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是中等拷贝数的复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是低拷贝数的复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pRi、pVS1、pRFS1010、pRK2、pSa或pBBR1复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是pRK2复制起点的变体。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pRFS1010复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pVS1复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pSa复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点具有SEQ ID NO：3、37、38、53、57、58、59、60或112或其变体和片段。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是repABC相容性复制起点。在一方面，所述repABC相容性复制起点具有SEQ ID NO：57、58、59或60、或其变体和片段。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点以及用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是相同的复制起点。在一方面，所述复制起点源自pRK2复制起点、pSa复制起点或pRFS1010复制起点。在一方面，所述复制起点源自pRK2复制起点。在一方面，所述pRK2复制起点具有SEQ ID NO：38、或其变体和片段。在一方面，所述复制起点源自pSa复制起点。在一方面，所述pSa复制起点具有SEQ IDNO：53、或其变体和片段。在一方面，所述复制起点源自pRFS1010复制起点。在一方面，所述pRFS1010复制起点具有SEQ ID NO：37、或其变体和片段。在一方面，所述复制起点源自pRK2复制起点。在一方面，所述pRK2复制起点是迷你型或微型pRK2复制起点。在一方面，所述pRK2复制起点是微型pRK2复制起点。在一方面，所述微型pRK2复制起点具有SEQ ID NO：54、或其变体和片段。在一方面，所述pRK2复制起点是迷你型pRK2复制起点。在一方面，所述迷你型pRK2具有SEQ ID NO：66、或其变体和片段。在一方面，所述pRK2复制起点包含trfA和OriV序列。在一方面，所述pRK2复制起点包含SEQ ID NO：64和65、或其变体和片段。在一方面，所述苍白杆菌还包含源自所述par DE操纵子的序列。在一方面，所述par DE操纵子具有SEQ ID NO：55、或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记提供对庆大霉素、新霉素/卡那霉素、潮霉素或壮观霉素的抗性。在一方面，所述选择性标记基因是aacC1基因、npt1基因、npt2基因、hpt基因、SpcN基因、aph基因或aadA基因。在一方面，所述选择性标记基因是aacC1基因。在一方面，所述aacC1基因具有SEQ ID NO：1、或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记基因是aadA基因。在一方面，所述aadA基因具有SEQ ID NO：39、或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记基因是npt1基因。在一方面，所述npt1基因具有SEQ ID NO：40或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记基因是npt2基因。在一方面，所述npt2基因具有SEQ ID NO：41或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记基因是hpt基因。在一方面，所述hpt基因具有SEQ ID NO：67或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记基因是具有SEQ ID NO：77、或其变体和片段的SpcN基因。在一方面，所述选择性标记基因是具有SEQ IDNO：78、或其变体和片段的aph基因。在一方面，所述选择性标记基因不是四环素选择性标记基因。在一方面，所述选择性标记基因不是tetAR基因。在一方面，所述选择性标记基因是反向选择性标记基因。在一方面，所述反向选择性标记基因是sacB基因、rpsL(strA)基因、pheS基因、dhfr(folA)基因、lacY基因、Gata-1基因、ccdB基因、或thyA-基因。在一方面，所述第一载体不包含SEQ ID NO：61、或其变体或片段。在一方面，所述第一载体不包含SEQ IDNO：62、或其变体或片段。在一方面，所述第一载体不包含tra操纵子序列或trb操纵子序列、或其变体或片段。在一方面，所述第一载体不包含SEQ ID NO：63、或其变体或片段。在一方面，所述第一载体具有SEQ ID NO：34、或其变体和片段。在一方面，所述第一载体具有SEQID NO：35、或其变体和片段。在一方面，所述第一载体具有SEQ ID NO：36、或其变体和片段。在一方面，所述载体包含SEQ ID NO：34、35、36、106、113或114中的任一个、或其变体和衍生物。在另一方面，本方法提供了一种试剂盒，所述设备包括：(a)所述苍白杆菌，其包含：第一载体，其包含处于有效连接的：(a)用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点；(b)用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点；(c)选择性标记基因；和(d)根瘤菌科毒力基因virB1-B11或r-virB1-B11、virC1-C2或r-virC1-C2、virD1-D2或r-virD1-D2、和virG或r-virG或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virB1-B11、r-virC1-C2、r-virD1-D2、和r-virG的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因；以及第二载体，其包含处于有效连接的一个或多个T-DNA边界序列，所述T-DNA边界序列有效地连接至目的序列；和(b)用于在植物转化中使用的说明书。
在另一方面，本公开提供了海沃德苍白杆菌H1，其包含：第一载体，其包含处于有效连接的：(a)用于在大肠杆菌中繁殖的、具有SEQ ID NO：2或其变体和片段的复制起点；(b)用于在苍白杆菌属物种中繁殖的、具有SEQ ID NO：3或其变体和片段的复制起点；(c)具有SEQ ID NO：1、或其变体和片段的选择性标记基因；和(d)毒力基因，其包含农杆菌属物种毒力基因：分别具有SEQ ID NO：4-14的virB1-B11毒力基因或分别具有SEQ ID NO：80-90的r-virB1-B11毒力基因、分别具有SEQ ID NO：16-17的virC1-C2毒力基因或分别具有SEQ IDNO：92-93的r-virC1-C2毒力基因、分别具有SEQ ID NO：18-19的virD1-D2毒力基因或分别具有SEQ ID NO：94-95的r-virD1-D2毒力基因、和具有SEQ ID NO：15的virG毒力基因或具有SEQ ID NO：91、或其变体和衍生物的r-virG毒力基因，其中包含所述毒力基因r-virB1-B11、r-virC1-C2、r-virD1-D2、和r-virG的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因；以及第二载体，其包含处于有效连接的一个或多个T-DNA边界序列，所述T-DNA边界序列有效地连接至目的序列。在一方面，所述载体包含SEQ ID NO：34、35、36、106、113或114中的任一个、或其变体和衍生物。在另一方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含：(a)所述苍白杆菌包含：第一载体，所述第一载体包含处于有效连接的：(a)用于在大肠杆菌中繁殖的、具有SEQ ID NO：2或其变体和片段的复制起点；(b)用于在苍白杆菌属物种中繁殖的、具有SEQ ID NO：3或其变体和片段的复制起点；(c)具有SEQ ID NO：1、或其变体和片段的选择性标记基因；和(d)毒力基因，其包含农杆菌属物种毒力基因：分别具有SEQ ID NO：4-14的virB1-B11毒力基因或分别具有SEQ ID NO：80-90的r-virB1-B11毒力基因、分别具有SEQ ID NO：16-17的virC1-C2毒力基因或分别具有SEQ ID NO：92-93的r-virC1-C2毒力基因、分别具有SEQ ID NO：18-19的virD1-D2毒力基因或分别具有SEQ IDNO：94-95的r-virD1-D2毒力基因、和具有SEQ ID NO：15的virG毒力基因或具有SEQ ID NO：91、或其变体和衍生物的r-virG毒力基因，其中包含所述毒力基因r-virB1-B11、r-virC1-C2、r-virD1-D2、和r-virG的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因；以及第二载体，其包含处于有效连接的一个或多个T-DNA边界序列，所述T-DNA边界序列有效地连接至目的序列；和(b)用于在植物转化中使用的说明书。
在另一方面，本公开提供了海沃德苍白杆菌H1，其包含：第一载体，其包含处于有效连接的：(a)用于在大肠杆菌中繁殖的、具有SEQ ID NO：2或其变体和片段的复制起点；(b)用于在苍白杆菌属物种中繁殖的、具有SEQ ID NO：3或其变体和片段的复制起点；(c)具有SEQ ID NO：1、或其变体和片段的选择性标记基因；和(d)序列，其包含农杆菌属物种毒力基因：分别具有SEQ ID NO：4-14的virB1-B11毒力基因或分别具有SEQ ID NO：80-90的r-virB1-B11毒力基因、分别具有SEQ ID NO：16-17的virC1-C2毒力基因或分别具有SEQ IDNO：92-93的r-virC1-C2毒力基因、分别具有SEQ ID NO：18-22的virD1-D5毒力基因或分别具有SEQ ID NO：94-98的r-virD1-D5毒力基因、分别具有SEQ ID NO：23-25的virE1-E3毒力基因或具有SEQ ID NO：100的r-virE3毒力基因、和具有SEQ ID NO：15的virG毒力基因或具有SEQ ID NO：91、或其变体和衍生物的r-virG毒力基因，其中包含所述毒力基因r-virB1-B11、r-virC1-C2、r-virD1-D5、r-virE3、和r-virG的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因，和第二载体，其包含处于有效连接的一个或多个T-DNA边界序列，所述T-DNA边界序列有效地连接至目的序列。在一方面，所述载体包含SEQ IDNO：34、35、36、106、113或114中的任一个、或其变体和衍生物。在另一方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含：(a)所述苍白杆菌包含：第一载体，所述第一载体包含处于有效连接的：(a)用于在大肠杆菌中繁殖的、具有SEQ ID NO：2或其变体和片段的复制起点；(b)用于在苍白杆菌属物种中繁殖的、具有SEQ ID NO：3或其变体和片段的复制起点；(c)具有SEQ IDNO：1、或其变体和片段的选择性标记基因；和(d)序列，其包含农杆菌属物种毒力基因：分别具有SEQ ID NO：4-14的virB1-B11毒力基因或分别具有SEQ ID NO：80-90的r-virB1-B11毒力基因、分别具有SEQ ID NO：16-17的virC1-C2毒力基因或分别具有SEQ ID NO：92-93的r-virC1-C2毒力基因、分别具有SEQ ID NO：18-22的virD1-D5毒力基因或分别具有SEQ IDNO：94-98的r-virD1-D5毒力基因、分别具有SEQ ID NO：23-25的virE1-E3毒力基因或具有SEQ ID NO：100的r-virE3毒力基因、和具有SEQ ID NO：15的virG毒力基因或具有SEQ IDNO：91、或其变体和衍生物的r-virG毒力基因，其中包含所述毒力基因r-virB1-B11、r-virC1-C2、r-virD1-D5、r-virE3、和r-virG的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因，和第二载体，其包含处于有效连接的一个或多个T-DNA边界序列，所述T-DNA边界序列有效地连接至目的序列；和(b)用于在植物转化中使用的说明书。
在另一方面，本公开提供了海沃德苍白杆菌H1，其包含：第一载体，其包含处于有效连接的：(a)用于在大肠杆菌中繁殖的、具有SEQ ID NO：2或其变体和片段的复制起点；(b)用于在苍白杆菌属物种中繁殖的、具有SEQ ID NO：3或其变体和片段的复制起点；(c)具有SEQ ID NO：1的选择性标记基因；和(d)序列，其包含农杆菌属物种毒力基因：具有SEQ IDNO：26的virA毒力基因或具有SEQ ID NO：79的r-virA毒力基因、分别具有SEQ ID NO：4-14的virB1-B11毒力基因或分别具有SEQ ID NO：80-90的r-virB1-B11毒力基因、分别具有SEQID NO：16-17的virC1-C2毒力基因或分别具有SEQ ID NO：92-93的r-virC1-C2毒力基因、分别具有SEQ ID NO：18-22的virD1-D5毒力基因或分别具有SEQ ID NO：94-98的r-virD1-D5毒力基因、分别具有SEQ ID NO：23-25的virE1-E3毒力基因或具有SEQ ID NO：100的r-virE3毒力基因、具有SEQ ID NO：15的virG毒力基因或具有SEQ ID NO：91的r-virG毒力基因、和具有SEQ ID NO：27、或其变体和衍生物的virJ毒力基因，其中包含所述毒力基因r-virA、r-virB1-B11、r-virC1-C2、r-virD1-D5、r-virE3、和r-virG的载体还包含具有SEQ IDNO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因，和第二载体，其包含处于有效连接的一个或多个T-DNA边界序列，所述T-DNA边界序列有效地连接至目的序列。在一方面，所述载体包含SEQ ID NO：34、35、36、106、113或114中的任一个、或其变体和衍生物。在另一方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含：(a)所述苍白杆菌包含：第一载体，所述第一载体包含处于有效连接的：(a)用于在大肠杆菌中繁殖的、具有SEQ ID NO：2或其变体和片段的复制起点；(b)用于在苍白杆菌属物种中繁殖的、具有SEQ ID NO：3或其变体和片段的复制起点；(c)具有SEQ ID NO：1的选择性标记基因；和(d)序列，其包含农杆菌属物种毒力基因：具有SEQ IDNO：26的virA毒力基因或具有SEQ ID NO：79的r-virA毒力基因、分别具有SEQ ID NO：4-14的virB1-B11毒力基因或分别具有SEQ ID NO：80-90的r-virB1-B11毒力基因、分别具有SEQID NO：16-17的virC1-C2毒力基因或分别具有SEQ ID NO：92-93的r-virC1-C2毒力基因、分别具有SEQ ID NO：18-22的virD1-D5毒力基因或分别具有SEQ ID NO：94-98的r-virD1-D5毒力基因、分别具有SEQ ID NO：23-25的virE1-E3毒力基因或具有SEQ ID NO：100的r-virE3毒力基因、具有SEQ ID NO：15的virG毒力基因或具有SEQ ID NO：91的r-virG毒力基因、和具有SEQ ID NO：27、或其变体和衍生物的virJ毒力基因，其中包含所述毒力基因r-virA、r-virB1-B11、r-virC1-C2、r-virD1-D5、r-virE3、和r-virG的载体还包含具有SEQ IDNO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因，和第二载体，其包含处于有效连接的一个或多个T-DNA边界序列，所述T-DNA边界序列有效地连接至目的序列；和(b)用于在植物转化中使用的说明书。
在另一方面，本公开提供了一种生产转化的植物细胞的方法，所述方法包括：使植物细胞与苍白杆菌接触，所述苍白杆菌包含：第一载体，所述第一载体包含处于有效连接的：(a)用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点；(b)用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点；(c)选择性标记基因；和(d)根瘤菌科毒力基因：分别具有SEQ IDNO：4-14的virB1-B11毒力基因或分别具有SEQ ID NO：80-90的r-virB1-B11毒力基因、分别具有SEQ ID NO：16-17的virC1-C2毒力基因或分别具有SEQ ID NO：92-93的r-virC1-C2毒力基因、分别具有SEQ ID NO：18-19的virD1-D2毒力基因或分别具有SEQ ID NO：94-95的r-virD1-D2毒力基因和具有SEQ ID NO：15的virG毒力基因或具有SEQ ID NO：91、或其变体和衍生物的r-virG毒力基因，其中包含所述毒力基因r-virB1-B11、r-virC1-C2、r-virD1-D2、和r-virG的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因；以及第二载体，其包含处于有效连接的一个或多个T-DNA边界序列，所述T-DNA边界序列有效地连接至目的序列；在允许苍白杆菌将目的序列转移至所述植物细胞的条件下培养所述植物细胞；并且鉴定在其基因组中包含目的序列的转化的植物细胞。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virB1-virB11分别具有SEQ ID NO：4-14、或其变体和衍生物，或者r-virB1-B11分别具有SEQ ID NO：80-90、或其变体和衍生物。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virC1-C2分别具有SEQ ID NO：16-17、或其变体和衍生物，或者r-virC1-C2分别具有SEQ ID NO：92-93、或其变体和衍生物。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virC1-D2分别具有SEQ ID NO：18-19、或其变体和衍生物，或者r-virD1-D2分别具有SEQ ID NO：94-95、或其变体和衍生物。在一方面，所述根瘤菌科毒力基因virG具有SEQ ID NO：15、或其变体和衍生物，或者r-virG毒力基因具有SEQ ID NO：91、或其变体和衍生物。在一方面，所述方法还包含一种或多种根瘤菌科毒力基因virA、virD3、virD4、virD5、virE1、virE2、virE3、virH、virH1、virH2、virK、virL、virM、virP、virQ、r-virA、r-virD3、r-virD4、r-virD5、r-virE3、或r-virF或其变体和衍生物。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点来自Col E1、pSC101、p15A、或R6K复制起点或变体或衍生物。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自Col E1复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：2、或其变体和片段的ColE1复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自pSC101复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：50、或其变体和片段的pSC101复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自p15A复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：51、或其变体和片段的p15A复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自R6K复制起点。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：52、或其变体和片段的R6K复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌物种中繁殖和稳定维持的复制起点是高拷贝数的复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是中等拷贝数的复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是低拷贝数的复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pRi、pVS1、pRFS1010、pRK2、pSa或pBBR1复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是pRK2复制起点的变体。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pRFS1010复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pVS1复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pSa复制起点。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点具有SEQ ID NO：3、37、38、53、57、58、59、60或112或其变体和片段。在一方面，用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是repABC相容性复制起点。在一方面，所述repABC相容性复制起点具有SEQ ID NO：57、58、59或60、或其变体和片段。在一方面，用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点以及用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是相同的复制起点。在一方面，所述复制起点源自pRK2复制起点、pSa复制起点或pRFS1010复制起点。在一方面，所述复制起点源自pRK2复制起点。在一方面，所述pRK2复制起点具有SEQ ID NO：38、或其变体和片段。在一方面，所述复制起点源自pSa复制起点。在一方面，所述pSa复制起点具有SEQ ID NO：53、或其变体和片段。在一方面，所述复制起点源自pRFS1010复制起点。在一方面，所述pRFS1010复制起点具有SEQ ID NO：37、或其变体和片段。在一方面，所述复制起点源自pRK2复制起点。在一方面，所述pRK2复制起点是迷你型或微型pRK2复制起点。在一方面，所述pRK2复制起点是微型pRK2复制起点。在一方面，所述微型pRK2复制起点具有SEQ ID NO：54、或其变体和片段。在一方面，所述pRK2复制起点是迷你型pRK2复制起点。在一方面，所述迷你型pRK2具有SEQ ID NO：66、或其变体和片段。在一方面，所述pRK2复制起点包含trfA和OriV序列。在一方面，所述pRK2复制起点包含SEQ ID NO：64和65、或其变体和片段。在一方面，所述方法还包含源自所述par DE操纵子的序列。在一方面，所述par DE操纵子具有SEQ ID NO：55、或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记提供对庆大霉素、新霉素/卡那霉素、潮霉素或壮观霉素的抗性。在一方面，所述选择性标记基因是aacC1基因、npt1基因、npt2基因、hpt基因、SpcN基因、aph基因或aadA基因。在一方面，所述选择性标记基因是aacC1基因。在一方面，所述aacC1基因具有SEQ ID NO：1、或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记基因是aadA基因。在一方面，所述aadA基因具有SEQID NO：39、或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记基因是npt1基因。在一方面，所述npt1基因具有SEQ ID NO：40、或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记基因是npt2基因。在一方面，所述npt2基因具有SEQ ID NO：41、或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记基因是hpt基因。在一方面，所述hpt基因具有SEQ ID NO：67、或其变体和片段。在一方面，所述选择性标记基因是具有SEQ ID NO：77、或其变体和片段的SpcN基因。在一方面，所述选择性标记基因是具有SEQ ID NO：78、或其变体和片段的aph基因。在一方面，所述选择性标记基因不是四环素选择性标记基因。在一方面，所述选择性标记基因不是tetAR基因。在一方面，所述选择性标记基因是反向选择性标记基因。在一方面，所述反向选择性标记基因是sacB基因、rpsL(strA)基因、pheS基因、dhfr(folA)基因、lacY基因、Gata-1基因、ccdB基因、或thyA-基因。在一方面，所述第一载体不包含SEQ ID NO：61、或其变体或片段。在一方面，所述第一载体不包含SEQ ID NO：62、或其变体或片段。在一方面，所述第一载体不包含tra操纵子序列或trb操纵子序列、或其变体或片段。在一方面，所述第一载体不包含SEQ IDNO：63、或其变体或片段。在一方面，所述第一载体具有SEQ ID NO：34、或其变体和片段。在一方面，所述第一载体具有SEQ ID NO：35、或其变体和片段。在一方面，所述第一载体具有SEQ ID NO：36、或其变体和片段。在一方面，所述方法还包括使在其基因组中包含所述目的序列的植物再生。在一方面，植物细胞来自单子叶植物或双子叶植物。在一方面，所述植物细胞来自选自由以下组成的组的植物：大豆、烟草、向日葵、拟南芥、红花、苜蓿、玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、粟、低芥酸菜籽、芸苔属、棉花和甘蔗。在一方面，在接触所述植物细胞之前，在乙酰丁香酮或诱导vir或r-vir基因功能的其他化合物的存在下使所述苍白杆菌生长。在一方面，所述植物细胞包含在来自植物种子、幼苗、愈伤组织、细胞悬液、子叶、分生组织、叶、根或茎的外植体中；并且使所述外植体与所述苍白杆菌接触。在一方面，所述外植体包含胚分生组织、体细胞分生组织、愈伤组织、细胞悬液、子叶、子叶节，或者包含来自叶、根或茎的组织。在一方面，鉴定包含所述目的序列的植物细胞在不存在选择剂的情况下进行。在一方面，鉴定包含所述目的序列的植物细胞包括在选择剂的存在下培养所述植物细胞，其中所述目的序列赋予对所述选择剂的耐受性或与赋予对所述选择剂的耐受性的选择性标记共递送。在一方面，所述选择剂是氯磺隆、胺苯磺隆、灭草烟、草甘膦、卡那霉素、壮观霉素、双丙氨磷、2，4-D或麦草畏。在一方面，所述目的序列与选择性标记基因没有物理连锁。在一方面，所述标记基因和目的序列在从包含目的序列的植物细胞再生的植物的子代中遗传分离。在一方面，所述苍白杆菌还包含第三载体，所述第三载体包含处于有效连接的第二目的序列。在一方面，从所述植物细胞使植物再生包括从包含所述植物细胞的外植体诱导形成一个或多个芽并且将至少第一芽培育成完整的可育植物。在一方面，使植物再生通过器官发生来发生。在一方面，所述苍白杆菌选自由以下组成的组：海沃德苍白杆菌H1、金雀儿苍白杆菌、大田苍白杆菌、羽扇豆苍白杆菌、稻苍白杆菌、小麦苍白杆菌、LBNL124-A-10、HTG3-C-07和牲畜苍白杆菌。在一方面，所述载体包含SEQ ID NO：34、35、36、106、113或114中的任一个、或其变体和衍生物。
在另一方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含：(a)所述组合物、方法或载体中任一项所述的苍白杆菌；和(b)用于在植物转化中使用的说明书。
附图说明
专利或申请文件包含至少一张用彩色绘制的图纸。根据要求并支付必要的费用后，本局将提供本专利或专利申请出版物的彩色图样副本。
图1A和图1B显示了基于16S rDNA序列的分子系统发育分析，使用了最大似然法，箭头指示海沃德苍白杆菌H1(EP1A09)的位置。
图2A-图2D显示了烟草转化实验。在双丙氨膦3mg/L培养基选择3周后，从用进一步包含PHP70365的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078转化的烟草叶片显示了表达DsRED的稳定转化的芽(图2B)。在双丙氨膦3mg/L培养基选择7周后，从用进一步包含PHP70365的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078转化的烟草叶片显示了表达DsRED的稳定转化的芽(图2D)。图2A(示出了图2B的组织)和图2C(示出了图2D的组织)显示使用没有DsRED过滤器设置的环境光的转化的烟草芽的图像。
图3A至图3D显示了大豆半粒种子外植体转化结果。图3C和图3D显示用进一步包含PHP70365的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078转化的大豆半粒种子外植体，其在感染5天后显示DsRED瞬时表达(图3D)。图3C显示了图3D在环境光下的大豆半粒种子外植体组织图像，并且图3D显示了DsRED5的瞬时表达。相反，用没有载体PHP70365的野生型海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078转化的大豆半粒种子外植体没有显示DsRED表达(图3B)。
图4A-图4J显示了进一步包含质粒PHP70365(pVIR8)的用海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078感染的大豆转化的连续步骤。图4A和图4B显示了转化2周至4周后观察到显示DsRED表达(图4B)的稳定转化的芽的芽诱导。图4A显示了来自图4B的组织的图像，但是在环境光下。图4C显示了芽伸长，其中外植体被传代培养用于进一步的芽伸长。图4D-图4G显示了大豆组织的DsRed表达。图4D和图4F在环境光下成像。图4E显示了图4D的组织的DsRed表达。图4G显示了图4F的组织的DsRed表达。图4H和图4I显示了生根，其中整个小植株产生了显示DsRED表达的根。图4H在环境光下成像。图4I显示了图4H的组织的DsRed表达。图4J显示了用进一步包含质粒PHP70365的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078转化的盆栽大豆植株。
图5A-图5D显示了用进一步包含质粒PHP70365的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078转化的大豆胚轴外植体。图5A显示了芽和愈伤组织诱导，其中在转化两周后观察到的分生组织区域中稳定转化的芽和愈伤组织显示了DsRED表达(图5B)。图5A示出了图5B在环境光下的组织图像。图5C和5D显示了芽伸长，其中在转化六周至八周后产生了尺寸为1cm-1.5cm的稳定转化的DsRED阳性芽(图5D)。图5C显示了图5D在环境光下的组织图像。在图5A和图5B中，尺寸条等于2mm。在图5C和图5D中，尺寸条等于5mm。
图6A-图6F显示了感染后五天大豆栽培种93Y21的半粒种子中海沃德苍白杆菌H1NRRL保藏B-67078(图6B)、金雀儿苍白杆菌(图6D)和牲畜苍白杆菌(图6F)的DsRED的瞬时表达的比较。图6A、图6C和图6E显示了分别在环境光下的图6B、图6D和图6F的组织图像。
具体实施方式
苍白杆菌是根瘤菌目的布鲁氏菌科中的细菌属。苍白杆菌菌株是革兰氏阴性短棒，是笔直的或稍弯曲，一端呈火焰状。这些细胞的宽度大约为0.6μm，并且长度为1.2μm至2μm。苍白杆菌是非孢子形成的，并且是严格需氧的和非发酵的。大多数苍白杆菌属物种的基因组是复杂的，具有常常与质粒相连的两个独立的环状染色体。Holmes于1988年(Holmes等人(1988)Int J Syst Bacteriol[国际系统细菌学杂志]38：408)描述了苍白杆菌属并且建议了将人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)作为该属的模式种。进一步的工作带来了对其他物种的认识，这包括O.ciceri、金雀儿苍白杆菌、大田苍白杆菌、O.gallinifaecis、O.grignonense、广州苍白杆菌(O.guangzhouense)、O.haematophilum、中间苍白杆菌(O.iutermedium)、O.lupini、稻苍白杆菌、牲畜苍白杆菌、O.pituitosum、假中间苍白杆菌(O.pseudintermedium)、O.pseudogrignonense、根际苍白杆菌(O.rhizosphaerae)、O.thiophenivorans和小麦苍白杆菌。
在本公开的一些实例中，提供了用于细胞转化的苍白杆菌。在一些实例中，所述苍白杆菌是Ochrobactrum grignonense。在一些实例中，所述苍白杆菌菌株是海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078。海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078在本文中可以被称为海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078、海沃德苍白杆菌H1或EP1A09。在一些实例中，苍白杆菌载体包含一个或多个毒力基因、边界区域和/或复制起点。在一些实例中，所述载体包含用于植物和细菌转化的一个或多个选择性标记。在一些实例中，一个或多个毒力基因选自由以下组成的组：virA、virB、virC、virD、virE、virF、virG及其变体及其任何组合物。在一些实例中，一个或多个vir基因选自由以下组成的组：virA、virJ、virB1、virB2、virB3、virB4、virB5、virB6、virB7、virB8、virB9、virB10、virB11、virG、virC1、virC2、virD1、virD2、virD3、virD4、virD5、virE1、virE2、virE3(Broothaerts等人，(2005)Nature[自然]433：629-633；US 20050289667；US 20050289672)、及其变体及其任何组合物。在一些实例中，提供了至少2、3、4、5、6、7或8个毒力基因。在一些实例中，在Ti质粒上提供了一个或多个毒力基因。在一些实例中，将一个或多个毒力基因并入苍白杆菌基因组中。在一些实例中，所述苍白杆菌包含一个或多个毒力基因的多于一个的拷贝。在一些实例中，所述苍白杆菌包含：第一核酸，其包含Ti质粒的vir基因区域，其中vir基因区域发挥作用以VirD2依赖性方式将编码目的序列的核酸引入植物细胞中。VirD2是涉及在T-DNA上切割一个或多个边界重复序列以产生单链DNA(ssDNA)分子的细菌内切核酸酶，其具有与ssDNA共价连接的单个VirD2蛋白(Young和Nester(1988)Journal of Bacteriology[细菌学杂志]170：3367-3374)。
在一些实例中，苍白杆菌属包含核酸，所述核酸包含与编码目的序列的核酸有效地连接的一个或多个T-DNA边界序列。在一些实例中，苍白杆菌包含了含有两个或更多个T-DNA边界序列的核酸。在一些实例中，T-DNA边界序列选自由以下组成的组：左边界序列、右边界序列和/或其他序列。在一些实例中，一个或多个vir基因和目的序列在单个多核苷酸分子上。在一些实例中，一个或多个vir基因和目的序列在分离的多核苷酸分子上。可以使用在细菌中有功能的任何一个或多个复制起点。在一些实例中，多数一个或多个复制起点是在农杆菌、大肠杆菌或两者中有功能的起点。在一些实例中，所述一个或多个复制起点选自由以下组成的组：pVS1、pSa、RK2、pRiA4b、incPa、incW、colE1、及其功能变体或衍生物。在一些实例中，所述苍白杆菌包含Ti或Ri质粒。在一些实例中，Ti或Ri质粒选自由以下组成的组：pTiBo542、pTiC58、pTiAch5、pTiChrys5、pTF101.1、pBIN19、pUCD2、pCGN及其功能性变体或衍生物或片段。在一些实例中，所述苍白杆菌还包含选择性标记。在一些实例中，选择性标记位于编码目的序列的核酸上。在一些实例中，选择性标记是目的序列。
“片段”意在是多核苷酸的一部分或者氨基酸序列和因此由其编码的蛋白质的一部分。多核苷酸的片段可以编码保留天然蛋白的生物活性的蛋白质片段。因此，核苷酸序列的片段的范围为至少约10个核苷酸、约15个核苷酸、约16个核苷酸、约17个核苷酸、约18个核苷酸、约19个核苷酸、约20个核苷酸、约22个核苷酸、约50个核苷酸、约75个核苷酸、约100个核苷酸、约200个核苷酸、约300个核苷酸、约400个核苷酸、约500个核苷酸、约600个核苷酸并最多至采用的全长多核苷酸。
“衍生物”是指具有与参考多核苷酸的生物活性基本相似的活性的多核苷酸或多核苷酸的一部分。毒力基因多核苷酸的衍生物将是功能性的并将保留毒力基因活性。
“变体”意指基本上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加和/或取代，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的取代。毒力基因多核苷酸的变体将保留毒力基因活性。如在此使用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守的变体包括如下那些序列，由于遗传密码的简并性，这些序列编码由毒力基因编码的多肽的氨基酸序列。变体多核苷酸还包括通过合成衍生的多核苷酸，诸如那些例如通过使用定点诱变产生但继续保留所需活性的多核苷酸。通常，如通过本文别处所描述的序列比对程序和参数确定的，具体的经披露的多核苷酸(即，毒力基因)的变体将与该具体的多核苷酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。具体的经披露的多核苷酸(即参照多核苷酸)的变体还可通过比较由变体多核苷酸所编码的多肽与由该参照多核苷酸所编码的多肽之间的序列同一性百分数来进行评价。可以使用本文别处描述的序列比对程序和参数计算任何两个多肽之间的百分比序列同一性。当通过比较由它们编码的两个多肽共有的序列同一性百分数来评估所使用的给定的所披露的多核苷酸对时，两个经编码的多肽之间的序列同一性百分数为至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
如本文所用，“pPHP”是指质粒PHP，其后接数字。例如，pPHP70365是指质粒PHP70365。例如，pVIR7是指质粒VIR7。
表19提供了本公开中提供的序列标识号(SEQ ID NO：)的列表。
还提供了用于转化细胞的方法。在一些实例中，所述细胞是植物细胞。在一些实例中，所述方法包括使细胞与包含毒力基因、边界区域和/或复制起点中的一个或多个以及目的序列的苍白杆菌接触；在允许苍白杆菌将目的序列转移至植物细胞的条件下培养细胞；并且鉴定在其基因组中包含目的序列的转化的细胞。在一些实例中，所述细胞是植物细胞并且所述方法还包括使在其基因组中包含所述目的序列的植物再生。在一些实例中，所述苍白杆菌是海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078。在一些实例中，所述苍白杆菌是Ochrobactrum grignonense、金雀儿苍白杆菌或牲畜苍白杆菌。在一些实例中，植物细胞来自单子叶植物或双子叶植物。在一些实例中，所述植物细胞来自选自由以下组成的组的植物：大豆、烟草、向日葵、拟南芥、红花、苜蓿、玉米、小麦、水稻、高粱、大麦、燕麦、粟、低芥酸菜籽、芸苔属、棉花和甘蔗。在一些实例中，在接触所述细胞之前，在乙酰丁香酮或诱导vir基因功能的其他化合物的存在下使所述苍白杆菌生长。
在一些实例中，所述植物细胞包含在来自植物种子、幼苗、愈伤组织、细胞悬液、子叶、分生组织、叶、根或茎的外植体中；并且使所述外植体与所述苍白杆菌接触。在一些实例中，所述外植体包含胚分生组织、体细胞分生组织、愈伤组织、细胞悬液、子叶、子叶节，或者包含来自叶、根或茎的组织。在一些实例中，鉴定包含所述目的序列的植物细胞在不存在选择剂的情况下进行。在其他实例中，鉴定包含所述目的序列的植物细胞包括在选择剂的存在下培养所述植物细胞，其中所述目的序列赋予对所述选择剂的耐受性或与赋予对所述选择剂的耐受性的选择性标记共递送。在一些实例中，所述选择剂是草甘膦、卡那霉素、双丙氨膦、2，4-D或麦草畏。在一些实例中，所述目的序列与选择性标记基因没有物理连锁。在这些实例中，所述标记基因和目的序列在从包含目的序列的植物细胞再生的植物的子代中遗传分离。在一些实例中，所述苍白杆菌还包含第三核酸，所述第三核酸包含第二目的序列，并且由此所述经转化的细胞在其基因组中包含所述第二目的序列。在一些实例中，从所述植物细胞使植物再生包括从包含所述植物细胞的外植体诱导形成一个或多个芽并且将至少第一芽培育成完整的可育植物。在一些实例中，再生通过器官发生来发生。
