CN108486162A

CN108486162A - 一种尿苷的生产方法

Info

Publication number: CN108486162A
Application number: CN201810352103.2A
Authority: CN
Inventors: 范晓光; 谢希贤; 陈宁; 李国梁; 贾子樊; 吴鹤云; 徐庆阳; 张成林
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2018-04-19
Publication date: 2018-09-04

Abstract

本发明涉及一种尿苷的生产方法，利用分子生物学方法向Bacillus subtilis A219的氨甲酰磷酸合成酶大亚基中引入突变位点(949位谷氨酸缺失，E949*)获得工程菌Bacillus subtilis A2191；在发酵罐中对工程菌进行发酵培养获得尿苷发酵液，工程菌的尿苷产量可以达到40g/L以上；从尿苷发酵液中分离提取得到尿苷晶体，晶体纯度大于98％。本发明利用微生物发酵法实现了尿苷的生产，具有生产成本低、污染小、产品收率和纯度高的优势，具备较高的工业推广应用价值。

Description

一种尿苷的生产方法

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，尤其是一种尿苷的生产方法。

背景技术

尿苷是一种重要的嘧啶核苷，可作为前体用于制备核苷类药物，如抗肿瘤药物5-氟尿苷，5-氟尿嘧啶核苷，抗病毒药物5-碘脱氧尿苷等。尿苷还可以用于制备尿苷酸钠，后者可以作为调味品添加到牛奶中以增强婴儿的免疫力，或者用于合成肝脏解毒物质葡萄糖醛酸。

传统的尿苷生产方法是使用核糖核酸(RNA)经过化学方法水解，然后分离提纯得到尿苷和胞苷，这不仅涉及大量的优质RNA原料，而且两种嘌呤核苷和两种嘧啶核苷必须产销平衡，否则成本价会很高。与化学法相比，用选育获得的特殊性状的菌株一步发酵法生产尿苷具有生产成本低，环境污染小，分离提纯简单等优势。日本武田化学公司在20世纪80年代开展了一系列的发酵法生产尿苷的研究工作，通过化学诱变获得了具有尿嘧啶缺陷、6-氮杂尿嘧啶抗性以及尿苷磷酸化酶活性丧失的菌株No.556，能够积累55g/L尿苷(Appliedmicrobiology and biotechnology,1989,30(3):234-238.)。进一步对培养条件以及培养基成分优化，在6000L的发酵罐中该菌株能稳定生产65g/L尿苷(Bioscience,biotechnology,and biochemistry,1994,58(9):1608-1612.)。而国内对于尿苷的发酵法生产仍停留在研发阶段。

前期的发明中，申请人通过常压等离子诱变结合嘧啶核苷结构类似物筛选获得高产嘧啶核苷的诱变菌株A219(CN 105671008 A)和A260(CN 105671007 A)，并发现了氨甲酰磷酸合成酶的变构调节位点，但诱变菌株的尿苷产量仍需进一步提高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种尿苷的生产方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种尿苷的生产方法，利用分子生物学方法向Bacillus subtilis A219的氨甲酰磷酸合成酶大亚基中引入突变位点(949位谷氨酸缺失，E949*)获得工程菌Bacillussubtilis A2191；在发酵罐(5L)中对工程菌进行发酵培养获得尿苷发酵液；从尿苷发酵液中分离提取得到尿苷晶体；所述Bacillus subtilis A219保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11774，该菌株氨甲酰磷酸合成酶大亚基具有序列表1所述核苷酸序列、序列表2所述氨基酸序列，其第1016位氨基酸为亮氨酸。

优选的，上述尿苷的生产方法，所述分子生物学方法是以Bacillus subtilisA219氨甲酰磷酸合成酶大亚基基因为模板，设计合成包含E949*突变位点的基因片段(见序列表8所示序列)，再通过原位修饰的方法使用合成的基因片段替换Bacillus subtilisA219的氨甲酰磷酸合成酶大亚基基因中的同源基因片段，从而获得工程菌Bacillussubtilis A2191。工程菌Bacillus subtilis A2191中氨甲酰磷酸合成酶大亚基应包含E949*突变位点(核苷酸序列见序列表3，氨基酸序列见序列表4)。

优选的，上述尿苷的生产方法，所述发酵培养方法是将工程菌Bacillus subtilisA2191接入到发酵培养基中，接种量为10％-15％，培养温度为34-38℃，pH值为6.7-7.0，相对溶氧控制在10％-30％，发酵过程中流加800g/L葡萄糖溶液并控制残糖浓度为0.5％-2％，发酵周期为45-65h。发酵完成后，工程菌A2191尿苷产量可以达到40g/L以上。

优选的，上述尿苷的生产方法，所述pH值是通过流加25％的氨水和玉米浆进行控制。

优选的，上述尿苷的生产方法，所述相对溶氧值是通过调节通气量和搅拌转速进行控制。

优选的，上述尿苷的生产方法，所述发酵培养基组成为：葡萄糖50g/L，酵母粉5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 5.2g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 5g/L，MnSO₄ 0.02g/L，ZnSO₄0.02g/L，柠檬酸钠10g/L，谷氨酸钠10g/L。

优选的，上述尿苷的生产方法，初始葡萄糖，流加葡萄糖(800g/L)以及流加玉米浆单独灭菌，其余组分一起灭菌，灭菌条件为115℃，15min。

优选的，上述尿苷的生产方法，所述尿苷分离提取方法(从尿苷发酵液中分离提取得到尿苷晶体)是指收集工程菌发酵液，离心方法去除菌体后，使用超滤膜过滤方法除去大分子杂质，再使用串联离子交换树脂方法对膜过滤液进行脱色除杂，最后收集树脂流出液进行浓缩结晶获得尿苷成品。

优选的，上述尿苷的生产方法，所述离心方法是使用高速离心机，离心转速8000-10000r/min，离心时间10-15min。

优选的，上述尿苷的生产方法，所述超滤膜过滤方法是使用截留分子量500-1000Da的有机中空纤维超滤膜，操作压力0.5-1.5Mpa，操作温度30-40℃。

优选的，上述尿苷的生产方法，所述串联离子交换树脂方法是将超滤膜过滤液依次通过弱碱性大孔型阴离子交换树脂和强酸性大孔型阳离子交换树脂，两种树脂的装填体积相同，进料浓度(尿苷浓度)为35-40g/L，进料体积为1-2BV，进料流速为0.5-1BV/h。

优选的，上述尿苷的生产方法，所述浓缩结晶是使用真空浓缩将树脂流出液浓缩至过饱和状态，再放入结晶器中进行降温结晶，用无水乙醇洗晶2-3次，得到的尿苷晶体的纯度大于98％。