该细菌目根瘤菌目包含常见的土壤细菌并且包括农杆菌属物种(Agrobacteriumspp.)的同时，还包括根瘤菌属物种(Rhizobium spp.)、中生根瘤菌属物种(Mesorhizobiumspp.)、中华根瘤菌属物种(Sinorhizobium spp.)和苍白杆菌属物种(Ochrobactrumspp.)。除了农杆菌属物种，根瘤菌目的其他成员，例如根瘤菌属物种已知与在分化的固氮根瘤中的植物根系共生地相关联(例如，Long(2001)Plant Physiol[植物生理学]125：69-72)。除了植物根系(特别是豆科植物)的宿主特异性根瘤之外，根瘤菌目成员的一些植物生长促进作用在没有结瘤的情况下是已知的(例如，Noel等人(1996)Can J Microbiol[加拿大微生物学杂志]42：279-283)。已经发表了描述除农杆菌以外的细菌转化植物的报道(例如，Broothaerts等人(2005)Nature[自然]433：629-633；US 20050289667；US20050289672；Weller等人(2004)Appl Env Microbiol[微生物学文献集]70：2779-2785；Weller等人(2005)P1 Pathol[植物病理学]54：799-805)。在根瘤菌科中，农杆菌属、根瘤菌属、中华根瘤菌属和剑菌属(Ensifer)已经显示了植物的转化，而DNA转移仅在叶瘤菌科的中生根瘤菌中显示出来。
在一些方面，根瘤菌科毒力基因是农杆菌属物种、根瘤菌属物种、中华根瘤菌属物种、中生根瘤菌属物种、叶杆菌属物种、苍白杆菌属物种或慢生根瘤菌属物种基因。在一方面，根瘤菌科毒力基因是根瘤菌属物种基因。在一方面，根瘤菌科毒力基因是中华根瘤菌属物种基因。在一方面，根瘤菌科毒力基因是中生根瘤菌属物种基因。在一方面，根瘤菌科毒力基因是叶杆菌属物种基因。在一方面，根瘤菌科毒力基因是苍白杆菌属物种基因。在一方面，根瘤菌科毒力基因是慢生根瘤菌属物种基因。
在一些方面，根瘤菌科毒力基因是农杆菌属物种基因。在一方面，农杆菌属物种基因是Agrobacterium albertimagni、Agrobacterium larrymoorei、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)、悬钩子农杆菌(Agrobacterium rubi)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或葡萄农杆菌(Agrobacterium vitis)基因。在一方面，农杆菌属基因是发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)或根癌农杆菌。在一方面，农杆菌属基因是发根农杆菌。在一方面，农杆菌属基因是根癌农杆菌。
许多具有Ti或Ri质粒的根癌农杆菌和发根农杆菌的野生型和解毒的(非致病性)菌株可用于基因转移到植物中。位于具有Ti或Ri质粒的野生型农杆菌的T-DNA中的植物激素合成基因转化后在植物细胞中表达，并根据农杆菌属菌株或物种引起瘤形成或毛状根表型。农杆菌的T-DNA可以被工程化以用一个或多个目的序列取代其许多毒力和致病决定簇(通过解毒)，并保留将修饰的T-DNA转移到植物细胞中并整合到基因组中的能力。含有这种解毒的Ti质粒的菌株被广泛用于植物转化。
在一些方面，载体构建体包含Ti质粒(根癌农杆菌)或Ri质粒(发根农杆菌)。在一些方面中，构建体包含一个或多个毒力基因。毒力基因可以来自Ti质粒并且在本文中表示为SEQ ID NO：4-27和SEQ ID NO：42-49(参见本文的表19)。毒力基因可以来自Ri质粒并且在本文中表示为SEQ ID NO：79-101。在本文中公开的Ri质粒毒力基因在vir基因名称之前使用“r”表示。例如，r-virA(SEQ ID NO：79)、r-virB1(SEQ ID NO：80)、r-virB2(SEQ IDNO：81)、r-virB3(SEQ ID NO：82)、r-virB4(SEQ ID NO：83)、r-virB5(SEQ ID NO：84)、r-virB6(SEQ ID NO：85)、r-virB7(SEQ ID NO：86)、r-virB8(SEQ ID NO：87)、r-virB9(SEQID NO：88)、r-virB10(SEQ ID NO：89)、r-virB11(SEQ ID NO：90)、r-virG(SEQ ID NO：91)、r-virC1(SEQ ID NO：92)、r-virC2(SEQ ID NO：93)、r-virD1(SEQ ID NO：94)、r-virD2(SEQID NO：95)、r-virD3(SEQ ID NO：96)、r-virD4(SEQ ID NO：97)、r-virD5(SEQ ID NO：98)、r-virF(SEQ ID NO：99)、r-virE3(SEQ ID NO：100)和r-galls(SEQ ID NO：101)。参见本文的表19。在本文中可以使用毒力基因(vir和r-vir)的不同组合。r-galls基因(SEQ ID NO：101)是本文所述的Ri质粒vir基因的毒力所必需的。
在一方面，所述载体进一步包含一个或多个农杆菌属毒力基因virA、virD3、virD4、virD5、virE1、virE2、virE3、virH、virH1、virH2、vir J、virK、virL、virM、virP或virQ或其变体和衍生物，或一种或多种农杆菌属毒力基因r-virA、r-virD3、r-virD4、r-virD5、r-virE3或r-virF或其变体和衍生物以及r-galls或其变体和衍生物。
在本公开中使用的苍白杆菌可以包含例如通过电穿孔引入的核酸。引入的核酸可以包含独立于VirD2功能的接合转移所需的多核苷酸、或者一个或多个毒力基因。引入的序列可以被插入到苍白杆菌基因组中。在其他实例中，引入的序列在一个或多个质粒上。在其他实例中，可以通过从另一种细菌物种的接合转移将多核苷酸转移至苍白杆菌中。例如，除了T4SS-依赖性T链递送系统之外，农杆菌还具有另外的质粒移动系统，其也可以在细菌细胞之间转移并整合质粒，如IncQ质粒pRFS1010，并通过接合转移将质粒转移并整合至植物基因组中(Buchanan-Wollaston等人(1987)Nature[自然]328：172-175，Shadenkov等人(1996)Mol Biol[分子生物学]30：272-275；Chen等人(2002)J Bacteriol[细菌学杂志]184：4838-4845)。此外，接合转移蛋白MobA与RFS1010质粒的MobB和MobC蛋白结合，切割oriT(转移起点)位点，连接5′末端并将ssDNA转移到独立于T4SS系统的细胞中(Bravo-Angel(1999)J Bacteriol[细菌学杂志]181：5758-5765，及其中的参考)。接合转移系统广泛存在于细菌中，导致细菌细胞之间遗传信息的交换。在根瘤菌中，其中根瘤菌是与系统发育有关的但不同于农杆菌(参见，例如，Spaink等人(编辑)，The Rhizobiaceae[根瘤菌科]，Kluwer Academic Publishers[克吕韦尔学术出版集团]，荷兰多德雷赫特，1998；和Farrand等人(2003)Int J Syst Evol Microbiol.[国际系统与进化微生物学杂志]53：1681-1687)，在一些物种中已经部分表征了接合转移系统(参见，例如Freiberg等人(1997)Nature[自然]387：394-401；Tumer等人(2002)FEMS Microbiol Ecol[FEMS微生物学生态学]42：227-234；Tun-Garrido等人(2003)J Bacteriol[细菌学杂志]185：1681-1692；以及Perez-Mendoza等人(2004)J Bacteriol[细菌学杂志]186：5753-5761)。与用于T-DNA动员的常规元件(分别为VirD2和RB和LB位点)相比，所述接合系统使用oriT作为切口位点并使用TraA或Mob作为切口酶。不像VirD2，其被发现在其C端具有用于植物核靶向的植物核定位信号(NLS)，而TraA或Mob都没有明显的NLS。
Ti/Ri质粒上的Vir区域是基因的一个集合，其集合功能是切除质粒的T-DNA区域并促进其转移和整合到植物基因组中。vir系统由植物响应伤害而产生的信号诱导。酚类化合物如乙酰丁香酮、注射器醛或香草乙酮激活virA基因，其编码是组成性表达的跨膜蛋白的受体。激活的virA基因充当激酶，使virG基因磷酸化。在其磷酸化形式中，virG充当剩余的vir基因操纵子的转录激活剂。virB操纵子编码产生孔/菌毛样结构的蛋白质。VirC结合过驱动序列。VirD1和virD2具有核酸内切酶活性，并且在左右边界内产生单链切割，并且virD4是偶联蛋白。VirE结合单链T-DNA，在所述过程的运输阶段对其进行保护。一旦进入植物细胞，就合成了T-DNA的互补链。
这些和其他的vir基因反过来起作用，所以这些基因都不需要包含在克隆载体中。例如，修饰的农杆菌菌株可以在其中T-DNA区域被删除的质粒上提供所有必需的Vir功能，从而允许细胞提供用于T-DNA转移的vir功能。在一个实例中，存在其中一部分pBR322(Bolivar等人，(1977).Gene[基因].2(2)：75-93；Bolivar等人(1977)Gene[基因]2(2)：95-113)用来替代T-DNA区域的和提供对氨苄青霉素的抗性的源自C58的菌株。
在设计用于转化过程的载体构建体时，选择将被引入到植物细胞或组织中的一种或多种遗传组分。遗传组分可包括使用苍白杆菌组合物和/或方法引入植物细胞或组织的任何核酸。遗传成分可以包括非植物DNA、植物DNA或合成DNA。在一些实例中，将遗传组分整合到DNA分子如重组双链质粒或载体分子中，所述DNA分子包含至少一种或多种以下遗传组分：在植物细胞中起作用以导致RNA序列的产生的启动子；导致RNA序列的产生的结构DNA序列；和指导RNA序列的3′末端的多腺苷酸化的3′非翻译的DNA序列。
提供了包含一个或多个用于在细胞基因组中表达和/或插入的目的序列的构建体。所述构建体可以包含在载体如二元载体(美国临时申请号62/252229，其全部内容通过引用并入本文)、三元载体或T-DNA载体中。构建体是指由具有不同功能和/或活性的各种类型的核苷酸序列组成的多核苷酸分子。各种类型的序列包括接头、衔接子、调节区、内含子、限制性位点、增强子、隔离子、可筛选标记、选择性标记、启动子、表达盒、编码多核苷酸、沉默多核苷酸、终止序列、复制起点、重组位点、切除盒、重组酶、细胞增殖因子、启动子捕获、有助于载体构建或分析的其他位点、或其任何组合。在一些实例中，构建体包含一个或多个表达盒，其中多核苷酸有效地连接至调节序列。“有效地连接”是两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，编码多核苷酸和调节序列(例如启动子)之间的有效连接是允许编码多核苷酸表达的功能性连接。有效地连接的元件可以是连续的或非连续的。当用于指两个蛋白质编码区域的连接时，有效地连接意在是这些编码区域处于相同的阅读框中。编码多核苷酸包括编码多肽或编码降低靶基因表达的沉默多核苷酸的任何多核苷酸。沉默多核苷酸的非限制性实例包括小干扰RNA、微RNA、反义RNA、发夹结构等。所述构建体还可以含有许多遗传组分以促进植物细胞或组织的转化并调节任何结构核酸序列的表达。在一些实例中，所述遗传组分被定位以表达mRNA，任选地所述mRNA被翻译成蛋白质。以双链形式存在的植物结构编码序列(基因、cDNA、合成DNA或其他DNA)的表达涉及通过RNA聚合酶从DNA的一条链转录信使RNA(mRNA)，和随后处理核内的mRNA初级转录物。该处理涉及一个3′非翻译区域，其聚腺苷酸化mRNA的3′末端。
T-DNA通过农杆菌转移到植物细胞的机制是众所周知的。简言之，T-DNA由两个边界区域序列(右边界(RB)和左边界(LB))划界。这些边界被毒力蛋白VirD2切割以产生在其5′末端共价连接VirD2的单链转移的DNA(“T链”)。蛋白质-DNA复合物(也包括农杆菌VirE2蛋白)通过包括毒力蛋白和ssDNA转运蛋白的4型分泌系统离开农杆菌细胞，并转移到植物细胞中。转移的DNA在植物细胞中进行进一步处理，并借助农杆菌毒力蛋白和植物因子的帮助整合到植物基因组中。使用农杆菌介导的载体将DNA引入植物细胞中是本领域众所周知的。(参见例如Fraley等人(1985)Bio/Technology[生物学/技术]3：629-635；Rogers等人(1987)Methods Enzymol[酶学方法]153：253-277；和美国专利5,563,055，其全部内容通过引用并入本文中)。可以转移这些相同的元件和机制来产生用于转化植物细胞的系统。
在一些实例中，构建体包含Ti或Ri质粒。在一些实例中，构建体包含一个或多个毒力基因。在一些实例中，Ti或Ri质粒是pC5105、pC5106或其变体或衍生物。在一些实例中，所提供的构建体能够从苍白杆菌virD2非依赖性转移，并且缺乏T-DNA边界序列，该构建体包含任选地有效地连接至目的序列的oriT序列和traA或mob序列。还提供了用这样的构建体转化的苍白杆菌。在一些实例中，苍白杆菌属包含含有T-DNA区域的Ti质粒，其中目的序列位于T-DNA内，任选位于T-DNA的左边界和右边界之间。合适的报道基因包括GUS或荧光蛋白，包括但不限于GFP、YFP、CFP、RFP、DsRed、ZsGreen、ZsYellow等。
在一些实例中，本文提供的转化方法可包括选择在没有选择剂的情况下用目的序列转化的植物细胞。选择用目的序列转化的植物细胞可以包括在选择剂存在下培养植物细胞，其中目的序列赋予对选择剂的耐受性或与赋予对选择的耐受性的另外的核酸有效地连接。这种选择剂的实例包括草甘膦、卡那霉素、双丙氨膦或麦草畏。在仍然其他的方面，所述目的序列与选择性标记基因没有物理连锁。例如，标记基因和目的序列可以在从用目的序列转化的植物细胞中再生的植物的子代中遗传分离。
植物生长调节剂或植物激素包括影响植物生长的化合物。植物生长调节剂包括但不限于：生长素、细胞分裂素、ABA、赤霉素、乙烯、油菜素内酯和多胺。生长素在低浓度下影响芽和根的伸长，但在较高水平下抑制生长。常用的生长素包括毒莠定(4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸)、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、IAA(吲哚-3-乙酸)、NAA(α-萘乙酸)和麦草畏(3，6-二氯茴香酸)。细胞分裂素引起细胞分裂、细胞分化和芽分化。常用的细胞分裂素包括激动素、BA(6-苄基氨基嘌呤)、2-ip(2-异戊烯基腺嘌呤)、BAP(6-苄基氨基嘌呤)、噻苯隆(TDZ)、玉米素核苷和玉米素。
转化是指将外源核酸序列引入细胞或组织中的过程。转化可能是暂时的或稳定的。在稳定的转化中，将部分或全部外源核酸整合(例如整合或稳定保持)在核基因组DNA或质体DNA中，或者能够在细胞核或质体中自主复制。
术语多核苷酸不限于仅包含DNA的组合物。多核苷酸可以包含核糖核苷酸或肽核酸、以及核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸和肽核酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子、合成类似物和修饰分子。多核苷酸还包括所有形式的序列，包括但不限于：单链、双链或多链形式、发夹、茎环结构、环状质粒等。
用于制备诸如盒、质粒或含有所需遗传组分的载体的构建体的多种方法和商业系统在本领域中是公知的。构建体通常由许多遗传组分组成，包括但不限于：调节元件如启动子、前导子、内含子和终止子序列。调节元件也称为顺式或反式调节元件，取决于元件与其控制的一个或多个序列基因的接近程度。
在一些实例中，构建体包含有效地连接至编码多核苷酸的启动子。术语启动子是指参与RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以开始编码序列的转录的DNA区域。启动子可以是天然存在的启动子、其变体或片段或是合成来源的。术语启动子是指指导转录所必需的最小序列(最小启动子)以及包含最小启动子和任意数目的附加元件的序列，例如操纵子序列、增强子、调节子、限制性位点、重组位点，位于最小启动子和编码序列之间的序列，以及5′-非翻译区(5′-UTR)的序列，其是被转录但不翻译成多肽的转录物区域，其可以以期望的方式影响或不以期望的方式影响转录水平。植物启动子是指从植物分离的启动子或由其衍生的启动子或在植物中起作用的异源启动子，例如来自植物病毒的启动子。可基于期望的结果或表达模式来选择启动子(关于植物启动子的综述，参见Potenza等人(2004)InVitro Cell Dev Biol[体外细胞和发育生物学]40：1-22)。
本领域已经描述了许多在植物细胞中有活性的启动子。响应于环境、激素、化学和/或发育信号而调节的各种启动子也可用于在植物细胞中表达任何构建体，包括例如受热调节的启动子(例如，Callis等人(1988)Plant Physiol[植物生理学]88：965-968)、受光调节的启动子(例如，pea RbcS-3A promoter[豌豆RbcS-3A启动子]，Kuhlemeier等人(1989)Plant Cell[植物细胞]1：471-478；和maize RbcS promoter[玉蜀黍RbcS启动子]，Schaffner等人(1991)Plant Cell[植物细胞]3：997-1012)、受激素，例如脱落酸调节的启动子(Marcotte等人(1989)Plant Cell[植物细胞]1：969-976)、受伤害调节的启动子(例如，Wuni等人(1989)Plant Cell[植物细胞]1：961-968)或受信号或化学品调节的启动子。描述启动子的实例包括但不限于：美国专利6,437,217(玉蜀黍RS81启动子)、美国专利5,641,876(水稻肌动蛋白启动子OsActl)、美国专利6,426,446(玉蜀黍RS324启动子)、美国专利6,429,362(玉蜀黍PR-1启动子)、美国专利6,232,526(玉蜀黍A3启动子)、美国专利5,322,938、5,352,605、5,359,142和5,530,196(35S启动子，35Senh)、美国专利6,433,252(玉蜀黍L3油脂蛋白启动子)、美国专利6,429,357(水稻肌动蛋白2启动子和水稻肌动蛋白2内含子)、美国专利5,837,848(根特异性启动子)、美国专利6,294,714(光诱导型启动子)、美国专利6,140,078(盐诱导型启动子)、美国专利6,252,138(病原体诱导型启动子)、美国专利6,175,060(缺磷诱导型启动子)、美国专利6,635,806(γ-coixin启动子)和美国专利7,151,204(玉蜀黍叶绿体醛缩酶启动子)。可以使用的另外的启动子是胭脂碱合酶(NOS)启动子(Ebert等人(1987)PNAS[美国科学院院报]84：5745-5749)、章鱼碱合酶(OCS)启动子(来自根癌农杆菌的瘤诱导性质粒)、花椰菜花叶病毒属启动子例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等人(1987)Plant Mol Biol[植物分子生物学]9：315-324)、CaMV 35S启动子(Odell等人(1985)Nature[自然]313：810-812)、玄参花叶病毒35S-启动子(Walker等人(1987)PNAS[美国科学院院报]84：6624；美国专利6,051,753；5,378,619)、蔗糖合酶启动子(Yang等人(1990)PNAS[美国科学院院报]87：4144-4148)、R基因复合体启动子(Chandler等人(1989)Plant Cell[植物细胞]1：1175-1183)、叶绿素a/b结合蛋白基因启动子、或花生褪绿条纹病花椰菜花叶病毒属启动子PClSV(美国专利5,850,019)。在一些实例中，可以使用At.Act 7(登录#U27811)、At.ANTI(US 20060236420)、FMy′35S-EFla(US 20050022261)、eIF4AlO(登录#X79008)和AGRtu.nos(基因库登录V00087；Depicker等人(1982)J Mol ApplGenet[应用基因学期刊]1：561-573；Bevan等人(1983)Nature[自然]304：184-187)、水稻细胞溶质丙糖磷酸盐异构酶(OsTPI；美国专利7,132,528)、和水稻肌动蛋白15基因(OsAct15；US 20060162010)启动子。在一些情况下，启动子可以包括5′UTR和/或第一内含子。
组成型启动子包括例如，Rsyn7启动子的核心启动子和WO 1999/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子、核心CaMV 35S启动子(Odell等人(1985)Nature[自然]313：810-812)、水稻肌动蛋白(McElroy等人(1990)Plant Cell[植物细胞]2：163-171)、泛素(Christensen等人(1989)Plant Mol Biol[植物分子生物学]12：619-632；和Christensen等人(1992)Plant Mol Biol[植物分子生物学]18：675-689)、pEMU(Last等人(1991)Theor Appl Genet[理论与应用遗传学]81：581-588)、MAS(Velten等人(1984)EMBOJ[欧洲分子生物学学会杂志]3：2723-2730)、ALS启动子(美国专利5,659,026)、农杆菌属胭脂碱合酶(NOS)启动子(Bevan等人(1983)Nucl Acids Res[核酸研究]11：369-385)；紫茉莉花叶病毒(MMV)启动子(Dey 和Maiti(1999)Plant Mol Biol[植物分子生物学]40：771-782；Dey和Maiti(1999)Transgenics[转基因学]3：61-70)、组蛋白2B(H2B)(WO 1999/43797)、香蕉条斑病毒(BSV)启动子(Remans等人(2005)Virus Research[病毒研究]108：177-186)、虎尾草条点花叶病(CSMV)启动子(Zhan等人(1993)Virology[病毒学]193：498-502)、木薯叶脉花叶病毒(CSVMV)启动子(Verdaguer等人(1998)Plant Mol Biol[植物分子生物学]37：1055-1067)、玄参花叶病毒(FMV)启动子(美国专利6,018,100)、水稻α-微管蛋白(OsTUBA1)启动子(Jeon等人(2000)Plant Physiol[植物生理学]123：1005-1014)、水稻细胞色素C(OsCC1)启动子(Jang等人(2002)Plant Physiol[植物生理学]129：1473-1481)、玉蜀黍醇脱氢酶1(ZmADH1)启动子(Kyozuka等人(1990)Maydica[美迪卡杂志]35：353-357)、油脂蛋白启动子等；其中的每一个通过引用整体并入本文中。其他组成型启动子被描述于例如美国专利5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；以及6,177,611；以上各个文献均通过引用以其全文并入本文中。
在一些实例中，可以在组合物和/或方法中使用诱导型启动子。伤口诱导型启动子(其可以对由昆虫摄食引起的损伤作出反应)包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因启动子；在美国专利5,428,148(其全部公开内容通过引用并入本文)中公开的wun1和wun2、系统素、WIP1、MPI基因启动子等。另外，可以使用病原体诱导型启动子，这种病原体诱导型启动子包括来自病程相关蛋白(PR蛋白)的那些，其在病原体感染后被诱导；例如但不限于PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶。参见例如WO 1999/43819，其全部公开内容通过引用并入本文中。可以使用在病原体感染部位处或附近局部表达的启动子。参见，例如美国专利号5,750,386(线虫诱导型)，其全部公开内容通过引用并入本文中；和玉蜀黍PRms基因的诱导型启动子，其表达是由病原体串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)诱导。
可以使用化学调节型启动子以通过应用外源化学调节剂来调节细胞或植物中的基因表达。在应用化学品诱导基因表达的情况下启动子可以是化学诱导型启动子，或者在应用化学品阻抑基因表达的情况下启动子可以是化学阻抑型启动子。化学诱导型启动子是本领域已知的，并且包括但不限于由苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉蜀黍In2-2启动子、由用作萌前除草剂的疏水亲电子化合物激活的玉蜀黍GST启动子、以及由水杨酸激活的烟草PR-1a启动子。其他的目的化学调节启动子包括类固醇应答启动子，如糖皮质激素诱导型启动子和四环素诱导型启动子和四环素抑制型启动子(参见例如，美国专利5,814,618和5,789,156，其全部公开内容通过引用并入本文中)。
组织偏好性启动子可以用于靶向特定植物组织内的增强的多肽表达。本领域已知组织优选的启动子，并且它们包括那些可被修饰用于弱表达的启动子。叶偏好性的、根偏好性的或根特异性启动子可以选自本领域已知的那些，或从各种相容性物种重新分离。根特异性启动子的实例包括大豆谷氨酰胺合酶基因的启动子、法国菜豆的GRP 1.8基因中的控制元件、根癌农杆菌的甘露碱合酶(MAS)基因和编码细胞溶质谷氨酰胺合酶(GS)的全长cDNA克隆。根特异性启动子还包括从固氮非豆科植物植物糙叶山黄麻(Parasponiaandersonii)和相关的非固氮非豆科植物山黄麻(Trema tomentosa)的血红蛋白基因中分离的那些，发根农杆菌高表达rolC和rolD根诱导基因的启动子、章鱼碱合酶的根-尖特异性启动子、以及TR2′和TR1′基因的根特异性启动子。另外的根偏好性启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子和rolB启动子。参见，例如美国专利5,837,876；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732和5,023,179，各自的全部公开通过引用并入本文中。拟南芥根偏好性调节序列在US 20130117883中公开，其全部公开内容通过引用并入本文中。
种子偏好性启动子包括种子特异性启动子(在种子发育期间有活性的那些启动子如种子贮藏蛋白的启动子)以及种子发芽性启动子(在种子发芽期间有活性的那些启动子)。这样的种子优选的启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导的信息)；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米蛋白)；和milps(肌醇-1-磷酸合酶)(参见，美国专利6,225,529，其全部公开通过引用并入本文中)。γ-玉蜀黍蛋白和Glb-1是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于：Kunitz型胰蛋白酶抑制剂3(KTi3)、菜豆β-菜豆素、油菜籽蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白1、大豆凝集素、十字花科蛋白等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于：玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、γ-玉米醇溶蛋白、糯质基因、超甜基因1、超甜基因2、球蛋白1等。在双子叶植物中，种子特异性启动子包括但不限于：来自拟南芥属的种皮启动子，pBAN；和来自拟南芥的早期种子启动子，p26、p63和p63tr(美国专利7,294,760和7,847,153，其全部公开内容通过引用并入本文中)。在特定组织中具有“优选”表达的启动子在该组织中比在至少一种其他植物组织中更大程度地表达。一些组织优先的启动子几乎专门在特定组织中表达。
还可以构建启动子嵌合体以增强转录活性(美国专利5,106,739)，或者组合所需的转录活性、诱导性、组织特异性、发育特异性或其任何组合。在植物中起作用的启动子包括但不限于：诱导型、病毒型、合成型、组成型、时间调调节型、空间调节型和/或时空调节型的启动子。组织增强的、组织特异性的和/或发育调节的其他启动子也是本领域已知的并且可以与本文提供的组合物和/或方法一起使用。
如果需要，可以修饰用于DNA构建体(即嵌合/重组植物基因)中的启动子以影响控制或表达特征。启动子可以通过与操纵子区域的连接、随机或受控的诱变或其他方式来获得。此外，可以改变启动子以含有多个增强子序列以帮助提高基因表达。
转录的终止可以通过与目的序列或其他序列有效地连接的3′非翻译的DNA序列来完成。重组DNA分子的3′非翻译区含有聚腺苷酸化信号，其在植物中起作用以使RNA的3′端添加腺苷酸核苷酸。终止区可以从在植物细胞中表达的各种基因获得，并且可以对转录起始区、有效地连接的多核苷酸和/或宿主细胞是天然的，或者终止区可以源自启动子、多核苷酸、宿主细胞或其任何组合的另一来源(即，外源的或异源的)。从马铃薯蛋白酶抑制剂(PinII)基因或根癌农杆菌的Ti质粒如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区(Fraley等人(1983)PNAS[美国科学院院报]80：4803-4807)可获得方便的终止区。还参见，Guerineau等人，(1991)Mol Gen.Genet.[分子遗传和基因组学]262：141-144；Proudfoot(1991)Cell[细胞]64：671-674；Sanfacon等人，(1991)Genes Dev.[基因与发展]5：141-149；Mogen等人，(1990)Plant Cell[植物细胞]2：1261-1272；Munroe等人，(1990)Gene[基因]，91：151-158；Ballas等人(1989)Nucl Acids Res[核酸研究]17：7891-7903；和Joshi等人(1987)NuclAcid Res[核酸研究]15：9627-9639。还可以使用的是来自豌豆RbcS2基因的聚腺苷酸化分子(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi等人(1984)EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]3：1671-1679)、AGRtu.nos(基因库登录E01312)、E6(登录#U30508)、水稻谷蛋白(Okita等人(1989)J BiolChem[生物化学杂志]264：12573)、和TaHsp17(wheat low molecular weight heat shockprotein gene[小麦低分子量热休克蛋白基因]；基因库登录#X13431)。
表达盒可以另外包含5′前导序列。这些前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5’非编码区域)(Elroy-Stein等人(1989)PNAS[美国科学院院报]86：6126 6130)；马铃薯Y病毒组前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie等人(1995)Gene[基因]165：233-238，和人类免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人(1991)Nature[自然]353：9094)；来自苜蓿花叶病病毒的外壳多肽mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling等人(1987)Nature[自然]325：622 625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人(1989)在Molecular Biology of RNA[RNA的分子生物学]中，编辑：Cech(Liss，纽约)，第237-256页)、和玉蜀黍褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel等人(1991)Virology[病毒学]81：382385)。还可参见Della Cioppa等人(1987)Plant Physiol[植物生理学]84：965 968。
构建体可以或可以不包含编码选择性标记的序列。在一些方面，选择性标记基因有助于转化的细胞或组织的选择。选择性标记序列包括编码抗生素抗性的序列，如新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)，以及赋予对除草剂化合物(如草胺磷、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D))的抗性的序列。合适的选择性标记序列的其他实例包括但不限于：编码对氯霉素、甲氨蝶呤、链霉素、壮观霉素、博来霉素、磺酰胺、溴苯腈、草丁膦和草甘膦的抗性的序列(参见例如，US 20030083480和US 20040082770，其全部公开内容通过引用并入本文中)。
在一些实例中，构建体可以包括编码重组酶的序列和/或其相应的重组位点。在一些实例中，重组酶的侧翼为两个或更多个重组位点，并且重组位点处于相同的平行方向上。平行取向是指两个或更多个重组序列都或者全部在3′至5′的方向，或都或者全部以5′至3′的方向。如本文所述，以相同方向排列的一组重组位点将导致重组位点之间的插入DNA序列的切除而不是倒位。当重组位点以相反或混合的方向取向时发生倒位。
也称为位点特异性重组酶的重组酶是催化其相容性重组位点之间的保守位点特异性重组的多肽。重组酶可以包括保留重组酶活性的天然多肽、变体和/或片段。编码重组酶的序列可以包括编码保留重组酶活性的重组酶的天然多核苷酸、变体和/或片段。编码的合适的重组酶包括天然重组酶或重组酶的生物活性片段或变体，如催化特定重组位点之间的保守性位点特异性重组的那些。天然多肽或多核苷酸包含天然存在的氨基酸序列或核苷酸序列。重组酶及其相容性位点可被称为重组酶系统。任何重组酶系统都可以使用。在一些实例中，使用来自整合酶和解离酶家族的重组酶。
在一些实例中，可以使用嵌合重组酶。嵌合重组酶是重组融合蛋白，该重组融合蛋白能够催化在重组位点之间的位点特异性重组，这些重组位点发源于不同的重组系统。例如，如果重组位点的组包含FRT位点和LoxP位点，则可以使用嵌合FLP/Cre重组酶或其活性变体或片段，或者可以分别提供两种重组酶。用于生产和使用此类嵌合重组酶或其活性变体或片段的方法描述在例如，WO 99/25840中，将其全部公开内容通过引用并入本文中。
可以在方法和组合物中使用任何合适的重组位点或重组位点的组，其包括但不限于：FRT位点、FRT位点的功能性变体、LOX位点和LOX位点的功能性变体、任何其组合或已知的重组位点的任何其他的组合。重组酶系统包括但不限于：噬菌体Mu的Gin重组酶、大肠杆菌的Pin重组酶、来自志贺氏杆菌(Shigella)的PinB、PinD和PinF以及鲁氏结合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)的R/RS系统。
功能变体包括嵌合重组位点，例如，与LOX位点融合的FRT位点。例如，可以使用来自Cre/Lox位点特异性重组系统的重组位点。这样的重组位点包括例如，天然的LOX位点和LOX的各种功能变体(参见例如，美国专利6,465,254和WO 01/111058，其全部公开内容通过引用并入本文中)。重组基因修饰的FRT重组位点可以用于各种体外和体内位点特异性重组方法，其允许目的核苷酸序列的靶向整合、交换、修饰、改变、切除、倒位和/或表达，参见例如，WO 99/25821、WO 99/25854、WO 99/25840、WO 99/25855、WO 99/25853和WO 2007/011733，其全部公开内容通过引用并入本文中。
在一些实例中，构建体可以包括一种或多种细胞增殖因子。在一些实例中，细胞增殖因子来自AP2/ERF蛋白质家族。AP2/ERF蛋白质家族是植物特异性的一类推定转录因子，其调节各种各样的发育过程并且以存在AP2/ERFDNA结合结构域为特征。基于保守结构域的存在，AP2/ERF蛋白被细分为不同的亚家族。最初，基于DNA结合结构域的数目将所述家族分成两个亚家族，ERF亚家族具有一个DNA结合结构域，并且AP2亚家族具有两个DNA结合结构域。随着更多的序列被鉴定，该科随后被细分为五个亚科：AP2、DREB、ERF、RAV等。APETALA2(AP2)蛋白质家族的成员在多种生物学事件中起作用，这包括但不限于：发育、植物再生、细胞分裂、胚发生和细胞增殖。AP2科包括但不限于来自玉蜀黍的AP2、ANT、Glossy15、AtBBM、BnBBM和ODP2(BBM)。
构建体可以包含一个或多个目的序列。在一些实例中，目的序列赋予转化的细胞或植物性状。在一些实例中，目的序列赋予昆虫抗性。昆虫抗性基因可以编码对害虫例如根虫、切根虫、欧洲玉米螟、大豆尺蠖、大豆胞囊线虫、蚜虫等的抗性。实例包括编码苏云金芽孢杆菌δ-内毒素的多核苷酸，如Cry蛋白，参见例如美国专利5,188,960；5,366,892；5,593,881；5,689,052；5,723,756；5,736,514；5,747,450；5,880,275；5,986,177；6,023,013；6,033,874；6,060,594；6,063,597；6,077,824；6,083,499；6,127,180；6,218,188；6,326,351；6,399,330；6,340,593；6,548,291；6,620,988；6,624,145；6,642,030；6,248,535；6,713,259；6,893,826；6,949,626；7,064,249；7,105,332；7,179,965；7,208,474；7,227,056；7,288,643；7,323,556；7,329,736；7,378,499；7,385,107；7,476,781；7,449,552；7,462,760；7,468,278；7,504,229；7,510,878；7,521,235；7,544,862；7,605,304；7,696,412；7,629,504；7,705,216；7,772,465；7,790,846；7,803,943；7,858,849；WO 1991/14778；WO 1999/31248；WO 2001/12731；WO 1999/24581；WO 1997/40162；US 20060112447；US 20060191034；US 20120278954；US 20110064710；和WO 2012/139004，其全部公开通过引用并入本文。Δ-内毒素的其他实例还包括但不限于：美国专利8,304,604和8,304,605(其全部公开内容通过引用并入本文中)的DIG-3或DIG-11毒素(Cry蛋白(如Cry1A)的α螺旋1和/或α螺旋2变体的N末端缺失)；美国专利7,070,982；6,962,705和6,713,063(其全部公开内容通过引用并入本文中)的Cry1A/F嵌合体；Cry3A蛋白，其包括但不限于：通过融合至少两种不同Cry蛋白的可变区和保守区的独特组合产生的工程化杂合杀昆虫蛋白(eHIP)(US 20100017914，其全部公开内容通过引用并入本文中)；US 20080295207(其全部公开内容通过引用并入本文中)的TIC807；PCT/US 2006/033867(其全部公开内容通过引用并入本文中)的ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128；AXMI蛋白，如在以下美国专利中的那些：8,236,757、7,923,602、8,084,416、8,334,431、8,318,900；WO 2006/083891；WO2005/038032；WO 2005/021585；US 20040250311；US 20040216186；US 20040210965；US20040210964；US 20040197917；US 20040197916；WO 2006/119457；WO 2004/074462；US20110023184；US 20110263488；US 20100197592；WO 2011/103248；WO 2011/103247；US20100298211；US 20090144852；US 20100005543，其全部公开通过引用并入本文；和Cry蛋白，如美国专利8,319,019中具有修饰的蛋白水解位点的Cry1A和Cry3A，其全部公开内容通过引用并入本文中。本领域技术人员熟知的多于一种杀有害生物蛋白也可以各自地在植物中表达，例如Vip3Ab和Cry1Fa(US 20120317682，通过引用并入本文中)；Cry1BE和Cry1F(US20120311746，通过引用并入本文中)；Cry1CA和Cry1AB(US 20120311745，通过引用并入本文中)；Cry1F和CryCa(US 20120317681，通过引用并入本文中)；Cry1DA和Cry1BE(US20120331590，通过引用并入本文中)；Cry1DA和Cry1Fa(US 20120331589，通过引用并入本文中)；Cry1AB和Cry1BE(US 20120324606，通过引用并入本文中)；以及Cry1Fa、Cry2Aa、Cry1I或CrylE(US 20120324605，通过引用并入本文中)。杀有害生物蛋白还包括美国专利7,491，869的杀昆虫脂肪酶，包括脂酰基水解酶，其全部公开内容通过引用并入本文中。杀有害生物蛋白还包括美国专利5,877,012、6,107,279、6,137,033、7,244,820、7,615,686和8,237,020中的VIP(营养型杀昆虫蛋白)毒素，其全部公开内容通过引用并入本文中。其他VIP蛋白为本领域技术人员所熟知。杀有害生物蛋白还包括毒素复合物(TC)蛋白，该毒素复合物蛋白可从生物体如致病杆菌属(Xenorhabdus)、发光杆菌属(Photorhabdus)和类芽孢杆菌属(Paenibacillus)获得(参见，美国专利7,491,698和8,084,418，其全部公开内容通过引用并入本文中)。
编码抗真菌蛋白质的多核苷酸也是有用的(例如美国专利6,875,907、7,498,413、7,589,176、7,598,346、8,084,671、6,891,085和7,306,946；通过引用并入本文中)。用于感知几丁质片段的编码LysM受体样激酶的多核苷酸作为抗真菌病原体的植物防御应答的第一步骤(US 20120110696，通过引用并入本文中)也是有用的。其他合适的多核苷酸包括编码瞬时疏水性肽的那些，例如在WO 1995/16776和美国专利5,580,852(均通过引用并入本文中)中描述的那些抑制真菌植物病原体的鲎抗菌肽的肽衍生物，以及在WO 1995/18855和美国专利5,609,914中描述的那些，通过引用并入本文中(赋予疾病抗性的合成抗微生物肽)。其他合适的多核苷酸包括编码解毒肽的那些，如伏马菌素、白僵菌素、串珠镰刀菌素和玉米赤霉烯酮及其结构相关的衍生物。例如，参见美国专利5,716,820；5,792,931；5,798,255；5,846,812；6,083,736；6,538,177；6,388,171和6,812,380(其全部公开内容通过引用并入本文中)、和无毒性(avr)和疾病抗性(R)基因(Jones等人(1994)Science[科学]266：789；Martin等人(1993)Science[科学]262：1432；和Mindrinos等人(1994)Cell[细胞]78：1089)；等等。
在其他实例中，一个或多个目的序列可以改变植物、植物组织、植物部分或种子的组成。在一些实例中，这些包括改变脂肪酸含量或分布，改变氨基酸含量或分布，改变碳水化合物含量或分布，改变纤维含量或分布、和/或改变植物或其部分的可消化性或可加工性等等。目的序列的实例包括但不限于：影响淀粉生产的基因(美国专利6,538,181；6,538,179；6,538,178；5,750,876；6,476,295)，修饰的石油生产的基因(美国专利6,444,876；6,426,447；6,380,462)，高产油的基因(美国专利6,495,739；5,608,149；6,483,008；6,476,295)，修饰的脂肪酸含量的基因(美国专利6,828,475；6,822,141；6,770,465；6,706,950；6,660,849；6,596,538；6,589,767；6,537,750；6,489,461；6,459,018)，高蛋白产量的基因(美国专利6,380,466)、果实成熟的基因(美国专利5,512,466)、增强的动物和人类营养的基因(美国专利6,723,837；6,653,530；6,5412,59；5,985,605；6,171,640)，生物聚合物的基因(美国专利RE37,543；美国专利6,228,623；5,958,745和US 20030028917)，改良的加工性状的基因(美国专利6,476,295)，改良的可消化性的基因(美国专利6,531,648)，低棉子糖的基因(美国专利6,166,292)，工业酶生产的基因(美国专利5,543,576)，改良的风味的基因(美国专利6,011,199)，固氮的基因(美国专利5,229,114)，杂交种子生产的基因(美国专利5,689,041)，纤维生产的基因(美国专利6,576,818；6,271,443；5,981,834；5,869,720)和生物燃料生产的基因(美国专利5,998,700)，其每一篇的公开内容通过引用并入本文中。
例如，硬脂酰-ACP的下调可以增加植物的硬脂酸含量。参见，WO 1999/64579，其全部公开内容通过引用并入本文中；通过FAD-2基因修饰提高油酸和/或通过FAD-3基因修饰降低亚麻酸(参见美国专利6,063,947，6,323,392，6,372,965和WO 1993/11245，其全部公开内容通过引用并入本文中)；改变共轭亚麻酸或亚油酸含量，例如在WO 2001/12800中，各自的全部公开内容通过引用并入本文中；改变LEC1、AGP、Dek1、Superal1、milps、各种Ipa基因(如Ipa1、Ipa3、hpt或hggt)。例如，参见WO 2002/42424、WO 1998/22604、WO 2003/011015、WO 2002/057439、美国专利6,423,886、6,197,561、6,825,397、US 20030079247和US 20030204870，其全部公开内容通过引用并入本文中。编码用于制备长链多不饱和脂肪酸的δ-8去饱和酶的多核苷酸(美国专利8,058,571和8,338,152，其全部公开内容通过引用并入本文中)和用于降低饱和脂肪的Δ-9去饱和酶(美国专利8,063,269，其全部公开内容通过引用并入本文中)；与脂质和糖代谢调节相关的多核苷酸和编码的蛋白，特别是用于生产转基因植物和调节种子储存化合物(包括脂质、脂肪酸、淀粉或种子储存蛋白)的水平的方法中以及并用于调节植物种子大小、种子数、种子重量、根长和叶子大小的方法中的脂质代谢蛋白(LMP)(EP 2404499，其全部公开内容通过引用并入本文中)；改变植物中糖诱导型2(HSI2)蛋白的高水平表达以增加或减少植物中HSI2的表达。增加HSI2的表达增加油含量，然而降低HSI2的表达降低脱落酸敏感性和/或增加抗旱性(US 20120066794，其全部公开内容通过引用并入本文中)；细胞色素b5(Cb5)单独的或与FAD2一起的表达调节植物种子中的油含量，特别是提高ω-3脂肪酸的水平，并提高ω-6脂肪酸与ω-3脂肪酸的比例(US20110191904，其全部公开内容通过引用并入本文中)；和用于调节糖代谢的编码褶皱1-样多肽的多核苷酸(美国专利8,217,223，其全部公开内容通过引用并入本文中)。脂肪酸修饰基因也可用于通过淀粉和油途径的相互关系影响淀粉含量和/或组成。改变的抗氧化剂含量或组成，如改变生育酚或生育三烯酚。例如，参见，美国专利6,787,683、US 20040034886和WO 2000/68393，其全部公开内容通过引用并入本文中，其涉及对抗氧化剂水平的操作以及通过改变黑尿酸香叶基香叶基转移酶(hggt)(WO 2003/082899)；以及改变的必需种子氨基酸。例如，参见，美国专利6,127,600(其全部公开内容通过引用并入本文中)(增加种子中必需氨基酸积累的方法)、美国专利6,080,913(其全部公开内容通过引用并入本文中)(增加种子中必需氨基酸积累的二元方法)、美国专利5,990,389(其全部公开内容通过引用并入本文中)(高赖氨酸)、WO 1999/40209(其全部公开内容通过引用并入本文中)(种子中氨基酸组成的改变)、WO 1999/29882(其全部公开内容通过引用并入本文中)(改变蛋白质氨基酸含量的方法)、美国专利5,850,016(其全部公开内容通过引用并入本文中)(种子中氨基酸组成的改变)、WO 1998/20133(其全部公开内容通过引用并入本文中)(具有增强的必需氨基酸水平的蛋白质)、美国专利5,885,802(其全部公开内容通过引用并入本文中)(高蛋氨酸)、美国专利5,885,801(其全部公开内容通过引用并入本文中)(高苏氨酸)、美国专利6,664,445(其全部公开内容通过引用并入本文中)(植物氨基酸植物合成酶)、美国专利6,459,019(其全部公开内容通过引用并入本文中)(增加赖氨酸和苏氨酸)、美国专利6,441,274(其全部公开内容通过引用并入本文中)(植物色氨酸合酶β亚基)、美国专利6,346,403(其全部公开内容通过引用并入本文中)(甲硫氨酸代谢酶)、美国专利5,939,599(其全部公开内容通过引用并入本文中)(高硫)、美国专利5,912,414(其全部公开内容通过引用并入本文中)(增加的甲硫氨酸)、WO 1998/56935(其全部公开内容通过引用并入本文中)(植物氨基酸生物合成酶)、WO 1998/45458(其全部公开内容通过引用并入本文中)(具有较高百分比的必需氨基酸的工程种子蛋白)、WO 1998/42831(其全部公开内容通过引用并入本文中)(增加的赖氨酸)、美国专利5,633,436(其全部公开内容通过引用并入本文中)(增加含硫氨基酸含量)、美国专利5,559,223(其全部公开内容通过引用并入本文中)(合成的储藏蛋白)、WO 1996/01905(其全部公开内容通过引用并入本文中)(增加的苏氨酸)、WO1995/15392(其全部公开内容通过引用并入本文中)(增加的赖氨酸)、US 20030163838、US20030150014、US 20040068767、美国专利6,803,498和WO 2001/79516(其全部公开内容通过引用并入本文中)。赋予植物可消化性的多核苷酸也是有用的。例如，通过调节木聚糖合酶的表达可以实现改变植物细胞壁中存在的木聚糖水平(参见例如美国专利8,173,866，其全部公开内容通过引用并入本文中)。
在一些实例中，一个或多个目的序列包括控制雄性不育的多核苷酸，其包括但不限于：在美国专利4,654,465和4,727,219(其全部公开内容通过引用并入本文中)和美国专利3,861,709和3,710,511(其全部公开内容通过引用并入本文中)中公开的那些。除此之外，美国专利5,432,068(其全部公开内容通过引用并入本文中)描述了细胞核雄性不育的系统。关于细胞核雄性和雌性不育系统和基因的另外的实例，也可参见美国专利5,859,341；6,297,426；5,478,369；5,824,524；5,850,014；和6,265,640，所有这些专利全部都通过引用并入本文中。
在一些实例中，在这些方面中有用的目的序列包括影响非生物胁迫抗性的多核苷酸，其包括但不限于：开花、结穗和种子发育、提高氮利用率、改变的氮反应性、抗旱性或耐受性、抗寒性或冷耐受性和耐盐性或盐耐受性和在胁迫下增加的产量。例如，参见：WO2000/73475，其全部公开内容通过引用并入本文中，其中通过改变苹果酸改变水的使用效率；美国专利5,892,009、5,965,705、5,929,305、5,891,859、6,417,428、6,664,446、6,706,866、6,717,034、6,801,104、WO 2000/060089、WO 2001/026459、WO 2001/035725、WO 2001/034726、WO 2001/035727、WO 2001/036444、WO 2001/036597、WO 2001/036598、WO 2002/015675、WO 2002/017430、WO 2002/077185、WO 2002/079403、WO 2003/013227、WO 2003/013228、WO 2003/014327、WO 2004/031349、WO 2004/076638、WO 199809521，其全部公开内容通过引用并入本文中；WO 199938977(其全部公开内容通过引用并入本文中)，其描述了基因(包括CBF基因)以及有效减轻冷冻、高盐度和干旱对植物的负面影响以及赋予植物表型其他积极作用的转录因子；US 20040148654和WO 2001/36596，其中在植物中改变脱落酸，产生改良的植物表型，例如增加的产量和/或增加的对非生物胁迫的耐受性，其全部公开内容通过引用并入本文中；WO 2000/006341、WO 2004/090143、美国专利7,531,723和6,992,237(其全部公开内容通过引用并入本文中)，其中改性细胞分裂素表达，产生具有增加的胁迫耐受性(例如耐旱性和/或增加的产量)的植物。还可参见，WO 2002/02776、WO 2003/052063、JP 2002/281975、美国专利6,084,153、WO 2001/64898、美国专利6,177,275和美国专利6,107,547(提高氮利用率和改变氮反应性)，其全部公开内容通过引用并入本文中；关于乙烯改变，参见US 20040128719、US 20030166197和WO 200032761，其全部公开内容通过引用并入本文中；关于非生物胁迫的植物转录因子或转录调节子，参见例如US20040098764或US 20040078852，其全部公开内容通过引用并入本文中；编码增加液泡焦磷酸酶(如AVP1)表达的多肽的多核苷酸(美国专利8,058,515，其全部公开内容通过引用并入本文中)用于提高产量；编码HSFA4或HSFA5的核酸(A4或A5类的热休克因子)多肽，寡肽转运蛋白(OPT4样)多肽；间隔期2样(PLA2样)多肽或Wuschel相关同源盒1样(WOX1样)多肽(US20110283420，其全部公开内容通过引用并入本文中)；下调编码聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)蛋白的多核苷酸以调节程序性细胞死亡(美国专利8,058,510，其全部公开内容通过引用并入本文中)以增加活力；编码用于赋予抗旱性的DTP21多肽的多核苷酸(US20110277181，其全部公开内容通过引用并入本文中)；编码ACC合酶3(ACS3)蛋白质的核苷酸序列，用于调节发育、调节胁迫应答和调节胁迫耐受性(US 20100287669，其全部公开内容通过引用并入本文中)；编码赋予耐旱表型(DTP)的蛋白质以赋予抗旱性的多核苷酸(WO2012/058528，其全部公开内容通过引用并入本文中)；赋予耐旱性和耐盐性的生育酚环化酶(TC)多核苷酸(US 20120272352，其全部公开内容通过引用并入本文中)；编码CAAX氨基末端家族蛋白质的多核苷酸，用于胁迫耐受性(美国专利8,338,661，其全部公开内容通过引用并入本文中)；SAL1编码多肽中的突变具有增加的胁迫耐受性，包括增加的抗旱性(US20100257633，其全部公开内容通过引用并入本文中)；编码增加产量相关性状的多肽(选自由GRF多肽、RAA1样多肽、SYR多肽、ARKL多肽和YTP多肽组成的组)的多核苷酸的表达(US20110061133，其全部公开内容通过引用并入本文中)；调节植物中编码III类海藻糖磷酸酯酶(TPP)多肽的多核苷酸的表达，用于增强植物中产量相关的性状，特别是增加种子产量(US 20100024067，其全部公开内容通过引用并入本文中)。
在一些实例中，一个或多个目的序列包括其他的多核苷酸，其影响植物生长和农学性状，例如产量、开花、植物生长和/或植物结构，参见例如，WO 1997/49811(其全部公开内容通过引用并入本文中)(LHY)、WO 1998/56918(其全部公开内容通过引用并入本文中)(ESD4)、WO 1997/10339和美国专利6,573,430(其全部公开内容通过引用并入本文中)(TFL)、美国专利6,713,663(其全部公开内容通过引用并入本文中)(FT)、WO 1996/14414(CON)、WO 1996/38560、WO 2001/21822(以上各专利全部公开内容通过引用并入本文中)(VRN1)、WO 2000/44918(其全部公开内容通过引用并入本文中)(VRN2)、WO 1999/49064(其全部公开内容通过引用并入本文中)(GI)、WO 2000/46358(其全部公开内容通过引用并入本文中)(FR1)、WO 1997/29123、美国专利6,794,560、美国专利6,307,126(其全部公开内容通过引用并入本文中)(GAI)、WO 1999/09174(其全部公开内容通过引用并入本文中)(D8和Rht)和WO 2004/031349(其全部公开内容通过引用并入本文中)(转录因子)。
在一些实例中，一个或多个目的序列包括赋予增加的产量的多核苷酸。例如，由编码核酸的1-氨基环丙烷-1-羧酸酯脱氨酶样多肽(ACCDP)转化的作物植物，其中，与该植物的野生型品种相比，在该作物植物中的表达使该植物具有增加的根生长、和/或增加的产量、和/或增加的对环境胁迫的耐受性(美国专利8,097,769，其全部公开内容通过引用并入本文中)；已显示，使用种子偏好性启动子的玉蜀黍锌指蛋白基因(Zm-ZFP1)的过表达能促进植物生长、增加每株植物的核数和总核重量(US 20120079623，其全部公开内容通过引用并入本文中)；已显示，玉蜀黍侧生器官界限(LOB)结构域蛋白(Zm-LOBDPI)的组成型过表达能增加每株植物的核数和总核重量(US 20120079622；其全部公开内容通过引用并入本文中)；通过调节植物中编码VIM1(甲基化1中的变体)样多肽或VTC2样(GDP-L-半乳糖磷酸化酶)多肽或DUF1685多肽或ARF6样(生长素应答因子)多肽(WO 2012/038893，其全部公开内容通过引用并入本文中)的核酸的表达来增强植物中产量相关的性状；调节植物中编码Ste20样多肽或其同系物的核酸的表达，得到相对于对照植物具有增加的产量的植物(EP2431472；其全部公开内容通过引用并入本文中)；以及编码核苷二磷酸酶激酶(NDK)多肽及其同源物的多核苷酸，用于修饰该植物根系结构(US 20090064373，其全部公开内容通过引用并入本文中)。
除草剂抗性性状可以包括编码针对起到抑制乙酰乳酸合酶(ALS)之作用的除草剂的抗性的基因，特别是磺酰脲型除草剂(例如含有导致这种抗性的突变特别是S4和/或HRA突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因)；编码对能抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草剂的抗性的基因，诸如草胺瞵或basta(例如bar基因)；草甘磷(如，EPSPS基因和gat基因；参见例如US20040082770和WO 03/092360，其全部公开内容通过引用并入本文中)或本领域已知的其他此类基因。bar基因编码对除草剂basta的抗性，nptII基因编码氨基糖苷3′-磷酸转移酶并提供对抗生素卡那霉素、新霉素遗传霉素和巴龙霉素的抗性，并且ALS基因突变体编码对除草剂氯磺隆的抗性。
在本公开的一个实例中，构建体包含可选择的、可筛选的或可鉴定的标记基因。充当选择或筛选装置的DNA可以在可再生的植物组织中起作用，以产生赋予植物组织对否则有毒性的化合物的抗性的化合物。许多可筛选或可选择的标记基因是本领域已知的并且可以使用。选择性标记和基因的实例在Miki和McHugh((2004)J Biotechnol[生物技术杂志]107193-232)中提供。用作可选择的、可筛选的或可鉴定的标记的目的基因包括但不限于：gus、GFP(绿色荧光蛋白)、红色荧光蛋白(RFP；DsRED)、黄色荧光蛋白(YFP；ZsYELLOW)、蓝绿色荧光蛋白(CFP)、荧光素酶(LUX)，赋予对抗生素如卡那霉素(Dekeyser等人(1989)PlantPhysiol[植物生理学]90：217-223)、新霉素、卡那霉素，巴龙霉素、G418、氨基糖苷、壮观霉素、链霉素、潮霉素B、博来霉素、腐草霉素、磺酰胺、链丝菌素、氯霉素、甲氨蝶呤、2-脱氧葡萄糖、甜菜醛、S-氨基乙基L-半胱氨酸、4-甲基色氨酸、D-木糖、D-甘露糖、苄基腺嘌呤-N-3-葡糖醛酸糖苷酶耐受性的基因，编码对除草剂有耐受性的酶的基因，例如草甘膦(例如，5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸酯合酶(EPSPS)：Della-Cioppa等人(1987)Bio/Technology[生物学/技术]5：579-584；美国专利5,627,061；5,633,435；6,040,497；5,094,945；W004074443和W0 04009761；草甘膦氧化还原酶(GOX；美国专利5,463,175)、草甘膦脱羧酶(W005003362和US 20040177399)；或草甘膦N-乙酰转移酶(GAT；US 20030083480)、茅草枯(例如，赋予对2，2-二氯丙酸的耐受性的dehI编码2，2-二氯丙酸脱卤素酶(茅草枯；W0199927116)、溴苯腈(用于赋予溴苯腈耐受性的卤代芳基腈酶(Bxn)(W0 198704181；美国专利4,810,648；W0 198900193 A))、磺酰基除草剂(例如，赋予对乙酰乳酸合酶抑制剂(例如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶基氧基苯甲酸和苯酞)的耐受性的乙酰羟基酸合酶或乙酰乳酸合酶；(美国专利6,225,105；5,767,366；4,761,373；5,633,437；6,613,963；5,013,659；5,141,870；5,378,824；和5,605,011))；编码ALS，GST-II)、双丙氨膦或草丁膦或衍生物(例如，赋予草丁膦或草铵膦耐受性的草丁膦乙酰转移酶(bar)(美国专利5,646,024；5,561,236；5,276,268；5,637,489和5,273,894；和EP 275,957)；莠去津(编码GST-III)、麦草畏(麦草畏单氧酶(DMO；US 20030115626，US 20030135879)、和稀禾定(改性的乙酰基-辅酶A羧化酶，用于赋予对环己二酮(稀禾定)和芳氧基苯氧基丙酸(氟吡甲禾灵)(美国专利6,414,222)等等。也可以实施其他选择程序，包括阳性选择机制，例如使用大肠杆菌的manA基因，其允许在甘露糖存在下生长(也参见Miki和McHugh(2004)J Biotechnol[生物技术杂志]107 193-232)。
一个或多个目的序列还包括编码多核糖核苷酸以通过基因沉默技术沉默或减少靶序列表达的多核苷酸，例如，共抑制、反义、RNAi、miRNA的表达(天然的或工程化的)、反式作用siRNA和核酶的表达(参见例如US 20060200878)。多核糖核苷酸可包含启动子发夹、微RNA或非编码RNA。启动子发夹可以包括双链核糖核苷酸结构，例如可能涉及RNA干扰(RNAi)或小干扰RNA(siRNA)的茎环结构或倒置重复序列。发夹启动子的实例描述于例如US20070199100中，其全部公开内容通过引用并入本文中。
由DNA构建体产生的任何mRNA也可含有5′非翻译前导序列。该序列可以源自选择用于表达基因的启动子，并且可以被特异性修饰以增加或减少mRNA的翻译。5′非翻译区也可以从病毒RNA，从合适的真核基因或从合成的基因序列中获得。增强子序列可用于增加或改变所得mRNA的翻译效率。非翻译前导序列可以源自本启动子/调节区，或任选来自任何不相关的启动子或基因(参见例如，美国专利5,362,865)。前导序列的实例包括玉蜀黍和矮牵牛热休克蛋白前导序列(美国专利5,362,865)、植物病毒外壳蛋白前导序列、植物加氧酶前导序列GmHsp(美国专利5,659,122)、PhDnaK(美国专利5,362,865)、AtAnt1、TEV(Carrington和Freed(1990)J Virol[病毒学杂志]64：1590-1597)、OsAct1(美国专利5,641,876)、OsTPI(美国专利7,132,528)、OsAct15(US 20060162010)、和AGRtu.nos(基因库登录V00087；Bevan等人(1983)Nature[自然]，304：184-187)。用于增强表达或影响基因的转录或翻译的其他遗传组分也被设想为遗传组分。例如，已经显示内含子序列有助于在植物细胞中表达转基因。内含子的实例包括肌动蛋白内含子(美国专利5,641,876)、玉米HSP70内含子(ZmHSP70；美国专利5,859,347；美国专利5,424,412)和水稻TPI内含子(OsTPI；美国专利7,132,528)。
对于苍白杆菌介导的转化，通常将构建体导入合适的宿主如大肠杆菌中，并与另一种合适的宿主如苍白杆菌配对。可替代地，构建体被直接转化(例如通过电穿孔)到感受态苍白杆菌中。构建体可以在Ti或Ri质粒上，或者可以分别提供。Ti或Ri质粒可以是天然存在的质粒，例如来自农杆菌(Agrobacterium)，并且可以分别诱导瘤或毛状根(参见例如Hooykaas等人(1977)J Gen Microbiol[普通和应用微生物学杂志]98：477-484，和Weller等人(2004)Appl Env Microbiol[应用与环境微生物学]70：2779-2785)。在其他实例中，Ti或Ri质粒可替代地被解毒并且不能导致植物细胞增殖。由于苍白杆菌和农杆菌具有不同的感染机制，一旦导入Ti或Ri辅助质粒，植物细胞与苍白杆菌的接触可能增加种系转化的频率，并且/或在转化期间对靶细胞或植物的有害作用较小。
提供了使用苍白杆菌将一种或多种遗传组分引入细胞、组织和/或植物的组合物和方法。在一些实例中，宿主含有不含导致瘤形成或根系发生的致癌基因的解毒的Ti或Ri质粒，其衍生物用作载体并含有随后引入植物的目的基因。另一方面，通过T4SS无关机制，即oriT-介导的接合转移，苍白杆菌将DNA转移至植物细胞中。T4SS无关的DNA转移所需的功能可能存在于含有待转移的DNA的质粒上，或可能存在于染色体或另一种质粒中，包括存在于这种细菌细胞中的Ti或Ri质粒。
可以使用任何合适的植物培养基来使植物组织培养物发育或维持植物组织培养物，并酌情用另外的植物生长调节剂补充，所述植物生长调节剂包括但不限于：生长激素，例如毒莠定(4-氨基-3，5，6-三氯吡啶甲酸)、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)和麦草畏(3，6-二氯茴香酸)、细胞分裂素如BAP(6-苄基氨基嘌呤)和激动素、ABA、和赤霉素。其他培养基添加剂可以包括但不限于：氨基酸、大分子元素、铁、微量元素、肌醇、维生素和有机物、碳水化合物、未限定的培养基组分如酪蛋白水解产物、有或没有合适的胶凝剂如琼脂的一种形式，如低熔点琼脂糖或植物凝胶。各种组织培养基在本领域中是众所周知的，其当适当补充时，支持植物组织的生长和发育并适于植物转化和再生。这种培养基的实例包括但不限于：Murashige和Skoog((1962)Physiol Plant[植物生理学]15：473-497)、N6(Chu等人(1975)Scientia Sinica[中国科学]18：659)、Linsmaier和Skoog((1965)Physiol Plant[植物生理学]18：100)、Uchimiya和Murashige((1962)Plant Physiol[植物生理学]15：473)、Gamborg氏培养基(Gamborg′s media)(Gamborg等人(1968)Exp Cell Res[实验细胞研究]50：151)、D氏培养基(D medium)(Duncan等人(1985)Planta[植物学]165：322-332)、McCown氏木本植物培养基(McCown＇s Woody plant media)(McCown和Lloyd(1981)Planta[植物学]165：322-332)、Nitsch和Nitsch((1969)Science[科学]163：85-87)；以及Schenk和Hildebrandt(1972 Can J Bot[加拿大植物学杂志]50：199-204)或这些补充的培养基的相应推导。如本领域众所周知的，用于转化和再生的培养基和培养基补充物，例如营养物和生长调节剂，以及其他培养条件如孵育期间的光强度、pH和温育温度可以针对特定的细胞、组织和/或目的植物进行修饰或优化。
本领域技术人员知道在植物转化过程中的典型步骤。可以通过直接从甘油储液接种液体培养基或通过将细菌划线到来自甘油储液的固化培养基上来制备待使用的苍白杆菌，允许细菌在适当的选择性条件下生长。可以通过在营养或培养条件下生长来预先诱导苍白杆菌，包括在促进转化的量的乙酰丁香酮的存在下。本领域技术人员熟悉细菌的生长和合适的培养条件的程序以及随后的接种程序。用于接种的细菌培养物的密度以及细菌细胞的数量与外植体组织的数量的比例可以随着系统而变化，并且因此预期了用于任何转化方法的这些参数的优化。
转化过程的下一个阶段是接种。在此阶段，将适当制备的植物、植物组织或外植体和细菌细胞悬液混合在一起。接种的持续时间和条件以及细菌细胞密度将根据植物转化系统而变化。转化细菌的生长或接种可以在存在乙酰丁香酮或其他已知的位于Ti或Ri质粒上的毒力基因表达诱导剂的情况下发生。
接种后，可以除去任何过量的细菌悬液，并将细菌和目标植物材料共培养。共培养指的是接种后和转移到任选的延迟或选择培养基之前的时间。任何数量的植物组织培养基都可以用于共培养步骤。接种细菌后的植物组织可以在液体或半固体培养基中培养。共培养通常进行约一天至四天。
与细菌共培养后，可以任选地将接种的植物组织或外植体直接置于选择培养基上。可替代地，在与细菌共培养后，可将它们置于不含选择剂的培养基上，并且随后置于选择性培养基上。本领域技术人员知道选择性方案、培养基和生长条件的许多改变，这些改变可以根据植物系统和选择剂而变化。典型的选择剂包括但不限于：抗生素如遗传霉素(G418)、卡那霉素或巴龙霉素、或除草剂草甘膦、草铵膦或麦草畏。可以将其他合适的培养基组分添加到选择或延迟培养基中以抑制细菌生长。这样的培养基组分可以包括但不限于：抗生素如羧苄青霉素或头孢噻肟。
随后将培养物转移到适合回收转化的小植物的培养基中。本领域技术人员知道回收转化植物的方法的数量。可以针对每个植物系统实施和优化各种培养基和转移要求，用于转基因植物的植物转化和回收。因此，本文中公开或提供的这样的培养基和培养条件可以被修改或用营养等效组分或用于选择和回收转基因事件的类似方法替代，并且仍落入本公开的范围内。
随后可以分析所产生的转化体及其子代，以确定转化载体上所包含的特定目的序列的存在或不存在，或通过递送目的序列产生的分子表型的存在或不存在。分子分析可包括但不限于DNA印迹(Southern blot)、PCR(聚合酶链式反应)分析、核酸测序、酶活性分析、免疫诊断方法、蛋白质表达分析、表达谱分析、代谢分析和/或谱、表型分型、现场评估等。可以进行这些和其他众所周知的方法以确认由所公开的方法产生的细胞、组织、植物、种子等的基因型、表型和/或稳定性。
术语植物包括完整植物、植物器官(例如叶、茎、果实、根等)、种子、植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚以及花、茎、果实、叶、根和子代。转基因植物是目前或之前用核酸转化的植物，并且因此至少部分由转基因细胞组成。植物部分包括植物细胞、植物原生质体、可再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块和在植物或植物部分(如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果、核、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花药等)中完好的植物细胞。植物细胞包括但不限于：来自种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子的原生质体和细胞。绿色组织是指那些在包括一段光照的条件下生长含有叶绿素和光合作用的植物部位。绿色组织可以包括再生组织、愈伤组织和体外培养的组织，例如含有多芽分生组织样结构。这些组织具有高百分比的能够持续细胞分裂的细胞并且能够长时间再生。
该方法和组合物可适用于任何植物，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物包括提供目的种子的谷物类植物、油料种子植物和豆科植物。目的植物物种的实例包括但不限于：豆类、低芥酸菜籽、玉米(玉蜀黍)，芸苔属(例如，甘蓝型油菜、芜菁、芥菜)(特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种)，苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))，水稻(rice，Oryza sativa)，黑麦(rye，Secale cereale)，高粱(甜高粱(Sorghum bicolor)，高粱(Sorghum vulgare))，粟(例如，珍珠粟(御谷(Pennisetum glaucum))，黍(粟米(Panicummiliaceum))，粟(谷子(Setaria italica))，穇子(龙爪稷(Eleusine coracana)))，向日葵(sunflower，Helianthus annuus)，红花(safflower，Carthamus tinctorius)，小麦(wheat，Triticum aestivum)，大豆(soybean，Glycine max，Glycine soja)，烟草(tobacco，Nicotiana tabacum)，马铃薯(potato，Solanum tuberosum)，花生(peanut，Arachis hypogaea)，棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypiumhirsutum))，甘薯(番薯(Ipomoea batatas))，木薯(cassava，Manihot esculenta)，咖啡(咖啡属(Coffea spp.))，椰子(coconut，Cocos nucifera)，菠萝(pineapple，Ananascomosus)，柑橘树(柑橘属(Citrus spp.))，可可(cocoa，Theobroma cacao)，茶树(tea，Camellia sinensis)，香蕉(芭蕉属(Musa spp.))，鳄梨(avocado，Persea americana)，无花果(fig或(Ficus casica))，番石榴(guava，Psidium guajava)，芒果(mango，Mangiferaindica)，橄榄(olive，Olea europaea)，木瓜(番木瓜(Carica papaya))，腰果(cashew，Anacardium occidentale)，澳洲坚果(macadamia，Macadamia integrifolia)，巴旦杏(almond，Prunus amygdalus)，甜菜(sugar beets，Beta vulgaris)，甘蔗(甘蔗属(Saccharum spp.))，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物和针叶树。
蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、西蓝花、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、茄子、茴香、四季豆、小萝卜、葫芦、韭菜、大白菜、秋葵、洋葱、豌豆、胡椒、南瓜、菠菜、笋瓜、甜玉米、莴苣(例如Lactuca sativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseoluslimensis)、豌豆(香豌豆属(Lathyrus)物种)和黄瓜属(Cucumis)的成员诸如黄瓜(C.Sativus)、瓜类、西瓜、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃(杜鹃花属物种(Rhododendron spp.))、绣球花(hydrangea，Macrophylla hydrangea)、木槿(hibiscus，Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(蔷薇属物种(Rosa spp.))、郁金香(郁金香属物种(Tulipa spp.))、水仙(水仙属物种(Narcissus spp.))、矮牵牛(petunias，Petuniahybrida)、康乃馨(carnation，Dianthus caryophyllus)、一品红(poinsettia，Euphorbiapulcherrima)和菊花。
可以使用的针叶树包括(例如)松树诸如火炬松(loblolly pine，Pinus taeda)、湿地松(slash pine，Pinus elliotii)、西黄松(ponderosa pine，Pinus ponderosa)、黑松(lodgepole pine，Pinus contorta)和辐射松(Monterey pine，Pinus radiata)；花旗松(Douglas-fir，Pseudotsuga menziesii)；西方铁杉(Western hemlock，Tsugacanadensis)；北美云杉(白云杉(Picea glauca))；红杉(北美红杉(Sequoiasempervirens))；枞树(true firs)诸如银杉(胶冷杉(Abies amabilis))和胶枞(香脂冷杉(Abiesbalsamea))；以及雪松，如西方红雪松(北美乔柏(Thuja plicata))和阿拉斯加黄雪松(黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis))。
实例
本领域技术人员将认识到本文提供的方法和组合物的许多优点。以下实例提供了详细的具体研究、方法和组成，然而，本领域技术人员将会理解，可以在所公开的具体实例中做出许多改变，并且仍然获得相近或相似的结果，而不背离本公开的精神和范围。本文引用的所有参考文献通过引用整体并入本文中，包括它们补充，解释，提供背景或教导在本文中使用的方法学、技术或组合物。
实例1-质粒构建
质粒pVir8(PHP70365；SEQ ID NO：106)是具有vir基因和T-DNA的38.8kb载体，其使用标准分子生物学方法在大肠杆菌中构建。它有两个来源(ColE1、pVS1)以在广泛的细菌中稳定复制，并编码对抗生素庆大霉素的抗性。它含有～27kb的来自超毒力pTiBo542Ti质粒的vir基因和一个编码可选择的bar(除草剂双丙氨膦抗性基因)标记的T-DNA和一个用于植物的可见红色荧光蛋白标记。vir基因的拷贝使用PCR从包含在根瘤农杆菌菌株AGL1(Lazo等人(1991)Biotechnology[生物技术]10：963-967)中的pTiBo542 Ti质粒(基因库登录号DQ058764和NC_010929)中分离。Vir基因包括：virA、virJ、virB1-B11、virG、virC1-C2、virD1-D5和virE1-E3。virA和virJ之间的IS66插入序列和virJ和virB1之间的区域各自被删除以提高稳定性并减小尺寸。
使用这些vir基因的功能性变体或衍生物也可能进一步改进。分离和组装重叠PCR产物。包括1.2kb pBR322 ColEI复制起点(Bolivar等人(1977)Gene[基因]2：95-113)用于在大肠杆菌中复制。包括了广泛的宿主范围pVS1复制起点的版本(Heeb等人(2000)Molecular Plant-Microbe Interactions[分子植物-微生物相互作用]13：232-237)用于在多种细菌宿主中稳定复制。包括了来自Tn1696的编码庆大霉素乙酰基转移酶的aacC1基因用于庆大霉素抗性(Poteete等人(2006)BioTechniques[生物技术]41：261-264)。质粒RV013684(SEQ ID 113)是目的载体，其使用GatewayTM和MultiSite重组克隆技术(Thermo Fisher Scientific Inc.[赛默飞世尔科技公司])作为用于改变T-DNA组成的构建中间体。该质粒在T-DNA的右边界和左边界内具有GatewayTMATTR4和ATTR3重组酶位点。这使得人们可以容易地用在含有侧翼ATTL4和ATTL3位点的进入型载体中构建的其他T-DNA来替代T-DNA区域。
为了优化转化载体系统，类似地构建了几个另外的质粒系列。这些包括将vir基因和T-DNA分别分离成单独的辅助质粒和二元质粒以形成“共栖”系统。也构建和测试了与上述PHP70365类似的“共整合”设计。已知不同的复制起点可影响植物中单拷贝事件的频率(Zhi等人，2015 Plant Cell Report[植物细胞报告]；34：745-754)；因此，构建和测试了共栖和共整合质粒的多种复制起点，并包括下面描述的那些。使用这些或其他复制起点的功能性变体或衍生物也可以进一步改进。
包括了T-DNA，并且其包含以下组分：超驱动的章鱼碱右边界、拟南芥泛素10启动子、5′UTR和驱动DsRED2INT表达的内含子1(基因库NM_202787)，其中第一个363bp的香菇珊瑚属物种红色荧光蛋白(DsRed，Clontech公司)编码序列被插入的ST-LS1 INTRON2打断，随后是DsRed的最后的315bp。包括了编码来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的草丁膦乙酰基转移酶的bar基因，其具有用于对除草剂Basta或双丙氨膦的抗性的大豆(Glycine max)密码子。如表1A所示，质粒PHP72277、PHD4673和PHD4674具有与PHP70365相同的DNA骨架，和不同的T-DNA中表达盒。
如表1A所示，质粒PHP81185具有与PHP70365中的T-DNA相同的DNA骨架和表达盒，和来自发根农杆菌K599Ri质粒的vir基因的不同拷贝。发根农杆菌菌株K599 NCPPB2659获自英国约克郡YO41 1LZ的沙赫顿(Sand Hutton)的植物病原细菌中央科学实验室的国家收藏中心(National Collection of Plant Pathogenic Bacteria Central ScienceLaboratory)(www.ncppb.com)。
表1A.质粒
如表1B所示，共整合载体PHP79752(BBR1 ORI)、PHP79765(repABC)、PHP79767(PVS1 ORI)、PHP81092(RK2micro)、PHP81093(PSA ORI)、PHP81094(RK2full)和PHP81095(PSA ORI+PARDE)含有相同的DNA骨架和T-DNA，但是含有不同的复制起点。辅助性载体PHP79077(repABC)、PHP79759(BBR1 ORI)、PHP79760(RFS1010 ORI)、PHP79761(PVS1 ORI)、PHP80398(RK2micro)、PHP80399(PSA ORI+PARDE)、PHP80402(PSA ORI)、PHP80403(RK2full)、PHP80566(RK2micro+PARDE)、RV005393(RK2full+PARDE)不含T-DNA，但含有相同的DNA骨架和不同的复制起点，如表1B所示。二元载体PHP79763(BBR1 ORI)、PHP79764(RFS1010 ORI)、PHP79766(repABC)、PHP79768(PVS1 ORI)、PHP80404(RK2full+PARDE)、PHP80569(RK2full)、RV005199(PSA ORI)、RV005200(PSA ORI+PARDE)、和RV005201(RK2micro)含有相同的DNA骨架和T-DNA，但是含有不同的复制起点，如表1B所示。表1B中的空框表明质粒组分不存在。