本发明的有益效果是：

1、本发明在现有技术的基础上，通过向Bacillus subtilis A219(CGMCCNo.11774)氨甲酰磷酸合成酶大亚基中引入突变位点(949位谷氨酸缺失)，进一步解除了从头合成途径中尿苷酸对于氨甲酰磷酸合成酶的反馈抑制，显著提升了尿苷的发酵产量。

2、本发明设计了适用于尿苷的分离提取方法，由于尿苷分子呈弱电性，不能被弱碱性大孔型阴离子交换树脂以及强酸性大孔型阳离子交换树脂吸附，因此可以用上述两种树脂串联，对发酵液中的色素、残留的无机盐以及小分子杂质进行吸附，进而高效快速的获得高纯度的尿苷成品。

综上，上述尿苷的生产方法，为了进一步提高诱变菌株的尿苷产量，克服现有技术尿苷产量低，难以分离的缺陷，利用分子生物学技术向A219的氨甲酰磷酸合成酶中引入新的突变位点获得新的工程菌，并提供了工程菌的发酵和尿苷的分离提取方法，为工业化尿苷的生产提供了参考依据。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。其中，

Bacillus subtilis A219中氨甲酰磷酸合成酶大亚基核苷酸序列如序列表1所示：

Bacillus subtilis A219中氨甲酰磷酸合成酶大亚基氨基酸序列如序列表2所示：

工程菌Bacillus subtilis A2191中氨甲酰磷酸合成酶大亚基核苷酸序列如序列表3所示：

工程菌Bacillus subtilis A2191中氨甲酰磷酸合成酶大亚基氨基酸序列如序列表4所示。

实施例1.工程菌Bacillus subtilis A2191的构建

(1)以Bacillus subtilis A219氨甲酰磷酸合成酶大亚基基因为模板(核苷酸序列见序列表1，氨基酸序列见序列表2)，设计并委托金唯智公司合成包含E949*突变位点的基因片段M(见序列表8)。

(2)通过重叠PCR方法，拼接一段由上游同源臂U(见序列表5)、氯霉素抗性基因cat(见序列表7)和下游同源臂D(见序列表6)构成的DNA片段，转化受体菌Bacillus subtilisA219感受态细胞，通过同源重组，在氨甲酰磷酸合成酶大亚基基因(核苷酸序列见序列表1，氨基酸序列见序列表2)位点第2846碱基附近，插入氯霉素抗性基因(基因序列见序列表7)，并替换掉部分基因编码序列。

(3)通过筛选氯霉素抗性菌株，获得尿嘧啶缺陷型转化子，将(1)中扩增得到的基因片段M(见序列表8)与上游同源臂U’(见序列表5)和下游同源臂D’(见序列表6)拼接成U’MD’片段，转化尿嘧啶缺陷株，通过同源重组，M片段将替换掉氯霉素抗性基因cat。用基本培养基平板筛选转化子，得到原养型的工程菌Bacillus subtilis A2191。经过测序验证工程菌Bacillus subtilis A2191中氨甲酰磷酸合成酶大亚基应包含E949*突变位点(基因序列见序列表3，氨基酸序列见序列表4)。

(4)上述基因扩增所用引物的序列表如表1所示。

表1基因扩增引物

实施例2.利用工程菌Bacillus subtilis A2191发酵生产尿苷

(1)活化培养：取保藏的工程菌Bacillus subtilis A2191划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次。用接种环刮取一环斜面种子接种于装有100mL种子培养基的1L三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200rpm振荡培养6h。

(2)发酵培养：将活化的种子接入到含有3L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量为10％，培养温度为36℃，相对溶氧控制在20％，发酵过程中流加800g/L葡萄糖溶液并控制残糖浓度为1％，，流加25％的氨水和玉米浆控制发酵过程pH值为7.0，发酵周期为60h。

(3)产物检测：发酵结束后，使用高效液相色谱仪测定发酵液中尿苷浓度。所用色谱柱为Phenomenex Gemini 5u C18 110A 150*4.6mm，柱温30℃，流动相为乙腈：水＝2：98，流速1mL/min，每个样品进样10μL，分析时间15min。经测定发酵液中尿苷浓度可达42g/L。

斜面培养基：葡萄糖1g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏g/L，酵母粉5g/L，NaCl 2.5g/L，琼脂20g/L，pH 6.7-7.0。灭菌条件为115℃，15min.

种子培养基：葡萄糖40g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaNO₃ 15g/L，KH₂PO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 5.2g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，柠檬酸钠1g/L，pH 6.7～7.0。灭菌条件为115℃，15min。

发酵培养基：葡萄糖50g/L，酵母粉5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 5.2g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，MgSO₄·7H₂O 5g/L，MnSO₄ 0.02g/L，ZnSO₄ 0.02g/L，柠檬酸钠10g/L，谷氨酸钠10g/L。其中，初始葡萄糖，流加葡萄糖(800g/L)以及流加玉米浆单独灭菌，其余组分一起灭菌。灭菌条件为115℃，15min。

实施例3.从发酵液中分离提取尿苷

(1)收集发酵液，高速离心(8000r/min，15min)去除菌体。

(2)使用截留分子量600Da的有机中空纤维超滤膜处理离心上清液，除去上清液中的大分子可溶性蛋白和色素，操作压力为1.0Mpa，操作温度40℃。

(3)将超滤膜过滤液依次通过弱碱性大孔型阴离子交换树脂D301和强酸性大孔型阳离子交换树脂D001，除去色素、残留的无机盐以及小分子杂质。两种树脂的装填体积相同，进料浓度(尿苷浓度)为38g/L，进料体积为1.5BV，进料流速为0.75BV/h。

(4)将树脂流出液真空浓缩至过饱和状态，再放入结晶器中进行降温结晶获得尿苷晶体，用无水乙醇洗晶2次。经检测，尿苷晶体的纯度为98.5％。

上述参照具体实施方式对该一种尿苷的生产方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种尿苷的生产方法

<150> 2017109025807

<151> 2017-09-29

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3216

<212> DNA

<213> 氨甲酰磷酸合成酶大亚基(枯草芽孢杆菌)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(3216)