表1B.用于比较复制子起点的质粒。
实例2-在烟草BY-2悬浮培养物中使用瞬时DsRED表达的细菌筛选
烟草BY-2细胞由RIKEN BRC[理化学研究所生物资源中心]通过日本文部科学省(MEXT)日本国家生物资源项目(National Bio-Resource Project)提供。Nagata等人(IntRev Cytol[细胞学国际评论](1992)132：1-30)主要描述了维持烟草BY-2悬浮培养物的方法并且使用BY-2悬浮细胞的改良方法(Newman等人(1993)Plant Cell[植物细胞]5：701-714)进行DsRED瞬时表达。
从用PHP70365转化的庆大霉素抗性菌株中，如在Leica荧光立体显微镜下所观察，24株细菌菌株在BY-2细胞中显示不同水平的DsRED表达。
实例3-DNA提取知16S rDNA的PCR
进行了多种分析以确定用于植物转化的苍白杆菌属物种。首先，使用MasterPureTMDNA纯化试剂盒(Cat#MCD85201，美国威斯康星州麦迪逊Epibio公司(Epibio，Madison，WI，USA))制备基因组DNA。使用从24个细菌中提取的基因组DNA，用PTC-100TM可编程热控制器(MJ Research，Inc.[MJ研究公司]，美国加利福尼亚州旧金山)进行PCR。用于扩增的引物是：
SEQ ID NO：102 16S-F 5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’
SEQ ID NO：103 16S-R 5’ACGGCTACCTTGTTACGACTT 3’
PCR混合物由5μL的(100-200ng)细菌DNA、1.25μL的50mM MgCl2、0.25μL的Taq DNA聚合酶(5U/μL，GIBCO BRL，克利夫兰)、2.5μL的10x Taq缓冲液(GIBCO BRL)、0.5μL的10mMdNTP、10μM引物和15μL无菌蒸馏水各0.5μL组成。将样品加热至94℃持续1分钟，然后进行在94℃(30秒)，50℃(30秒)，72℃(90秒)，然后72℃持续10分钟的30个循环。使用HTS PCR 96孔板(Cat#MSNU 03010，EMD Millipore[EMD米利波尔公司]，德国)清洁PCR产物。
所得到的PCR产物通过Elim Biopharmaceuticals公司(美国加利福尼亚州海沃德市(Hayward，CA，USA))测序，并且这些序列被用于搜索美国国家生物技术信息中心基因库(NCBI GenBank)数据库。表2中显示了使用EP1A09(SEQ ID NO：105)的1318bp的16S rDNA序列从美国国家生物技术信息中心基因库(NCBI GenBank)BLAST搜索的最高命中。搜索结果显示EP1A09与各种苍白杆菌物种具有很高的16S rDNA同源性(表2)。
表2.来自美国国家生物技术信息中心基因库(NCBI GenBank)BLAST搜索的前15个最高命中
实例4-通过16S rDNA序列、脂肪酸甲酯(FAME)和基质辅助激光解吸/电离 (MALDI)-飞行时间(TOF)进行进一步的细菌鉴定
为了鉴定EP1A09的种类，使用以下方法：(SEQ ID NO：104)的详细16S rDNA同源性搜索，提取的微生物脂肪酸乙酯(FAME)的气相色谱分析和使用基质辅助激光解吸/电离的飞行时间质量摄谱(MALDI-TOF)。这些分析由MIDI实验室(MIDI Labs)(美国德克萨斯州纽瓦克市(Newark，DE，USA))进行。
从纯菌落中分离出的基因组DNA，PCR扩增16S rRNA基因。使用的引物是对应于位置0005F和0531R的通用16S引物。扩增产物从过量的引物和dNTP中纯化，并通过在琼脂糖凝胶上运行部分产物来检查质量和数量。使用DNA聚合酶和染料终止子化学进行16S rRNA扩增产物的循环测序。然后从测序反应中去除过量的染料标记的终止子。将样品在3130遗传分析仪(用户公告#2(2001)ABI PRISM 7700序列检测系统，Applied Biosystems[美国应用生物系统公司])上进行电泳。来自EP1A09菌株的469bp的16S rDNA序列与MIDI实验室(MIDILabs)验证的文库不匹配，但是与基因库相比，如表3所示，在属的水平上，在人苍白杆菌中产生99％的匹配。
表3.MIDI实验室(MIDI Labs)用EP1A09菌株的16S rDNA序列的基因库搜索结果(D16M2 DNA匹配报告)
根据MIDI实验室标准程序(Sasser(1990)在Methods in Phytobacteriology[植物细菌学方法]，Klement等人主编，第199页-204页，布达佩斯克拉多埃达德米亚(Adademiai，Kiado，Budapest)；Norman和Yuen(1998)Can J Plant Pathol[加拿大植物病理学]20：171-175)，使用气相色谱分析系统进行脂肪酸(FAME)分析，并且结果显示物种水平与人苍白杆菌相匹配，人苍白杆菌是MIDI实验室(表4)中FAME文库中唯一的苍白杆菌物种。
表4A.EP1A09的FAME分析
表4B.EP1A09的FAME分析
根据标准程序(Bizzini等人(2010)J Clin Micro[临床微生物学杂志]5：1549-1554)进行MALDI-TOF，并且结果显示物种水平与来自MIDI实验室的MALDI-TOF文库的O.grignonense匹配，该文库含有人苍白杆菌、O.gallinifaecis、O.grignonense、中间苍白杆菌、苍白杆菌和小麦苍白杆菌多个菌株(表5)。使用得分值键评估每个匹配的得分。
表5A.MALDI-TOF分析匹配
表5B.MALDI-TOF分析的得分参考
范围 置信水平
2.000-3.000 物种
2.000-3.000多物种 物种，紧密相关
1.700-1.999 属
0.000-1.699 无匹配
实例5-通过估计16S rRNA序列之间的进化分歧的苍白杆菌分离株的基因组组装 和表征
为新型苍白杆菌菌株以及已知特性的苍白杆菌的几种培养物收集菌株构建草稿基因组组装(表6)。基因组DNA根据由Illumina[依诺米那公司]开发的文库构建方案制备，并使用Illumina MiSeq进行测序。简而言之，在用Covaris S220仪器剪切基因组DNA后，将所得DNA片段末端修复，并将其3′末端处理以添加A碱基。连接Illumina特异性衔接子和基于凝胶的尺寸选择后，衔接子连接的DNA片段用Illumina特异性PCR引物进行有限的PCR扩增。根据Illumina[依诺米那公司]的说明书，在Illumina MiSeq上进行扩增的DNA片段的簇生成和配对末端测序。用来自菌株的DNA片段加载单个流动池。使用Illumina管道软件生成序列和质量评分，用于图像分析和碱基识别。在最初的碱基识别和处理之后，由Illumina管道生成的测序文件被转换为FASTQ格式，并且执行额外的定制质量过滤，使得如果在其3′端具有一个或多个碱基且质量评分＜15读数被修正。使用默认的kmer值，将成对的末端Illumina读数(2x 150bp)与SPAdes 3.1.1(Bankevich等人(2012)J Comp Biol[计算生物学杂志]19：455-477)组装。此外，使用SPAdes管道选项执行读取纠错和错配/短INDEL校正。小于500bp的组装的重叠群从最终产物中除去。
表6.经测序的菌株
在MEGA6(Tamura等人(2013)Mol Biol Evol[分子生物学与进化]30：2725-2729)中进行CLUSTALW比对和进化分析中序列之间每个序列的碱基差异数。通过将每对序列之间的差异数除以16S rDNA的1,337bp来计算百分比同一性(表7-9)。
表7.估计16S rRNA序列之间的进化趋异(％)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1 100 97.7 96.7 95.4 98.2 98.7 100 96.2 97.5 98.1 98.3 98.3 100 98.6 99.6 100 98.2 95.5 98.7 98.7
2 100 98.1 95.0 96.3 97.2 97.7 97.0 96.5 96.0 96.3 96.0 97.7 96.3 97.6 97.7 95.9 95.1 98.4 98.4
3 100 94.8 96.0 97.1 96.7 96.9 97.5 96.9 95.9 96.8 96.7 95.9 96.6 96.7 96.7 95.1 97.1 97.1
4 100 95.9 95.9 95.4 96.9 95.7 95.3 96.0 95.7 95.4 96.0 95.6 95.4 95.3 93.6 94.9 94.9
5 100 98.2 98.2 95.6 97.3 98.5 99.0 98.1 98.2 99.2 98.0 98.2 98.7 95.1 97.2 97.2
6 100 98.7 95.9 97.8 97.8 98.0 98.0 98.7 98.1 98.7 98.7 97.9 95.4 97.9 97.9
7 100 96.2 97.5 98.1 98.3 98.3 100 98.6 99.6 100 98.2 95.5 98.7 98.7
8 100 95.7 95.0 95.7 95.2 96.2 95.5 95.9 96.2 95.1 95.5 96.6 96.6
9 100 97.8 96.9 97.8 97.5 97.2 97.7 97.5 97.8 94.1 96.4 96.4
10 100 98.6 99.3 98.1 98.7 97.8 98.1 99.9 94.7 96.9 96.9
11 100 98.4 98.3 99.3 97.9 98.3 98.7 95.3 97.5 97.5
12 100 98.3 98.7 97.9 98.3 99.5 95.0 97.2 97.2
13 100 98.6 99.6 100 98.2 95.5 98.7 98.7
14 100 98.4 98.6 98.9 95.0 97.8 97.8
15 100 99.6 97.8 95.3 98.4 98.4
16 100 98.2 95.5 98.7 98.7
17 100 94.8 97.0 97.0
18 100 95.4 95.4
19 100 100
20 100
表8.表7中列出的生物名称
表9.估计EP1A09和其他16S rRNA序列之间的进化趋异(％)
实例6-苍白杆菌菌株的多基因座序列分型
使用Romano等人2009年描述的方案进行苍白杆菌菌株的多基因座序列分析(MLSA)。这些是用于MLSA方案的七个基因座：
(1)＞gi|256809827|gb|ACV31014.1|分支酸合酶，部分[人苍白杆菌ATCC49188]；
(2)＞gi|256809699|gb|ACV30950.1|70kDa热休克蛋白，部分[人苍白杆菌ATCC49188]；
(3)＞gi|256809647|gb|ACV30924.1|甘油醛-3-磷酸脱氢酶，部分[人苍白杆菌ATCC 49188]；
(4)＞gi|256809455|gb|ACV30828.1|25kDa外膜蛋白，部分[人苍白杆菌ATCC49188]；
(5)＞gi|256809287|gb|ACV30744.1|重组酶A，部分[人苍白杆菌ATCC 49188]；
(6)＞gi|256809135|gb|ACV30668.1|DNA-依赖型RNA聚合酶β亚基，部分[人苍白杆菌ATCC 49188]；和
(7)＞gi|256808991|gb|ACV30596.1|邻氨基苯甲酸合酶，部分[人苍白杆菌ATCC49188]。
通过使用基于Tamura-Nei模型的最大似然法(Tamura和Nei(1993)Mol Biol Evol[分子生物学与进化]10：512-526)推断进化历史。从100次重复推断出的引导共同树被用来表示被分析的类群的进化历史(Felsenstein(1985)Evolution[进化]39：783-791)。与在小于50％的引导重复中再现的分区相对应的分支塌陷。分支旁边显示了在引导测试(100个重复)中聚集的相关分类群的重复树的百分比。通过将Neighbor-Join和BioNJ算法应用于使用最大合成似然(MCL)方法估计的成对距离的矩阵，然后选择具有优越对数似然值的拓扑，来自动获得用于启发式搜索的一个或多个初始树。分析涉及42个核苷酸序列。包括的密码子位置是第1+第2+第3+非编码的。所有包含缺口和缺失数据的位置都被淘汰。最终数据集共有3456个位置。进化分析在MEGA6中进行(Tamura等人(2013)Mol Biol Evol[分子生物学与进化]30：2725-2729)。如图1A和图1B所示，用FigTree程序(可以在线获得于：tree-dot-bio-dot-ed-dot-ac-dot-uk/software/figtree/)绘制最终树。由此得到的系统发育树表明，分离株EP1A09是新的苍白杆菌物种。该新分离株EP1A09于2015年7月10日以登录号NRRLB-67078保藏于农业研究服务培养物保藏中心(Agricultural Research Service CultureCollection，NRRL)，并被命名为海沃德苍白杆菌H1。
实例7-烟草的稳定转化
基本上如Gallois和Marinho(Methods Mol Biol[分子生物学方法](1995)49：39-48)所述进行烟草叶片转化。在无菌聚丙烯容器(Catalog#0701，International ContainerCorp[国际容器公司]，马里兰州塞文市(Severn，MD))中无菌培养烟草植物(烟草栽培变种Petite Havana SR1，目录#NT-02-20-0l，Lehle Seeds公司，德克萨斯州圆石市(RoundRock，TX))，在24℃体外，在16小时光下(80-110μE/m2/s白色冷荧光灯下)进行，所述容器含有具有1.5％蔗糖和0.3％结冷胶的半强度Murashige和Skoog(MS)培养基。从生长的小植株上切出具有一个节的茎，并且然后在相同的环境条件下每4周-6周转移到新鲜的半强度MS中。
将具有和不具有植物转化载体PHP70365的对数生长期的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078培养物以1,500x g离心10分钟，并且然后用液体共培养培养基将苍白杆菌细胞沉淀稀释至0.5的OD600nm，所述培养基由含有2mg/L N6-苄基腺嘌呤(BA)、1％葡萄糖和200μM乙酰丁香酮的MS培养基(pH 5.2)组成。叶片从体外生长的3-4周龄烟草植物中获得。从植物中切下无菌烟草叶，并在100×25mm培养皿中的液体共培养培养基中的20mL EP1A09(OD＝0.5)(海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078)中浸泡5分钟。然后将叶片切成3×3mm的片段，并且然后将叶片完全浸没在20mL的苍白杆菌中5分钟。将叶片片段印迹在高压灭菌的滤纸上，然后在由MS培养基(pH 5.2)与2mg/L BA、1％葡萄糖、200μM乙酰丁香酮和Phytoagar(目录#A175，PhytoTechnology Laboratories公司，堪萨斯州沙尼米逊(ShawneeMission，KS))组成的固体共培养培养基在24℃在16小时光照(80-110μE/m2/s，白色冷荧光灯下)下孵育。共培养3天后，将20个叶片片段/块转移至由具有2mg/L BA、3％蔗糖、0.3％结冷胶、3mg/L双丙氨膦和250μg/mL头孢噻肟的MS固体培养基(pH 5.7)组成的芽诱导培养基中。在Leica荧光立体显微镜(莱卡公司，德国韦茨拉尔(Leica，Wetzlar，Germany))下观察DsRED荧光蛋白的表达水平，所述Leica荧光立体显微镜配备有用于在530-560nm下激发和在590-650nm下发射的滤波器组。在共培养3天后观察到DsRED焦点的瞬时表达，并且在转化后3周观察到表达稳定的DsRED的芽苞(图2B)。将双丙氨膦抗性愈伤组织和芽转移至新鲜芽诱导培养基中用于芽增殖，并且在转化后7周用DsRED表达可视化结果(图2D)。图2D表明进一步包含PHP70365的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078可稳定转化烟草植物。
棉花愈伤组织从Coker 312启动，并用具有PHP72477的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078培养物转化。
实例8-大豆半粒种子转化
大豆转化基本上如Paz等人((2006)Plant Cell Rep[植物细胞报告]25：206-213)和美国专利7,473,822所述进行。如Di等人((1996)Plant Cell Rep[植物细胞报告]15：746-750)所述，使用氯气将来自大豆品系的成熟种子表面消毒16小时，所述氯气通过将3.5mL的12N HCl与100mL市售漂白剂(5.25％次氯酸钠)混合而产生。将消毒的种子在室温在无菌蒸馏水中浸泡16小时(在25×100mm培养皿中100粒种子)。表10总结了用于大豆半种子转化和植物再生的各种栽培培养基的组成。
将在含有300μM乙酰丁香酮的感染培养基中进一步含有在OD600＝0.5下的载体PHP70365(SEQ ID NO：106)悬液的10mL体积的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078添加到浸泡的种子中。然后沿着种脐纵向切割种子以分离子叶，并在海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078悬液中除去种皮、初生芽和胚轴，由此产生半种子外植体。将半种子外植体平面朝下放在具有4mL新鲜的苍白杆菌/感染培养基的深板中，没有子叶重叠。用封口膜(“Parafilm M”VWR目录#52858)密封板，然后超声处理(Sonicator-VWR型号50T)持续30秒。超声处理后，将半种子外植体转移至单层高压灭菌的无菌滤纸(VWR#415/目录#28320-020)上，共培养固体培养基(每个平板18-22个外植体；平面朝下)。用微孔胶带(目录#1530-0，3M，明尼苏达州圣保罗市(St.Paul，MN))将板密封，并在21℃在昏暗的光下(5-10μE/m2/s，白色冷荧光灯)孵育16小时，持续5天。
共培养后，将半粒种子外植体在液体芽诱导(SI)培养基中洗涤一次，然后将外植体在没有选择的情况下在用0.7％琼脂固化的芽诱导培养基上培养。将外植体的基部(即胚轴取出部分的外植体)嵌入培养基中，面朝上。在24℃的Percival生物培养箱中进行芽诱导，光周期为18小时，并且光强度为130-160μE/m2/s。14天后，将外植体转移到含有3mg/L双丙氨膦的新鲜芽诱导培养基中。每两周将半粒种子外植体转移到新鲜培养基中。在芽诱导培养基上培养四周后，将外植体转移至含有5mg/L双丙氨膦的芽伸长(SE)培养基中(表10)。六到十周后，分离伸长的芽(＞1-2em)并转移到含有1mg/L双丙氨膦的生根培养基中(表10)。
表10.大豆转化培养基
在共培养五天后获得了用进一步包含PHP70365的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078转化的外植体中的瞬时DsRED表达，但用海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078空载体(载体)转化的大豆外植体没有显示任何DsRED表达(图3B)。在含有双丙氨磷3mg/L的芽起始培养基上用海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078(PHP70365)转化2-3周后，在杰克和杜邦先锋优良栽培种(Jack and DuPont Pioneer elite cultivars)中观察到DsRED阳性芽(图4B)。在用海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078(其还包含PHP70365(图4C-图4G))转化10-12周后观察到尺寸为1cm-2cm的稳定转化的DsRED阳性芽，并且能够成功地出芽(图4H-图4I)。随后将这些T0小苗转移至土壤中(图4J)。
在杜邦先锋优良大豆栽培品种中进一步包含PHP70365的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078的转化效率总结在表11中。每100个感染的子叶中平均有1.6个回收DsRED阳性芽。这些DsRED阳性植物中约70％在双丙氨膦生根培养基中成功生根。
使用Pellet杵(目录#Nalge Nunc Intemational公司，美国纽约州罗契斯特市(Rochester，NY，USA))，在1.5mL的埃彭道夫管中，从用海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078(进一步包含PHP70365)转化的DsRED阳性和双丙氨膦抗性大豆事件的叶组织中制备粗提取物。将LL带(目录#7800019，Romer Labs Inc[Romer实验室公司]，美国密苏里州联合市(Union，MO，USA))置于每个提取样品中并使其显影2-10分钟。所有的DsRED阳性事件对LL测试都给出了表现出bar基因表达的阳性反应，而未转化的对照(WT)植物显示阴性结果(无bar基因表达)。
表11.在杜邦先锋优良大豆栽培品种中进一步包含PHP70365的海沃德苍白杆菌H1NRRL保藏B-67078的稳定转化效率。
实例9-转基因大豆的植物表型和T1种子分离
将用进一步包含PHP70365的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078转化的转基因小植物转移到湿润的Jiffy-7泥炭小球(Jiffy Products Ltd[Jiffy食品公司]，加拿大舍派堪(Shippagan，Canada))上，并且保持密封在透明塑料托盘盒中，直到在Percival培养箱中在60-100μE/m2/s，26℃/24℃日/夜温度的16小时光周期的条件下适应了新环境(图4J)。将硬化的小植物装入含有润湿的SunGro 702繁殖混合物(马萨诸塞州01001亚加瓦姆市银街770号(770 Silver Street，AGAWAM，MA 01001))的2加仑盆中，并在温室中生长至成熟以收获。其中五株转基因植物看起来形态正常，而一株可能由于DsRED的过度表达而发育不良。与未转化的野生型植物相比，DsRED过表达的转基因大豆植物在体外和温室中观察到DsRED毒性或降低的可再生性或表型效应的迹象。收集来自温室中的T0植物的叶组织，并进行qPCR分析以确定PHP70365的T-DNA(RB-ATUBQ10：DsRED：PINII Term-GMUBQ：BAR GMOT：UBQ14Term-LB)中转基因的拷贝数。五个T0事件中的四个(事件编号277793891、279161306、279161388和278728430)含有来自PHP70365的T-DNA(表12)的DsRED和BAR表达盒的单个拷贝，事件274749446具有一些引入序列的一个以上的拷贝。
表12.通过qPCR分析，用进一步包含PHP70365的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078转化的转基因T0大豆植物的转基因拷贝数。
所有五种T0植物正常开花并产生T1种子。来自这五个事件的T1种子在荧光显微镜和环境光下显示出强的DsRED表达。观察到的来自5个转基因事件的DsRED表达与非表达T1种子的比率分别为391∶146、162∶48、98∶26、119∶49和170∶66，这对于单个基因座上的显性基因是与3∶1的孟德尔分离比一致的(表13)。
表13.从进一步包含PHP70365的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078转化的转基因大豆植物中收集的T1种子的数量和DsRED分离。
实例10-大豆转化
使用氯气消毒成熟的干燥种子，并在室温避光吸收在含有5g/l蔗糖和6g/l琼脂的半固体培养基上。过夜孵育后，将种子在室温在黑暗中在蒸馏水中浸泡另外的3-4小时。使用手术刀刀片从子叶中分离完整的胚轴。使用实例9中所述的方案进行苍白杆菌介导的胚轴转化。在共培养3-4天后观察到在用进一步包含PHP70365的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078转化的胚轴的分生组织区域中的瞬时DsRED表达。在含有双丙氨磷3mg/L的芽起始培养基上进一步包含PHP70365的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078转化2-3周后观察到分生组织区域中的DsRED阳性芽原基和愈伤组织(图5B)。进一步包含PHP70365的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078转化后6-8周产生了尺寸为1-1.5cm的稳定转化的DsRED阳性芽(图5D)。
实例11-用于转化植物细胞的替代性苍白杆菌菌株
如表14所示，来自DSMZ的16个苍白杆菌菌株(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH公司，德国)和2个菌株获得自Tamas Torok博士，Lawrence Berkeley National Laboratory[美国劳伦斯伯克力国家实验室](加利福尼亚州伯克利)并且所述菌株如按照该供应商的说明书进行培养。所有16个菌株对在100mg/L的庆大霉素敏感，但只有8个菌株(金雀儿苍白杆菌、大田苍白杆菌、羽扇豆苍白杆菌、稻苍白杆带、牲畜苍白杆菌和小麦苍白杆菌、LBNL124-A-10和HTG3-C-07)在电穿孔后用具有庆大霉素选择的PHP70365转化。对这8个菌株和海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078进行了遗传转化烟草BY-2细胞(使用具有YFP表达盒的PHP72277)和大豆半粒种子(使用具有DsRED盒的PHP70365)的能力的测试。除了海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078之外，金雀儿苍白杆菌和牲畜苍白杆菌能够转化BY-2细胞(表14)和大豆外植体(图6)。大田苍白杆菌、羽扇豆苍白杆菌、稻苍白杆菌和小麦苍白杆菌也能够转化烟草BY-2细胞，但其转化效率比海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078、金雀儿苍白杆菌和牲畜苍白杆菌显著更低(10-50倍)。在表14中，“X”是指没有获得用质粒PHP70365转化的任何菌落。“O”是指获得了用质粒PHP70365转化的菌落。“ND”表示未确定。更多+显示更高的瞬时荧光蛋白表达。
表14.苍白杆菌菌株
实例12-拟南芥转化
将进一步包含如实例3中所述的质粒PHD4673的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078接种到含有100mg/L庆大霉素的50mL LB液体培养基中，并在28℃，250rpm下培养18-24小时。将进一步包含PHD4673培养物的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078在4,000rpm，20℃离心15分钟，并将沉淀物再悬浮于含有0.02％(v/v)Silwet L-77表面活性剂的75mL新鲜制备的5％蔗糖中(Helena Chemical Company[海伦娜化学公司]田纳西州38017科利尔维市席林大道225号(225Schilling Blvd.Collierville，TN 38017))。拟南芥Col-0转化使用修饰的花浸法(Clough和Bent(1998)Plant J[植物学]16：735-743)进行。在进一步包含PHD4673的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078花浸法之后，允许植物在21℃的植物生长室中生长，在60-100μE/m2/s下光照16小时，并且在荚果变成褐色后收集种子。种子在层流罩下用95％乙醇表面杀菌1分钟，用20％漂白剂加1滴Tween-20表面杀菌15分钟，并用无菌水洗涤3次。将30mg灭菌的种子铺在在150x 25mm培养皿(目录#351013，福尔肯大型培养皿(Falcon Large Petri Dishes)，VWR公司)中的琼脂选择培养基上，所述培养基由具有维生素的1x MS盐、1％蔗糖(pH 5.7)、0.8％TC琼脂、100mmg/L特美汀和50mg/L卡那霉素组成。将板在层流下干燥并用石蜡膜密封，并在21℃以60-100μE/m2/s的光周期培养16小时以发芽和生长。在卡那霉素50mg/L培养基上选择9天后，计数发芽和绿色的假定事件并在荧光显微镜下观察到DsRED表达。显示卡那霉素抗性和DsRED阳性发芽幼苗的转化效率为0.53％-1％，并且平均转化效率为0.77％(表15)。将卡那霉素抗性和DsRED阳性发芽的幼苗移植到土壤中以进一步生长和分析。
表15.转化效率显示卡那霉素抗性和用进一步包含PHD4673的海沃德苍白杆菌H1NRRL保藏B-67078转化的DsRED阳性拟南芥种子。
实例13-高粱叶片中的瞬时表达
将过夜培养的空的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078(无载体)和进一步包含PHD4674的O海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078在4,000rpm下，在20℃离心20分钟，并且将沉淀物重新悬浮在10mM MgSO4中，用400μM乙酰丁香酮调节细胞密度至接近OD 600下的1.0。将高粱杜邦先锋TX430植物在375-450μE/m2/s，26℃白天和22℃夜间的16小时光照下的生长室中生长。如Kapila等人(Plant Sci[植物科学](1997)122：101-108)和Siehl等人(Plant Physiol[植物生理学](2014)166：1162-76)所述进行浸润。5周龄高粱植物的叶用空的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078和海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078(PHD4674)浸润以瞬时DsRED表达，并在浸润后第4天用徕卡荧光显微镜检查(dpi)。在用进一步包含PHD4674的海沃德苍白杆菌H1NRRL保藏B-67078浸润的高粱叶片中看到DsRED表达，但用空的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078则没有。通过荧光显微镜在浸润后第4天检测到成功的DsRED表达的首次确认(dpi)，但定量延迟至7dpi以允许基因产物的进一步积累。通过GE Typhoon Trio(可变模式成像仪)(GE Healthcare Bio-Sciences[通用电气医疗生物科学公司]，邮箱643065宾夕法尼亚州匹兹堡，15264-3065)对所有处理的样品进行DsRED定量。在扫描之前，过滤提取物的细胞碎片并通过Bradford测定标准化至终体积为100μL CCLR缓冲液/每个测量样品的150μg总可溶性蛋白质，然后通过ImageQuantTL图像分析软件(GE Healthcare Bio-Sciences[通用电气医疗生物科学公司]，邮箱643065，宾夕法尼亚州匹兹堡15264-3065)分析最终扫描。进一步包含PHD4674的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078浸润的高粱叶提取物的相对荧光单位的平均值比空的海沃德苍白杆菌H1NRRL保藏B-67078的数值高3.5倍-23倍。结果清楚地表明，进一步包含PHD4674的海沃德苍白杆菌H1可以在高粱细胞中递送DNA并表达。
表16.来自用空的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078浸润的高粱叶提取物和进一步包含PHD4674的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078的相对DsRED表达。每个处理包括相对荧光单位的12-18个叶样品。
实例14-PHP70365(Ti vir构建体)与PHP81185(Ri vir构建体)的比较
大豆转化如实例10中所述进行。在共培养后7天观察到在具有PHP70365或PHP81185的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078转化的胚轴的分生组织区域中的瞬时DsRED表达。用两种构建体感染的外植体显示相等水平的DsRed瞬时表达。进一步包含PHP70365或PHP81185的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078转化后6-8周产生了尺寸为1-1.5cm的稳定转化的DsRED阳性芽。进一步包含PHP70365或PHP81185的海沃德苍白杆菌H1NRRL保藏B-67078的稳定转化效率是相似的，如表17所示。
表17.进一步包含PHP70365(SEQ ID NO：106)或PHP81185(SEQ ID NO：114)的海沃德苍白杆菌H1 NRRL保藏B-67078的稳定转化效率
构建体 外植体编号 成熟植物数量(％)
PHP70365 118 3(2.5)
PHP81185 123 3(2.4)
实例15-比较在共整合和其栖载体系统中的不同复制子起点
将表1B和表18中列出的共整合载体，以及辅助载体和二元载体的组合引入海沃德苍白杆菌H1中并使用烟草BY-2悬浮细胞的修饰方法(如实例2所述)进行红色荧光蛋白(RFP)瞬时表达。感染后7天在Leica荧光立体显微镜下观察到了RFP表达。在烟草BY-2细胞中显示RFP表达的质粒总结在表18中。
除复制起点外，共整合载体PHP79762(BBR1 ORI)、PHP79767(PVS1 ORI)和PHP81092(RK2micro)与pVir8是同基因的。在每个质粒PHP之后()中表示复制起点。这些载体都显示出瞬时的RFP表达。所有上述的复制起点都可用于植物转化。
在下文中，不管质粒PHP编号如何，辅助质粒都是复制起点以外的同基因。同样地，二元载体是复制起点以外的同基因。在每个质粒PHP之后()中表示复制起点。共栖载体系统的下列组合，(1)辅助质粒PHP79759(BBR1 ORI)，具有二元载体PHP79763(BBR1 ORI)、RV005199(PSA ORI)、PHP79768(PVS1 ORI)、PHP79766(repABC)、PHP80569(RK2full)和PHP80404(RK2full+PARDE)，(2)辅助质粒PHP80402(PSA ORI)，具有二元载体PHP80569(RK2full)和PHP80404(RK2full+PARDE)，(3)辅助质粒PHP80399(PSA ORI+PARDE)，具有二元载体PHP79768(PVS1 ORI)、PHP79766(repABC)、PHP80569(RK2full)和PHP80404(RK2full+PARDE)，(4)辅助质粒PHP79761(PVS1 ORI)，具有二元载体RV005199(PSA ORI)、PHP79768(PVS1 ORI)、PHP79766(repABC)、PHP79764(RFS1010 ORI)、PHP80569(RK2full)和PHP80404(RK2full+PARDE)，(5)辅助质粒PHP79760(RFS1010 ORI)，具有二元载体RV005199(PSAORI)、PHP79768(PVS1 ORI)、PHP79766(repABC)、PHP79764(RFS1010 ORI)和PHP80404(RK2full+PARDE)，(6)辅助质粒RV005393(RK2full+PARDE)，具有二元载体RV005199(PSAORI)、PHP79768(PVS1 ORI)和PHP79766(repABC)，(7)辅助质粒PHP80398(RK2micro)，具有二元载体RV005199(PSA ORI)、PHP79766(repABC)和RV005201(RK2micro)，和(8)辅助质粒PHP80566(RK2micro+PARDE)，具有二元载体PHP79768(PVS1 ORI)全部显示出不同水平的RFP表达。上面列出的所有复制起点都可用于植物转化。
表18.复制子起点显示在用携带共整合或共栖(辅助和二元)载体的海沃德苍白杆菌H1菌株转化的烟草BY-2细胞中瞬时RFP表达。表18中的空框表明质粒组分不存在。
实例16：用苍白杆菌进行植物转化
苍白杆菌转化也可以用于植物的遗传改良。在有或没有辅助质粒的T-DNA二元载体上，可以使用苍白杆菌介导的随机转化来递送含有目的基因的表达盒。可用于这些随机转化的植物材料可以是：双子叶植物，其包括但不限于：向日葵、拟南芥、红花、大豆、苜蓿、低芥酸菜籽、芸苔属植物、棉花，或单子叶植物，其包括但不限于：玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、高粱、粟和甘蔗。
实例17：与苍白杆菌的位点特异性整合
如本文所公开的苍白杆菌转化可以用于由重组酶介导的位点特异性基因靶向。可以使用苍白杆菌转化来产生含有一个或多个不相同的重组位点以提供靶基因座的品系。然后可以在靶基因座上使用苍白杆菌转化进行位点特异性整合(SSI)，以允许递送含有一种或多种构建体的转移盒，如美国临时申请号62/296639所述，其全部内容通过引用并入本文中。
实例18：用苍白杆菌进行核酸酶介导的基因组修饰
如本文所公开的苍白杆菌转化可用于进行由CRISPR-Cas核酸酶介导的基因组修饰。WO 2013/141680、US 2014/0068797和WO 2015/026883中描述了由CRISPR-Cas核酸酶介导的进行基因组修饰的方法，所述文献各自通过引用全部并入本文中。
实例19：用于改善SSI，CRISPR-Cas9核酸酶的苍白杆菌转化的替代性复制起点 (Ori)和使用具有不同复制起点的转移盒和/或辅助质粒的内切核酸酶-介导的基因组修饰
使用具有不同Oris的载体进行的苍白杆菌转化可用于改善SSI和CRISPR-Cas9基因组编辑。WO 2013/141680、US 2014/0068797和WO 2015/026883中描述了由CRISPR-Cas核酸酶介导的进行基因组修饰的方法，所述文献各自通过引用全部并入本文中。具有不同的细菌Oris的转移盒导致不同的质粒拷贝数，其包括但不限于RepABC、pRi、pVS1、RK2，所述转移盒可用于调节递送到用于SSI和CRISPR-Cas9基因组编辑的植物细胞的DNA分子的量。可替代地，具有不同Oris的转移盒可以与携带额外毒力基因的辅助质粒组合。这些辅助质粒可能具有不同的细菌复制起点(表1B)，其具有不同的质粒拷贝数。
实例20：序列鉴定编号(SEQ ID NO：)
表19.
保藏
在一些方面，所述细菌菌株是于2015年7月10日，以登录号NRRL B-67078，保藏于农业研究服务培养物保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection，NRRL)(伊利诺斯州61604皮奥瑞亚市北大学街1815号(1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604))的海沃德苍白杆菌H1菌株的纯生物培养物(nrrl.ncaur.usda.gov，可通过使用“www”前缀在万维网上访问)。这些保藏将根据国际承认用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约(Budapest Treaty)的条款维护。这些保藏仅仅是为了本领域技术人员的方便，而不是承认在35 U.S.C.§112下要求保藏。在向专利商标局委员以及由委员确定在要求下有资格的人员提出申请的期间，所述保藏是可获得的。考虑到本申请的任何权利要求，依照37 C.F.R.§1.808，所述一位或多位申请人将使农业研究服务培养物保藏中心(NRRL)(伊利诺斯州61604皮奥瑞亚市北大学街1815号(1815North University Street，Peoria，Illinois 61604))的保藏的一个或多个样品为公众可获得。所述保藏将在NRRL存储处(这是一个公共存储处)中维护30年，也可以是在最近的要求之后5年，或专利的可执行期限内，以较长的时间为准，并且在此期间如果其变得无法存活，则应将其替换。在专利公布时，所述保藏将不可撤销地且无限制或无条件地向公众提供。此外，一位或多位申请人已经满足37 C.F.R.§§1.801-1.809的所有要求，包括在保藏时提供样品的生存力的指示。一位或多位申请人无权不顾法律对转移生物材料或其商业运输的任何限制。一位或多位申请人不会不理会对本专利授予他们的权利的任何侵犯。但是，应当理解的是，在由政府行为授予的专利权的部分废除中，保藏物的可用性不会构成实践主题公开的许可。
如本文所使用的，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”以及“该”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括多个这样的细胞，并且提及“蛋白质”包括本领域技术人员已知的一种或多种蛋白质及其等效物等。在此所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义，除非另有明确说明。
出于所有目的，在此全文并入此说明书中引用的所有的出版物、专利、专利申请或其它文献以供参考，这就如同出于所有目的单独提到各个出版物、专利、专利申请或其它文献以将它们整体并入供作参考。
尽管为了清楚和理解的目的已经详细描述了上述发明，但是本领域技术人员通过阅读本公开内容将清楚的是，可以在形式和细节方面进行各种改变而不脱离本发明的真实范围。例如，上述所有的技术、方法、组合物、设备和系统都可以各种组合使用。虽然为了清楚理解的目的，已经通过说明和实例的方式对前述公开进行了详细描述，但是在所附权利要求的范围内可以实施某些改变和修改。

Claims (318)

1.一种分离的海沃德苍白杆菌(Ochrobactrum haywardense)H1，其中所述苍白杆菌(Ochrobactrum)被保藏在NRRL B-67078下。
2.海沃德苍白杆菌H1，其包含载体，所述载体包含处于有效连接的：
a.第一核酸，其包含vir基因区域，其中所述vir基因区域发挥作用以VirD2依赖性方式将编码目的序列的核酸引入植物细胞中；和
b.第二核酸，其包含与目的序列有效地连接的一个或多个T-DNA边界序列。
3.如权利要求2所述的苍白杆菌，其中所述第一核酸和所述第二核酸在单个多核苷酸分子上。
4.如权利要求2所述的苍白杆菌，其中所述第一核酸和所述第二核酸在分离的多核苷酸分子上。
5.如权利要求2-4中任一项所述的苍白杆菌，其还包含选择性标记基因。
6.如权利要求5所述的苍白杆菌，其中所述选择性标记基因提供对庆大霉素、新霉素/卡那霉素、潮霉素或壮观霉素的抗性。
7.如权利要求5-6中任一项所述的苍白杆菌，其中所述选择性标记基因是aacC1基因、npt1基因、npt2基因、hpt基因、SpcN基因、aph基因或aadA基因。
8.如权利要求5-7中任一项所述的苍白杆菌，其中所述选择性标记基因是aacC1基因。
9.如权利要求5-8中任一项所述的苍白杆菌，其中所述aacC1基因具有SEQ ID NO：1、或其变体和片段。
10.如权利要求5-9中任一项所述的苍白杆菌，其中所述选择性标记基因是aadA基因。
11.如权利要求5-10中任一项所述的苍白杆菌，其中所述aadA基因具有SEQ ID NO：39、或其变体和片段。
12.如权利要求5-11中任一项所述的苍白杆菌，其中所述选择性标记基因是npt1基因。
13.如权利要求5-12中任一项所述的苍白杆菌，其中所述npt1基因具有SEQ ID NO：40、或其变体和片段。
14.如权利要求5-13中任一项所述的苍白杆菌，其中所述选择性标记基因是npt2基因。
15.如权利要求5-14中任一项所述的苍白杆菌，其中所述npt2基因具有SEQ ID NO：41、或其变体和片段。
16.如权利要求5-15中任一项所述的苍白杆菌，其中所述选择性标记基因是hpt基因。
17.如权利要求5-16中任一项所述的苍白杆菌，其中所述hpt基因具有SEQ ID NO：67、或其变体和片段。
18.如权利要求5-17中任一项所述的苍白杆菌，其中所述选择性标记基因不是四环素选择性标记基因。
19.如权利要求5-18中任一项所述的苍白杆菌，其中所述选择性标记基因不是tetAR基因。
20.如权利要求5-19中任一项所述的苍白杆菌，其中所述选择性标记基因是反向选择性标记基因。
21.如权利要求20所述的苍白杆菌，其中所述反向选择性标记基因是sacB基因、rpsL(strA)基因、pheS基因、dhfr(folA)基因、lacY基因、Gata-1基因、ccdB基因、或thyA-基因。
22.如权利要求2-21中任一项所述的苍白杆菌，其中所述vir基因区域包含分别具有SEQ ID NO：4-14、或其变体和衍生物的根瘤菌科(Rhizobiaceae)毒力基因virB1-virB11或分别具有SEQ ID NO：80-90、或其变体和衍生物的r-virB1-B11，其中包含所述毒力基因r-virB1-B11的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。
23.如权利要求2-21中任一项所述的苍白杆菌，其中所述vir基因区域包含分别具有SEQ ID NO：16-17、或其变体和衍生物的根瘤菌科毒力基因virC1-C2或分别具有SEQ IDNO：92-93、或其变体和衍生物的r-virC1-C2，其中包含所述毒力基因r-virC1-C2的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。
24.如权利要求2-21中任一项所述的苍白杆菌，其中所述vir基因区域包含分别具有SEQ ID NO：18-19、或其变体和衍生物的根瘤菌科毒力基因virD1-D2或分别具有SEQ IDNO：94-95、或其变体和衍生物的r-virD1-D2，其中包含所述毒力基因r-virD1-D2的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。
25.如权利要求2-21中任一项所述的苍白杆菌，其中所述vir基因区域包含具有SEQ IDNO：15、或其变体和衍生物的根瘤菌科毒力基因virG或具有SEQ ID NO：91、或其变体和衍生物的r-virG毒力基因，其中包含所述毒力基因r-virG的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。
26.如权利要求2-21中任一项所述的苍白杆菌，其中所述vir基因区域包含一种或多种根瘤菌科毒力基因virA、virD3、virD4、virD5、virE1、virE2、virE3、virH、virH1、virH2、virK、virL、virM、virP、virQ、r-virA、r-virD3、r-virD4、r-virD5、r-virE3、或r-virF或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virA、r-virD3、r-virD4、r-virD5、r-virE3、或r-virF的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。
27.如权利要求26所述的苍白杆菌，其中所述根瘤菌科毒力基因是具有SEQ ID NO：26、或其变体和衍生物的virA，或具有SEQ ID NO：79、或其变体和衍生物的r-virA毒力基因，其中包含所述毒力基因r-virA的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。
28.如权利要求26所述的苍白杆菌，其中所述根瘤菌科毒力基因virD3-D5分别具有SEQID NO：20-22、或其变体和衍生物或所述r-virD3-D5毒力基因分别具有SEQ ID NO：96-98、或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virD3-D5的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。
29.如权利要求26所述的苍白杆菌，其中所述根瘤菌科毒力基因virE1-E3分别具有SEQID NO：23-25、或其变体和衍生物或所述r-virE3毒力基因具有SEQ ID NO：100、或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virE3的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。
30.如权利要求26所述的苍白杆菌，其中所述根瘤菌科毒力基因virH-H1分别具有SEQID NO：42-43、或其变体和衍生物。
31.如权利要求26所述的苍白杆菌，其中所述根瘤菌科毒力基因virK具有SEQ ID NO：45、或其变体和衍生物。
32.如权利要求26所述的苍白杆菌，其中所述根瘤菌科毒力基因virL具有SEQ ID NO：46、或其变体和片段。
33.如权利要求26所述的苍白杆菌，其中所述根瘤菌科毒力基因virM具有SEQ ID NO：47、或其变体和片段。
34.如权利要求26所述的苍白杆菌，其中所述根瘤菌科毒力基因virP具有SEQ ID NO：48、或其变体和片段。
35.如权利要求26所述的苍白杆菌，其中所述根瘤菌科毒力基因virQ具有SEQ ID NO：49、或其变体和片段。
36.如权利要求26所述的苍白杆菌，其包含所述根瘤菌科毒力基因virD3-D5和virE1-E3或其变体和片段或r-virD3-D5和r-virE3或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virD3-D5和r-virE3的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。
37.如权利要求26所述的苍白杆菌，其包含根瘤菌科毒力基因virA、virD3-D5和virE1-E3或其变体和片段，或r-virA、r-virD3-D5和r-virE3或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virA、r-virD3-D5和r-virE3的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。
38.如权利要求2-37中任一项所述的苍白杆菌，其还包含用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中繁殖和稳定维持的复制起点。
39.如权利要求38所述的苍白杆菌，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自Col E1、pSC101、p15A或R6K复制起点、及其变体或衍生物。
40.如权利要求39所述的苍白杆菌，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自Col E1复制起点。
41.如权利要求40所述的苍白杆菌，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：2、或其变体和片段的ColE1复制起点。
42.如权利要求39所述的苍白杆菌，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自pSC101复制起点。
43.如权利要求42所述的苍白杆菌，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：50、或其变体和片段的pSC101复制起点。
44.如权利要求39所述的苍白杆菌，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自p15A复制起点。
45.根据权利要求44所述的苍白杆菌，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：51、或其变体和片段的p15A复制起点。
46.如权利要求39所述的苍白杆菌，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自R6K复制起点。
47.如权利要求46所述的苍白杆菌，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：52、或其变体和片段的R6K复制起点。
48.如权利要求2-47中任一项所述的苍白杆菌，其还包含用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点。
49.如权利要求48所述的苍白杆菌，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是高拷贝数的复制起点。
50.如权利要求48所述的苍白杆菌，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是中等拷贝数的复制起点。
51.如权利要求48所述的苍白杆菌，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是低拷贝数的复制起点。
52.如权利要求48所述的苍白杆菌，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pRi、pVS1、pRFS1010、pRK2、pSa或pBBR1复制起点。
53.如权利要求52所述的苍白杆菌，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是pRK2复制起点的变体。
54.如权利要求52所述的苍白杆菌，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pRFS1010复制起点。
55.如权利要求52所述的苍白杆菌，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pVS1复制起点。
56.如权利要求52所述的苍白杆菌，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pSa复制起点。
57.如权利要求52所述的苍白杆菌，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点具有SEQ ID NO：3、37、38、53、57、58、59、60或112或其变体和片段。
58.如权利要求48所述的苍白杆菌，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是repABC相容性复制起点。
59.如权利要求58所述的苍白杆菌，其中所述repABC相容性复制起点具有SEQ ID NO：57、58、59或60、或其变体和片段。
60.如权利要求38-59中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点以及用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是相同的复制起点。
61.如权利要求60所述的苍白杆菌，其中所述复制起点源自pRK2复制起点、pSa复制起点或pRFS1010复制起点。
62.如权利要求60或61所述的苍白杆菌，其中所述复制起点源自pRK2复制起点。
63.如权利要求62所述的苍白杆菌，其中所述pRK2复制起点具有SEQ ID NO：38、或其变体和片段。
64.如权利要求60或61所述的苍白杆菌，其中所述复制起点源自pSa复制起点。
65.如权利要求64所述的苍白杆菌，其中所述pSa复制起点具有SEQ ID NO：53、或其变体和片段。
66.如权利要求60或61所述的苍白杆菌，其中所述复制起点源自pRFS1010复制起点。
67.如权利要求66所述的苍白杆菌，其中所述pRFS1010复制起点具有SEQ ID NO：37、或其变体和片段。
68.如权利要求60-62中任一项所述的苍白杆菌，其中所述pRK2复制起点是迷你型或微型pRK2复制起点。
69.如权利要求60-62或68中任一项所述的苍白杆菌，其中所述pRK2复制起点是微型pRK2复制起点。
70.如权利要求69所述的苍白杆菌，其中所述微型pRK2复制起点具有SEQ ID NO：54、或其变体和片段。
71.如权利要求60-62或68中任一项所述的苍白杆菌，其中所述pRK2复制起点是迷你型pRK2复制起点。
72.如权利要求71所述的苍白杆菌，其中所述迷你型pRK2具有SEQ ID NO：66、或其变体和片段。
73.如权利要求60-62或68中任一项所述的苍白杆菌，其中所述pRK2复制起点包含trfA和OriV序列。
74.如权利要求73所述的苍白杆菌，其中所述pRK2复制起点包含SEQ ID NO：64和65或其变体和片段。
75.如权利要求60-74中任一项所述的苍白杆菌，其还包含源自par DE操纵子的序列。
76.如权利要求75所述的苍白杆菌，其中所述par DE操纵子具有SEQ ID NO：55、或其变体和片段。
77.一种生产转化的植物细胞的方法，所述方法包括：
a.使植物细胞与包含处于有效连接的第一核酸和第二核酸的苍白杆菌接触，其中所述第一核酸包含vir基因区域并且所述第二核酸包含有效地连接至目的序列的一个或多个T-DNA边界序列；
b.在允许苍白杆菌将所述目的序列转移至所述植物细胞的条件下培养所述植物细胞；和
c.鉴定在其基因组中包含所述目的序列的转化的植物细胞。
78.如权利要求77所述的方法，其还包括使在其基因组中包含所述目的序列的植物再生。
79.如权利要求77或78所述的方法，其中所述植物细胞来自单子叶植物或双子叶植物。
80.如权利要求77或78所述的方法，其中所述植物细胞来自选自由以下组成的组的植物：大豆、烟草、向日葵、拟南芥(Arabidopsis)、红花、苜蓿、玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、粟、低芥酸菜籽、芸苔属(Brassica)、棉花和甘蔗。
81.如权利要求77-80中任一项所述的方法，其中在接触所述植物细胞之前，在乙酰丁香酮或诱导vir或r-vir基因功能的其他化合物的存在下使所述苍白杆菌生长。
82.如权利要求77-81中任一项所述的方法，其中所述植物细胞包含在来自植物种子、幼苗、愈伤组织、细胞悬液、子叶、分生组织、叶、根或茎的外植体中；并且使所述外植体与所述苍白杆菌接触。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述外植体包含胚分生组织、体细胞分生组织、愈伤组织、细胞悬液；子叶、子叶节，或者包含来自叶、根或茎的组织。
84.如权利要求77所述的方法，其中鉴定包含所述目的序列的植物细胞在不存在选择剂的情况下进行。
85.如权利要求77所述的方法，其中鉴定包含所述目的序列的植物细胞包括在选择剂的存在下培养所述植物细胞，其中所述目的序列赋予对所述选择剂的耐受性或与赋予对所述选择剂的耐受性的选择性标记共递送。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述选择剂是氯磺隆、胺苯磺隆、灭草烟、草甘膦、卡那霉素、壮观霉素、双丙氨磷、2，4-D或麦草畏。
87.如权利要求85所述的方法，其中所述目的序列与选择性标记基因没有物理连锁。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述标记基因和所述目的序列在从包含所述目的序列的植物细胞再生的植物的子代中遗传分离。
89.如权利要求77所述的方法，其中所述苍白杆菌还包含第三核酸，所述第三核酸包含第二目的序列，并且由此所述经转化的细胞在其基因组中包含所述第二目的序列。
90.如权利要求78所述的方法，其中从所述植物细胞使植物再生包括从包含所述植物细胞的外植体诱导形成一个或多个芽并且将至少第一芽培育成完整的可育植物。
91.如权利要求90所述的方法，其中再生通过器官发生来发生。
92.如权利要求77-91中任一项所述的方法，其中所述苍白杆菌选自由以下组成的组：海沃德苍白杆菌H1、金雀儿苍白杆菌(Ochrobactrum cytisi)、大田苍白杆菌(Ochrobactrum daejeonense)、羽扇豆苍白杆菌(Ochrobactrum lupine)、稻苍白杆菌(Ochrobactrum oryzae)、小麦苍白杆菌(Ochrobactrum tritici)、LBNL124-A-10、HTG3-C-07和牲畜苍白杆菌(Ochrobactrum pecoris)。
93.如权利要求77所述的方法，其中所述苍白杆菌还包含选择性标记。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述选择性标记提供对庆大霉素、新霉素/卡那霉素、潮霉素或壮观霉素的抗性。
95.如权利要求93-94中任一项所述的方法，其中所述选择性标记基因是aacC1基因、npt1基因、npt2基因、hpt基因、SpcN基因、aph基因或aadA基因。
96.如权利要求93-95中任一项所述的方法，其中所述选择性标记基因是aacC1基因。
97.如权利要求93-96中任一项所述的方法，其中所述aacC1基因具有SEQ ID NO：1、或其变体和片段。
98.如权利要求93-97中任一项所述的方法，其中所述选择性标记基因是aadA基因。
99.如权利要求93-98中任一项所述的方法，其中所述aadA基因具有SEQ ID NO：39、或其变体和片段。
100.如权利要求93-99中任一项所述的方法，其中所述选择性标记基因是npt1基因。
101.如权利要求93-100中任一项所述的方法，其中所述npt1基因具有SEQ ID NO：40、或其变体和片段。
102.如权利要求93-101中任一项所述的方法，其中所述选择性标记基因是npt2基因。
103.如权利要求93-102中任一项所述的方法，其中所述npt2基因具有SEQ ID NO：41、或其变体和片段。
104.如权利要求93-103中任一项所述的方法，其中所述选择性标记基因是hpt基因。
105.如权利要求93-104中任一项所述的方法，其中所述hpt基因具有SEQ ID NO：67、或其变体和片段。
106.如权利要求93-105中任一项所述的方法，其中所述选择性标记基因不是四环素选择性标记基因。
107.如权利要求93-106中任一项所述的方法，其中所述选择性标记基因不是tetAR基因。
108.如权利要求93-107中任一项所述的方法，其中所述选择性标记基因是反向选择性标记基因。
109.如权利要求108所述的方法，其中所述反向选择性标记基因是sacB基因、rpsL(strA)基因、pheS基因、dhfr(folA)基因、lacY基因、Gata-1基因、ccdB基因、或thyA-基因。
110.如权利要求77-109中任一项所述的方法，其中所述vir基因区域包含分别具有SEQID NO：4-14、或其变体和衍生物的根瘤菌科毒力基因virB1-virB11或分别具有SEQ ID NO：80-90、或其变体和衍生物的r-virB1-B11，其中包含所述毒力基因r-virB1-B11的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。
111.如权利要求77-109中任一项所述的方法，其中所述vir基因区域包含分别具有SEQID NO：16-17、或其变体和衍生物的根瘤菌科毒力基因virC1-C2或分别具有SEQ ID NO：92-93、或其变体和衍生物的r-virC1-C2，其中包含所述毒力基因r-virC1-C2的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。
112.如权利要求77-109中任一项所述的方法，其中所述vir基因区域包含分别具有SEQID NO：18-19、或其变体和衍生物的根瘤菌科毒力基因virD1-D2或分别具有SEQ ID NO：94-95、或其变体和衍生物的r-virD1-D2，其中包含所述毒力基因r-virD1-D2的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。
113.如权利要求77-109中任一项所述的方法，其中所述vir基因区域包含具有SEQ IDNO：15、或其变体和衍生物的根瘤菌科毒力基因virG或具有SEQ ID NO：91、或其变体和衍生物的r-virG毒力基因，其中包含所述毒力基因r-virG的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。
114.如权利要求77-109中任一项所述的方法，其中所述vir基因区域包含一种或多种根瘤菌科毒力基因virA、virD3、virD4、virD5、virE1、virE2、virE3、virH、virH1、virH2、virK、virL、virM、virP、virQ、r-virA、r-virD3、r-virD4、r-virD5、r-virE3、或r-virF或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virA、r-virD3、r-virD4、r-virD5、r-virE3、或r-virF的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。
115.如权利要求114所述的方法，其中所述根瘤菌科毒力基因是具有SEQ ID NO：26、或其变体和衍生物的virA，或具有SEQ ID NO：79、或其变体和衍生物的r-virA毒力基因，其中包含所述毒力基因r-virA的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。
116.如权利要求114所述的方法，其中所述根瘤菌科毒力基因virD3-D5分别具有SEQID NO：20-22、或其变体和衍生物或所述r-virD3-D5毒力基因分别具有SEQ ID NO：96-98、或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virD3-D5的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。
117.如权利要求114所述的方法，其中所述根瘤菌科毒力基因virE1-E3分别具有SEQID NO：23-25、或其变体和衍生物或所述r-virE3毒力基因具有SEQ ID NO：100、或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virE3的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。
118.如权利要求114所述的方法，其中所述根瘤菌科毒力基因virH-H2分别具有SEQ IDNO：42-43、或其变体和衍生物。
119.如权利要求114所述的方法，其中所述根瘤菌科毒力基因virK具有SEQ ID NO：45、或其变体和衍生物。
120.如权利要求114所述的方法，其中所述根瘤菌科毒力基因virL具有SEQ ID NO：46、或其变体和片段。
121.如权利要求114所述的方法，其中所述根瘤菌科毒力基因virM具有SEQ ID NO：47、或其变体和片段。
122.如权利要求114所述的方法，其中所述根瘤菌科毒力基因virP具有SEQ ID NO：48、或其变体和片段。
123.如权利要求114所述的方法，其中所述根瘤菌科毒力基因virQ具有SEQ ID NO：49、或其变体和片段。
124.如权利要求114所述的方法，其包含所述根瘤菌科毒力基因virD3-D5和virE1-E3、或其变体和片段或r-virD3-D5和r-virE3、或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virD3-D5和r-virE3的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。
125.如权利要求114所述的方法，其包含所述根瘤菌科毒力基因virA、virD3-D5和virE1-E3、或其变体和片段，或r-virA、r-virD3-D5和r-virE3、或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virA、r-virD3-D5和r-virE3的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因。
126.如权利要求77-125中任一项所述的方法，其中所述苍白杆菌还包含用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点。
127.如权利要求126所述的方法，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自Col E1、pSC101、p15A、或R6K复制起点及其变体或衍生物。
128.如权利要求127所述的方法，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自Col E1复制起点。
129.如权利要求128所述的方法，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：2、或其变体和片段的ColE1复制起点。
130.如权利要求127所述的方法，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自pSC101复制起点。
131.如权利要求130所述的方法，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：50、或其变体和片段的pSC101复制起点。
132.如权利要求127所述的方法，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自p15A复制起点。
133.如权利要求132所述的方法，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：51、或其变体和片段的p15A复制起点。
134.如权利要求127所述的方法，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自R6K复制起点。
135.如权利要求134所述的方法，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：52、或其变体和片段的R6K复制起点。
136.如权利要求77-135中任一项所述的方法，其中所述苍白杆菌还包含用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点。
137.如权利要求136所述的方法，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是高拷贝数的复制起点。
138.如权利要求136所述的方法，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是中等拷贝数的复制起点。
139.如权利要求136所述的方法，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是低拷贝数的复制起点。
140.如权利要求136所述的方法，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pRi、pVS1、pRFS1010、pRK2、pSa或pBBR1复制起点。
141.如权利要求140所述的方法，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是pRK2复制起点的变体。
142.如权利要求140所述的方法，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pRFS1010复制起点。
143.如权利要求140所述的方法，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pVS1复制起点。
144.如权利要求140所述的方法，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pSa复制起点。
145.如权利要求140所述的方法，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点具有SEQ ID NO：3、37、38、53、57、58、59、60或112或其变体和片段。
146.如权利要求136所述的方法，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是repABC相容性复制起点。
147.如权利要求146所述的方法，其中所述repABC相容性复制起点具有SEQ ID NO：57、58、59或60、或其变体和片段。
148.如权利要求126-147中任一项所述的方法，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点以及所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是相同的复制起点。
149.如权利要求148所述的方法，其中所述复制起点源自pRK2复制起点、pSa复制起点或pRFS1010复制起点。
150.如权利要求148或149所述的方法，其中所述复制起点源自pRK2复制起点。
151.如权利要求150所述的方法，其中所述pRK2复制起点具有SEQ ID NO：38、或其变体和片段。
152.如权利要求148或149所述的方法，其中所述复制起点源自pSa复制起点。
153.如权利要求152所述的方法，其中所述pSa复制起点具有SEQ ID NO：53、或其变体和片段。
154.如权利要求148或149所述的方法，其中所述复制起点源自pRFS1010复制起点。
155.如权利要求154所述的方法，其中所述pRFS1010复制起点具有SEQ ID NO：37、或其变体和片段。
156.如权利要求149-151中任一项所述的方法，其中所述pRK2复制起点是迷你型或微型pRK2复制起点。
157.如权利要求149-151或156中任一项所述的方法，其中所述pRK2复制起点是微型pRK2复制起点。
158.如权利要求157所述的方法，其中所述微型pRK2复制起点具有SEQ ID NO：54、或其变体和片段。
159.如权利要求149-151或156中任一项所述的方法，其中所述pRK2复制起点是迷你型pRK2复制起点。
160.如权利要求159所述的方法，其中所述迷你型pRK2具有SEQ ID NO：66、或其变体和片段。
161.如权利要求149-151或156中任一项所述的方法，其中所述pRK2复制起点包含trfA和OriV序列。
162.如权利要求161所述的方法，其中所述pRK2复制起点包含SEQ ID NO：64和65、或其变体和片段。
163.如权利要求136-162中任一项所述的方法，其还包含源自par DE操纵子的序列。
164.如权利要求163所述的方法，其中所述par DE操纵子具有SEQ ID NO：55、或其变体和片段。
165.海沃德苍白杆菌H1，其包含：
第一载体，其包含处于有效连接的：
a)用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点；
b)用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点；
c)选择性标记基因；和
d)根瘤菌科毒力基因virB1-B11或r-virB1-B11、virC1-C2或r-virC1-C2、virD1-D2或r-virD1-D2、和virG或r-virG或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virB1-B11、r-virC1-C2、r-virD1-D2、和r-virG的载体还包含具有SEQ ID NO：101、或其变体和衍生物的r-galls毒力基因；以及
第二载体，其包含处于有效连接的一个或多个T-DNA边界序列，所述T-DNA边界序列有效地连接至目的序列。
166.如权利要求165所述的苍白杆菌，其中所述根瘤菌科毒力基因是分别具有SEQ IDNO：4-14、或其变体和衍生物的virB1-virB11，或分别具有SEQ ID NO：80-90、或其变体和衍生物的r-virB1-B11。
167.如权利要求165所述的苍白杆菌，其中所述根瘤菌科毒力基因是分别具有SEQ IDNO：16-17、或其变体和衍生物的virC1-C2，或分别具有SEQ ID NO：92-93、或其变体和衍生物的r-virC1-C2。
168.如权利要求165所述的苍白杆菌，其中所述根瘤菌科毒力基因是分别具有SEQ IDNO：18-19、或其变体和衍生物的virD1-D2，或分别具有SEQ ID NO：94-95、或其变体和衍生物的r-virD1-D2。
169.如权利要求165所述的苍白杆菌，其中所述根瘤菌科毒力基因是具有SEQ ID NO：15、或其变体和衍生物的virG，或具有SEQ ID NO：91、或其变体和衍生物的r-virG毒力基因。
170.如权利要求165所述的苍白杆菌，其还包含一种或多种根瘤菌科毒力基因virA、virD3、virD4、virD5、virE1、virE2、virE3、virH、virH1、virH2、virK、virL、virM、virP、virQ、r-virA、r-virD3、r-virD4、r-virD5、r-virE3、或r-virF或其变体和衍生物。
171.如权利要求165-170中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自Col E1、pSC101、p15A或R6K复制起点、或其变体或衍生物。
172.如权利要求165-171中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自Col E1复制起点。
173.如权利要求165-172中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：2、或其变体和片段的ColE1复制起点。
174.如权利要求165-173中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自pSC101复制起点。
175.如权利要求165-174中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：50、或其变体和片段的pSC101复制起点。
176.如权利要求165-175中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自p15A复制起点。
177.如权利要求165-176中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：51、或其变体和片段的p15A复制起点。
178.如权利要求165-177中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自R6K复制起点。
179.如权利要求165-178中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：52、或其变体和片段的R6K复制起点。
180.如权利要求165-179中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是高拷贝数的复制起点。
181.如权利要求165-179中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是中等拷贝数的复制起点。
182.如权利要求165-179中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是低拷贝数的复制起点。
183.如权利要求165-179中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pRi、pVS1、pRFS1010、pRK2、pSa或pBBR1复制起点。
184.如权利要求165-179或183中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是pRK2复制起点的变体。
185.如权利要求165-179或183中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pRFS1010复制起点。
186.如权利要求165-179或183中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pVS1复制起点。
187.如权利要求165-179或183中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pSa复制起点。
188.如权利要求165-179或183中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点具有SEQ ID NO：3、37、38、53、57、58、59、60或112或其变体和片段。
189.如权利要求165-179中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是repABC相容性复制起点。
190.如权利要求189所述的苍白杆菌，其中所述repABC相容性复制起点具有SEQ IDNO：57、58、59或60、或其变体和片段。
191.如权利要求165-170中任一项所述的苍白杆菌，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点以及所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是相同的复制起点。
192.如权利要求191所述的苍白杆菌，其中所述复制起点源自pRK2复制起点、pSa复制起点或pRFS1010复制起点。
193.如权利要求191或192所述的苍白杆菌，其中所述复制起点源自pRK2复制起点。
194.如权利要求193所述的苍白杆菌，其中所述pRK2复制起点具有SEQ ID NO：38、或其变体和片段。
195.如权利要求191或192所述的苍白杆菌，其中所述复制起点源自pSa复制起点。
196.如权利要求195所述的苍白杆菌，其中所述pSa复制起点具有SEQ ID NO：53、或其变体和片段。
197.如权利要求191或192所述的苍白杆菌，其中所述复制起点源自pRFS1010复制起点。
198.如权利要求197所述的苍白杆菌，其中所述pRFS1010复制起点具有SEQ ID NO：37、或其变体和片段。
199.如权利要求191或192所述的苍白杆菌，其中所述复制起点源自pRK2复制起点。
200.如权利要求192-194或199中任一项所述的苍白杆菌，其中所述pRK2复制起点是迷你型或微型pRK2复制起点。
201.如权利要求192-194或199-200中任一项所述的苍白杆菌，其中所述pRK2复制起点是微型pRK2复制起点。
202.如权利要求201所述的苍白杆菌，其中所述微型pRK2复制起点具有SEQ ID NO：54、或其变体和片段。
203.如权利要求192-194或199-200中任一项所述的苍白杆菌，其中所述pRK2复制起点是迷你型pRK2复制起点。
204.如权利要求203所述的苍白杆菌，其中所述迷你型pRK2具有SEQ ID NO：66、或其变体和片段。
205.如权利要求192-194或199-204中任一项所述的苍白杆菌，其中所述pRK2复制起点包含trfA和OriV序列。
206.如权利要求205所述的苍白杆菌，其中所述pRK2复制起点包含SEQ ID NO：64和65、或其变体和片段。
207.如权利要求180-206中任一项所述的苍白杆菌，其还包含源自par DE操纵子的序列。
208.如权利要求207所述的苍白杆菌，其中所述par DE操纵子具有SEQ ID NO：55、或其变体和片段。
209.如权利要求165-208中任一项所述的苍白杆菌，其中所述选择性标记提供对庆大霉素、新霉素/卡那霉素、潮霉素或壮观霉素的抗性。
210.如权利要求209所述的苍白杆菌，其中所述选择性标记基因是aacC1基因、npt1基因、npt2基因、hpt基因、SpcN基因、aph基因或aadA基因。
211.如权利要求210所述的苍白杆菌，其中所述选择性标记基因是aacC1基因。
212.如权利要求211所述的苍白杆菌，其中所述aacC1基因具有SEQ ID NO：1、或其变体和片段。
213.如权利要求210所述的苍白杆菌，其中所述选择性标记基因是aadA基因。
214.如权利要求213所述的苍白杆菌，其中所述aadA基因具有SEQ ID NO：39、或其变体和片段。
215.如权利要求210所述的苍白杆菌，其中所述选择性标记基因是npt1基因。
216.如权利要求215所述的苍白杆菌，其中所述npt1基因具有SEQ ID NO：40、或其变体和片段。
217.如权利要求210所述的苍白杆菌，其中所述选择性标记基因是npt2基因。
218.如权利要求217所述的苍白杆菌，其中所述npt2基因具有SEQ ID NO：41、或其变体和片段。
219.如权利要求210所述的苍白杆菌，其中所述选择性标记基因是hpt基因。
220.如权利要求219所述的苍白杆菌，其中所述hpt基因具有SEQ ID NO：67、或其变体和片段。
221.如权利要求165-208中任一项所述的苍白杆菌，其中所述选择性标记基因不是四环素选择性标记基因。
222.如权利要求165-208中任一项所述的苍白杆菌，其中所述选择性标记基因不是tetAR基因。
223.如权利要求165-208中任一项所述的苍白杆菌，其中所述选择性标记基因是反向选择性标记基因。
224.如权利要求223所述的苍白杆菌，其中所述反向选择性标记基因是sacB基因、rpsL(strA)基因、pheS基因、dhfr(folA)基因、lacY基因、Gata-1基因、ccdB基因、或thyA-基因。
225.如权利要求165-224中任一项所述的苍白杆菌，其中所述第一载体不包含SEQ IDNO：61、或其变体或片段。
226.如权利要求165-225中任一项所述的苍白杆菌，其中所述第一载体不包含SEQ IDNO：62、或其变体或片段。
227.如权利要求165-226中任一项所述的苍白杆菌，其中所述第一载体不包含tra操纵子序列或trb操纵子序列、或其变体或片段。
228.如权利要求227所述的苍白杆菌，其中所述第一载体不包含SEQ ID NO：63、或其变体或片段。
229.如权利要求165所述的苍白杆菌，其中所述第一载体具有SEQ ID NO：34、或其变体和片段。
230.如权利要求165所述的苍白杆菌，其中所述第一载体具有SEQ ID NO：35、或其变体和片段。
231.如权利要求165所述的苍白杆菌，其中所述第一载体具有SEQ ID NO：36、或其变体和片段。
232.海沃德苍白杆菌H1，其包含：
第一载体，其包含处于有效连接的：
a.用于在大肠杆菌中繁殖的、具有SEQ ID NO：2或其变体和片段的复制起点；
b.用于在苍白杆菌属物种中繁殖的、具有SEQ ID NO：3或其变体和片段的复制起点；
c.具有SEQ ID NO：1、或其变体和片段的选择性标记基因；和
d.毒力基因，其包含农杆菌属物种(Agrobacterium spp.)毒力基因：分别具有SEQ IDNO：4-14的virB1-B11毒力基因或分别具有SEQ ID NO：80-90的r-virB1-B11毒力基因、分别具有SEQ ID NO：16-17的virC1-C2毒力基因或分别具有SEQ ID NO：92-93的r-virC1-C2毒力基因、分别具有SEQ ID NO：18-19的virD1-D2毒力基因或分别具有SEQ ID NO：94-95的r-virD1-D2毒力基因、和具有SEQ ID NO：15的virG毒力基因或具有SEQ ID NO：91的r-virG毒力基因或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virB1-B11、r-virC1-C2、r-virD1-D2、和r-virG的载体还包含具有SEQ ID NO：101的r-galls毒力基因或其变体和衍生物；以及
第二载体，其包含处于有效连接的一个或多个T-DNA边界序列，所述T-DNA边界序列有效地连接至目的序列。
233.海沃德苍白杆菌H1，其包含：
第一载体，其包含处于有效连接的：
a.用于在大肠杆菌中繁殖的、具有SEQ ID NO：2或其变体和片段的复制起点；
b.用于在苍白杆菌属物种中繁殖的、具有SEQ ID NO：3或其变体和片段的复制起点；
c.具有SEQ ID NO：1、或其变体和片段的选择性标记基因；和
d.序列，其包含农杆菌属物种毒力基因：分别具有SEQ ID NO：4-14的virB1-B11毒力基因或分别具有SEQ ID NO：80-90的r-virB1-B11毒力基因、分别具有SEQ ID NO：16-17的virC1-C2毒力基因或分别具有SEQ ID NO：92-93的r-virC1-C2毒力基因、分别具有SEQ IDNO：18-22的virD1-D5毒力基因或分别具有SEQ ID NO：94-98的r-virD1-D5毒力基因、分别具有SEQ ID NO：23-25的virE1-E3毒力基因或具有SEQ ID NO：100的r-virE3毒力基因、和具有SEQ ID NO：15的virG毒力基因或具有SEQ ID NO：91的r-virG毒力基因或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virB1-B11、r-virC1-C2、r-virD1-D5、r-virE3、和r-virG的载体还包含具有SEQ ID NO：101的r-galls毒力基因或其变体和衍生物，以及
第二载体，其包含处于有效连接的一个或多个T-DNA边界序列，所述T-DNA边界序列有效地连接至目的序列。
234.海沃德苍白杆菌H1，其包含：
第一载体，其包含处于有效连接的：
a.用于在大肠杆菌中繁殖的、具有SEQ ID NO：2或其变体和片段的复制起点；
b.用于在苍白杆菌属物种中繁殖的、具有SEQ ID NO：3或其变体和片段的复制起点；
c.具有SEQ ID NO：1的选择性标记基因；和
d.序列，其包含农杆菌属物种毒力基因：具有SEQ ID NO：26的virA毒力基因或具有SEQID NO：79的r-virA毒力基因、分别具有SEQ ID NO：4-14的virB1-B11毒力基因或分别具有SEQ ID NO：80-90的r-virB1-B11毒力基因、分别具有SEQ ID NO：16-17的virC1-C2毒力基因或分别具有SEQ ID NO：92-93的r-virC1-C2毒力基因、分别具有SEQ ID NO：18-22的virD1-D5毒力基因或分别具有SEQ ID NO：94-98的r-virD1-D5毒力基因、分别具有SEQ IDNO：23-25的virE1-E3毒力基因或具有SEQ ID NO：100的r-virE3毒力基因、具有SEQ ID NO：15的virG毒力基因或具有SEQ ID NO：91的r-virG毒力基因、和具有SEQ ID NO：27的virJ毒力基因或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virA、r-virB1-B11、r-virC1-C2、r-virD1-D5、r-virE3、和r-virG的载体还包含具有SEQ ID NO：101的r-galls毒力基因或其变体和衍生物，以及
第二载体，其包含处于有效连接的一个或多个T-DNA边界序列，所述T-DNA边界序列有效地连接至目的序列。
235.一种生产转化的植物细胞的方法，所述方法包括：
使植物细胞与苍白杆菌接触，所述苍白杆菌包含：第一载体，其包含处于有效连接的：
a)用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点；
b)用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点；
c)选择性标记基因；和
d)根瘤菌科毒力基因：分别具有SEQ ID NO：4-14的virB1-B11毒力基因或分别具有SEQID NO：80-90的r-virB1-B11毒力基因、分别具有SEQ ID NO：16-17的virC1-C2毒力基因或分别具有SEQ ID NO：92-93的r-virC1-C2毒力基因、分别具有SEQ ID NO：18-19的virD1-D2毒力基因或分别具有SEQ ID NO：94-95的r-virD1-D2毒力基因、和具有SEQ ID NO：15的virG毒力基因或具有SEQ ID NO：91的r-virG毒力基因或其变体和衍生物，其中包含所述毒力基因r-virB1-B11、r-virC1-C2、r-virD1-D2、和r-virG的载体还包含具有SEQ ID NO：101的r-galls毒力基因或其变体和衍生物；以及
第二载体，其包含处于有效连接的一个或多个T-DNA边界序列，所述T-DNA边界序列有效地连接至目的序列；
在允许苍白杆菌将所述目的序列转移至所述植物细胞的条件下培养所述植物细胞；和
鉴定在其基因组中包含所述目的序列的转化的植物细胞。
236.如权利要求235所述的方法，其中所述根瘤菌科毒力基因virB1-virB11分别具有SEQ ID NO：4-14、或其变体和衍生物，或者r-virB1-B11分别具有SEQ ID NO：80-90、或其变体和衍生物。
237.如权利要求235所述的方法，其中所述根瘤菌科毒力基因virC1-C2分别具有SEQID NO：16-17、或其变体和衍生物，或者r-virC1-C2分别具有SEQ ID NO：92-93、或其变体和衍生物。
238.如权利要求235所述的方法，其中所述根瘤菌科毒力基因virC1-D2分别具有SEQID NO：18-19、或其变体和衍生物，或者r-virD1-D2分别具有SEQ ID NO：94-95、或其变体和衍生物。
239.如权利要求235所述的方法，其中所述根瘤菌科毒力基因virG具有SEQ ID NO：15、或其变体和衍生物，或者r-virG毒力基因具有SEQ ID NO：91、或其变体和衍生物。
240.如权利要求235所述的方法，其还包含一种或多种根瘤菌科毒力基因virA、virD3、virD4、virD5、virE1、virE2、virE3、virH、virH1、virH2、virK、virL、virM、virP、virQ、r-virA、r-virD3、r-virD4、r-virD5、r-virE3、或r-virF或其变体和衍生物。
241.如权利要求235-240中任一项所述的方法，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自Col E1、pSC101、p15A或R6K复制起点、或其变体或衍生物。
242.如权利要求235-241中任一项所述的方法，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自Col E1复制起点。
243.如权利要求235-242中任一项所述的方法，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：2、或其变体和片段的ColE1复制起点。
244.如权利要求235-243中任一项所述的方法，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自pSC101复制起点。
245.如权利要求235-244中任一项所述的方法，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：50、或其变体和片段的pSC101复制起点。
246.如权利要求235-245中任一项所述的方法，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自p15A复制起点。
247.如权利要求235-246中任一项所述的方法，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：51、或其变体和片段的p15A复制起点。
248.如权利要求235-247中任一项所述的方法，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自R6K复制起点。
249.如权利要求235-248中任一项所述的方法，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点源自具有SEQ ID NO：52、或其变体和片段的R6K复制起点。
250.如权利要求235-249中任一项所述的方法，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是高拷贝数的复制起点。
251.如权利要求235-249中任一项所述的方法，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是中等拷贝数的复制起点。
252.如权利要求235-249中任一项所述的方法，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是低拷贝数的复制起点。
253.如权利要求235-249中任一项所述的方法，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pRi、pVS1、pRFS1010、pRK2、pSa或pBBR1复制起点。
254.如权利要求235-249或253中任一项所述的方法，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是pRK2复制起点的变体。
255.如权利要求235-249或253中任一项所述的方法，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pRFS1010复制起点。
256.如权利要求235-249或253中任一项所述的方法，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pVS1复制起点。
257.如权利要求235-249或253中任一项所述的方法，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点源自pSa复制起点。
258.如权利要求235-249或253中任一项所述的方法，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点具有SEQ ID NO：3、37、38、53、57、58、59、60或112或其变体和片段。
259.如权利要求235-249中任一项所述的方法，其中所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是repABC相容性复制起点。
260.如权利要求259所述的方法，其中所述repABC相容性复制起点具有SEQ ID NO：57、58、59或60、或其变体和片段。
261.如权利要求235-240中任一项所述的方法，其中所述用于在大肠杆菌中繁殖和稳定维持的复制起点以及所述用于在苍白杆菌属物种中繁殖和稳定维持的复制起点是相同的复制起点。
262.如权利要求261所述的方法，其中所述复制起点源自pRK2复制起点、pSa复制起点或pRFS1010复制起点。
263.如权利要求261或262所述的方法，其中所述复制起点源自pRK2复制起点。
264.如权利要求263所述的方法，其中所述pRK2复制起点具有SEQ ID NO：38、或其变体和片段。
265.如权利要求261或262所述的方法，其中所述复制起点源自pSa复制起点。
266.如权利要求265所述的方法，其中所述pSa复制起点具有SEQ ID NO：53、或其变体和片段。
267.如权利要求261或262所述的方法，其中所述复制起点源自pRFS1010复制起点。
268.如权利要求267所述的方法，其中所述pRFS1010复制起点具有SEQ ID NO：37、或其变体和片段。
269.如权利要求261或262所述的方法，其中所述复制起点源自pRK2复制起点。
270.如权利要求262-264或269中任一项所述的方法，其中所述pRK2复制起点是迷你型或微型pRK2复制起点。
271.如权利要求262-264或269-270中任一项所述的方法，其中所述pRK2复制起点是微型pRK2复制起点。
272.如权利要求271所述的方法，其中所述微型pRK2复制起点具有SEQ ID NO：54、或其变体和片段。
273.如权利要求262-264或269-270中任一项所述的方法，其中所述pRK2复制起点是迷你型pRK2复制起点。
274.如权利要求273所述的方法，其中所述迷你型pRK2具有SEQ ID NO：66、或其变体和片段。
275.如权利要求262-264或269-274中任一项所述的方法，其中所述pRK2复制起点包含trfA和OriV序列。
276.如权利要求275所述的方法，其中所述pRK2复制起点包含SEQ ID NO：64和65、或其变体和片段。
277.如权利要求250-276中任一项所述的方法，其还包含源自par DE操纵子的序列。
278.如权利要求277所述的方法，其中所述par DE操纵子具有SEQ ID NO：55、或其变体和片段。
279.如权利要求235-278中任一项所述的方法，其中所述选择性标记提供对庆大霉素、新霉素/卡那霉素、潮霉素或壮观霉素的抗性。
280.如权利要求279所述的方法，其中所述选择性标记基因是aacC1基因、npt1基因、npt2基因、hpt基因、SpcN基因、aph基因或aadA基因。
281.如权利要求280所述的方法，其中所述选择性标记基因是aacC1基因。
282.如权利要求281所述的方法，其中所述aacC1基因具有SEQ ID NO：1、或其变体和片段。
283.如权利要求280所述的方法，其中所述选择性标记基因是aadA基因。
284.如权利要求283所述的方法，其中所述aadA基因具有SEQ ID NO：39、或其变体和片段。
285.如权利要求280所述的方法，其中所述选择性标记基因是npt1基因。
286.如权利要求285所述的方法，其中所述npt1基因具有SEQ ID NO：40、或其变体和片段。
287.如权利要求280所述的方法，其中所述选择性标记基因是npt2基因。
288.如权利要求287所述的方法，其中所述npt2基因具有SEQ ID NO：41、或其变体和片段。
289.如权利要求280所述的方法，其中所述选择性标记基因是hpt基因。
290.如权利要求289所述的方法，其中所述hpt基因具有SEQ ID NO：67、或其变体和片段。
291.如权利要求235-278中任一项所述的方法，其中所述选择性标记基因不是四环素选择性标记基因。
292.如权利要求235-278中任一项所述的方法，其中所述选择性标记基因不是tetAR基因。
293.如权利要求235-278中任一项所述的方法，所述选择性标记基因是反向选择性标记基因。
294.如权利要求293所述的方法，其中所述反向选择性标记基因是sacB基因、rpsL(strA)基因、pheS基因、dhfr(folA)基因、lacY基因、Gata-1基因、ccdB基因、或thyA-基因。
295.如权利要求235-294中任一项所述的方法，其中所述第一载体不包含SEQ ID NO：61、或其变体或片段。
296.如权利要求235-295中任一项所述的方法，其中所述第一载体不包含SEQ ID NO：62、或其变体或片段。
297.如权利要求235-296中任一项所述的方法，其中所述第一载体不包含tra操纵子序列或trb操纵子序列、或其变体或片段。
298.如权利要求235或297所述的方法，其中所述第一载体不包含SEQ ID NO：63、或其变体或片段。
299.如权利要求235-298中任一项所述的方法，其中所述第一载体具有SEQ ID NO：34、或其变体和片段。
300.如权利要求235-298中任一项所述的方法，其中所述第一载体具有SEQ ID NO：35、或其变体和片段。
301.如权利要求235-298中任一项所述的方法，其中所述第一载体具有SEQ ID NO：36、或其变体和片段。
302.如权利要求235所述的方法，其还包括使在其基因组中包含所述目的序列的植物再生。
303.如权利要求235或302所述的方法，其中所述植物细胞来自单子叶植物或双子叶植物。
304.如权利要求235或302所述的方法，其中所述植物细胞来自选自由以下组成的组的植物：大豆、烟草、向日葵、拟南芥、红花、苜蓿、玉米、小麦、水稻、大麦、燕麦、粟、低芥酸菜籽、芸苔属、棉花和甘蔗。
305.如权利要求235-304中任一项所述的方法，其中在接触所述植物细胞之前，在乙酰丁香酮或诱导vir或r-vir基因功能的其他化合物的存在下使所述苍白杆菌生长。
306.如权利要求235或303-305中任一项所述的方法，其中所述植物细胞包含在来自植物种子、幼苗、愈伤组织、细胞悬液、子叶、分生组织、叶、根或茎的外植体中；并且使所述外植体与所述苍白杆菌接触。
307.如权利要求306所述的方法，其中所述外植体包含胚分生组织、体细胞分生组织、愈伤组织、细胞悬液；子叶、子叶节，或者包含来自叶、根或茎的组织。
308.如权利要求235所述的方法，其中所述鉴定包含所述目的序列的植物细胞在不存在选择剂的情况下进行。
309.如权利要求235所述的方法，其中所述鉴定包含所述目的序列的植物细胞包括在选择剂的存在下培养所述植物细胞，其中所述目的序列赋予对所述选择剂的耐受性或与赋予对所述选择剂的耐受性的选择性标记共递送。
310.如权利要求309所述的方法，其中所述选择剂是氯磺隆、胺苯磺隆、灭草烟、草甘膦、卡那霉素、壮观霉素、双丙氨磷、2，4-D或麦草畏。
311.如权利要求235所述的方法，其中所述目的序列与选择性标记基因没有物理连锁。
312.如权利要求311所述的方法，其中所述标记基因和所述目的序列在从包含所述目的序列的植物细胞再生的植物的子代中遗传分离。
313.如权利要求235所述的方法，其中所述苍白杆菌还包含第三载体，所述第三载体包含处于有效连接的第二目的序列。
314.如权利要求302所述的方法，其中从所述植物细胞使植物再生包括从包含所述植物细胞的外植体诱导形成一个或多个芽并且将至少第一芽培育成完整的可育植物。
315.如权利要求314所述的方法，其中使植物再生通过器官发生来发生。
316.如权利要求235-315中任一项所述的方法，其中所述苍白杆菌选自由以下组成的组：海沃德苍白杆菌H1、金雀儿苍白杆菌、大田苍白杆菌、羽扇豆苍白杆菌、稻苍白杆菌、小麦苍白杆菌、LBNL124-A-10、HTG3-C-07和牲畜苍白杆菌。
317.一种试剂盒，其包含：
(a)如权利要求2-76或165-234中任一项所述的苍白杆菌；以及
(b)用于在植物转化中使用的说明书。
318.如权利要求2、165、232、233、234或235中任一项所述的载体，其中所述载体包含SEQ ID NO：34、35、36、106、113或114中的任一个、或其变体和衍生物。
CN201680051469.5A 2015-08-28 2016-08-26 苍白杆菌介导的植物转化 Pending CN108513584A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562211267P 2015-08-28 2015-08-28
US62/211267 2015-08-28
PCT/US2016/049135 WO2017040343A1 (en) 2015-08-28 2016-08-26 Ochrobactrum-mediated transformation of plants