<400> 1

atgccaaaac gcgtagacat taacaaaatt ttagtaatcg gatctggacc gatcatcatc 60

ggccaagcag cagaatttga ctatgcggga acacaagcct gtcttgcttt gaaagaagaa 120

ggctatgaag tcatccttgt caactcaaac cctgcaacga tcatgacaga tacagaaatg 180

gctgaccggg tttacatcga accgctcaca cctgaattcc tgacacgaat catcagaaaa 240

gagcgcccgg atgccattct tcctacactc ggaggccaaa ccggtttgaa tcttgcggtt 300

gagctttctg aaagaggcgt tttggcagaa tgcggcgtcg aagtgcttgg cacgaaactg 360

tctgcgattc agcaagctga agaccgtgac ttgttcagaa cattaatgaa tgaactgaat 420

gaaccggtgc ctgaaagtga gattatccac tcccttgaag aagcagaaaa attcgtcagt 480

caaattggat tccctgtcat tgtccgcccg gcatatacat taggcggaac aggcggaggc 540

atctgctcga atgaaacaga gctaaaagaa atcgttgaga acggcttgaa attaagcccg 600

gtacaccaat gtctgcttga aaaaagcatc gccggctata aagaaatcga gtatgaagtc 660

atgagagaca gccaggatca cgccattgtc gtttgtaaca tggaaaacat tgatccagtt 720

ggaatccata ctggagacag tattgttgtc gcgccgagcc aaacgctcag cgatcgcgaa 780

tatcagctct tgcggaatgt atcgttaaaa ctgattcgcg cgcttgggat cgaaggcgga 840

tgtaatgtcc agctcgcctt agatccagac agcttccaat attacattat tgaagtaaat 900

ccgcgtgtca gccgttcatc tgcccttgca tcaaaagcaa cggggtaccc gattgcaaag 960

ctcgctgcta aaattgcagt cggactttca ttagatgaaa tgatgaaccc ggtgacagga 1020

aaaacatatg cagcatttga acctgctctt gactatgtcg tatccaaaat tccgcgctgg 1080

ccgtttgata agtttgaatc agcaaacaga aagcttggca cgcaaatgaa agcgacaggt 1140

gaggtcatgg caatcggccg cacgcttgaa gagtcattgc tgaaggcagt gcgatcactg 1200

gaagcggatg tgtatcatct tgaattgaag gacgccgctg acatttcaga tgagcttctt 1260

gaaaagcgaa ttaaaaaggc cggtgatgaa cgcttattct acttagctga agcgtacaga 1320

agaggctaca cggtagaaga cctccatgaa ttttccgcta tcgatgtctt cttcttgcat 1380

aagctgttcg gaatcgtaca gtttgaaaaa gaattgaagg ccaatgcggg cgatacagat 1440

gtgctgagac gggcaaaaga actcggcttc tctgatcagt acatcagccg tgaatggaaa 1500

atgaaagaat ctgagcttta cagcttgaga aaacaagcgg ggattgcgcc ggtattcaaa 1560

atggtagata catgcgcggc ggaatttgag tcagaaacgc catacttcta tagcacatat 1620

gaagaagaaa atgaatctgt cgttacagat aagaaaagtg tgatggtgct tggttcgggt 1680

ccgattcgaa tcggtcaggg tgtcgagttc gactatgcga cggttcactc tgtatgggca 1740

attaaacaag caggctatga agccattatt gtcaacaaca acccggaaac cgtttcaaca 1800

gacttcagca tctcagacaa gctgtatttt gaaccgctta cgattgaaga tgtcatgcac 1860

atcattgacc tcgaacagcc aatgggcgtt gtcgtacaat ttggcggaca aactgcgatt 1920

aaccttgctg acgagctttc tgcacgcgga gtgaaaatcc ttggaacttc attagaagat 1980

ttagaccgtg ccgaagaccg ggataaattt gaacaagcgc ttggagaact tggtgttcct 2040

cagccgcttg gcaaaacagc gacatcagtt aatcaggcgg taagcatcgc aagtgatatc 2100

ggttatccgg tactggtacg cccttcctat gtacttggcg gccgggcgat ggagattgtt 2160

taccatgaag aggaactgct tcattacatg aaaaatgcag tcaaaatcaa tccacagcac 2220

cctgtattaa ttgatagata cttgaccgga aaagaaattg aagtcgatgc agtatccgac 2280

ggtgaaacag tcgtcattcc gggaattatg gagcacattg aacgtgcggg cgttcactcc 2340

ggagactcaa tcgctgttta tccgcctcag tctctcacag aggacattaa gaaaaaaatt 2400

gaacaataca cgatcgcatt ggctaaaggg ctgaatattg tcggtttgct caatattcaa 2460

ttcgtcttgt cgcaaggcga ggtgtacgtg ctagaagtga atccgagatc aagcagaacc 2520

gtaccgtttt taagcaaaat tacgggtatc ccaatggcga atctcgcaac aaaaatcatt 2580

cttggtcaaa agctggctgc gtttggctat acagagggcc ttcagcctga acagcaaggt 2640

gtatttgtaa aagcgccggt cttctccttt gccaagctga gaagagtgga tattacgtta 2700

gggcctgaaa tgaaatcaac aggtgaagtc atggggaaag attcgacact tgaaaaggcg 2760

ctctacaaag ccttgatcgc ttcaggtatt caaatcccga actacggttc cgtgctttta 2820

acagtagctg ataaggacaa agaagaaggg cttgccattg ctaagcggtt ccacgcgatc 2880

ggctacaaca ttttagcgac ggaaggaacg gcaggctacc tgaaagaagc ttccattcca 2940

gcgaaggtcg tcggaaaaat cggtcaggat ggcccgaact tgcttgatgt catcagaaac 3000

ggagaagcgc agtttgtcat caatacgctg acaaaaggaa agcagctggc aagagacggt 3060

tttagaatca gacgtgaatc agtagaaaat ggtgttgcct gcctaacatc tttagatacg 3120

gcagaggcga tattgcgagt gctggaaagc atgacattcc gtgctgatca aatgccggca 3180

gtcaacacaa atcaggaggc ggcagtcact atatga 3216

<210> 2

<211> 1071

<212> PRT

<213> 氨甲酰磷酸合成酶大亚基(枯草芽孢杆菌)

<220>

<221> DNA_BIND

<222> (1)..(1071)

<400> 2

Met Pro Lys Arg Val Asp Ile Asn Lys Ile Leu Val Ile Gly Ser Gly

1 5 10 15

Pro Ile Ile Ile Gly Gln Ala Ala Glu Phe Asp Tyr Ala Gly Thr Gln

20 25 30

Ala Cys Leu Ala Leu Lys Glu Glu Gly Tyr Glu Val Ile Leu Val Asn

35 40 45

Ser Asn Pro Ala Thr Ile Met Thr Asp Thr Glu Met Ala Asp Arg Val

50 55 60

Tyr Ile Glu Pro Leu Thr Pro Glu Phe Leu Thr Arg Ile Ile Arg Lys

65 70 75 80

Glu Arg Pro Asp Ala Ile Leu Pro Thr Leu Gly Gly Gln Thr Gly Leu

85 90 95

Asn Leu Ala Val Glu Leu Ser Glu Arg Gly Val Leu Ala Glu Cys Gly

100 105 110

Val Glu Val Leu Gly Thr Lys Leu Ser Ala Ile Gln Gln Ala Glu Asp

115 120 125

Arg Asp Leu Phe Arg Thr Leu Met Asn Glu Leu Asn Glu Pro Val Pro

130 135 140

Glu Ser Glu Ile Ile His Ser Leu Glu Glu Ala Glu Lys Phe Val Ser

145 150 155 160

Gln Ile Gly Phe Pro Val Ile Val Arg Pro Ala Tyr Thr Leu Gly Gly

165 170 175

Thr Gly Gly Gly Ile Cys Ser Asn Glu Thr Glu Leu Lys Glu Ile Val

180 185 190

Glu Asn Gly Leu Lys Leu Ser Pro Val His Gln Cys Leu Leu Glu Lys

195 200 205

Ser Ile Ala Gly Tyr Lys Glu Ile Glu Tyr Glu Val Met Arg Asp Ser

210 215 220

Gln Asp His Ala Ile Val Val Cys Asn Met Glu Asn Ile Asp Pro Val

225 230 235 240

Gly Ile His Thr Gly Asp Ser Ile Val Val Ala Pro Ser Gln Thr Leu

245 250 255

Ser Asp Arg Glu Tyr Gln Leu Leu Arg Asn Val Ser Leu Lys Leu Ile

260 265 270

Arg Ala Leu Gly Ile Glu Gly Gly Cys Asn Val Gln Leu Ala Leu Asp

275 280 285

Pro Asp Ser Phe Gln Tyr Tyr Ile Ile Glu Val Asn Pro Arg Val Ser

290 295 300

Arg Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Ala Thr Gly Tyr Pro Ile Ala Lys