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108513584A true CN108513584A (zh) 2018-09-07

Family

ID=56896792

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201680051469.5A Pending CN108513584A (zh) 2015-08-28 2016-08-26 苍白杆菌介导的植物转化

Country Status (10)

Country Link
US (1) US11236347B2 (zh)
EP (1) EP3341483B1 (zh)
JP (1) JP2018527931A (zh)
CN (1) CN108513584A (zh)
AU (1) AU2016315655A1 (zh)
BR (1) BR112018004108A2 (zh)
CA (1) CA2992488A1 (zh)
DK (1) DK3341483T3 (zh)
ES (1) ES2773072T3 (zh)
WO (1) WO2017040343A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111909874A (zh) * 2020-08-17 2020-11-10 东北农业大学 一株生防菌i-5及其在防治紫花苜蓿根腐病中的应用
CN116121288A (zh) * 2023-03-27 2023-05-16 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 一组克隆恶臭假单胞菌大片段dna的载体及其应用

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11529412B2 (en) 2015-11-30 2022-12-20 Seed Health, Inc. Method and system for protecting honey bees from pesticides
US10933128B2 (en) 2015-11-30 2021-03-02 Joseph E. Kovarik Method and system for protecting honey bees from pesticides
ES2693895A1 (es) 2017-06-12 2018-12-14 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Vectores binarios y usos de los mismos
BR112020006045A2 (pt) 2017-09-25 2020-10-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. molécula de ácido nucleico, cassete de expressão, vetor, célula vegetal, planta, semente da planta, método para produzir uma planta transgênica, planta transgênica, semente da planta transgênica, método para aprimorar a eficiência de maturação de embrião somático e método para produzir uma planta dicotiledônea transgênica ou uma planta gimnosperma transgênica
BR112020007343A2 (pt) 2017-10-13 2020-10-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. método para gerar um embrião de planta haploide, micrósporo embriogênico, embrioide ou tecido embriogênico, célula vegetal compreendendo um cassete de expressão, população de células vegetais
WO2019133371A1 (en) 2017-12-27 2019-07-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Transformation of dicot plants
JP2021517812A (ja) * 2018-03-12 2021-07-29 パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド 植物の形質転換方法
EP3833747A1 (en) 2018-06-28 2021-06-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for selecting transformed plants
BR112021008329A2 (pt) * 2018-10-31 2021-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. composições e métodos para transformação de plantas mediada por ochrobactrum
BR112021008331A2 (pt) 2018-10-31 2021-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. composições e métodos para edição gênica mediada por ochrobactrum
AU2020234553A1 (en) 2019-03-11 2021-07-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for clonal plant production
CA3128376A1 (en) 2019-03-27 2020-10-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant explant transformation
US20220240467A1 (en) 2019-04-18 2022-08-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Embryogenesis factors for cellular reprogramming of a plant cell
WO2021173528A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Sorghum doubled haploid production system
BR112022025167A2 (pt) 2020-06-12 2022-12-27 Pioneer Hi Bred Int Alteração de composição de semente em plantas
JP2023544016A (ja) 2020-09-30 2023-10-19 パイオニア ハイ－ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド 単子葉外植片の迅速な形質転換
WO2022087616A1 (en) 2020-10-21 2022-04-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Parthenogenesis factors and methods of using same
CN116635529A (zh) 2020-10-21 2023-08-22 先锋国际良种公司 双单倍体诱导物
US20220162623A1 (en) * 2020-11-20 2022-05-26 AgBiome, Inc. Compositions and methods for incorporation of dna into the genome of an organism
WO2023183918A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of parthenogenic haploid induction and haploid chromosome doubling
WO2024123786A1 (en) 2022-12-06 2024-06-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for co-delivery of t-dnas expressing multiple guide polynucleotides into plants

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101490266A (zh) * 2006-05-16 2009-07-22 孟山都技术有限公司 非土壤杆菌属细菌物种用于植物转化的用途
WO2014157541A1 (ja) * 2013-03-29 2014-10-02 日本たばこ産業株式会社 植物の形質転換方法に使用するためのアグロバクテリウム細菌