305 310 315 320

Leu Ala Ala Lys Ile Ala Val Gly Leu Ser Leu Asp Glu Met Met Asn

325 330 335

Pro Val Thr Gly Lys Thr Tyr Ala Ala Phe Glu Pro Ala Leu Asp Tyr

340 345 350

Val Val Ser Lys Ile Pro Arg Trp Pro Phe Asp Lys Phe Glu Ser Ala

355 360 365

Asn Arg Lys Leu Gly Thr Gln Met Lys Ala Thr Gly Glu Val Met Ala

370 375 380

Ile Gly Arg Thr Leu Glu Glu Ser Leu Leu Lys Ala Val Arg Ser Leu

385 390 395 400

Glu Ala Asp Val Tyr His Leu Glu Leu Lys Asp Ala Ala Asp Ile Ser

405 410 415

Asp Glu Leu Leu Glu Lys Arg Ile Lys Lys Ala Gly Asp Glu Arg Leu

420 425 430

Phe Tyr Leu Ala Glu Ala Tyr Arg Arg Gly Tyr Thr Val Glu Asp Leu

435 440 445

His Glu Phe Ser Ala Ile Asp Val Phe Phe Leu His Lys Leu Phe Gly

450 455 460

Ile Val Gln Phe Glu Lys Glu Leu Lys Ala Asn Ala Gly Asp Thr Asp

465 470 475 480

Val Leu Arg Arg Ala Lys Glu Leu Gly Phe Ser Asp Gln Tyr Ile Ser

485 490 495

Arg Glu Trp Lys Met Lys Glu Ser Glu Leu Tyr Ser Leu Arg Lys Gln

500 505 510

Ala Gly Ile Ala Pro Val Phe Lys Met Val Asp Thr Cys Ala Ala Glu

515 520 525

Phe Glu Ser Glu Thr Pro Tyr Phe Tyr Ser Thr Tyr Glu Glu Glu Asn

530 535 540

Glu Ser Val Val Thr Asp Lys Lys Ser Val Met Val Leu Gly Ser Gly

545 550 555 560

Pro Ile Arg Ile Gly Gln Gly Val Glu Phe Asp Tyr Ala Thr Val His

565 570 575

Ser Val Trp Ala Ile Lys Gln Ala Gly Tyr Glu Ala Ile Ile Val Asn

580 585 590

Asn Asn Pro Glu Thr Val Ser Thr Asp Phe Ser Ile Ser Asp Lys Leu

595 600 605

Tyr Phe Glu Pro Leu Thr Ile Glu Asp Val Met His Ile Ile Asp Leu

610 615 620

Glu Gln Pro Met Gly Val Val Val Gln Phe Gly Gly Gln Thr Ala Ile

625 630 635 640

Asn Leu Ala Asp Glu Leu Ser Ala Arg Gly Val Lys Ile Leu Gly Thr

645 650 655

Ser Leu Glu Asp Leu Asp Arg Ala Glu Asp Arg Asp Lys Phe Glu Gln

660 665 670

Ala Leu Gly Glu Leu Gly Val Pro Gln Pro Leu Gly Lys Thr Ala Thr

675 680 685

Ser Val Asn Gln Ala Val Ser Ile Ala Ser Asp Ile Gly Tyr Pro Val

690 695 700

Leu Val Arg Pro Ser Tyr Val Leu Gly Gly Arg Ala Met Glu Ile Val

705 710 715 720

Tyr His Glu Glu Glu Leu Leu His Tyr Met Lys Asn Ala Val Lys Ile

725 730 735

Asn Pro Gln His Pro Val Leu Ile Asp Arg Tyr Leu Thr Gly Lys Glu

740 745 750

Ile Glu Val Asp Ala Val Ser Asp Gly Glu Thr Val Val Ile Pro Gly

755 760 765

Ile Met Glu His Ile Glu Arg Ala Gly Val His Ser Gly Asp Ser Ile

770 775 780

Ala Val Tyr Pro Pro Gln Ser Leu Thr Glu Asp Ile Lys Lys Lys Ile

785 790 795 800

Glu Gln Tyr Thr Ile Ala Leu Ala Lys Gly Leu Asn Ile Val Gly Leu

805 810 815

Leu Asn Ile Gln Phe Val Leu Ser Gln Gly Glu Val Tyr Val Leu Glu

820 825 830

Val Asn Pro Arg Ser Ser Arg Thr Val Pro Phe Leu Ser Lys Ile Thr

835 840 845

Gly Ile Pro Met Ala Asn Leu Ala Thr Lys Ile Ile Leu Gly Gln Lys

850 855 860

Leu Ala Ala Phe Gly Tyr Thr Glu Gly Leu Gln Pro Glu Gln Gln Gly

865 870 875 880

Val Phe Val Lys Ala Pro Val Phe Ser Phe Ala Lys Leu Arg Arg Val

885 890 895

Asp Ile Thr Leu Gly Pro Glu Met Lys Ser Thr Gly Glu Val Met Gly

900 905 910

Lys Asp Ser Thr Leu Glu Lys Ala Leu Tyr Lys Ala Leu Ile Ala Ser

915 920 925

Gly Ile Gln Ile Pro Asn Tyr Gly Ser Val Leu Leu Thr Val Ala Asp

930 935 940

Lys Asp Lys Glu Glu Gly Leu Ala Ile Ala Lys Arg Phe His Ala Ile

945 950 955 960

Gly Tyr Asn Ile Leu Ala Thr Glu Gly Thr Ala Gly Tyr Leu Lys Glu

965 970 975

Ala Ser Ile Pro Ala Lys Val Val Gly Lys Ile Gly Gln Asp Gly Pro

980 985 990

Asn Leu Leu Asp Val Ile Arg Asn Gly Glu Ala Gln Phe Val Ile Asn

995 1000 1005

Thr Leu Thr Lys Gly Lys Gln Leu Ala Arg Asp Gly Phe Arg Ile Arg

1010 1015 1020

Arg Glu Ser Val Glu Asn Gly Val Ala Cys Leu Thr Ser Leu Asp Thr

1025 1030 1035 1040

Ala Glu Ala Ile Leu Arg Val Leu Glu Ser Met Thr Phe Arg Ala Asp

1045 1050 1055

Gln Met Pro Ala Val Asn Thr Asn Gln Glu Ala Ala Val Thr Ile

1060 1065 1070

<210> 3

<211> 3213

<212> DNA

<213> 氨甲酰磷酸合成酶大亚基(枯草芽孢杆菌)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(3213)

<400> 3

atgccaaaac gcgtagacat taacaaaatt ttagtaatcg gatctggacc gatcatcatc 60

ggccaagcag cagaatttga ctatgcggga acacaagcct gtcttgcttt gaaagaagaa 120

ggctatgaag tcatccttgt caactcaaac cctgcaacga tcatgacaga tacagaaatg 180

gctgaccggg tttacatcga accgctcaca cctgaattcc tgacacgaat catcagaaaa 240

gagcgcccgg atgccattct tcctacactc ggaggccaaa ccggtttgaa tcttgcggtt 300

gagctttctg aaagaggcgt tttggcagaa tgcggcgtcg aagtgcttgg cacgaaactg 360

tctgcgattc agcaagctga agaccgtgac ttgttcagaa cattaatgaa tgaactgaat 420

gaaccggtgc ctgaaagtga gattatccac tcccttgaag aagcagaaaa attcgtcagt 480

caaattggat tccctgtcat tgtccgcccg gcatatacat taggcggaac aggcggaggc 540

atctgctcga atgaaacaga gctaaaagaa atcgttgaga acggcttgaa attaagcccg 600

gtacaccaat gtctgcttga aaaaagcatc gccggctata aagaaatcga gtatgaagtc 660

atgagagaca gccaggatca cgccattgtc gtttgtaaca tggaaaacat tgatccagtt 720

ggaatccata ctggagacag tattgttgtc gcgccgagcc aaacgctcag cgatcgcgaa 780

tatcagctct tgcggaatgt atcgttaaaa ctgattcgcg cgcttgggat cgaaggcgga 840

tgtaatgtcc agctcgcctt agatccagac agcttccaat attacattat tgaagtaaat 900

ccgcgtgtca gccgttcatc tgcccttgca tcaaaagcaa cggggtaccc gattgcaaag 960

ctcgctgcta aaattgcagt cggactttca ttagatgaaa tgatgaaccc ggtgacagga 1020

aaaacatatg cagcatttga acctgctctt gactatgtcg tatccaaaat tccgcgctgg 1080

ccgtttgata agtttgaatc agcaaacaga aagcttggca cgcaaatgaa agcgacaggt 1140

gaggtcatgg caatcggccg cacgcttgaa gagtcattgc tgaaggcagt gcgatcactg 1200

gaagcggatg tgtatcatct tgaattgaag gacgccgctg acatttcaga tgagcttctt 1260

gaaaagcgaa ttaaaaaggc cggtgatgaa cgcttattct acttagctga agcgtacaga 1320

agaggctaca cggtagaaga cctccatgaa ttttccgcta tcgatgtctt cttcttgcat 1380

aagctgttcg gaatcgtaca gtttgaaaaa gaattgaagg ccaatgcggg cgatacagat 1440

gtgctgagac gggcaaaaga actcggcttc tctgatcagt acatcagccg tgaatggaaa 1500

atgaaagaat ctgagcttta cagcttgaga aaacaagcgg ggattgcgcc ggtattcaaa 1560

atggtagata catgcgcggc ggaatttgag tcagaaacgc catacttcta tagcacatat 1620

gaagaagaaa atgaatctgt cgttacagat aagaaaagtg tgatggtgct tggttcgggt 1680

ccgattcgaa tcggtcaggg tgtcgagttc gactatgcga cggttcactc tgtatgggca 1740

attaaacaag caggctatga agccattatt gtcaacaaca acccggaaac cgtttcaaca 1800

gacttcagca tctcagacaa gctgtatttt gaaccgctta cgattgaaga tgtcatgcac 1860

atcattgacc tcgaacagcc aatgggcgtt gtcgtacaat ttggcggaca aactgcgatt 1920

aaccttgctg acgagctttc tgcacgcgga gtgaaaatcc ttggaacttc attagaagat 1980

ttagaccgtg ccgaagaccg ggataaattt gaacaagcgc ttggagaact tggtgttcct 2040

cagccgcttg gcaaaacagc gacatcagtt aatcaggcgg taagcatcgc aagtgatatc 2100

ggttatccgg tactggtacg cccttcctat gtacttggcg gccgggcgat ggagattgtt 2160

taccatgaag aggaactgct tcattacatg aaaaatgcag tcaaaatcaa tccacagcac 2220

cctgtattaa ttgatagata cttgaccgga aaagaaattg aagtcgatgc agtatccgac 2280

ggtgaaacag tcgtcattcc gggaattatg gagcacattg aacgtgcggg cgttcactcc 2340

ggagactcaa tcgctgttta tccgcctcag tctctcacag aggacattaa gaaaaaaatt 2400

gaacaataca cgatcgcatt ggctaaaggg ctgaatattg tcggtttgct caatattcaa 2460

ttcgtcttgt cgcaaggcga ggtgtacgtg ctagaagtga atccgagatc aagcagaacc 2520

gtaccgtttt taagcaaaat tacgggtatc ccaatggcga atctcgcaac aaaaatcatt 2580

cttggtcaaa agctggctgc gtttggctat acagagggcc ttcagcctga acagcaaggt 2640

gtatttgtaa aagcgccggt cttctccttt gccaagctga gaagagtgga tattacgtta 2700

gggcctgaaa tgaaatcaac aggtgaagtc atggggaaag attcgacact tgaaaaggcg 2760

ctctacaaag ccttgatcgc ttcaggtatt caaatcccga actacggttc cgtgctttta 2820

acagtagctg ataaggacaa agaagggctt gccattgcta agcggttcca cgcgatcggc 2880

tacaacattt tagcgacgga aggaacggca ggctacctga aagaagcttc cattccagcg 2940

aaggtcgtcg gaaaaatcgg tcaggatggc ccgaacttgc ttgatgtcat cagaaacgga 3000

gaagcgcagt ttgtcatcaa tacgctgaca aaaggaaagc agctggcaag agacggtttt 3060

agaatcagac gtgaatcagt agaaaatggt gttgcctgcc taacatcttt agatacggca 3120

gaggcgatat tgcgagtgct ggaaagcatg acattccgtg ctgatcaaat gccggcagtc 3180

aacacaaatc aggaggcggc agtcactata tga 3213

<210> 4

<211> 1070

<212> PRT

<213> 氨甲酰磷酸合成酶大亚基(枯草芽孢杆菌)

<220>

<221> DNA_BIND

<222> (1)..(1070)

<400> 4

Met Pro Lys Arg Val Asp Ile Asn Lys Ile Leu Val Ile Gly Ser Gly

1 5 10 15

Pro Ile Ile Ile Gly Gln Ala Ala Glu Phe Asp Tyr Ala Gly Thr Gln

20 25 30

Ala Cys Leu Ala Leu Lys Glu Glu Gly Tyr Glu Val Ile Leu Val Asn

35 40 45

Ser Asn Pro Ala Thr Ile Met Thr Asp Thr Glu Met Ala Asp Arg Val

50 55 60

Tyr Ile Glu Pro Leu Thr Pro Glu Phe Leu Thr Arg Ile Ile Arg Lys

65 70 75 80

Glu Arg Pro Asp Ala Ile Leu Pro Thr Leu Gly Gly Gln Thr Gly Leu

85 90 95

Asn Leu Ala Val Glu Leu Ser Glu Arg Gly Val Leu Ala Glu Cys Gly

100 105 110

Val Glu Val Leu Gly Thr Lys Leu Ser Ala Ile Gln Gln Ala Glu Asp

115 120 125

Arg Asp Leu Phe Arg Thr Leu Met Asn Glu Leu Asn Glu Pro Val Pro

130 135 140

Glu Ser Glu Ile Ile His Ser Leu Glu Glu Ala Glu Lys Phe Val Ser

145 150 155 160

Gln Ile Gly Phe Pro Val Ile Val Arg Pro Ala Tyr Thr Leu Gly Gly

165 170 175

Thr Gly Gly Gly Ile Cys Ser Asn Glu Thr Glu Leu Lys Glu Ile Val

180 185 190

Glu Asn Gly Leu Lys Leu Ser Pro Val His Gln Cys Leu Leu Glu Lys

195 200 205

Ser Ile Ala Gly Tyr Lys Glu Ile Glu Tyr Glu Val Met Arg Asp Ser

210 215 220

Gln Asp His Ala Ile Val Val Cys Asn Met Glu Asn Ile Asp Pro Val

225 230 235 240

Gly Ile His Thr Gly Asp Ser Ile Val Val Ala Pro Ser Gln Thr Leu

245 250 255

Ser Asp Arg Glu Tyr Gln Leu Leu Arg Asn Val Ser Leu Lys Leu Ile

260 265 270

Arg Ala Leu Gly Ile Glu Gly Gly Cys Asn Val Gln Leu Ala Leu Asp

275 280 285

Pro Asp Ser Phe Gln Tyr Tyr Ile Ile Glu Val Asn Pro Arg Val Ser

290 295 300

Arg Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Ala Thr Gly Tyr Pro Ile Ala Lys