Family Cites Families (380)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3710511A (en) 1971-04-21 1973-01-16 Univ Illinois Procedures for use of genic male sterility in production of commercial hybrid maize
US3861709A (en) 1973-07-12 1975-01-21 Amsted Ind Inc Shiftable fifth wheel construction
US5094945A (en) 1983-01-05 1992-03-10 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase, production and use
AU559562B2 (en) 1983-01-17 1987-03-12 Monsanto Company Genetically transformed plants
US8334139B1 (en) 1983-01-17 2012-12-18 Monsanto Technology Llc Plasmids for transforming plant cells
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
US4761373A (en) 1984-03-06 1988-08-02 Molecular Genetics, Inc. Herbicide resistance in plants
US5569597A (en) 1985-05-13 1996-10-29 Ciba Geigy Corp. Methods of inserting viral DNA into plant material
US4654465A (en) 1985-07-18 1987-03-31 Agracetus Genic male-sterile maize
US4810648A (en) 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
KR950008571B1 (ko) 1986-01-08 1995-08-03 롱쁠랑 아그로시미 할로아릴니트릴 분해 유전자, 그의 용도 및 이를 함유한 세포
ES2018274T5 (es) 1986-03-11 1996-12-16 Plant Genetic Systems Nv Celulas vegetales resistentes a los inhibidores de glutamina sintetasa, preparadas por ingenieria genetica.
US5637489A (en) 1986-08-23 1997-06-10 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5276268A (en) 1986-08-23 1994-01-04 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5273894A (en) 1986-08-23 1993-12-28 Hoechst Aktiengesellschaft Phosphinothricin-resistance gene, and its use
US5378824A (en) 1986-08-26 1995-01-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5013659A (en) 1987-07-27 1991-05-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5605011A (en) 1986-08-26 1997-02-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
US4727219A (en) 1986-11-28 1988-02-23 Agracetus Genic male-sterile maize using a linked marker gene
US5608142A (en) 1986-12-03 1997-03-04 Agracetus, Inc. Insecticidal cotton plants
US5359142A (en) 1987-01-13 1994-10-25 Monsanto Company Method for enhanced expression of a protein
US5322938A (en) 1987-01-13 1994-06-21 Monsanto Company DNA sequence for enhancing the efficiency of transcription
CN87100603A (zh) 1987-01-21 1988-08-10 昂科公司 抗黑素瘤疫苗
US5229114A (en) 1987-08-20 1993-07-20 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Approaches useful for the control of root nodulation of leguminous plants
US5597718A (en) 1988-10-04 1997-01-28 Agracetus Genetically engineering cotton plants for altered fiber
US5023179A (en) 1988-11-14 1991-06-11 Eric Lam Promoter enhancer element for gene expression in plant roots
DE69033816T2 (de) 1989-02-24 2002-08-08 Monsanto Technology Llc., St. Louis Synthetische pflanzengene und verfahren zu ihrer herstellung
US5110732A (en) 1989-03-14 1992-05-05 The Rockefeller University Selective gene expression in plants
US5106739A (en) 1989-04-18 1992-04-21 Calgene, Inc. CaMv 355 enhanced mannopine synthase promoter and method for using same
US5073675A (en) 1989-05-26 1991-12-17 Dna Plant Technology Corporation Method of introducing spectinomycin resistance into plants
US5188960A (en) 1989-06-27 1993-02-23 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins
US5689041A (en) 1989-08-10 1997-11-18 Plant Gentic Systems N.V. Plants modified with barstar for fertility restoration
US6051753A (en) 1989-09-07 2000-04-18 Calgene, Inc. Figwort mosaic virus promoter and uses
EP0426641B1 (en) 1989-10-31 2000-09-13 Monsanto Company Promoter for transgenic plants
US5641876A (en) 1990-01-05 1997-06-24 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
US5837848A (en) 1990-03-16 1998-11-17 Zeneca Limited Root-specific promoter
US6426447B1 (en) 1990-11-14 2002-07-30 Monsanto Technology Llc Plant seed oils
US5187091A (en) 1990-03-20 1993-02-16 Ecogen Inc. Bacillus thuringiensis cryiiic gene encoding toxic to coleopteran insects
US5543576A (en) 1990-03-23 1996-08-06 Mogen International Production of enzymes in seeds and their use
ATE225853T1 (de) 1990-04-12 2002-10-15 Syngenta Participations Ag Gewebe-spezifische promotoren
EP0528857B1 (en) 1990-04-26 2002-01-30 Aventis CropScience N.V. New bacillus thuringiensis strain and its gene encoding insecticidal toxin
US5969214A (en) 1990-06-11 1999-10-19 Calgene, Inc. Glycogen biosynthetic enzymes in plants
US5478369A (en) 1990-06-12 1995-12-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same
US5432068A (en) 1990-06-12 1995-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Control of male fertility using externally inducible promoter sequences
US6297426B1 (en) 1990-06-12 2001-10-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of mediating female fertility in plants
US5824524A (en) 1990-06-12 1998-10-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating fertility and method of using same
AU644203B2 (en) 1990-06-18 1993-12-02 Monsanto Company Increased starch content in plants
US5498830A (en) 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
CA2083948C (en) 1990-06-25 2001-05-15 Ganesh M. Kishore Glyphosate tolerant plants
US6483008B1 (en) 1990-08-15 2002-11-19 Calgene Llc Methods for producing plants with elevated oleic acid content
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5512466A (en) 1990-12-26 1996-04-30 Monsanto Company Control of fruit ripening and senescence in plants
US5277905A (en) 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
US5459252A (en) 1991-01-31 1995-10-17 North Carolina State University Root specific gene promoter
MX9200621A (es) 1991-02-14 1993-02-01 Du Pont Gen de una proteina con alto contenido de azufre de una semilla y metodo para aumentar el contenido de azufre en aminoacidos de las plantas.
US5767366A (en) 1991-02-19 1998-06-16 Louisiana State University Board Of Supervisors, A Governing Body Of Louisiana State University Agricultural And Mechanical College Mutant acetolactate synthase gene from Ararbidopsis thaliana for conferring imidazolinone resistance to crop plants
US5399680A (en) 1991-05-22 1995-03-21 The Salk Institute For Biological Studies Rice chitinase promoter
ATE174626T1 (de) 1991-08-02 1999-01-15 Mycogen Corp Neuer mikroorganismus und insektizid
JPH07502163A (ja) 1991-08-09 1995-03-09 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 植物の栄養価改良用のプログラム可能水準の必須アミノ酸類を含有する規定された構造を有する合成貯蔵蛋白質
AU668096B2 (en) 1991-08-27 1996-04-26 Syngenta Participations Ag Proteins with insecticidal properties against homopteran insects and their use in plant protection
DE69233410D1 (de) 1991-10-04 2004-10-21 Univ North Carolina State Pathogenresistente transgene pflanzen
AU675923B2 (en) 1991-12-04 1997-02-27 E.I. Du Pont De Nemours And Company Fatty acid desaturase genes from plants
US5773691A (en) 1992-03-19 1998-06-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Chimeric genes and methods for increasing the lysine and threonine content of the seeds of plants
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
US5428148A (en) 1992-04-24 1995-06-27 Beckman Instruments, Inc. N4 - acylated cytidinyl compounds useful in oligonucleotide synthesis
US5401836A (en) 1992-07-16 1995-03-28 Pioneer Hi-Bre International, Inc. Brassica regulatory sequence for root-specific or root-abundant gene expression
BR9306802A (pt) 1992-07-27 1998-12-08 Pioneer Hi Bred Int Processo independente de genótipos para produção de planta de soja transgénica e processo de regeneração de plantas de soja a partir de nodos cotiledonais
US6372965B1 (en) 1992-11-17 2002-04-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and hydroxylases from plants
US6011199A (en) 1992-12-15 2000-01-04 Commonwealth Scientific Method for producing fruiting plants with improved fruit flavour
US5607914A (en) 1993-01-13 1997-03-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic antimicrobial peptides
WO1994016078A2 (en) 1993-01-13 1994-07-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. High lysine derivatives of alpha-hordothionin
US6414222B1 (en) 1993-02-05 2002-07-02 Regents Of The University Of Minnesota Gene combinations for herbicide tolerance in corn
IL108814A0 (en) 1993-03-02 1994-06-24 Du Pont Improved feedcrops enriched in sulfur amino acids and methods for improvement
US5877012A (en) 1993-03-25 1999-03-02 Novartis Finance Corporation Class of proteins for the control of plant pests
US5814618A (en) 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
US5789156A (en) 1993-06-14 1998-08-04 Basf Ag Tetracycline-regulated transcriptional inhibitors
US5362865A (en) 1993-09-02 1994-11-08 Monsanto Company Enhanced expression in plants using non-translated leader sequences
JPH08509871A (ja) 1993-09-30 1996-10-22 アグラシータス インコーポレイテッド 異種ペルオキシダーゼを生産するトランスジェニック綿植物
US6107547A (en) 1993-10-06 2000-08-22 New York University Transgenic plants that exhibit enhanced nitrogen assimilation
KR960706564A (ko) 1993-11-30 1996-12-09 미리암 디. 메코너헤이 키메릭 유전자 및 옥수수, 대두 및 평지 식물의 종자중 리신 함량을 증가시키는 방법(Chimeric Genes and Methods for Increasing the Lysine Content of the Seeds of Corn, Soybean and Rapeseed Plants)
US5580852A (en) 1993-12-17 1996-12-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Derivatives of tachyplesin having inhibitory activity towards plant pathogenic fungi
US5689052A (en) 1993-12-22 1997-11-18 Monsanto Company Synthetic DNA sequences having enhanced expression in monocotyledonous plants and method for preparation thereof
US5593881A (en) 1994-05-06 1997-01-14 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis delta-endotoxin
IL113685A0 (en) 1994-05-13 1995-08-31 Du Pont Nucleic acid fragments chimeric genes and methods for increasing the methionine content of the seeds of plants
US5633363A (en) 1994-06-03 1997-05-27 Iowa State University, Research Foundation In Root preferential promoter
US6828475B1 (en) 1994-06-23 2004-12-07 Calgene Llc Nucleic acid sequences encoding a plant cytoplasmic protein involved in fatty acyl-CoA metabolism
CA2192550A1 (en) 1994-07-08 1996-01-25 Saverio Carl Falco Chimeric genes and method for increasing the threonine content of the seeds of plants
US5750876A (en) 1994-07-28 1998-05-12 Monsanto Company Isoamylase gene, compositions containing it, and methods of using isoamylases
US5792931A (en) 1994-08-12 1998-08-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Fumonisin detoxification compositions and methods
US5608144A (en) 1994-08-12 1997-03-04 Dna Plant Technology Corp. Plant group 2 promoters and uses thereof
US5633437A (en) 1994-10-11 1997-05-27 Sandoz Ltd. Gene exhibiting resistance to acetolactate synthase inhibitor herbicides
EP0711834A3 (en) 1994-10-14 1996-12-18 Nissan Chemical Ind Ltd New Bacillus strain and product for the control of harmful organisms
GB9422083D0 (en) 1994-11-02 1994-12-21 Innes John Centre Genetic control of flowering
US5716837A (en) 1995-02-10 1998-02-10 Monsanto Company Expression of sucrose phosphorylase in plants
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
HUP9900864A3 (en) 1995-05-31 2001-11-28 Pioneer Hi Bred Int Methods of increasing accumulation of essential amino acids in seeds
GB9511196D0 (en) 1995-06-02 1995-07-26 Innes John Centre Genetic control of flowering
HUP9900878A2 (hu) 1995-06-02 1999-07-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Alfa-hordotionin nagy metionintartalmú származéka
AR003683A1 (es) 1995-06-02 1998-09-09 Pioneer Hi Bred Int Proteinas derivadas de alfa-hordiotonina con alto contenido de treonina
US5837876A (en) 1995-07-28 1998-11-17 North Carolina State University Root cortex specific gene promoter
GB9518731D0 (en) 1995-09-13 1995-11-15 Innes John Centre Flowering genes
GB9602796D0 (en) 1996-02-12 1996-04-10 Innes John Centre Innov Ltd Genetic control of plant growth and development
US6084153A (en) 1996-02-14 2000-07-04 The Governors Of The University Of Alberta Plants having enhanced nitrogen assimilation/metabolism
US6946588B2 (en) 1996-03-13 2005-09-20 Monsanto Technology Llc Nucleic acid encoding a modified threonine deaminase and methods of use
US6091002A (en) 1996-03-13 2000-07-18 Monsanto Company Polyhydroxyalkanoates of narrow molecular weight distribution prepared in transgenic plants
US5958745A (en) 1996-03-13 1999-09-28 Monsanto Company Methods of optimizing substrate pools and biosynthesis of poly-β-hydroxybutyrate-co-poly-β-hydroxyvalerate in bacteria and plants
US5850016A (en) 1996-03-20 1998-12-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Alteration of amino acid compositions in seeds
US6083499A (en) 1996-04-19 2000-07-04 Mycogen Corporation Pesticidal toxins
US6166292A (en) 1996-04-26 2000-12-26 Ajinomoto Co., Inc. Raffinose synthetase gene, method of producing raffinose and transgenic plant
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
US5985605A (en) 1996-06-14 1999-11-16 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Dept. Of Agriculture & Agri-Food Canada DNA sequences encoding phytases of ruminal microorganisms
GB9613132D0 (en) 1996-06-21 1996-08-28 Innes John Centre Innov Ltd Genetic control of flowering
US5998700A (en) 1996-07-02 1999-12-07 The Board Of Trustees Of Southern Illinois University Plants containing a bacterial Gdha gene and methods of use thereof
US5850026A (en) 1996-07-03 1998-12-15 Cargill, Incorporated Canola oil having increased oleic acid and decreased linolenic acid content
US6177275B1 (en) 1996-07-24 2001-01-23 New York University Plant nitrogen regulatory P-PII genes
US5850019A (en) 1996-08-06 1998-12-15 University Of Kentucky Research Foundation Promoter (FLt) for the full-length transcript of peanut chlorotic streak caulimovirus (PCLSV) and expression of chimeric genes in plants
US5750848A (en) 1996-08-13 1998-05-12 Monsanto Company DNA sequence useful for the production of polyhydroxyalkanoates
US5892009A (en) 1996-09-04 1999-04-06 Michigan State University DNA and encoded protein which regulates cold and dehydration regulated genes
US6417428B1 (en) 1996-09-04 2002-07-09 Michael F. Thomashow Plant having altered environmental stress tolerance
US6706866B1 (en) 1996-09-04 2004-03-16 Michigan State University Plant having altered environmental stress tolerance
WO1998010080A1 (en) 1996-09-05 1998-03-12 Unilever N.V. Salt-inducible promoter derivable from a lactic acid bacterium, and its use in a lactic acid bacterium for production of a desired protein
US6063756A (en) 1996-09-24 2000-05-16 Monsanto Company Bacillus thuringiensis cryET33 and cryET34 compositions and uses therefor
US6080913A (en) 1996-09-25 2000-06-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Binary methods of increasing accumulation of essential amino acids in seeds
CA2268263A1 (en) 1996-10-29 1998-05-07 Calgene Llc Plant cellulose synthase and promoter sequences
HUP0000810A3 (en) 1996-11-01 2002-02-28 Pioneer Hi Bred Int Proteins with enhanced levels of essential amino acids
US6017534A (en) 1996-11-20 2000-01-25 Ecogen, Inc. Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity
US6713063B1 (en) 1996-11-20 2004-03-30 Monsanto Technology, Llc Broad-spectrum δ-endotoxins
US6232529B1 (en) 1996-11-20 2001-05-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of producing high-oil seed by modification of starch levels
US5846812A (en) 1996-11-22 1998-12-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Zearalenone detoxification compositions and methods
DE69703047T2 (de) 1996-11-22 2001-01-11 Pioneer Hi Bred Int Verfahren und zusammensetzungen zur detoxifizierung von moniliformin
US5798255A (en) 1996-11-22 1998-08-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Beauvericin detoxification compositions and methods
US5942664A (en) 1996-11-27 1999-08-24 Ecogen, Inc. Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants
US5986177A (en) 1997-01-10 1999-11-16 Agricultural Genetic Engineering Research Institute Bacillus thuringiensis isolates with broad spectrum activity
US6252138B1 (en) 1997-01-20 2001-06-26 Plant Genetic Systems, N.V. Pathogen-induced plant promoters
US6140553A (en) 1997-02-20 2000-10-31 Plant Genetic Systems, N.V. Transformation method for plants
US5922564A (en) 1997-02-24 1999-07-13 Performance Plants, Inc. Phosphate-deficiency inducible promoter
HUP0002305A3 (en) 1997-03-27 2002-09-30 Du Pont Chimeric genes and methods for increasing the lysine content of the seeds of plants
US6040497A (en) 1997-04-03 2000-03-21 Dekalb Genetics Corporation Glyphosate resistant maize lines
US7105724B2 (en) 1997-04-04 2006-09-12 Board Of Regents Of University Of Nebraska Methods and materials for making and using transgenic dicamba-degrading organisms
US6171640B1 (en) 1997-04-04 2001-01-09 Monsanto Company High beta-conglycinin products and their use
ZA981569B (en) 1997-04-08 1999-08-25 Du Pont An engineered seed protein having a higher percentage of essential amino acids.
US5972664A (en) 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
AR013633A1 (es) 1997-04-11 2001-01-10 Calgene Llc METODO PARA LA ALTERACIoN DE LA COMPOSICIoN DE ÁCIDOS GRASOS DE CADENA MEDIA EN SEMILLAS VEGETALES QUE EXPRESAN UNA TIOESTERASA QUE PREFIERE CADENA MEDIA VEGETAL HETERoLOGA.
US6380466B1 (en) 1997-05-08 2002-04-30 Calgene Llc Production of improved rapeseed exhibiting yellow-seed coat
CN1255541C (zh) 1997-06-05 2006-05-10 卡尔金有限责任公司 脂酰辅酶a：脂肪醇酰基转移酶
CN1259170A (zh) 1997-06-06 2000-07-05 纳幕尔杜邦公司 植物氨基酸生物合成酶
DE69840650D1 (zh) 1997-06-12 2009-04-23 Du Pont
GB9712415D0 (en) 1997-06-13 1997-08-13 Innes John Centre Innov Ltd Genetic control of flowering
US6197561B1 (en) 1997-07-22 2001-03-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes controlling phytate metabolism in plants and uses thereof
GB9717192D0 (en) 1997-08-13 1997-10-22 Innes John Centre Innov Ltd Genetic control of plant growth and development
US5929305A (en) 1997-10-14 1999-07-27 Michigan State University Plant material containing non-naturally introduced binding protein for regulating cold and dehydration regulatory genes
US6218188B1 (en) 1997-11-12 2001-04-17 Mycogen Corporation Plant-optimized genes encoding pesticidal toxins
JP4206154B2 (ja) 1997-11-13 2009-01-07 大日本住友製薬株式会社 変異型ｌｏｘＰ配列とその応用
EP1034286B1 (en) 1997-11-18 2010-01-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Mobilization of viral genomes from t-dna using site-specific recombination systems
ES2256972T3 (es) 1997-11-18 2006-07-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Metodo novedoso para la integracion de un adn foraneo dentro de genomas de eucariotas.
NZ504300A (en) 1997-11-18 2002-06-28 Pioneer Hi Bred Int A method for directional stable transformation of eukaryotic cells using non-identical recombination sites
EP1032692A1 (en) 1997-11-18 2000-09-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Targeted manipulation of herbicide-resistance genes in plants
IL122270A0 (en) 1997-11-20 1998-04-05 Yeda Res & Dev DNA molecules conferring to plants resistance to a herbicide and plants transformed thereby
AR017831A1 (es) 1997-12-10 2001-10-24 Pioneer Hi Bred Int Metodo para alterar la composicion de aminoacidos de una proteina nativa de interes, proteina elaborada, y polinucleotido
US6077824A (en) 1997-12-18 2000-06-20 Ecogen, Inc. Methods for improving the activity of δ-endotoxins against insect pests
AU2001399A (en) 1997-12-18 1999-07-05 Ecogen Inc. Insect-resistant transgenic plants and methods for improving delta-endotoxin activity against target insects
US6060594A (en) 1997-12-18 2000-05-09 Ecogen, Inc. Nucleic acid segments encoding modified bacillus thuringiensis coleopteran-toxic crystal proteins
US6023013A (en) 1997-12-18 2000-02-08 Monsanto Company Insect-resistant transgenic plants
US6063597A (en) 1997-12-18 2000-05-16 Monsanto Company Polypeptide compositions toxic to coleopteran insects
US7053282B1 (en) 1998-02-09 2006-05-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Alteration of amino acid compositions in seeds
US6653530B1 (en) 1998-02-13 2003-11-25 Calgene Llc Methods for producing carotenoid compounds, tocopherol compounds, and specialty oils in plant seeds
ES2273127T3 (es) 1998-02-26 2007-05-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Promotor alfa-tubulin 3-18 del maiz.
WO1999043819A1 (en) 1998-02-26 1999-09-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Family of maize pr-1 genes and promoters
EP1064385A2 (en) 1998-03-20 2001-01-03 Plant Bioscience Limited Plant control genes
US6225530B1 (en) 1998-04-15 2001-05-01 The Salk Institute For Biological Studies Flowering locus T (FT) and genetically modified plants having modulated flower development
US6635806B1 (en) 1998-05-14 2003-10-21 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for expression of transgenes in plants
US6307123B1 (en) 1998-05-18 2001-10-23 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for transgene identification
JP2002517201A (ja) 1998-06-05 2002-06-18 カルジーン エルエルシー アシルＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ関連核酸配列
US7008664B1 (en) 1998-06-11 2006-03-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for improving the carcass quality of an animal
WO1999064614A2 (en) 1998-06-12 1999-12-16 Calgene Llc Polyunsaturated fatty acids in plants
BR9911800A (pt) 1998-07-02 2001-02-28 Calgene Llc Proteìnas de diacil glicerol acil transferase
US6538177B1 (en) 1998-07-15 2003-03-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for fumonisin detoxification
JP2000083680A (ja) 1998-07-16 2000-03-28 Nippon Paper Industries Co Ltd 光誘導型プロモ―タ―の制御下に置かれた不定芽再分化遺伝子を選抜マ―カ―遺伝子とする植物への遺伝子導入方法及びこれに用いる植物への遺伝子導入用ベクタ―
US6693185B2 (en) 1998-07-17 2004-02-17 Bayer Bioscience N.V. Methods and means to modulate programmed cell death in eukaryotic cells
US6476294B1 (en) 1998-07-24 2002-11-05 Calgene Llc Plant phosphatidic acid phosphatases
GB9816681D0 (en) 1998-07-31 1998-09-30 Minnesota Mining & Mfg Cleaning pads formed from non-woven abrasive web material,especially for domestic use
DE69937354T2 (de) 1998-08-04 2008-07-24 Cargill, Inc., Wayzata Promotoren der fettsäuren-desaturase aus pflanzen
US6365802B2 (en) 1998-08-14 2002-04-02 Calgene Llc Methods for increasing stearate content in soybean oil
US6930225B2 (en) 1998-08-17 2005-08-16 Pioneer Hi-Bred Int'l Inc. Maize cellulose synthases and uses thereof
US20040068767A1 (en) 1998-08-17 2004-04-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize cellulose synthases and uses thereof
US7179955B2 (en) 1998-08-17 2007-02-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize cellulose synthases genes and uses thereof
ATE376060T1 (de) 1998-08-17 2007-11-15 Pioneer Hi Bred Int Maiszellulosesynthasen und deren verwendungen
ATE309362T1 (de) 1998-08-20 2005-11-15 Pioneer Hi Bred Int Samen-bevorzugende promotoren
US6346403B1 (en) 1998-09-08 2002-02-12 E.I. Du Pont De Nemours And Company Methionine metabolic enzymes
US6717034B2 (en) 2001-03-30 2004-04-06 Mendel Biotechnology, Inc. Method for modifying plant biomass
US20050086718A1 (en) 1999-03-23 2005-04-21 Mendel Biotechnology, Inc. Plant transcriptional regulators of abiotic stress
US6664446B2 (en) 1999-03-23 2003-12-16 Mendel Biotechnology, Inc. Transgenic plants comprising polynucleotides encoding transcription factors that confer disease tolerance
WO2000060089A1 (en) 1999-04-07 2000-10-12 Mendel Biotechnology, Inc. Genetic trait breeding method
US20030041356A1 (en) 2001-03-27 2003-02-27 Lynne Reuber Methods for modifying flowering phenotypes
DE69929073T2 (de) 1998-10-01 2006-08-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Verfahren und Zusammensetzungen für die Transformation von Pflanzen
DE69931511T2 (de) 1998-10-23 2006-09-28 Mycogen Corp., San Diego Für 15kda und 45kda pestizid-proteine kodierende pflanzen-optimierte polynukleotide
US6489542B1 (en) 1998-11-04 2002-12-03 Monsanto Technology Llc Methods for transforming plants to express Cry2Ab δ-endotoxins targeted to the plastids
US6825397B1 (en) 1998-11-09 2004-11-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. LEC1 trancriptional activator nucleic acids and methods of use thereof
JP2002541763A (ja) 1998-11-25 2002-12-10 ザ トラスティーズ オヴ ザ ユニヴァーシティー オヴ ペンシルバニア 植物中のエチレン応答因子１（ｅｒｆ１）
US6531648B1 (en) 1998-12-17 2003-03-11 Syngenta Participations Ag Grain processing method and transgenic plants useful therein
GB9901927D0 (en) 1999-01-28 1999-03-17 John Innes Foundation Methods and means for modification of plant characteristics
GB9902660D0 (en) 1999-02-05 1999-03-31 Plant Bioscience Ltd Plant gene
US6323392B1 (en) 1999-03-01 2001-11-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Formation of brassica napus F1 hybrid seeds which exhibit a highly elevated oleic acid content and a reduced linolenic acid content in the endogenously formed oil of the seeds
US6835540B2 (en) 2001-03-16 2004-12-28 Mendel Biotechnology, Inc. Biosynthetic pathway transcription factors
EP1190068B1 (en) 1999-04-15 2006-01-25 Calgene LLC Nucleic acid sequences to proteins involved in tocopherol synthesis
US7531723B2 (en) 1999-04-16 2009-05-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Modulation of cytokinin activity in plants
US6992237B1 (en) 1999-04-16 2006-01-31 Pioneer Hi-Bred International Inc. Regulated expression of genes in plant seeds
CA2372687A1 (en) 1999-05-07 2000-11-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Phytyl/prenyltransferase nucleic acids, polypeptides and uses thereof
US6429357B1 (en) 1999-05-14 2002-08-06 Dekalb Genetics Corp. Rice actin 2 promoter and intron and methods for use thereof
US6194636B1 (en) 1999-05-14 2001-02-27 Dekalb Genetics Corp. Maize RS324 promoter and methods for use thereof
US6207879B1 (en) 1999-05-14 2001-03-27 Dekalb Genetics Corporation Maize RS81 promoter and methods for use thereof
US6232526B1 (en) 1999-05-14 2001-05-15 Dekalb Genetics Corp. Maize A3 promoter and methods for use thereof
US6653535B1 (en) 1999-05-28 2003-11-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for modulating water-use efficiency or productivity in a plant by transforming with a DNA encoding a NAPD-malic enzyme operably linked to a guard cell or an epidermal cell promoter