305 310 315 320

Leu Ala Ala Lys Ile Ala Val Gly Leu Ser Leu Asp Glu Met Met Asn

325 330 335

Pro Val Thr Gly Lys Thr Tyr Ala Ala Phe Glu Pro Ala Leu Asp Tyr

340 345 350

Val Val Ser Lys Ile Pro Arg Trp Pro Phe Asp Lys Phe Glu Ser Ala

355 360 365

Asn Arg Lys Leu Gly Thr Gln Met Lys Ala Thr Gly Glu Val Met Ala

370 375 380

Ile Gly Arg Thr Leu Glu Glu Ser Leu Leu Lys Ala Val Arg Ser Leu

385 390 395 400

Glu Ala Asp Val Tyr His Leu Glu Leu Lys Asp Ala Ala Asp Ile Ser

405 410 415

Asp Glu Leu Leu Glu Lys Arg Ile Lys Lys Ala Gly Asp Glu Arg Leu

420 425 430

Phe Tyr Leu Ala Glu Ala Tyr Arg Arg Gly Tyr Thr Val Glu Asp Leu

435 440 445

His Glu Phe Ser Ala Ile Asp Val Phe Phe Leu His Lys Leu Phe Gly

450 455 460

Ile Val Gln Phe Glu Lys Glu Leu Lys Ala Asn Ala Gly Asp Thr Asp

465 470 475 480

Val Leu Arg Arg Ala Lys Glu Leu Gly Phe Ser Asp Gln Tyr Ile Ser

485 490 495

Arg Glu Trp Lys Met Lys Glu Ser Glu Leu Tyr Ser Leu Arg Lys Gln

500 505 510

Ala Gly Ile Ala Pro Val Phe Lys Met Val Asp Thr Cys Ala Ala Glu

515 520 525

Phe Glu Ser Glu Thr Pro Tyr Phe Tyr Ser Thr Tyr Glu Glu Glu Asn

530 535 540

Glu Ser Val Val Thr Asp Lys Lys Ser Val Met Val Leu Gly Ser Gly

545 550 555 560

Pro Ile Arg Ile Gly Gln Gly Val Glu Phe Asp Tyr Ala Thr Val His

565 570 575

Ser Val Trp Ala Ile Lys Gln Ala Gly Tyr Glu Ala Ile Ile Val Asn

580 585 590

Asn Asn Pro Glu Thr Val Ser Thr Asp Phe Ser Ile Ser Asp Lys Leu

595 600 605

Tyr Phe Glu Pro Leu Thr Ile Glu Asp Val Met His Ile Ile Asp Leu

610 615 620

Glu Gln Pro Met Gly Val Val Val Gln Phe Gly Gly Gln Thr Ala Ile

625 630 635 640

Asn Leu Ala Asp Glu Leu Ser Ala Arg Gly Val Lys Ile Leu Gly Thr

645 650 655

Ser Leu Glu Asp Leu Asp Arg Ala Glu Asp Arg Asp Lys Phe Glu Gln

660 665 670

Ala Leu Gly Glu Leu Gly Val Pro Gln Pro Leu Gly Lys Thr Ala Thr

675 680 685

Ser Val Asn Gln Ala Val Ser Ile Ala Ser Asp Ile Gly Tyr Pro Val

690 695 700

Leu Val Arg Pro Ser Tyr Val Leu Gly Gly Arg Ala Met Glu Ile Val

705 710 715 720

Tyr His Glu Glu Glu Leu Leu His Tyr Met Lys Asn Ala Val Lys Ile

725 730 735

Asn Pro Gln His Pro Val Leu Ile Asp Arg Tyr Leu Thr Gly Lys Glu

740 745 750

Ile Glu Val Asp Ala Val Ser Asp Gly Glu Thr Val Val Ile Pro Gly

755 760 765

Ile Met Glu His Ile Glu Arg Ala Gly Val His Ser Gly Asp Ser Ile

770 775 780

Ala Val Tyr Pro Pro Gln Ser Leu Thr Glu Asp Ile Lys Lys Lys Ile

785 790 795 800

Glu Gln Tyr Thr Ile Ala Leu Ala Lys Gly Leu Asn Ile Val Gly Leu

805 810 815

Leu Asn Ile Gln Phe Val Leu Ser Gln Gly Glu Val Tyr Val Leu Glu

820 825 830

Val Asn Pro Arg Ser Ser Arg Thr Val Pro Phe Leu Ser Lys Ile Thr

835 840 845

Gly Ile Pro Met Ala Asn Leu Ala Thr Lys Ile Ile Leu Gly Gln Lys

850 855 860

Leu Ala Ala Phe Gly Tyr Thr Glu Gly Leu Gln Pro Glu Gln Gln Gly

865 870 875 880

Val Phe Val Lys Ala Pro Val Phe Ser Phe Ala Lys Leu Arg Arg Val

885 890 895

Asp Ile Thr Leu Gly Pro Glu Met Lys Ser Thr Gly Glu Val Met Gly

900 905 910

Lys Asp Ser Thr Leu Glu Lys Ala Leu Tyr Lys Ala Leu Ile Ala Ser

915 920 925

Gly Ile Gln Ile Pro Asn Tyr Gly Ser Val Leu Leu Thr Val Ala Asp

930 935 940

Lys Asp Lys Glu Gly Leu Ala Ile Ala Lys Arg Phe His Ala Ile Gly

945 950 955 960

Tyr Asn Ile Leu Ala Thr Glu Gly Thr Ala Gly Tyr Leu Lys Glu Ala

965 970 975

Ser Ile Pro Ala Lys Val Val Gly Lys Ile Gly Gln Asp Gly Pro Asn

980 985 990

Leu Leu Asp Val Ile Arg Asn Gly Glu Ala Gln Phe Val Ile Asn Thr

995 1000 1005

Leu Thr Lys Gly Lys Gln Leu Ala Arg Asp Gly Phe Arg Ile Arg Arg

1010 1015 1020

Glu Ser Val Glu Asn Gly Val Ala Cys Leu Thr Ser Leu Asp Thr Ala

1025 1030 1035 1040

Glu Ala Ile Leu Arg Val Leu Glu Ser Met Thr Phe Arg Ala Asp Gln

1045 1050 1055

Met Pro Ala Val Asn Thr Asn Gln Glu Ala Ala Val Thr Ile

1060 1065 1070

<210> 5

<211> 618

<212> DNA

<213> 氨甲酰磷酸合成酶大亚基上游同源臂基因U(枯草芽孢杆菌)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(618)

<400> 5

tttagaccgt gccgaagacc gggataaatt tgaacaagcg cttggagaac ttggtgttcc 60

tcagccgctt ggcaaaacag cgacatcagt taatcaggcg gtaagcatcg caagtgatat 120

cggttatccg gtactggtac gcccttccta tgtacttggc ggccgggcga tggagattgt 180

ttaccatgaa gaggaactgc ttcattacat gaaaaatgca gtcaaaatca atccacagca 240

ccctgtatta attgatagat acttgaccgg aaaagaaatt gaagtcgatg cagtatccga 300

cggtgaaaca gtcgtcattc cgggaattat ggagcacatt gaacgtgcgg gcgttcactc 360

cggagactca atcgctgttt atccgcctca gtctctcaca gaggacatta agaaaaaaat 420

tgaacaatac acgatcgcat tggctaaagg gctgaatatt gtcggtttgc tcaatattca 480

attcgtcttg tcgcaaggcg aggtgtacgt gctagaagtg aatccgagat caagcagaac 540

cgtaccgttt ttaagcaaaa ttacgggtat cccaatggcg aatctcgcaa caaaaatcat 600

tcttggtcaa aagctggc 618

<210> 6

<211> 609

<212> DNA

<213> 氨甲酰磷酸合成酶大亚基下游同源臂基因D(枯草芽孢杆菌)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(609)

<400> 6

agtcactata tgaaaaaagc gtatttgaca gtatgttcta accagcaaat tgcagaccgg 60

gtgtttcaaa tggttctgaa aggggagctt gtccaagggt ttacaacccc tggacagttc 120

cttcatctta aagtgagcga agcggttacg cctcttttga gaaggccgat cagcatcgca 180

gacgtcaact ttgaaaaaaa tgaagtcacc atcatttatc gggtagatgg ggaagggaca 240

agactcttgt cactgaagca gcagggagaa cttgtggatg tcctcgggcc tttgggaaat 300

ggctttcctg ttaatgaagt tcaacccgga aagacggctt tgctggtagg aggcggagta 360

ggtgtgccgc ctctccaaga gctgtcgaaa cgcttgattg aaaaaggggt aaatgtcatc 420

cacgttttag gattccaatc ggcaaaggat gttttttacg aggaagaatg ccggcagtac 480

ggagacacgt atgtggcaac agctgacgga agctacgggg aaaccggatt tgtcacagat 540

gtgattaaac ggaaaaagct agagtttgat atcctcctca gctgcgggcc gacaccgatg 600

ctcaaggcg 609

<210> 7

<211> 1020

<212> DNA

<213> 质粒pC194(氯霉素抗性基因cat包括转录起始位点终止子的完整基因)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1020)

<400> 7

gggtaactag cctcgccggc aatagttacc cttattatca agataagaaa gaaaaggatt 60

tttcgctacg ctcaaatcct ttaaaaaaac acaaaagacc acatttttta atgtggtctt 120

tattcttcaa ctaaagcacc cattagttca acaaacgaaa attggataaa gtgggatatt 180

tttaaaatat atatttatgt tacagtaata ttgactttta aaaaaggatt gattctaatg 240

aagaaagcag acaagtaagc ctcctaaatt cactttagat aaaaatttag gaggcatatc 300

aaatgaactt taataaaatt gatttagaca attggaagag aaaagagata tttaatcatt 360

atttgaacca acaaacgact tttagtataa ccacagaaat tgatattagt gttttatacc 420

gaaacataaa acaagaagga tataaatttt accctgcatt tattttctta gtgacaaggg 480

tgataaactc aaatacagct tttagaactg gttacaatag cgacggagag ttaggttatt 540

gggataagtt agagccactt tatacaattt ttgatggtgt atctaaaaca ttctctggta 600

tttggactcc tgtaaagaat gacttcaaag agttttatga tttatacctt tctgatgtag 660

agaaatataa tggttcgggg aaattgtttc ccaaaacacc tatacctgaa aatgcttttt 720

ctctttctat tattccatgg acttcattta ctgggtttaa cttaaatatc aataataata 780

gtaattacct tctacccatt attacagcag gaaaattcat taataaaggt aattcaatat 840

atttaccgct atctttacag gtacatcatt ctgtttgtga tggttatcat gcaggattgt 900

ttatgaactc tattcaggaa ttgtcagata ggcctaatga ctggctttta taatatgaga 960

taatgccgac tgtacttttt acagtcggtt ttctaatgtc actaacctgc cccgttagtt 1020

<210> 8

<211> 603

<212> DNA

<213> E949*突变位点的基因片段M(人工序列)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(603)

<400> 8

tgcgtttggc tatacagagg gccttcagcc tgaacagcaa ggtgtatttg taaaagcgcc 60

ggtcttctcc tttgccaagc tgagaagagt ggatattacg ttagggcctg aaatgaaatc 120

aacaggtgaa gtcatgggga aagattcgac acttgaaaag gcgctctaca aagccttgat 180

cgcttcaggt attcaaatcc cgaactacgg ttccgtgctt ttaacagtag ctgataagga 240

caaagaaggg cttgccattg ctaagcggtt ccacgcgatc ggctacaaca ttttagcgac 300

ggaaggaacg gcaggctacc tgaaagaagc ttccattcca gcgaaggtcg tcggaaaaat 360

cggtcaggat ggcccgaact tgcttgatgt catcagaaac ggagaagcgc agtttgtcat 420

caatacgctg acaaaaggaa agcagtcggc aagagacggt tttagaatca gacgtgaatc 480

agtagaaaat ggtgttgcct gcctaacatc tttagatacg gcagaggcga tattgcgagt 540

gctggaaagc atgacattcc gtgctgatca aatgccggca gtcaacacaa atcaggaggc 600

ggc 603

Claims

1.一种尿苷的生产方法，其特征在于：利用分子生物学方法向Bacillus subtilisA219的氨甲酰磷酸合成酶大亚基中引入突变位点获得工程菌Bacillus subtilis A2191；在发酵罐中对工程菌进行发酵培养获得尿苷发酵液；从尿苷发酵液中分离提取得到尿苷晶体；所述Bacillus subtilis A219保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11774，该菌株氨甲酰磷酸合成酶大亚基具有序列表1所述核苷酸序列、序列表2所述氨基酸序列，其第1016位氨基酸为亮氨酸。

2.根据权利要求1所述的尿苷的生产方法，其特征在于：所述分子生物学方法是以Bacillus subtilis A219氨甲酰磷酸合成酶大亚基基因为模板，设计合成包含E949*突变位点的基因片段、见序列表8所示序列，再通过原位修饰的方法使用合成的基因片段替换Bacillus subtilis A219的氨甲酰磷酸合成酶大亚基基因中的同源基因片段，从而获得工程菌Bacillus subtilis A2191；工程菌Bacillus subtilis A2191中氨甲酰磷酸合成酶大亚基应包含E949*突变位点，其核苷酸序列见序列表3，氨基酸序列见序列表4。

3.根据权利要求1所述的尿苷的生产方法，其特征在于：所述发酵培养方法是将工程菌Bacillus subtilis A2191接入到发酵培养基中，接种量为10％-15％，培养温度为34-38℃，pH值为6.7-7.0，相对溶氧控制在10％-30％，发酵过程中流加800g/L葡萄糖溶液并控制残糖浓度为0.5％-2％，发酵周期为45-65h。

4.根据权利要求3所述的尿苷的生产方法，其特征在于：所述pH值是通过流加25％的氨水和玉米浆进行控制。

5.根据权利要求3所述的尿苷的生产方法，其特征在于：所述相对溶氧值是通过调节通气量和搅拌转速进行控制。

6.根据权利要求3所述的尿苷的生产方法，其特征在于：所述发酵培养基组成为：葡萄糖50g/L，酵母粉5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，K₂HPO₄ 5.2g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 5g/L，MnSO₄ 0.02g/L，ZnSO₄ 0.02g/L，柠檬酸钠10g/L，谷氨酸钠10g/L。

7.根据权利要求3所述的尿苷的生产方法，其特征在于：所述尿苷分离提取方法是收集工程菌发酵液，离心方法去除菌体后，使用超滤膜过滤方法除去大分子杂质，再使用串联离子交换树脂方法对膜过滤液进行脱色除杂，最后收集树脂流出液进行浓缩结晶获得尿苷成品。

8.根据权利要求3所述的尿苷的生产方法，其特征在于：所述离心方法是使用高速离心机，离心转速8000-10000r/min，离心时间10-15min；所述超滤膜过滤方法是使用截留分子量500-1000Da的有机中空纤维超滤膜，操作压力0.5-1.5Mpa，操作温度30-40℃。

9.根据权利要求7所述的尿苷的生产方法，其特征在于：所述串联离子交换树脂方法是将超滤膜过滤液依次通过弱碱性大孔型阴离子交换树脂和强酸性大孔型阳离子交换树脂，两种树脂的装填体积相同，进料浓度为35-40g/L，进料体积为1-2BV，进料流速为0.5-1BV/h。

10.根据权利要求7所述的尿苷的生产方法，其特征在于：所述浓缩结晶是使用真空浓缩将树脂流出液浓缩至过饱和状态，再放入结晶器中进行降温结晶，用无水乙醇洗晶2-3次。