US6489461B1 (en) 1999-06-08 2002-12-03 Calgene Llc Nucleic acid sequences encoding proteins involved in fatty acid beta-oxidation and methods of use
US6770465B1 (en) 1999-06-09 2004-08-03 Calgene Llc Engineering B-ketoacyl ACP synthase for novel substrate specificity
US6441274B1 (en) 1999-06-16 2002-08-27 E. I. Du Pont De Nemours & Company Plant tryptophan synthase beta subunit
WO2001004314A2 (en) 1999-07-12 2001-01-18 Monsanto Technology, Llc. Nucleic acid molecules and proteins associated with sterol synthesis and metabolism
US6388171B1 (en) 1999-07-12 2002-05-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for fumonisin detoxification
WO2001011058A1 (en) 1999-08-09 2001-02-15 Monsanto Technology Llc Novel cloning methods and vectors
BR0013309A (pt) 1999-08-16 2002-05-28 Du Pont Fragmento de ácido nucléico isolado, complemento, gene quimérico, planta ou célula hospedeira transformada, planta transformada, planta ou célula hospedeira, sementes, óleo método de alteração do nìvel de ácidos graxos em uma planta ou célula hospedeira, método de produção de óleo se sementes contendo ácidos graxos, método para a produção de enzimas modificadoras de ácidos graxos, método para isolar fragmentos de ácidos nucléicos e seus subfragmentos funcionalmente equivalentes, alimentos animal e método para aprimorar a qualidade de carcaça de um animal
WO2001012731A1 (en) 1999-08-19 2001-02-22 Ppg Industries Ohio, Inc. Hydrophobic particulate inorganic oxides and polymeric compositions containing same
US6423886B1 (en) 1999-09-02 2002-07-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Starch synthase polynucleotides and their use in the production of new starches
GB9922071D0 (en) 1999-09-17 1999-11-17 Plant Bioscience Ltd Methods and means for modification of plant characteristics
WO2001026459A2 (en) 1999-10-12 2001-04-19 Mendel Biotechnology, Inc. Flowering time modification
RU2220387C1 (ru) 1999-10-21 2003-12-27 Флуор Корпорейшн Способы извлечения пропана с высоким выходом и устройство для их осуществления
US20020178464A1 (en) 1999-11-10 2002-11-28 Whitehead Institute For Biomedical Research Proton transporters and uses in plants
BR0015633A (pt) 1999-11-17 2002-07-09 Mendel Biotechnology Inc Planta, polinucleotìdeo, vetor, célula, composição, polipeptìdeo, métodos para produzir uma planta e para identificar um fator que é modulado por, ou interage com, um polipeptìdeo codificado por um polinucleotìdeo, uma molécula que module a atividade ou a expressão de um polinucleotìdeo ou polipeptìdeo de interesse e uma sequência similar ou homóloga a um ou mais polinucleotìdeos, e, sistema integrado, meio computadorizado ou legìvel em computador
CA2391879C (en) 1999-11-17 2006-04-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Modulation of plant response to abscisic acid
TR200702139T2 (tr) 1999-12-16 2007-06-21 Monsanto Technology Llc Yeni bitki tanım yapıları
US6248535B1 (en) 1999-12-20 2001-06-19 University Of Southern California Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens
US7049115B2 (en) 2000-02-29 2006-05-23 E. I. Du Pont De Nemours & Company Genes encoding denitrification enzymes
US6613963B1 (en) 2000-03-10 2003-09-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Herbicide tolerant Brassica juncea and method of production
MXPA02010012A (es) 2000-04-14 2003-04-25 Pioneer Hi Bred Int Celulosa sintetasas de maiz y usos de las mismas.
CN1137265C (zh) 2000-07-06 2004-02-04 中国科学院微生物研究所 一种提高植物氮素同化效率的方法
WO2002008403A2 (en) 2000-07-25 2002-01-31 Calgene Llc Nucleic acid sequences encoding beta-ketoacyl-acp synthase and uses thereof
EP2410060A1 (en) 2000-08-22 2012-01-25 Mendel Biotechnology, Inc. Genes for modifying plant traits IV
WO2002017430A1 (en) 2000-08-22 2002-02-28 Paratek Microwave, Inc. Combline filters with tunable dielectric capacitors
US6875907B2 (en) 2000-09-13 2005-04-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antimicrobial peptides and methods of use
US6713259B2 (en) 2000-09-13 2004-03-30 Monsanto Technology Llc Corn event MON810 and compositions and methods for detection thereof
HUP0303050A3 (en) 2000-10-24 2005-11-28 Du Pont Plant transcription factors
US7605304B2 (en) 2000-10-24 2009-10-20 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes encoding novel bacillus thuringiensis proteins with pesticidal activity against coleopterans
US7462481B2 (en) 2000-10-30 2008-12-09 Verdia, Inc. Glyphosate N-acetyltransferase (GAT) genes
CA2425956C (en) 2000-10-30 2014-12-23 Maxygen, Inc. Novel glyphosate n-acetyltransferase (gat) genes
US20030024005A1 (en) 2000-11-17 2003-01-30 Hillyard Jeanna R. Cotton event PV-GHBK04 (757) and compositions and methods for detection thereof
US7122658B1 (en) 2000-11-22 2006-10-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Seed-preferred regulatory elements and uses thereof
US7151204B2 (en) 2001-01-09 2006-12-19 Monsanto Technology Llc Maize chloroplast aldolase promoter compositions and methods for use thereof
US6812380B2 (en) 2001-03-27 2004-11-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods of zearalenone detoxification
JP2002281975A (ja) 2001-03-28 2002-10-02 Yamaguchi Technology Licensing Organization Ltd 大豆のナイトレートトランスポーター１遺伝子ファミリーに属する遺伝子
AR035799A1 (es) 2001-03-30 2004-07-14 Syngenta Participations Ag Toxinas insecticidas aisladas de bacillus thuringiensis y sus usos.
US6891085B2 (en) 2001-04-20 2005-05-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleic acid encoding the FUS6 antimicrobial polypeptide of Agrotis ipsilon and its use to enhance disease resistance in a plant
WO2002090540A1 (en) 2001-05-10 2002-11-14 The Salk Institute For Biological Studies Ethylene insensitive plants
US7294759B2 (en) 2001-06-29 2007-11-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alteration of oil traits in plants
WO2003011015A2 (en) 2001-08-02 2003-02-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for improving seed and grain characteristics
AU2002323142A1 (en) 2001-08-09 2003-02-24 Mendel Biotechnology, Inc. Yield-related polynucleotides and polypeptides in plants
AU2002331897A1 (en) 2001-09-27 2003-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Phytate polynucleotides and methods of use
WO2003052063A2 (en) 2001-12-14 2003-06-26 The Nitrate Elimination Company, Inc. Simplified eukaryotic nitrate reductase
US9267144B2 (en) 2002-01-23 2016-02-23 Monsanto Technology Llc Plastid transformation of maize
US7154029B2 (en) 2002-03-22 2006-12-26 E.I. Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods for altering tocotrienol content
WO2003092360A2 (en) 2002-04-30 2003-11-13 Verdia, Inc. Novel glyphosate-n-acetyltransferase (gat) genes
US20040128719A1 (en) 2002-06-21 2004-07-01 Klee Harry J. Materials and methods for tissue-specific targeting of ethylene insensitivity in transgenic plants
US7462760B2 (en) 2002-06-26 2008-12-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes encoding plant protease-resistant pesticidal proteins and method of their use
MXPA04012647A (es) 2002-06-26 2005-03-23 Du Pont Genes que codifican proteinas con actividad pesticida.
BR0312771A (pt) 2002-07-18 2005-05-03 Monsanto Technology Llc Métodos para usar polinucleotìdeos artificiais e composições destes para reduzir silenciamento de transgene
RS20050183A (en) 2002-07-29 2007-06-04 Monsanto Technology Llc., Dna sequences related to corns transformant pv-zmir 13 (mon863) plants and compositions and method for detection thereof
US20040078852A1 (en) 2002-08-02 2004-04-22 Thomashow Michael F. Transcription factors to improve plant stress tolerance
WO2004020636A1 (en) 2002-08-29 2004-03-11 Monsanto Technology, Llc Nucleotide sequences encoding cry1bb proteins for enhanced expression in plants
BR0314389A (pt) 2002-09-18 2005-07-12 Mendel Biotechnology Inc Polinucleotìdeos e polipeptìdeos em plantas
ATE506438T1 (de) 2002-12-18 2011-05-15 Athenix Corp Herbizidresistenz verleihende gene
BRPI0406856A (pt) 2003-01-21 2005-12-27 Dow Agrosciences Llc Mistura e compatibilidade de proteìnas de tc para controle de peste
EP1594961B1 (en) 2003-02-18 2013-12-25 Monsanto Technology LLC Glyphosate resistant class i 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps)
US20040210964A1 (en) 2003-02-20 2004-10-21 Athenix Corporation AXMI-009, a delta-endotoxin gene and methods for its use
US20040210965A1 (en) 2003-02-20 2004-10-21 Athenix Corporation AXMI-007, a delta-endotoxin gene and methods for its use
US7351881B2 (en) 2003-02-20 2008-04-01 Athenix Corporation AXMI-008, a delta-endotoxin gene and methods for its use
US7355099B2 (en) 2003-02-20 2008-04-08 Athenix Corporation AXMI-004, a delta-endotoxin gene and methods for its use
US20040197917A1 (en) 2003-02-20 2004-10-07 Athenix Corporation AXMI-014, delta-endotoxin gene and methods for its use
NZ567340A (en) 2003-02-20 2008-10-31 Athenix Corp Delta-endotoxin genes of bacillus thuringiensis and methods for their use as pesticide
US20040216186A1 (en) 2003-02-20 2004-10-28 Athenix Corporation AXMI-006, a delta-endotoxin gene and methods for its use
WO2005003362A2 (en) 2003-03-10 2005-01-13 Athenix Corporation Methods to confer herbicide resistance
CA2519912A1 (en) 2003-03-28 2004-10-14 Monsanto Technology Llc Regulatory regions that promote early plant seed enhanced transcription
AU2004227360B2 (en) 2003-04-04 2009-05-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Modulation of cytokinin activity in plants
HUE028375T2 (en) 2003-05-02 2016-12-28 Dow Agrosciences Llc TC 1507 corn and a method for detecting it
RU2382822C2 (ru) 2003-07-07 2010-02-27 Монсанто Текнолоджи, Ллс ИНСЕКТИЦИДНЫЕ БЕЛКИ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ВИДОВ БАКТЕРИЙ Bacillus, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
EP1651770B1 (en) 2003-08-08 2008-02-06 Monsanto Technology LLC Promoter molecules for use in plants
IL157538A0 (en) 2003-08-21 2004-03-28 Bar Ilan Res & Dev Company Ltd Plant resistant to cytoplasm-feeding parasites
US7253343B2 (en) 2003-08-28 2007-08-07 Athenix Corporation AXMI-003, a delta-endotoxin gene and methods for its use
EP1664311A2 (en) 2003-09-25 2006-06-07 Monsanto Technology LLC Actin regulatory elements for use in plants
US20050183161A1 (en) 2003-10-14 2005-08-18 Athenix Corporation AXMI-010, a delta-endotoxin gene and methods for its use
CA2450000A1 (en) 2003-12-18 2005-06-18 Alberta Research Council Inc. Method of creating plants with reduced level of saturated fatty acid in seed oil
US7629504B2 (en) 2003-12-22 2009-12-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Bacillus thuringiensis cry9 nucleic acids
AR047811A1 (es) 2004-02-20 2006-02-22 Du Pont Lipasas y metodos de uso en plantas
ES2552053T3 (es) 2004-02-25 2015-11-25 Pioneer Hi-Bred International Inc. Nuevos polipéptidos cristalinos de Bacillus thuringiensis, polinucleótidos, y composiciones de los mismos
WO2005103266A1 (en) 2004-03-26 2005-11-03 Dow Agrosciences Llc Cry1f and cry1ac transgenic cotton lines and event-specific identification thereof
RU2385347C2 (ru) 2004-06-16 2010-03-27 Басф Плант Сайенс Гмбх Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие wrinkled1-подобные полипептиды, и способы их применения в растениях
US20050289667A1 (en) 2004-06-28 2005-12-29 Cambia Biological gene transfer system for eukaryotic cells
US20050289672A1 (en) 2004-06-28 2005-12-29 Cambia Biological gene transfer system for eukaryotic cells
WO2006004914A2 (en) * 2004-06-28 2006-01-12 Cambia Biological gene transfer system for eukaryotic cells
MXPA06015054A (es) 2004-07-02 2007-08-07 Pioneer Hi Bred Int Polipeptidos antifungales.
WO2006023869A2 (en) 2004-08-24 2006-03-02 Monsanto Technology Llc Adenylate translocator protein gene non-coding regulatory elements for use in plants
EP1794308B1 (en) 2004-09-29 2013-08-28 Pioneer-Hi-Bred International, Inc. Corn event das-59122-7 and methods for detection thereof
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
CA2595901C (en) 2005-01-31 2015-02-17 Athenix Corporation Axmi-018, axmi-020, and axmi-021, a family of delta-endotoxin genes and methods for their use
US7601498B2 (en) 2005-03-17 2009-10-13 Biotium, Inc. Methods of using dyes in association with nucleic acid staining or detection and associated technology
EP1871788B1 (en) 2005-04-01 2009-09-16 Athenix Corporation Axmi-027 a family of delta-endotoxin genes and methods for their use
BRPI0610520B1 (pt) 2005-04-04 2022-04-05 E.I. Du Pont De Nemours & Company Vetor, constructo de dna recombinante, e processos para transformar uma célula hospedeira, produzir uma planta, conferir ou aperfeiçoar a resistência a colletotrichum, determinar a presença ou ausência de um polinucleotídeo, alterar o nível de expressão de uma proteína, e de identificação de uma planta de milho
WO2006119457A1 (en) 2005-05-02 2006-11-09 Athenix Corporation Axmi-028 and axmi-029, family of novel delta-endotoxin genes and methods for their use
US7473822B1 (en) 2005-06-27 2009-01-06 Iowa State University Research Foundation, Inc. Soybean transformation and regeneration using half-seed explant
WO2007003660A1 (en) 2005-07-06 2007-01-11 Cropdesign N.V. Plant yield improvement by ste20-like gene expression
US8097769B2 (en) 2005-07-18 2012-01-17 Basf Plant Science Gmbh Yield increase in plants overexpressing the ACCDP genes
ES2390132T3 (es) 2005-07-18 2012-11-06 Pioneer Hi-Bred International Inc. Sitios de recombinación FRT modificados y métodos de uso
US8993846B2 (en) 2005-09-06 2015-03-31 Monsanto Technology Llc Vectors and methods for improved plant transformation efficiency
US7498413B2 (en) 2006-01-06 2009-03-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize antimicrobial protein useful for enhancing plant resistance to pathogens
WO2007087567A2 (en) 2006-01-25 2007-08-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antifungal polypeptides
US7329736B2 (en) 2006-04-14 2008-02-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Bacillus thuringiensis cry gene and protein
US7449552B2 (en) 2006-04-14 2008-11-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Bacillus thuringiensis cry gene and protein
CA2905478A1 (en) 2006-05-16 2007-12-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antifungal polypeptides
PL2032598T3 (pl) 2006-06-14 2013-08-30 Athenix Corp AXMI-031, AXMI-039, AXMI-040 oraz AXMI-049, rodzina genów delta-endotoksyny oraz sposoby ich zastosowania
US20080070829A1 (en) 2006-06-15 2008-03-20 Athenix Corporation Family of pesticidal proteins and methods for their use
WO2008001414A1 (fr) 2006-06-23 2008-01-03 Japan Tobacco Inc. Vecteur cosmide destiné à transformer une plante et son procédé d'utilisation
US7510878B2 (en) 2006-07-21 2009-03-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
EP2044105A2 (en) 2006-07-21 2009-04-08 Pioneer Hi-Bred International Inc. Bacillus thuringiensis toxin with anti-lepidopteran activity
BRPI0715354A2 (pt) 2006-08-07 2015-06-23 Univ Missouri Quinases semelhantes a receptor lysm para melhora da resposta de defesa de plantas contra fungos patogênicos
US8334428B2 (en) 2006-11-15 2012-12-18 Purdue Research Foundation Backbone-free low transgene copy transgenic plants
US7858849B2 (en) 2006-12-08 2010-12-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Bacillus thuringiensis crystal polypeptides, polynucleotides, and compositions thereof
MX2009005514A (es) 2006-12-15 2009-06-04 Cropdesign Nv Plantas que presentan un incremento de sus rasgos relacionados con el rendimiento y un metodo para producirlas.
CN105112438A (zh) 2007-03-09 2015-12-02 孟山都技术公司 使用壮观霉素选择的植物转化方法
UA96187C2 (ru) 2007-03-28 2011-10-10 Сингента Партисипейшнс Аг Гибридные инсектицидные белки, которые имеют активность против западного кукурузного корневого жука или европейского кукурузного мотылька
US20090075358A1 (en) 2007-03-29 2009-03-19 Cambia Vectors for transformation of plant cells
US7790156B2 (en) 2007-04-10 2010-09-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Δ-8 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
US8609936B2 (en) 2007-04-27 2013-12-17 Monsanto Technology Llc Hemipteran-and coleopteran active toxin proteins from Bacillus thuringiensis
WO2008154695A1 (en) 2007-06-20 2008-12-24 The Australian National University Method for improving stress resistance in plants and materials therefor
US7772465B2 (en) 2007-06-26 2010-08-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
BRPI0814689A2 (pt) 2007-07-13 2014-10-07 Basf Plant Science Gmbh Planta transgênica, polinucleotídeo isolado, polipeptídeo isolado, e, métodos para produzir uma planta transgênica e para aumentar o rendimento e/ou o crescimento de uma planta sob condições normais ou limitadas de água e/ou de aumentar a tolerância de uma planta a um estresse ambiental
EP2527449A3 (en) 2007-08-29 2013-04-03 E. I. du Pont de Nemours and Company Methods involving genes encoding nucleoside diphosphatase kinase (NDK) polypeptides and homologs thereof for modifying the plant's root architecture
MX2010002753A (es) 2007-09-14 2010-03-30 Basf Plant Science Gmbh Plantas que tienen rasgos aumentados relacionados con el rendimiento y un metodo para obtenerlas.
MX2010004104A (es) 2007-10-16 2010-11-26 Athenix Corp Axmi-066 y axmi-076: proteinas delta-endotoxinicas y metodos para su uso.
US8173866B1 (en) 2008-01-11 2012-05-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Modulation of plant xylan synthases
EA020327B1 (ru) 2008-06-25 2014-10-30 Атеникс Корпорейшн Гены токсинов и способы их применения
CA3183317A1 (en) 2008-07-02 2010-01-07 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Axmi-115, axmi-113, axmi-005, axmi-163 and axmi-184: insecticidal proteins and methods for their use
EP3023499A1 (en) 2008-07-16 2016-05-25 Monsanto Technology LLC Methods and vectors for producing transgenic plants
DE602009000701D1 (de) 2008-10-08 2011-03-17 Research In Motion Ltd Zweistufiger Einzeltaster
WO2010075498A2 (en) 2008-12-23 2010-07-01 Athenix Corporation Axmi-150 delta-endotoxin gene and methods for its use
BRPI0924153A2 (pt) 2009-01-23 2016-05-24 Pioneer Hi Bred Int molécula de ácido nucleico isolado, construção de dna, célula hospedeira, planta transgênica, semente transformada, polipeptídeo isolado com atividade pesticida, composição e método para controlar uma população de praga de insetos, para exterminar uma praga de insetos, para produzir um polipeptídeo com atividade pesticida e para proteger uma planta de uma praga
US20110283420A1 (en) 2009-01-28 2011-11-17 Basf Plant Science Company Gmbh Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same
US8299217B2 (en) 2009-02-05 2012-10-30 Athenix Corp. Variant AXMI-R1 delta endotoxin genes and methods for their use
CA3081727A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Pesticidal proteins and methods for their use
AR075818A1 (es) 2009-03-11 2011-04-27 Athenix Corp Axmi-001, axmi- 002, axmi-030 y axmi -035 y axmi -045: genes de toxina y metodos para su uso
US8987553B2 (en) 2009-04-14 2015-03-24 Pioneer Hi Bred International Inc Modulation of ACC synthase improves plant yield under low nitrogen conditions
ES2532145T3 (es) 2009-04-17 2015-03-24 Dow Agrosciences Llc Toxinas Cry insecticidas DIG-3
US20120066794A1 (en) 2009-05-28 2012-03-15 Nirmala Sharma Increased Seed Oil and Abiotic Stress Tolerance Mediated by HSI2
CN103002744A (zh) 2009-06-16 2013-03-27 陶氏益农公司 Dig-11杀虫cry毒素
CN102648281B (zh) 2009-07-02 2017-04-05 阿森尼克斯公司 Axmi‑205杀虫基因和它的使用方法
MX2012002951A (es) 2009-09-11 2012-07-17 Valent Biosciences Corp Nuevo aislado de bacillus thuringiensis.
AR078828A1 (es) 2009-10-30 2011-12-07 Du Pont Plantas tolerantes a la sequia y constructos y metodos relacionados que involucran genes que codifican a los polipeptidos dtp21
US20120272352A1 (en) 2009-10-30 2012-10-25 Syngenta Participations Ag Genes Conferring Drought and Salt Tolerance and Uses Thereof
EP2513318B1 (en) 2009-12-16 2018-01-24 Dow AgroSciences LLC Use of cry1ab in combination with cry1be for management of resistant insects
AR079499A1 (es) 2009-12-16 2012-02-01 Dow Agrosciences Llc Uso combinado de las proteinas cry1da y cry1fa para el manejo de la resistencia de insectos
AR079501A1 (es) 2009-12-16 2012-02-01 Dow Agrosciences Llc Uso combinado de las proteinas cry1ca y cry1ab para el control de la resistencia a los insectos
EP2512222B1 (en) 2009-12-16 2018-01-24 Dow AgroSciences LLC COMBINED USE OF CRY1Ca AND CRY1Fa PROTEINS FOR INSECT RESISTANCE MANAGEMENT
NZ601102A (en) 2009-12-16 2014-10-31 Dow Agrosciences Llc Use of cry1da in combination with cry1be for management of resistant insects
AU2010330914B2 (en) 2009-12-16 2016-04-21 Dow Agrosciences Llc Combined use of Vip3Ab and Cry1Fa for management of resistant insects
CA2782572A1 (en) 2009-12-16 2011-06-23 Dow Agrosciences Llc Insecticidal protein combinations comprising cry1ab and cry2aa for controlling european corn borer, and methods for insect resistance management
WO2011084718A1 (en) 2009-12-17 2011-07-14 The Curators Of The University Of Missouri Plant genes associated with seed oil content and methods of their use
EP2937419B1 (en) 2010-02-18 2017-08-16 Athenix Corp. Axmi221z, axmi222z, axmi223z, axmi224z, and axmi225z delta-endotoxin genes and methods for their use
MX2012009634A (es) 2010-02-18 2012-09-28 Athenix Corp Genes delta-endotoxinicos axmi218, axmi219, axmi220, axmi226, axmi227, axmi228, axmi229, axmi230, y axmi231 y metodos para sus uso.
WO2012006426A2 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Grassroots Biotechnology, Inc. Regulatory polynucleotides and uses thereof
KR20130132405A (ko) 2010-07-29 2013-12-04 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 형질전환 빈도를 증가시키기 위해 변형된 아그로박테리움 균주
EP2619311A4 (en) 2010-09-24 2014-03-05 Basf Plant Science Co Gmbh PLANTS WITH IMPROVED PERFORMANCE CHARACTERISTICS AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF
US20120079622A1 (en) 2010-09-24 2012-03-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Yield Enhancement in Plants by Modulation of a ZM-LOBDP1 Protein
US8772024B2 (en) 2010-09-27 2014-07-08 Pioneer Hi Bred International Inc Yield enhancement in plants by modulation of a ZM-ZFP1 protein
US9624504B2 (en) 2010-10-28 2017-04-18 E I Du Pont De Nemours And Company Drought tolerant plants and related constructs and methods involving genes encoding DTP6 polypeptides
WO2012098111A1 (en) 2011-01-17 2012-07-26 Philip Morris Products S.A. Vectors for nucleic acid expression in plants
BR112013020382A2 (pt) 2011-02-11 2016-10-25 Monsanto Technology Llc ácidos nucleicos e proteínas pesticidas e usos dos mesmos
CN111197051B (zh) 2011-04-07 2023-10-20 孟山都技术公司 具有对抗半翅目和/或鳞翅目昆虫的活性的昆虫抑制毒素家族
US9392758B2 (en) 2011-08-26 2016-07-19 Integrated Plant Genetics, Inc. Transformation of mature citrus
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
BR112014026203A2 (pt) 2012-04-23 2017-07-18 Bayer Cropscience Nv engenharia do genoma direcionado nas plantas
PL3401400T3 (pl) 2012-05-25 2019-12-31 The Regents Of The University Of California Sposób i kompozycje do modyfikacji docelowego dna przez ukierunkowujący RNA oraz do modulacji transkrypcji przez ukierunkowujący RNA
AU2014308896A1 (en) 2013-08-22 2016-03-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Plant genome modification using guide RNA/Cas endonuclease systems and methods of use
US20170137833A1 (en) 2014-05-16 2017-05-18 Kaneka Corporation Agrobacterium and method for producing transformed plant using the same

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101490266A (zh) * 2006-05-16 2009-07-22 孟山都技术有限公司 非土壤杆菌属细菌物种用于植物转化的用途
WO2014157541A1 (ja) * 2013-03-29 2014-10-02 日本たばこ産業株式会社 植物の形質転換方法に使用するためのアグロバクテリウム細菌

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
邹智: "农杆菌vir 基因诱导因子研究进展", 《中国生物工程杂志》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111909874A (zh) * 2020-08-17 2020-11-10 东北农业大学 一株生防菌i-5及其在防治紫花苜蓿根腐病中的应用
CN111909874B (zh) * 2020-08-17 2022-08-19 东北农业大学 一株生防菌i-5及其在防治紫花苜蓿根腐病中的应用
CN116121288A (zh) * 2023-03-27 2023-05-16 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 一组克隆恶臭假单胞菌大片段dna的载体及其应用
CN116121288B (zh) * 2023-03-27 2023-09-01 广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心) 一组克隆恶臭假单胞菌大片段dna的载体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP3341483B1 (en) 2019-12-18
DK3341483T3 (da) 2020-03-16
JP2018527931A (ja) 2018-09-27
EP3341483A1 (en) 2018-07-04
US20180216123A1 (en) 2018-08-02
WO2017040343A1 (en) 2017-03-09
CA2992488A1 (en) 2017-03-09
US11236347B2 (en) 2022-02-01
AU2016315655A1 (en) 2018-02-01
AU2016315655A8 (en) 2018-03-01
ES2773072T3 (es) 2020-07-09
BR112018004108A2 (pt) 2018-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108513584A (zh) 苍白杆菌介导的植物转化
JP6990653B2 (ja) 迅速な植物形質転換のための方法および組成物
CN104219949B (zh) 人造叶绿体转运肽
Ye et al. Development of insect‐resistant transgenic rice with Cry1C*‐free endosperm
CN108064129A (zh) 玉米和大豆中复合性状基因座的位点特异性整合位点的产生和使用方法
CN1204364A (zh) 抗旱或抗盐胁迫转基因谷类植物的生产
CN108350465A (zh) 改善植物转化的方法和组合物
US8962328B2 (en) Cultivation medium for Agrobacterium-mediated transformation of dicot plants
CN103228671A (zh) 植物中的重金属减少
Cho et al. Development of an efficient marker‐free soybean transformation method using the novel bacterium Ochrobactrum haywardense H1
CN109963941A (zh) 用于操纵腺毛中的大麻素和其他化合物的毛状体特异性启动子
CN109306000A (zh) 抗逆相关蛋白IbBBX24及其编码基因与应用
CN110592137B (zh) 拟南芥at5g10290基因及其突变体在提高植物耐旱性的应用
CN106414742A (zh) 玉米调节元件及其用途
Tepfer DNA transfer to plants by Agrobacterium rhizogenes: A model for genetic communication between species and biospheres
CN104531656B (zh) 一种来自小球藻的磷酸甘露糖异构酶基因及其应用
CN101942457A (zh) 甘蓝型油菜及其亲本物种白菜和甘蓝tt8基因家族及其应用
Mangena Plant Transformation Via Agrobacterium Tumefaciens: Culture Conditions, Recalcitrance and Advances in Soybean
CN102533783A (zh) 甘蓝tt8基因家族及其应用
CN105368848B (zh) 一种人工合成的抗虫基因及其应用
RU2631929C2 (ru) Способ получения безмаркерных трансгенных растений каланхоэ перистого, экспрессирующих ген цекропина Р1
JP4228072B2 (ja) アビジンをコードする人工合成遺伝子
de Freitas Biology and Management of Agrobacterium rhizogenes
CN105400797B (zh) 一种含有抗虫基因的重组dna片段及其应用
Negawo Transgenic insect resistance in grain legumes

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180907

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication